抗稻瘟病基因Pi67(t)的显性分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本
发明属于
农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种
水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)的显性分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 稻瘟病(Pyricularia grisea cav.)是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae；无性态：Pyricularia)引起的水稻病害，其分布范围十分广泛。据统计，全世界有80余个国家均有发生，一般流行年份可造成10％-20％的减产，严重发生时则达到40％-50％。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，每年损失稻谷达数亿千克。随着品种应用的单一化、集中化以及
气候的影响，稻瘟病的危害也越来越重。尽管人们在病害防治上耗费了巨大的精
力和物质投入，但限于诸多方面因素的影响，防病效果一直不尽人意，尤其在病害严重发生年份，常常给生产、育种造成重大损失。以辽宁省为例，自20世纪90年代起，分别发生了因辽粳287、辽盐241、辽粳454和辽星1号几个主栽品种抗病性退化导致的穗颈瘟大面积发生，严重影响了北方粳稻的生产。产生这种现象的根本原因就是主栽品种对稻瘟病菌的抗谱狭窄，且单一化、集中化种植现象普遍，这样一旦稻瘟菌流行小种发生变化，品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，选育聚合多基因或具广谱抗性的水稻品种尤为必要。
[0003] 目前，在抗稻瘟病品种选育的过程中，育种家主要采用系谱法，或结合分子标记辅助选择抗病个体。传统的系谱法通过两亲本组配，从分离后代中择优选育品种，抗瘟表型依赖于田间自然鉴定或人工接种鉴定，
鉴别难度大，准确率低。由于不了解亲本的抗瘟基因型，育种者在亲本选择上非常盲目，通常是海量配组，海量选择后代，工作量大，育种效率低。在利用分子标记辅助选择进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连
锁的SSR标记，易造成
假阳性的判断，如能根据抗感等位基因本身的序列差异来设计不同基因的共分离标记，不仅可首先检测亲本所携带的抗瘟基因，也能在后代辅助选择时大大提高抗性品种选择的准确性。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)的显性分子标记及其应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0006] 一种抗稻瘟病基因Pi67(t)，在水稻品种GY8的第12号
染色体10.18Mb-11.19Mb区域内，存在抗稻瘟病基因Pi67(t)。
[0007] 一种与所述的抗稻瘟病基因Pi67(t)的显性分子标记：分子标记为在水稻抗稻瘟病Pi67(t)的
定位区域内存在一个141bp的插入位点，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
[0008] 一种用于检测所述分子标记的的引物组合，所述引物组合由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中
碱基序列所示；其中，SEQ ID NO.2正向引物Pi67(t)-1-F序列是5′-TAACTTGTCAACGCATCACC-3′，SEQ ID NO.3反向引物Pi67(t)-1-R序列是5′-AATTAAAGTTCTCATTCGACCA-3′。
[0009] 一种所述的引物组合的应用，所述引物组合在选育携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种中的应用。
[0010] 进一步的说：
[0011] 1)以携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻抗病品系GY8与其它不携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种杂交并繁衍后代群体；
[0012] 2)提取上述所获得群体中单个植株的基因组DNA，用
权利要求3所述引物组合进行PCR扩增，扩增产物的
片段长度为1284bp，则标志着所检测水稻样品携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。
[0013] 一种检测水稻品种是否携带Pi67(t)方法，
[0014] 1)提取水稻样品基因组DNA；
[0015] 2)利用权利要求3所述的引物组合对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增；
[0016] 3)扩增产物的片段长度为1284bp，则标志着其样品基因组中携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。
[0017] 一种利用所述引物组合选育携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种的方法，[0018] 1)以携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻抗病品系GY8与其它不携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种杂交，并繁衍后代群体；
[0019] 2)利用CTAB法提取上述群体中单个植株的基因组DNA，用所述引物组合进行PCR扩增，即能够获得片段长度为1284bp的产物，则标志着所检测水稻样品携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 本发明是将北方粳稻品种GY8与辽星1号杂交，构建F8代重组自交系RILs群体，采用芯片技术，从GY8中定位到一个广谱抗稻瘟病基因Pi67(t)；抗稻瘟病基因Pi67(t)在水稻育种中已经得到应用，为提高该基因在育种过程中的选择效率和准确性，缩短育种周期，特发明与Pi67(t)共分离的分子标记及其在水稻新品种选育过程中的应用方法，具体为：
[0022] 1.本发明获得的与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)共分离的分子标记，其鉴定的抗稻瘟病基因为在水稻品种GY8中定位的新基因，该基因已在在北方粳稻抗病育种中应用，后代材料抗稻瘟病性强。本发明的应用可显著提高Pi67(t)利用效率。
[0023] 2.本发明提供的分子标记基于二代重测序结果开发，并经过一代测序验证，结果精确，特异性好。
[0024] 3.本发明提供的分子标记位于抗病基因Pi67(t)的定位区域内，该区域为第12号染色体着丝粒附近，重组概率低，在遗传上与Pi67(t)连锁紧密，标记与基因共分离程度高。
[0025] 4.本发明提供的分子标记为显性标记，多态性好，便于通过琼脂糖凝胶
电泳准确区分，应用的成本低、操作简便、准确性高。
附图说明
[0026] 图1为本发明
实施例提供的抗稻瘟病基因Pi67(t)定位区域和Indel位点在水稻染色体上的
位置图；
[0027] 图2为利用本发明实施例提供的Indel标记在两个亲本及其后代中进行PCR扩增的产物电泳条带图，M代表Maker、G代表GY8、L代表辽星1号1-19代表GY8和辽星1号的杂交后代；
[0028] 图3为利用本发明实施例提供的Indel标记在不同水稻品种中进行PCR扩增的产物电泳条带图，M代表Maker、1-48代表不同的水稻品种。
具体实施方式
[0029] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0030] 实施例1水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)的定位
[0031] 利用抗稻瘟病水稻品种GY8与感稻瘟病水稻品种辽星1号杂交，从F2代开始利用单粒传的方法构建重组自交系群体RILs，群体中包括197个株系。
[0032] 将上述获得株系在辽宁省的稻瘟病诱发圃中种植，连续两年调查上述获得的群体中197个株系和两个亲本对稻瘟病的抗性；致病反应型和小种确定按全国稻瘟病菌生理小种联合试验组(1980)统一标准进行评定。调查记载标准为：
[0033]
[0034]
[0035] 利用8K水稻
基因芯片对两个亲本和197个株系的基因型进行检测，在水稻的12条染色体上共发现559个亲本间有差异的SNP。再利用QTL IciMapping
软件，将GY8携带的抗稻瘟病基因定位到12号染色体的7.8M-13.2M范围内。利用重组自交系群体中携带定位区域的株系与感病亲本辽星1号回交构建回交群体,再从回交群体中筛选重组子，结合重组子的表型将定位区域缩小到第12号染色体10.18Mb-11.19Mb范围内，并将GY8携带的抗稻瘟病基因命名为Pi67(t)如图1所示。
[0036] 实施例2与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)共分离的分子标记的开发
[0037] 利用二代重测序技术对携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品系GY8和不携带该基因的水稻品种辽星1号进行重测序，获得平均
覆盖深度大于30×的测序数据。通过比对两个品种的序列，发现两个水稻品种在抗稻瘟病基因Pi67(t)的定位区域内存在一个141bp的插入位点,抗稻瘟病基因Pi67(t)和Indel位点在染色体上的位置，如图1所示。
[0038] 由图1可见在抗稻瘟病基因Pi67(t)位于水稻第12号染色体10.18Mb-11.19Mb范围内，Indel位点位于10.93Mb的位置；与不携带基因Pi67(t)的辽星1号相比，携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的GY8有141bp的插入。即为SEQ ID NO.1所示的与抗稻瘟病基因Pi67(t)共分离的分子标记。
[0039] SEQ ID NO.1
[0040] GAGCCCAAGGGACATGTCTCAGCAACATACGGACGCGACGAGGATGAACGTGCTTGCTCGTCTCATTTCCCAGGTCCGTCGTTCGATCGGTAACTTGTCAACGCATCACCGATCCGTGATGGGGCTGCCGTGGACACCCTT[0041] 根据上述Indel位点两端序列设计一对引物组合，所述引物组合由如SEQ ID NO.2所示的DNA序列和如SEQ ID NO.3所示的DNA序列组成。SEQ ID NO.2正向引物Pi67(t)-1-F序列是5′-TAACTTGTCAACGCATCACC-3′，SEQ ID NO.3反向引物Pi67(t)-1-R序列是5′-AATTAAAGTTCTCATTCGACCA-3′。
[0042] 利用上述获得引物对，对水稻品种GY8和辽星1号的基因组DNA分别进行PCR扩增。
[0043] 反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix(
艾德莱PC0902)10μL，10μM的引物各0.5μL，100μg/mL的模板DNA 1μL，ddH2O 8μL。
[0044] PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃
退火30s，72℃延伸45s，30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
[0045] 由上述PCR扩增产物可见，携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的GY8的扩增产物为1284bp而不携带基因Pi67(t)的辽星1号没有扩增产物，该引物能够很好的区分抗病与感病的基因型。
[0046] 实施例3与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)共分离的分子标记的验证
[0047] 以抗稻瘟病基因Pi67(t)的供体品种GY8和感病品种辽星1号为亲本，构建F2群体，以辽宁地区流行的稻瘟病菌的混合菌对群体中的单株进行苗期人工接种，鉴定其对稻瘟病的抗性。并利用引物组合SEQ ID NO：2/SEQID NO：3对F2群体各植株的基因型进行鉴定。
[0048] 具体试验如下：
[0049] 以抗稻瘟病基因Pi67(t)的供体品种GY8和感病品种辽星1号为亲本，构建F2群体为试材，种植于
温室。将辽宁地区流行的稻瘟病菌ZA1、ZA9、ZB1和ZF1分别移植于燕麦片番茄汁琼脂培养基上，25-27℃条件下培养7d，待菌丝长满，用灭菌的
棉签擦掉气生菌丝后保湿培养，稻瘟病菌会大量产孢。待7个品种稻苗长至5叶1心时，将上述扩繁培养的分生孢子用120ml无菌水清洗，用双层纱布过滤装入三
角瓶中，配制孢子悬液(浓度为120倍
显微镜视野下有20个左右孢子)，将上述5个稻瘟病菌小种混合，配制成混合菌孢子悬浮液，对试验材料进行喷雾接种。接种后用黑色塑料膜遮光、保湿12小时。于接种后10d调查，调查方法参照实施例1。同时提取F2群体植株的基因组DNA，以引物组合SEQ ID NO：2/SEQID NO：3进行PCR扩增.PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳,应用凝胶成像系统记录试验结果,扩增结果如图2所示。由图可见接种鉴定及基因扩增的结果表明，其中1-19号为GY8和辽星1号杂交的F2代部分株系，F2群体中凡扩增产物中有1条长度约1284bp片段的个体对稻瘟病均表现抗病，没有扩增产物的个体对稻瘟病均表现为感病。实施例结果表明，利用引物组合SEQ ID NO：2/SEQID NO：3可准确的筛选到携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的植株，筛选效率达到100％。
[0050] 实施例4利用分子标记Pi67(t)-1检测水稻品种中是否携带抗稻瘟病基因Pi67(t)[0051] 以包括抗稻瘟病基因Pi67(t)供体品种GY8在内的48个水稻品种为试材，正常栽植于田间，于苗期按实施例3所述方法提取DNA，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物进行PCR扩增，扩增结果如图3所示，除抗稻瘟病基因Pi67(t)供体品种GY8(2号)外，3号等16个水稻品种也扩增出与供体品种和单基因系一致的特异性产物。基于分子标记鉴定的结果可确定这16个品种携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。
[0052] 该标记可以高效地用于水稻品种是否携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的鉴定。
[0053] 实施例5与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记的应用[0054] 利用感病水稻品种辽星1号与携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的GY8号杂交构建育种群体，利用引物组合SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：3对后代植株的基因组DNA进行PCR扩增，实施方法同实施例3。如果扩增产物为1284bp的片段，该单株携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。再对携带Pi67(t)的植株进行株型和产量性状的筛选，选育出既携带抗稻瘟病基因又具有良好株型和产量性状的水稻品系。实施例结果表明，应用该分子标记能够从后代材料中快速准确鉴定出携带Pi67(t)基因的水稻植株，
加速水稻抗稻瘟病品种培育的
进程。
