基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法
阅读：889发布：2024-02-15
专利汇可以提供基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物，分别为B型，12对SNP引物；C型，10对引物包括1对InDel和9对SNP引物；D型，3对引物包括1对InDel和2对SNP引物；HS型，19对引物包括2对InDel和17对SNP引物；T型，7对SNP引物。该方法可用于鉴定玉米自交系或杂交种的胞质类型，鉴定玉米自交系或杂交种母本的胞质类型，对玉米材料进行分类划群反映母系演化 进程 。该方法的应用在基因组 水 平上拓展了玉米材料类群划分、母系追踪的分析方法，为玉米 细胞质 遗传特性研究提供了新思路和手段。，下面是基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法专利的具体信息内容。
1.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米B型胞质材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下12个SNP标记中的至少一个，它们的信息如表1所示：
表1
2.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米C型胞质不育材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下9个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表2所示：
表2
。
3.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米D型胞质材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下2个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表3所示：
表3
。
4.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米HS型胞质不育材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下17个SNP标记和2个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表4所示：
表4
5.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米T型胞质不育材料的分子标记，其特征在于，所述。分子标记选自以下7个SNP标记中的至少一个，它们的信息如表5所示：
表5
。
6.基于KASP技术开发的用于检测权利要求1-5任一项所述分子标记的引物，其特征在于，用于检测表1中标记CPMSNP01～CPMSNP93的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:105-140所示，其中用于检测标记CPMSNP01的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:105-107，用于检测标记CPMSNP02的KASP引物为SEQ ID NO:108-110，以此类推；
用于检测表2中标记CPMIDP10～CPMSNP81的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:141-170所示，其中用于检测标记CPMIDP10的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:141-143，用于检测标记CPMSNP18的KASP引物为SEQ ID NO:144-146，以此类推；
用于检测表3中标记CPMIDP07～CPMSNP19的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:171-179所示，其中用于检测标记CPMIDP07的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:171-173，用于检测标记CPMSNP07的KASP引物为SEQ ID NO:174-176，以此类推；
用于检测表4中标记CPMIDP01～CPMSNP96的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:180-237所示，其中用于检测标记CPMIDP01的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游引物1、下游引物2，序列为SEQ ID NO:180-183，用于检测标记CPMIDP02的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:184-186，用于检测标记CPMSNP08的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:187-189，以此类推；
用于检测表5中标记CPMSNP03～CPMSNP86的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:238-258所示，其中用于检测标记CPMSNP03的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:238-240，用于检测标记CPMSNP04的KASP引物为SEQ ID NO:241-243，以此类推。
7.含有权利要求6所述引物的检测试剂或试剂盒。
8.基于KASP技术的玉米五种叶绿体胞质类型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测玉米样品的DNA；
2)KASP反应：向步骤1)提取的DNA模板中加入KASP Primer mix和KASP ROX standard reaction mix，进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR产物；
所述KASP Primer mix为权利要求6所述的各KASP引物中上游引物5’端分别修饰不同荧光标签序列后，与下游通用引物形成的混合物；
优选地，所述荧光标签序列为：5’-FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
5’-HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为：DNA模板1.5μL，KASP ROX standard reaction mix 0.5μL，KASP Primer mix 0.014μL，ddH2O 0.5μL；所述KASP Primer mix中各引物的浓度为100μM。
PCR反应程序为：94℃15min；94℃20s，61-55℃1min(每个循环降低0.6℃)，10个循环；
94℃20s，58℃1min，30个循环。
10.权利要求1-5任一项所述分子标记或权利要求6所述引物在玉米样品检测、玉米分子标记辅助育种中的应用。
基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法
技术领域
背景技术
[0002] 玉米是全球第一大作物，在我国农业生产中具有重要地位；是杂交良种应用最早最普及的作物，也是全球和我国种业市场份额最大的作物。父母本双亲的筛选是培育优良玉米杂交种的关键因素，因此针对于双亲自交系类群划分的研究报道颇多，但均是基于核基因组分子标记的分析。即主要是从核基因组染色体重组方面进行分析，该遗传变异主要是由于人工组配选育优良材料导致的。
[0003] 叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，拥有自身完整的一套基因组，称为叶绿体基因组。叶绿体基因组结构非常保守，DNA一般为双链环状分子，高等植物中叶绿体基因组大小一般为120-160kb。与核基因组不同，叶绿体基因组具有细胞质遗传的特点，植物叶绿体基因组为单亲遗传(多数为母系遗传)，一般不发生重组；叶绿体具有基因组较小且相对保守，分子进化速率慢，基因组的遗传变异容易受到群体遗传效应的影响；因此叶绿体分子标记是研究群体分化的有效手段。禾本科植物玉米叶绿体基因组属于严格母系遗传，基于叶绿体基因组的分子标记对玉米材料进行分析，可以鉴定出玉米分化形成的几种叶绿体胞质类型。
[0004] 高通量测序和基因组生物信息学分析技术的成熟，有效促进了对叶绿体基因组的研究。从叶绿体基因组水平上挖掘单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失多态(InDel)等分子标记位点成为可能。KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)为竞争性等位基因特异性PCR技术，具备试验流程简单、高效、灵活、易操作等特点，适合SNP/InDel等二态性标记类型的基因分型检测。
[0005] 现有玉米自交系、种质资源材料的分类和划群均是基于细胞核基因组信息，植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，即叶绿体和线粒体基因组信息。细胞质基因组信息尤其是叶绿体基因组具有上述优点，更加适合于对玉米材料从早期分化上进行分类划群，反映母本单系演化进程。因此，本发明利用重测序数据开发玉米叶绿体胞质类型的特异位点，基于KASP基因分型平台设计引物并进行验证评估，建立玉米叶绿体胞质类型鉴定的一种方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。
[0007] 本发明的发明构思如下：(1)170份玉米代表性材料的选取，包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、以及细胞质CMS不育类型等样品。(2)高浓度、高质量总DNA制备。(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍。(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性。(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组，将170份材料叶绿体基因组序列进行比对，筛选出100个SNP/InDel叶绿体基因组变异位点。(6)玉米五种叶绿体胞质类型的确定，基于170份材料叶绿体基因组序列利用MP(Maximum Parsimony)最大简约法和ML(Maximum Likelihood)最大似然法分别建立系统进化聚类图，结果显示所有样品被划分为五种类型。五种类型分别为：B型为改良瑞德、改良兰卡以及美国骨干自交系材料；C型为C型细胞质不育材料；D型为旅大红骨杂优群、地方品种以及热带材料；HS型为S型细胞质不育材料和唐四平头杂优群材料；T型为T型细胞质不育材料。(7)五种胞质类型特异鉴定位点的确定，分析五种类群之间的Fst值(遗传分化系数)，Fst值大于0.9为该类群的特异位点。玉米B、C、D、HS、T五种胞质类型分别分析获得B型特异位点12个，C型特异位点11个，D型特异位点4个，HS型特异位点20个，T型特异位点7个。(8)引物设计、评估与验证，基于KASP技术体系设计上述特异位点的引物，利用94份代表五种类型的样品在以下四个方面进行引物评估，第一扩增是否成功，第二是否反映了母系遗传，第三与测序结果是否一致，第四是否为五种叶绿体胞质类型的特异引物。最终获得玉米B、C、D、HS、T五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物分别是12、10、3、19、7对。位点具体信息见表1-表5，引物具体信息见表6。本发明中基于KASP技术体系的玉米五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物获得的技术路线图见图1。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米B型胞质材料的分子标记，所述分子标记选自以下12个SNP标记中的至少一个，它们的位点信息如表1所示：
[0009] 表1
[0010]
[0011] 本发明提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米C型胞质不育材料的分子标记，所述分子标记选自以下9个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表2所示：
[0012] 表2
[0013]
[0014] 本发明提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米D型胞质材料的分子标记，所述分子标记选自以下2个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的位点信息如表3所示：
[0015] 表3
[0016]
[0017] 本发明提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米HS型胞质不育材料的分子标记，所述分子标记选自以下17个SNP标记和2个InDel标记中的至少一个，它们的位点信息如表4所示：
[0018] 表4
[0019]
[0020]
[0021] 其中，所述InDel标记CPMIDP01和CPMIDP02的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:103-104所示。
[0022] 本发明提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米T型胞质不育材料的分子标记，所述分子标记选自以下7个SNP标记中的至少一个，它们的位点信息如表5所示：
[0023] 表5
[0024]
[0025] 所述分子标记的物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列而确定的，所述玉米品种B73叶绿体基因组的版本号为AGPv3。
[0026] 本发明还提供基于KASP技术开发的用于检测表1-表5所述分子标记的引物。
[0027] 优选地，用于检测表1中标记CPMSNP01～CPMSNP93的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:105-140所示，其中用于检测标记CPMSNP01的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:105-107，用于检测标记CPMSNP02的KASP引物为SEQ ID NO:108-110，以此类推。
[0028] 优选地，用于检测表2中标记CPMIDP10～CPMSNP81的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:141-170所示，其中用于检测标记CPMIDP10的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:141-143，用于检测标记CPMSNP18的KASP引物为SEQ ID NO:144-146，以此类推。
[0029] 优选地，用于检测表3中标记CPMIDP07～CPMSNP19的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:171-179所示，其中用于检测标记CPMIDP07的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:171-173，用于检测标记CPMSNP07的KASP引物为SEQ ID NO:174-176，以此类推。
[0030] 优选地，用于检测表4中标记CPMIDP01～CPMSNP96的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:180-237所示，其中用于检测标记CPMIDP01的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游引物1、下游引物2，序列为SEQ ID NO:180-183，用于检测标记CPMIDP02的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:184-186，用于检测标记CPMSNP08的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:187-189，以此类推。
[0031] 优选地，用于检测表5中标记CPMSNP03～CPMSNP86的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:238-258所示，其中用于检测标记CPMSNP03的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQ ID NO:238-240，用于检测标记CPMSNP04的KASP引物为SEQ ID NO:241-243，以此类推。
[0033] 本发明提供的51对SNP/InDel引物可以基于KASP平台实现基因分型数据的获得。具体方案为，根据KASP技术要求针对于本发明提供的位点设计引物，引物为普通引物不含荧光基团；购置KASP技术配套的PCR扩增体系MasterMix；配置反应体系加入DNA、引物和MasterMix；运行反应程序；原位扫描荧光信号；数据分析获得基因型数据。
[0034] 本发明还提供一种玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。具体包括如下步骤：(1)提取被检测自交系或杂交种材料的总DNA；(2)利用本发明提供的SNP/IDNEL引物，基于KASP基因分型平台进行PCR扩增、荧光扫描获得基因型数据，并判定属于哪种叶绿体胞质类型。本发明提供的引物还可用于鉴定玉米或杂交种母本的胞质类型，可用于对玉米材料进行分类划群反映母系演化进程。
[0035] 本发明还提供一种基于KASP技术的玉米五种叶绿体胞质类型的鉴定方法，包括以下步骤：
[0036] 1)提取待测玉米样品的DNA；
[0037] 2)KASP反应：向步骤1)提取的DNA模板中加入KASP Primer mix和KASP ROX standard reaction mix，进行PCR扩增；
[0038] 3)采用荧光检测仪分析PCR产物。
[0039] 所述KASP Primer mix为各KASP引物中上游引物5’端分别修饰不同荧光标签序列后，与下游通用引物(下游引物)形成的混合物。
[0040] 优选地，所述荧光标签序列为：5’-FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
[0041] 5’-HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
[0042] 优选地，步骤2)中PCR反应体系为：DNA模板1.5μL，KASP ROX standard reaction mix(Kbiosciences,Herts UK)0.5μL，KASP Primer mix 0.014μL，ddH2O 0.5μL；所述KASP Primer mix中各引物的浓度为100μM。
[0043] 优选地，PCR反应程序为：94℃15min；采用降落PCR的方式，94℃20s，61-55℃1min(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃20s，58℃1min，30个循环。
[0044] 优选地，扩增产物利用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入Kraken软件(LGC，Middlesex，UK)进行分析获得每个样品每个数据点的指纹数据。根据每个位点的指纹数据，依据表6中列出的每个位点代表该类型的等位基因进行判定，如果与表中所述等位基因相同则为其对应的胞质类型，如果为另一个等位基因则不属于该胞质类型。
[0045] 本发明还提供所述KASP引物，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴定玉米五种叶绿体胞质类型或选育不育材料中的应用。
[0046] 本发明进一步提供所述分子标记或所述KASP引物，或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在玉米样品检测、玉米分子标记辅助育种中的应用。
[0047] 本发明的发明点在于：(1)从全基因组数据中分离得到叶绿体基因组数据：由于叶绿体基因组序列相对保守，并且测序质量和长度足够，因此在本发明中叶绿体基因组数据获得是通过拼接方案，同时结合与玉米叶绿体参考基因组比对方式。玉米叶绿体基因组数据获得关键步骤为，利用Blast程序筛选叶绿体基因组的contig，使用Sequencher软件组装叶绿体基因组contig，组装好的序列与玉米叶绿体参考基因组(玉米品种B73，AGPv3)进行比对验证确认，为获得准确可靠的叶绿体基因组序列提供保障。(2)玉米五种叶绿体胞质类型的确定：基于来源广泛、表型和基因型丰富的170份材料的叶绿体基因组序列信息，利用PAUP4.0和RAxML7.04软件，MP(Maximum Parsimony)最大简约法和ML(Maximum Likelihood)最大似然法分别建立系统进化聚类图。两种方法建立的聚类图结果显示所有玉米样品被划分为五种叶绿体胞质类型。(3)基于KASP技术玉米五种叶绿体胞质类型特异引物确定：将所有类型玉米自交系的变异位点进行分析，筛选确定五种胞质类型特异位点，基于KASP技术体系设计评估引物。引物筛选标准为是否扩增成功，是否遵循母系遗传，基因型数据准确性等方面，最终确定胞质类型鉴定的特异引物。
[0048] 本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的170份玉米自交系材料，获得叶绿体基因组序列，并分析170份材料的胞质类型。比较叶绿体基因组核苷酸多态性，开发鉴定玉米叶绿体胞质类型的特异位点，基于KASP技术体系设计引物并进行评估，建立一种玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。该方法可用于鉴定玉米自交系或杂交种的胞质类型，鉴定玉米或杂交种母本的胞质类型，对玉米材料进行分类划群反映母系演化进程。该方法的应用在基因组水平上拓展了玉米材料类群划分、母系追踪的分析方法，为为玉米细胞质遗传特性等研究提供了新思路和技术手段。附图说明
[0049] 图1为本发明基于KASP技术体系的玉米五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物获得的技术路线图。
[0050] 图2A-图2E为本发明中对玉米B、C、D、HS、T五种胞质类型特异鉴定引物的试验结果。图中圆点代表玉米材料的基因型。图2A为B型胞质类型特异鉴定引物，图2B为C型胞质类型特异鉴定引物，图2C为D型胞质类型特异鉴定引物，图2D为H/S型胞质类型特异鉴定引物，图2E为T型胞质类型特异鉴定引物。
具体实施方式
[0051] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0052] 实施例1基于KASP技术体系玉米五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物的获得[0053] 1、样品选取：选取170份具有广泛代表性的玉米自交系进行全基因组测序。这170份样品包括普通玉米、糯玉米、甜玉米、爆裂玉米等玉米类型；包括了我国所有杂种优势群，唐四平头、旅大红骨、瑞德、兰卡、改良瑞德、改良兰卡、P群、地方品种，以及T、C、S三种细胞质不育类型材料。
[0054] 2、样品制备：170份玉米样品的种子在培养箱内发苗5天，前3天为无光照条件，后2天为光照条件(即出土之后给予充足光照)。每个样品从中选取30株绿苗叶片并混合，液氮条件下充分研磨。总DNA采用CTAB法提取，并去除RNA。用紫外分光光度计和琼脂糖电泳分别检测所提取DNA的质量，琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有降解；紫外分光光度计检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA没有蛋白污染，RNA含量低)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA盐离子含量低)；DNA浓度大于1000ng/μL。
[0055] 3、总DNA高通量测序：对170份玉米样本DNA和PCR产物采用超声打断，切胶回收400-600bp的DNA片段，利用 的建库试剂盒构建500bp大小的文库，利用Hiseq
4000PE150的测序平台进行测序，测序深度为5倍，平均每个样本获得约10GB数据。
4000PE150的测序平台进行测序，测序深度为5倍，平均每个样本获得约10GB数据。
[0056] 4、高通量测序数据处理、叶绿体基因组拼接：高通量测序数据分别独立使用SPAdes(Bankevich et al.,2012)和SOAPdenovo2(Luo et al.,2012)两个软件进行拼接。对于每个软件拼接的contig利用Blast程序进行筛选出叶绿体基因组的contig(Altschul et al.,1997)；筛选出的叶绿体基因组contig使用Sequencher进行组装。然后使用Geneious 8.1(Kearse et al.,2012)把所有的reads map到拼接好的叶绿体基因组序列上，验证拼接成的contig序列是否正确。
[0057] 5、叶绿体基因组注释、多态位点确定：叶绿体基因组注释用DOGMA(Dual Organellar Geno Me Annotator)(Wyman et al.,2004)进行，用BLASTX和BLASTN搜索鉴定编码基因的位置。170个玉米叶绿体基因组用MAFFT软件进行比对(Katoh and Standley,2013)，然后用Se-al软件进行手工调整比对结果。对于序列里面出现的倒位比对的原则是进行拉开，以免造成错误的数据多态性。利用DnaSp 5.0统计两个叶绿体基因组中的变异位点和序列多态性(Librado and Rozas,2009)，开发获得100个SNP/InDel多态位点。
[0058] 6、玉米五种叶绿体胞质类型的确定：基于来源广泛、表型和基因型丰富的170份材料的叶绿体基因组序列信息，利用PAUP4.0和RAxML7.04软件，MP(Maximum Parsimony)最大简约法和ML(Maximum Likelihood)最大似然法分别建立系统进化聚类图。两种方法建立的聚类图结果显示所有玉米样品被划分为五种叶绿体胞质类型。五种类型分别为：B型为改良瑞德、改良兰卡以及美国骨干自交系材料；C型为C型细胞质不育材料；D型为旅大红骨杂优群、地方品种以及热带材料；HS型为S型细胞质不育材料和唐四平头杂优群材料；T型为T型细胞质不育材料。
[0059] 7、玉米五种叶绿体胞质类型特异位点的确定：基于170份玉米代表性材料的100个SNP/InDel多态基因型数据，利用VCFtools软件中的weir-fst-pop功能分析不同类群之间的Fst值，即不同类群之间的遗传分化系数，Fst值大于0.9认为该位点为特异位点。对玉米B、C、D、HS、T五种胞质类型分别分析获得B型特异位点12个，C型特异位点11个，D型特异位点4个，HS型特异位点20个，T型特异位点7个。
[0060] 8、基于KASP平台进行引物设计、评估与验证：基于KASP技术体系设计上述特异位点的引物。SNP和InDel(小于26bp的插入缺失)位点，需设计3条引物，两条为等位基因特异的引物，一条为通用的反向引物。对于插入片段大于26bp的InDel位点，分别针对于插入和缺失设计两对引物。选取94份代表五种类型的样品，基于KASP技术体系评估验证所设计的引物。上述材料主要验证引物扩增效果，标记位点是否严格遵循母系遗传，基因型数据与测序结果一致性，是否为五种类型的特异引物。
[0061] 9、引物验证试验过程：DNA提取采取混株提取DNA的方式，混合了30个单株的绿叶，DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。DNA质量和浓度用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)紫外分光光度计进行测定，根据测量值调节工作液浓度为20ng/μL。PCR反应体系为1μL，包括1.5μL总DNA(烘干)，0.5μL KASP ROX standard reaction mix(Kbiosciences,Herts UK)，0.014μL引物混合物，0.5μL去离子水。反应程序在水浴PCR仪(Hydrocycler HC-64)中执行，反应程序为94℃15min；循环10次，采取降落PCR方式，94℃20s，61℃1min，(61℃降落到55℃，每个循环降低0.6℃)；94℃20sec，58℃1min，循环30次。
采用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)对PCR产物进行荧光信号扫描，获得原始数据；利用Kraken软件进行基因型统计(LGC，Middlesex，UK)。
采用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)对PCR产物进行荧光信号扫描，获得原始数据；利用Kraken软件进行基因型统计(LGC，Middlesex，UK)。
[0062] 10、确定鉴定玉米五种叶绿体胞质类型的特异引物：基于上述94份材料的试验数据，针对于设计的引物在以下四个方面进行评估。第一，引物扩增是否成功；第二，是否反映了母系遗传特征；第三，基因型数据是否与测序结果一致；第四，验证是否为五种叶绿体胞质类型的特异引物。最终获得玉米B、C、D、HS、T五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物分别是12、10、3、19、7对。
[0063] 本发明中基于KASP技术体系的玉米五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物获得的技术路线图见图1。图2A-图2E展示了玉米B、C、D、HS、T五种胞质类型特异鉴定引物的试验结果。
[0064] 利用本发明提供的12对、10对、3对、19对、7对引物分别鉴别玉米自交系是否为B、C、D、HS、T型不育的分析结果图见图2A-图2E。图2A-图2E中每对引物结果分型图中，每个数据点为每个样品在每对引物中分型结果；数据点在原点附近的为阴性对照样品，其余数据点一部分靠近X轴，一部分靠近Y轴，分别代表了每对引物显示的两种纯合基因型结果；利用软件读取的基因型数据数据分别与表1、表2、表3、表4、表5中的每对引物的信息进行核对，如果与“玉米B、C、D、HS、T五种胞质类型等位基因”一致则为对应的B、C、D、HS、T胞质类型，如果为另一种基因型则为非B、C、D、HS、T胞质类型。
[0065] 实施例2基于KASP技术的玉米五种叶绿体胞质类型的高通量鉴定方法
[0066] 实验目的：对96个玉米自交系种质材料鉴定其五种叶绿体胞质类型。
[0067] 1、待鉴定玉米自交系样品DNA提取：每个样品随机选取50粒种子，进行发苗，给予充足光照，形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，每个样品从50个单株中随机选取了30个单株的绿叶并混合，DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，
2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。
2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。
[0068] 2、PCR扩增：从本发明表6中提供的B、C、D、HS、T五种叶绿体胞质类型特异鉴定引物中，分别选取1对或多对进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板1.5μL，KASP ROX standard reaction mix(Kbiosciences,Herts UK)0.5μL，KASP Primer mix 0.014μL，ddH2O 0.5μL；所述KASP Primer mix中各引物的浓度为100μM。PCR反应程序为：94℃15min；采用降落PCR的方式，94℃20s，61-55℃1min(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃20s，58℃1min，30个循环。
[0069] 3、指纹数据获得：将扩增产物利用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入Kraken软件(LGC，Middlesex，UK)进行分析获得每个玉米样本每个数据点的指纹数据。
[0070] 4、结果判定：基于表6中所列出的每对引物在玉米五种叶绿体胞质类型中的等位基因进行判定。
[0071] 实施例3利用本发明提供的特异引物鉴定玉米自交系或杂交种母本的叶绿体胞质类型
[0072] 待鉴定玉米自交系或杂交种样品DNA提取，PCR扩增，指纹数据获得方法同实施例2。
[0073] 结果判定：由于玉米叶绿体基因组为母系遗传，所以待检测玉米自交系或杂交种的叶绿体胞质类型与其母本完全相同。基于表6中所列出的每对引物在玉米五种叶绿体胞质类型中的等位基因进行判定。
[0074] 实施例4利用本发明提供的特异引物对玉米材料进行划群反映母系演化关系[0075] 实验目的：100份不同遗传背景的玉米材料(包含自交系和杂交种)，基于叶绿体特异引物进行划群并分析其母系演化关系。
[0076] 待测玉米材料DNA提取，PCR扩增，指纹数据获得方法同实施例2。
[0077] 聚类图构建：利用Power-Marker ver.3.25软件，选用Rogers(1972)遗传距离计算法，分析建立NJ聚类树状图(neighbor-joining trree)。100份样品被划分为到不同的类群内，最多为五大类群，即本发明中确定的B\C\D\HS\T五大类。基于聚类图的拓扑结构，分析每个样品所属的类群，以及不同类群之间的相关关系。
[0078] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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