一种具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物及其制备方法和
应用
技术领域
背景技术
[0002]
炎症是
机体对于刺激的一种防御反应，常表现为红、肿、热、痛及其他功能障碍。当机体受到外来病原体刺激时，常引起各种炎症介质过量释放以及炎症细胞过度激活。巨噬细胞作为机体抗击外来物侵袭的重要一关，当巨噬细胞受到外来刺激被激活后会产生大量的NO，进一步诱导炎症细胞因子的产生，因此，抑制巨噬细胞释放NO，有利于
预防或
治疗炎症。
[0003] 骨质增生症又称为增生性骨关节炎，骨性关节炎(OA)、退变性关节病、老年性关节炎，肥大性关节炎，是由于构成关节的软骨、
椎间盘，韧带等软组织变性、退化，关节边缘形成骨刺，滑膜肥厚等变化，而出现骨破坏，引起继发性的骨质增生，导致关节
变形，当受到异常
载荷时，引起关节
疼痛，活动受限等症状的一种
疾病。目前的研究认为骨质增生症和炎症反应有关，有效抗炎对其有很好的治疗作用，因此目前主要是通过抗炎类药物对其进行治疗。
[0004] 目前使用的炎症治疗物多为合成药物(例如布洛芬)、抗组胺剂、类固醇、可的松、免疫
抑制剂和免疫激动剂，但这些药物仅暂时性地缓解炎症且具有诸如超敏反应和免疫系统退化等
副作用。目前传统的合成类抗炎药物已很难满足社会需求，天然药物成为医药界关注的热点。我国的中医药学源远流长，博大精深，是中国传统文化的代表与传统文化的瑰宝。因此，从中药中筛选出具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物对预防或治疗炎症及骨质增生症具有重要的意义。
[0005] 菝葜为百合科
植物菝葜Smilax china L的干燥根茎，
别名金刚藤、金刚刺、王瓜草、红灯果等，收载于2010年版中国药典一部，其味酸、甘，性平，具有祛
风利湿、解毒散瘀的功效。我国民间常用其治疗骨质增生、风湿关节痛、跌打损伤、妇科炎症等病症，而巴基斯坦民间用其治疗风湿、哮喘等病。现代药理学研究表明菝葜具有抗炎、抗风湿、抗
肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖等作用。鉴于菝葜属植物显著的生理活性，国内外学者对菝葜进行了大量研究，但是其化学成分研究相对较少，药效物质
基础仍有待确定，因此，从中药菝葜中筛选出具有抗炎作用的化合物具有非常重要的意义。
发明内容
[0006] 针对
现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物及其制备方法和应用。
[0007] 本发明所述的具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物，具有式Ⅰ所示化学结构：
[0008]
[0009] 所述的具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物可通过化学合成或从植物中提取得到；
[0010] 作为优选方案，所述的具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物从菝葜中提取分离得到。
[0011] 一种制备本发明所述的具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物的方法，包括如下步骤：
[0012] a)将百合科植物菝葜的根茎干燥后
粉碎作为原料，用醇
水溶液回流提取1～3次，每次提取1～6小时，合并提取液，得粗提液；
[0013] b)将粗提液调至pH≤7，过滤；将
滤饼干燥后作为提取原料，用醇类
有机溶剂提取1～3次，每次5～45分钟；合并提取液，减压浓缩后溶于水中，过滤，浓缩，得到菝葜粗提物；
[0014] c)将所得菝葜粗提物用固相萃取柱分离，分别以水和甲醇依次洗脱，对得到的甲醇洗脱部位反向
硅胶柱层析，以体积比为20:80～90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，然后经高压液相反相分离，即得式Ⅰ所示的具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物。
[0015] 作为优选方案，步骤a)中所用的醇为甲醇、
乙醇或丙醇。
[0016] 作为优选方案，步骤a)中所述的醇水溶液的体积分数为50～95％，每次提取所加入的乙醇水溶液与原料的液料比是(5～15)毫升/克。
[0017] 作为优选方案，步骤b)中，将粗提液调至pH为4～7，过滤。
[0018] 作为优选方案，步骤b)中，所用的醇类
有机溶剂为甲醇、乙醇或丙醇。
[0019] 作为优选方案，步骤b)中，每次提取所加入的醇类有机溶剂与提取原料的液料比是(5～15)毫升/克。
[0020] 作为优选方案，步骤c)中，高压液相反相分离时，采用体积比为20:80～60:40的乙腈-水进行梯度洗脱。
[0021] 本发明所述的具有抑制巨噬细胞释放NO活性的化合物的应用，是指以式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物、水合物、
溶剂化物中的至少一种作为活性成分用于制备抗炎药物。
[0022] 进一步说，是指以式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物、水合物、溶剂化物中的至少一种作为活性成分用于制备治疗和/或预防骨质增生症的药物。
[0023] 本发明所述的药物可以各种
给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。
[0024] 本发明所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、
薄膜衣片剂、
肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、
软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
[0025] 本发明所述药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。例如，所述药物为口服剂型时，可含有常用的赋形剂，诸如
粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、
润滑剂、崩解剂、
着色剂、
调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括
纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括
淀粉、聚乙烯吡咯烷
酮和淀粉衍
生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如
硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基
硫酸钠。
[0026] 本发明中所述术语的定义如下：
[0027] 术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的
无机酸或
有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括但不限于：
盐酸、
氢溴酸、
磷酸、
硝酸、硫酸；所述的有机酸包括但不限于：
甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-
萘二磺酸、亚细亚酸、
草酸、
酒石酸、乳酸、水杨酸、
苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、
丙二酸、
琥珀酸、富
马酸、庚二酸、
己二酸、马来酸、苹果酸、
氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、
抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、
对甲苯磺酸、
柠檬酸，以及氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
[0028] 术语“互变异构体”是指因分子中某一
原子在两个
位置迅速移动而产生的官能团异构体，例如：烯醇与相应的酮。
[0029] 术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。
[0030] 术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
[0032] 本发明的研究结果显示：本发明所述的式Ⅰ化合物能明显抑制RAW264.7巨噬细胞炎症介质NO的过量释放，具有抑制巨噬细胞释放NO的活性，说明式Ⅰ化合物具有良好的抗炎作用，可望用于制备抗炎药物，尤其可望用于制备预防和/或治疗骨质增生症的药物，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0033] 图1为本发明
实施例2中式Ⅰ化合物对Raw264.7巨噬细胞存活率的影响示意图，图中，C表示RAW264.7细胞；50表示加入浓度为50UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞，10表示加入浓度为10UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞；
[0034] 图2为本发明实施例2中式Ⅰ化合物对Raw264.7巨噬细胞产生NO的抑制作用示意图，图中，C表示RAW264.7细胞；L表示LPS刺激所造成的炎症模型细胞；P表示加入阳性药小白菊内酯的炎症细胞；50表示加入浓度为50UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞，10表示加入浓度为10UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0036] 实施例1：式Ⅰ化合物的制备：
[0037] a)将百合科植物菝葜的根茎干燥后粉碎，作为原料，取3kg原料，加30L的80v％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取3小时，合并提取液，得粗提液；
[0038] b)将粗提液调至pH为5，过滤；将滤饼干燥后作为提取原料，取500mg提取原料，加5L的乙醇回流提取2次，每次20分钟；合并提取液，减压浓缩后溶于水中，过滤，浓缩，得到菝葜粗提物；
[0039] c)将所得菝葜粗提物用固相萃取柱分离，分别以水和甲醇依次洗脱，对得到的甲醇洗脱部位反向硅胶柱层析，以体积比为20:80～90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，然后经高压液相反相分离，以体积比为20:80～60:40的乙腈-水进行梯度洗脱，即得白色粉末状化合物。
[0040] 经测试分析得到：
[0041] IR(KBr)ν(cm-1):3380,1758,1614,1585,1589；
[0042] UVλmax(MeOH)nm 203(3.29),222(4.12),280(3.58),320(4.38),362(4.27)；
[0043] HR-ESI-MS m/z 535.2327((calcd.536.2410 for[M-H]-)；
[0044] 核磁数据如表1所示：
[0045] 表1式Ⅰ化合物的核磁数据(100MHz；DMSO)(δppm)
[0046]
[0047]
[0048] 根据上述测试结果可以确定，所得化合物具有式Ⅰ所示化学结构。
[0049] 实施例2：式Ⅰ化合物对于RAW 264.7小鼠巨噬细胞释放NO活性的抑制试验[0050] 2.1.RAW 264.7小鼠巨噬细胞的培养：
[0051] RAW 264.7小鼠巨噬细胞购自中国细胞系库(中国北京)，在37℃，5％CO2
培养箱内培养，培养基补充有10％热灭活FBS(胎
牛血清)，2.05mM L-谷氨酰胺，青霉素(100U/mL)和
链霉素(100U/mL)。
[0052] 2.2.样品的配制
[0053] 取式Ⅰ化合物1mg加入1mL蒸馏水加热搅拌制成1mL混悬液，1500r/m离心去除沉淀再用0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用，药液在50℃减压蒸干，重新定溶在细胞培养液中，在加入细胞培养液前亦用0.22μm微孔滤膜滤过。
[0055]
收获在100mm培养皿上生长的细胞RAW264.7并接种于96孔板(2×10 5个细胞/孔)中以产生NO；将板用10或50μM的样品预处理30分钟，并与LPS(脂多糖，1μg/mL)温育24小时；用Griess
试剂通过培养的巨噬细胞RAW264.7上清液中的亚硝酸盐浓度来确定NO的量；通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，Sigma-Aldrich]还原评估细胞活
力，阳性对照为小白菊内酯(英文名：parthenolide)。
[0056] 试验结果如图1和图2所示。
[0057] 图1为本实施例中式Ⅰ化合物对Raw264.7巨噬细胞存活率的影响示意图；图中，C表示RAW264.7细胞；50表示加入浓度为50UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞，10表示加入浓度为10UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞，从图1可见，式Ⅰ化合物对Raw264.7巨噬细胞的增殖无影响，安全无毒。
[0058] 图2为本实施例中式Ⅰ化合物对Raw264.7巨噬细胞产生NO的抑制作用示意图；图中，C表示RAW264.7细胞；L表示LPS刺激所造成的炎症模型细胞；P表示加入阳性药小白菊内酯的炎症细胞；50表示加入浓度为50UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞，10表示加入浓度为10UM的式Ⅰ化合物的炎症细胞，从图2可见，式Ⅰ化合物可有效抑制Raw264.7巨噬细胞产生过量NO，说明式Ⅰ化合物具有抑制巨噬细胞释放No的活性，进而说明式Ⅰ化合物具有显著的抗炎活性。
[0059] 由于现有研究表明：抑制巨噬细胞释放NO，能有效预防或治疗炎症，同时炎症的治疗可能有效预防或治疗骨质增生症，因此，本发明所述的式I化合物可望用于制备抗炎药物，尤其可望用于制备预防和/或治疗骨质增生症的药物。
[0060] 最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
