一种用于肺癌七项标志物检测的蛋白芯片及其制备方法
阅读：1051发布：2020-06-17
专利汇可以提供一种用于肺癌七项标志物检测的蛋白芯片及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于检测 肺 癌七项的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：（1）黑玻片预处理；（2） 抗原 溶液点样；（3）封闭工艺；制得所述蛋白芯片。本发明蛋白芯片用于检测肺癌七项标志物，应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；本 发明人 开发了同时包含有GAGE7 抗体 、MAGE A1抗体、CAGE抗体、P53抗体、PGP9.5抗体、SOX2抗体和GBU4-5抗体共7个自免指标的蛋白芯片 诊断 试剂 盒 ，具有快速，高效，低成本等优点。，下面是一种用于肺癌七项标志物检测的蛋白芯片及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用于肺癌七项标志物检测的蛋白芯片，其特征在于所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：
（1）黑玻片预处理；
（2）抗原溶液点样；
（3）封闭工艺，制得所述蛋白芯片。
2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（1）中所述黑玻片预处理的方法为：
①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16 24h，之后采用纯化水清洗2 8次；
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②将黑玻片置于质量浓度为0.05 1%的硅烷溶液中浸泡20 60min；
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③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100 180℃条件下烘烤0.2 0.6h。
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3.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（2）中所述抗原溶液包括GAGE7抗原、MAGE A1抗原、CAGE抗原、P53抗原、PGP9.5抗原、SOX2抗原和GBU4-5抗原溶液。
4.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（2）中所述点样的方法为机器自动化点样。
5.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（3）中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1 24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯~
片。
6.根据权利要求5所述的蛋白芯片，其特征在于所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或乳清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。
7.一种权利要求1 6任一项所述蛋白芯片的应用，其特征在于将所述蛋白芯片制成试~
剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶的第二抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物。
一种用于肺癌七项标志物检测的蛋白芯片及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 目前，癌症成为了包括中国在内的大多数国家的一个主要公共卫生问题。随着世界人口的增长和老龄化，以及吸烟、肥胖、缺乏体力活动等危险因素的形成，癌症的发生率也在逐年增加，严重威胁着人类健康。据国家癌症中心2018年全国最新癌症报告显示，2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例，按发病例数排位，肺癌位居全国发病首位。在发达国家，肺癌是男性患者的主要死亡原因，并且已经超越了乳腺癌成为了女性患者主要的死亡原因[1]。尽管烟草在中国女性中的普及率较低，但或许更多受到了烹饪油烟的因素影响，使得中国女性的肺癌发病率要高于欧洲国家[2]。其它已知的肺癌相关的危险因素还包括职业暴露和接触环境致癌物，比如石棉、砷、氡多环芳烃等[3]。近期研究显示外界空气[4]的污染也会导致肺癌的发生 。由于大多数患者在肺癌发生的早期无明显的特异性临床症状和体征，未引起足够的重视，当患者出现不适症状时，多数已处于肺癌的晚期阶段，从而错过了手术机会，甚至由于体能状态的因素而无法进行有效的后续治疗。研究数据显示，Ⅰ期肺癌的5年生存率为60％-70％，而Ⅳ期肺癌患者则不到5％[5]。尽管随着医学技术水平的不断发展与进步，应用于肺癌的治疗方法和手段也有了较大改善，肺癌驱动基因的发现和对免疫逃逸机制的研究，使得个体化靶向治疗和免疫治疗的理念深入人心，为部分晚期肺癌患者带来了福音，然而其总体预后并无显著改善，5年总生存率仅为16％-18％[6]。因此，如何进行合理有效、及时的肺癌筛查与诊断对减少肺癌患者的死亡率，提高生存率至关重要。
[0003] 传统的肺癌筛查以低剂量CT为主，但有研究表明LDCT筛查肺癌时的假阳性率可达 30％以上，从而导致了对患者的过度诊治，造成医疗资源的浪费，同时增加了患者的心理和经济负担[1]。血液分子标志物的检测作为一种简便、无创、易于推广的检测方法，在肺癌的诊断中显示出了较高的灵敏度和特异度。肿瘤体液免疫机制的明确和免疫监视概念的提出为自身抗体的研究奠定了基础，研究认为在肿瘤发生发展的过程中可表达少量异常的蛋白，称之为肿瘤相关性抗原(TAAs)，这些TAAs可通过突变、过表达、异常表达、异位表达、转录后修饰、折叠错误、不稳定降解等方式获得免疫原性，从而激活机体免疫系统产生相应的肿瘤相关抗原自身抗体[7]。随着TAAs筛选技术的不断进步，如噬菌体展示技术、蛋白组学分[8-10]
析技术、蛋白芯片技术等，大量的自身抗体在肺癌及其他实体肿瘤中检出 ，目前公开发表的已有2000余种。单一自身抗体检测对肺癌诊断的敏感性欠佳，而多种自身抗体联合检测展示了良好诊断效能[11]。EarlyCDT-Lung是由六种(p53、NY-ESO-1、CAGE GBU4-5、 Anexin1和SOX2)或七种(p53、NY-ESO-1、CAGE GBU4-5、SOX2、HuD和MAGE A4) 自身抗体组成[12]
的抗体谱。Chapman CJ 等采用ELISA 法检测了235例初诊肺癌患者和266 例健康人群血清中两个抗体谱自身抗体水平，结果显示六种自身抗体联合检测诊断肺癌的敏感性39％，特异性为89％，七种自身抗体联合检测诊断肺癌的敏感性为41％，特异性为91％，且对早期肺癌诊断的阳性检出率可达40％。2015年，我国国家食品药品监督管理局批准了七种自身抗体检测试剂盒上市，这七种自身抗体为P53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、 MAGE A1、CAGE的抗体组成的抗体谱。
析技术、蛋白芯片技术等，大量的自身抗体在肺癌及其他实体肿瘤中检出 ，目前公开发表的已有2000余种。单一自身抗体检测对肺癌诊断的敏感性欠佳，而多种自身抗体联合检测展示了良好诊断效能[11]。EarlyCDT-Lung是由六种(p53、NY-ESO-1、CAGE GBU4-5、 Anexin1和SOX2)或七种(p53、NY-ESO-1、CAGE GBU4-5、SOX2、HuD和MAGE A4) 自身抗体组成[12]
的抗体谱。Chapman CJ 等采用ELISA 法检测了235例初诊肺癌患者和266 例健康人群血清中两个抗体谱自身抗体水平，结果显示六种自身抗体联合检测诊断肺癌的敏感性39％，特异性为89％，七种自身抗体联合检测诊断肺癌的敏感性为41％，特异性为91％，且对早期肺癌诊断的阳性检出率可达40％。2015年，我国国家食品药品监督管理局批准了七种自身抗体检测试剂盒上市，这七种自身抗体为P53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、 MAGE A1、CAGE的抗体组成的抗体谱。
[0004] (1)P53(抑癌基因p53)
[0005] P53是最早发现的抑癌基因之一，是含有393个氨基酸的转录因子。P53蛋白能调节细胞周期和避免细胞癌变发生。在许多癌症中，P53基因突变导致的P53蛋白失活是癌症产生的一个重要步骤。P53自身抗体通常针对发生突变的P53基因产物而产生的。血清P53蛋白和P53自身抗体与肿瘤风险增加有关，可以作为恶性肿瘤早期诊断的血清学标记物。
[0006] (2)PGP9.5(神经元胞质白基因产物9.5)
[0007] PGP9.5又称泛素C末端水解链L1，是表达在神经组织中的一种泛素水解酶，该蛋白含有223个氨基酸。PGP9.5在原发性肺癌和肺癌细胞系中有大量表达，但不在正常的肺部组织表达，在原发性非小细胞肺癌中，54％的Ⅰ期和Ⅱ、ⅢA期均有大量PGP9.5表达。
[0008] (3)MAGEA1(黑色素瘤抗原A1)
[0009] MAGEA1属于人黑色素瘤抗原家族。该蛋白含有309个氨基酸。MAGEA1不表达在正常组织中，只表达于恶性肿瘤和睾丸组织，因此称为肿瘤/睾丸抗原。MAGEA1在非小细胞肺癌中表达与较差的预后相关。
[0010] (4)GBU4-5(解旋酶GBU4-5)
[0011] GBU4-5属于ATP结合RNA解旋酶，该蛋白有1177个氨基酸。这些蛋白很可能在癌变过程中发挥重要作用，同时有肿瘤特异性和免疫原性。在控制细胞分化过程中转座子的甲基化和基因表达过程中起抑制作用，在非小细胞肺癌中表达增高。
[0012] (5)CAGE(肿瘤/睾丸抗原CAGE)
[0013] CAGE属于DEAD box解旋酶家族，该蛋白含有631个氨基酸。CAGE不表达在正常的组织，只表达于恶性肿瘤和睾丸组织，因此被称为肿瘤/睾丸抗原。它的表达量与细胞周期有关，它在癌细胞中激活ERK和p38蛋白并增加肿瘤细胞的扩散。
[0014] (6)SOX2(性别决定区Y框蛋白2)
[0015] SOX2是Y染色体上的性别决定区(SRY)家族基因成员之一，是SOX基因族的组成部分(SOX基因族包括SOX1、SOX2和SOX3)，属于B1组，定位于染色体3q26.3～q27上，包含一个外显子，编码由317个氨基酸组成的蛋白质，主要结构包括C-末端、HMG-boxDNA 结合结构域和N-末端，其中起主要作用的是HMG结构域。SOX2通过HMG结构域识别靶基因，结合特定的DNA序列，在早期胚胎的内细胞团、生殖细胞、多能干细胞以及癌细胞中均可表达，能调控组织细胞的增殖、决定细胞分化方向和维持干细胞的全能性，其缺乏会导致胚胎外胚层发育不良，胚胎停育。此外，SOX2还可以癌基因的形式在肿瘤发生和发展中起着重要调控作用。既往研究发现SOX2在胃癌、胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞中异常表达，与恶性肿瘤的发生发展、分化程度、转移及预后等密切相关。
[0016] 肺癌细胞中SOX2基因阳性表达率为48.7％(19/39)，正常肺组织中SOX2基因表达均为阴性，据此推测，SOX2基因的高表达可能与肺癌的发生、发展有关。此外，Bass等发现肺癌组织细胞中染色体3q26.33上SOX2基因存在的位置存在明显的基因扩增，推测SOX2基因可能在维持上皮细胞多向分化和促进肺支气管上皮化生的过程中起重要作用，其机制可能与SOX2在细胞中高表达可使肺支气管上皮细胞失去分化成熟能力，从而促使肺癌的发生。
[0017] (7)GAGE7(G抗原7)
[0018] GAGE7在多种癌症中广泛表达，表明其在肿瘤发生中起作用，高水平的GAGE7表达在鳞状细胞癌中更常见。
[0019] 肺癌七项相关指标检测目前有以下几种方法：酶联免疫法(Elisa)、重组cDNA表达克隆血清肿瘤抗原分析(SEREX)、噬菌体展示技术、血清蛋白组学分析等。
[0020] Elisa在临床应用中最广泛，但是这种方法每次只能检测一个指标，而且灵敏度，重现性等性能都欠佳。比起Elisa，SEREX技术使得可检测的TAA或自身抗体的数量大大增加，但是这种方法只能在细菌中表达，且高敏感度高特异性的基因易被忽略，无法自动化，无法用于大样本研究，因此无法大量使用于临床；为了解决SEREX技术通量低的问题，开发出了噬菌体展示技术，但是除了通量较SEREX技术高外，它的缺点与SEREX技术相同；血清蛋白组学分析技术是2D电泳、蛋白印迹及质谱技术的组合，虽然避免了费时，但存在2D电泳分辨率差，操作繁琐等问题；本发明提供的蛋白芯片方法，可以实现七个指标一次性检测，有效地提高检测效率，实现定量检测、降低检测成本，且灵敏度高、特异性好、全自动化程度高、应用范围广等。
发明内容
[0021] 针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种通过检测自身免疫疾病标志物浓度来诊断肺癌的蛋白芯片及其制备方法。应用本公司独创的蛋白芯片技术可以有效地提高检测效率，降低检测成本；本发明人开发了同时包含有GAGE7抗体、MAGE A1抗体、CAGE 抗体、P53抗体、PGP9.5抗体、SOX2抗体和GBU4-5抗体共7个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。
[0022] 本发明的技术方案如下：
[0023] 一种用于自身免疫疾病标志物检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：
[0024] (1)黑玻片预处理；
[0025] (2)抗原溶液点样；
[0026] (3)封闭工艺，制得所述蛋白芯片。
[0027] 步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为：
[0028] ①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16～24h，之后采用纯化水清洗2～8 次；
[0030] ③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0.2～0.6h。
[0031] 步骤(2)中所述抗体溶液包括GAGE7抗原、MAGE A1抗原、CAGE抗原、P53抗原、 PGP9.5抗原、SOX2抗原和GBU4-5抗原溶液。
[0032] 步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样。
[0033] 步骤(3)中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1～24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。
[0035] 一种所述蛋白芯片的应用，将所述蛋白芯片制成试剂盒。
[0038] 本发明有益的技术效果在于：
[0039] 本发明蛋白芯片用于检测7个重要的肺癌相关自身免疫标志物，应用蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；同时包含有抗GAGE7抗体、抗MAGE A1 抗体、抗CAGE抗体、抗P53抗体、抗PGP9.5抗体、抗SOX2抗体和抗GBU4-5抗体7个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速、高效、低成本等优点。配合本公司的自动化蛋白芯片阅读仪，可以实现自动化检测。由于有效地将7个指标集成在一张芯片中进行检测，只需要一份病人血样就可以实现七个指标的同时快速检测，极大地提高了检测的效率。
[0040] 本发明采用经典的免疫学间接法。在玻璃为载体的芯片基质上固定捕获抗原，这些抗原可以捕获被测样本中特异性的抗体，被捕获的抗体与标记有HRP酶或碱磷酶的第二抗体相结合，形成复合物。清洗去除未结合的第二抗体后，加入对标记物敏感的化学发光底物进行化学发光，其光信号通过CCD摄像头采集，通过光信号的强弱可以判断被测样本中特定标志物抗原的浓度。
[0041] 本试剂盒使用了自身免疫芯片技术平台，优势在于：①由于抗体与本产品抗原结合的特异性高、亲和力强，并且受到其他杂质影响较低，因此，对生物样品的要求非常低，可简化样品的前处理过程；②能够快速高通量、平行化定量分析大量的蛋白质样品；③操作简单，结果正确率高；④病人只需采一份血样，且迅速可以给出监测结果。⑤所需试剂和样品少，价格低廉。附图说明
[0042] 图1为本发明抗体点样示意图；
[0043] 图中，列1：阳性质控列；列2：空白；列3至列9：分别为抗GAGE7抗体、抗MAGE A1抗体、抗CAGE抗体、抗P53抗体、抗PGP9.5抗体、抗SOX2抗体和抗GBU4-5抗体。
具体实施方式
[0044] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
[0045] 实施例1
[0046] 一种用于肺癌标志物检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：
[0047] (1)黑玻片预处理；
[0048] ①将黑玻片置于含有2％NaOH的玻片预处理液中浸泡16h，之后采用纯化水清洗2～8 次；
[0049] ②将黑玻片置于质量浓度为0.05％的硅烷溶液(25％乙醇)中浸泡60min；
[0050] ③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于180℃条件下烘烤0.2h。
[0051] (2)抗原溶液点样；
[0052] 参考图1，采用机器自动化点样GAGE7抗原、MAGE A1抗原、CAGE抗原、P53抗原、 PGP9.5抗原、SOX2抗原和GBU4-5抗原溶液，抗原溶液浓度为0.02mg/mL，每点点样20nL，各抗原点样分布如图1所示。
[0053] (3)封闭工艺；
[0054] 将点样好的黑玻片没入封闭液(内含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液)中10h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。
[0055] (4)试剂盒
[0056] 将所述蛋白芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，pH＝6.0)、检测液A(含1％鲁米诺和2％Tris)和检测液B(1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。
[0057] 实施例2
[0058] 一种用于肺癌标志物检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：
[0059] (1)黑玻片预处理；
[0060] ①将黑玻片置于含有2％NaOH的玻片预处理液中浸泡24h，之后采用纯化水清洗2～8 次；
[0061] ②将黑玻片置于质量浓度为0.5％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡30min；
[0062] ③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于140℃条件下烘烤0.5h。
[0063] (2)抗原溶液点样；
[0064] 参考图1，采用机器自动化点样GAGE7抗原、MAGE A1抗原、CAGE抗原、P53抗原、 PGP9.5抗原、SOX2抗原和GBU4-5抗原溶液，抗原溶液浓度为0.02mg/mL，每点点样20nL，各抗体点样分布如图1所示。。
[0065] (3)封闭工艺；
[0066] 将点样好的黑玻片没入封闭液(内含2％乳清蛋白的PBS缓冲液)中24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。
[0067] (4)试剂盒
[0068] 将所述蛋白芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，pH＝6.0)、检测液A(含1％鲁米诺和2％Tris)和检测液B(含 1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。
[0069] 实施例3
[0070] 一种用于肺癌标志物检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：
[0071] (1)黑玻片预处理；
[0072] ①将黑玻片置于含有2％NaOH的玻片预处理液中浸泡20h，之后采用纯化水清洗2～8 次；
[0073] ②将黑玻片置于质量浓度为1％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20min；
[0074] ③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100℃条件下烘烤0.6h。
[0075] (2)抗原溶液点样；
[0076] 参考图1，采用机器自动化点样GAGE7抗原、MAGE A1抗原、CAGE抗原、P53抗原、 PGP9.5抗原、SOX2抗原和GBU4-5抗原溶液，抗原溶液浓度为0.02mg/mL，每点点样20nL，各抗体点样分布如图1所示。
[0077] (3)封闭工艺；
[0078] 将点样好的黑玻片没入封闭液(内含3％牛血清白蛋白的Tris缓冲液)中8h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。
[0079] (4)试剂盒
[0080] 将所述蛋白芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，pH＝6.0)、检测液A(含含1％鲁米诺和2％Tris)和检测液B (1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。
[0081] 测试例：
[0082] 使用本公司生产的SLXP-001型生物芯片阅读仪对临床血清进行检测，检测结果与杭州某公司生产的七种自身抗体检测试剂盒(Elisa法)进行对比。
[0083] SLXP-001B型生物芯片阅读仪的工作过程如下：
[0084] 仪器自动吸取200ul的稀释后的待测样本(血清稀释100倍)至反应杯中，仪器将本发明实施例制得的蛋白芯片自动地放入待测血清中，37℃孵育40分钟，随后仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液(200ul，仪器自动提前吸好)，再次孵育40分钟后，仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中(由 100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成，由仪器自动吸取和混合)，最后对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果并与参比的Elisa方法进行比较。检测结果如表1，表2所示。
[0085] 表1
[0086]
[0087] 表2
[0088]
[0089] 由上表可见，本发明所提供的试剂盒，同时检测GAGE7抗体、MAGE A1抗体、CAGE 抗体、P53抗体、PGP9.5抗体、SOX2抗体和GBU4-5抗体7个指标，可以获得与单指标试剂盒相似的结果(相对误差多数在5％以内)，在灵敏度，线性范围等方面也没有显著差异。本试剂盒可以有效地替代单指标试剂盒进行多种自身免疫疾病抗体的测定。使用本试剂盒可以实现高效率，简操作，低成本，用时短等多个优点，有助于肺癌的早期诊断。
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