专利汇可以提供一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种缓解罗氏沼虾脂质过 氧 化的Dorsal基因干扰方法,包括以下步骤:(1)根据罗氏沼虾Dorsal基因的核苷酸序列合成序列特异性的dsRNA;(2)调整dsMsDorsal的浓度,按4μg/g虾的剂量注射,控制注射体积在30μL以内,(3)检测dsMsDorsal对组织损伤、细胞凋亡和基因表达的影响。本发明针对罗氏沼虾Dorsal基因设计的dsMsDorsal能快捷、高效、特异性地抑制罗氏沼虾 摄食 饲料 脂肪酸 不平衡 、脂肪酸氧化等原因导致的脂质过氧化,实现罗氏沼虾健康、高效养殖。,下面是一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法专利的具体信息内容。
1.一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,包括以下步骤:
①根据罗氏沼虾Dorsal基因的核苷酸序列,合成序列特异性的dsMsDorsal,具体包括如下步骤:
(1)cDNA的制备
取罗氏沼虾肝胰腺,用Trizol法提取Total RNA,提取后Total RNA的用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并利用Nano Drop紫外分光光度计测定RNA浓度,浓度达标的RNA借助试剂盒进行反转录成cDNA,并保存于-20℃备用;
(2)引物的设计
利用http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl网页端设计dsRNA引物,引物设计时,在每对引物的5’端都加上一段T7启动子序列,获得引物序列如下:
正义链
TAATACGACTCACTATAGGGCAAGTGTTCCTCGAAGGCTC,
反义链
TAATACGACTCACTATAGGGAACTTCACCAATTTGTCCGC;
(3)cDNA的扩增
以cDNA为模板,借助试剂盒进行扩增,扩增步骤为: 94℃ 5min → [94℃ 30s → 53℃ 45s → 72℃ 1min]×35 cycle → 72℃ 10min,利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的质量,条带清晰且无杂带视为合格,将合格的目标条带进行切胶回收并进行纯化;
(4)dsRNA的转录及合成
按照转录试剂盒说明书要求转录合成dsRNA,其中,TranscriptAid Enzyme Mix 和核苷酸置于冰上,5× TranscriptAid Reaction Buffer 置于室温,将反应液缓慢混匀,转录在PCR仪上进行,反应条件为37℃ 2 h,所得的转录产物进行后续的纯化;
(5)dsRNA的纯化
a) 向上述反应液中加入2μL DNase I,RNase free,混合均匀,在37℃条件下静置
15min;
b) 加入2μL 0.5 M EDTA,调制反应液pH至8.0;在65℃条件下静置10min;
c) 向上述反应液中加入150μL的DEPC水和15μL 3M醋酸钠,充分混匀,其中醋酸钠溶液的pH为5.2;
d) 加入150μL的比例为1:1的苯酚/氯仿混合物,充分混匀后离心,将上层水相转移至新离心管中;
e) 向新离心管中加入150μL的氯仿,充分混匀后离心,将上层水相转移至新的离心管中;
f) 向新离心管中加入两倍体积的乙醇,-20℃冰却至少30 min,4℃离心20 min,弃上清;
g) 向上述沉淀中加入500μL的70%冷乙醇漂洗,13000 rpm,4℃离心5min,弃上清后干燥,其中70%冷乙醇采用DEPC水配制;
h) 加入20μLDEPC水溶解沉淀,制成dsMsDorsal溶液,-20℃保存备用;
②调整合成后的dsMsDorsal浓度,按2~4μg/g虾的剂量进行围心腔注射;
③检测dsMsDorsal对抗氧化酶活性、组织损伤、细胞凋亡和基因表达的影响,结果表明缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法可有效缓解生产上由脂质过氧化所导致的罗氏沼虾生长抑制和肝胰腺损伤。
2.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述步骤(1)中RNA浓度达标标准为≥200 ng/μL,即RNA浓度在200 ng/μL以上均可使用,反转录试剂盒型号为Takara Primer Script II 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒。
3.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述步骤(2)中T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGG。
4.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述步骤(3)中cDNA扩增采用的试剂盒型号为Takara PrimeSTAR HS DNA Ploymetase试剂盒,Code No. R010A,切胶纯化使用的试剂盒型号为Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒,Code No. 9762。
5.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述步骤(4)中dsRNA转录试剂盒型号为Thermo Scientific TranscriptAidTM T7 High Yield Transcription kit # K0441,对于≤100 nt的转录本,PCR仪的反应时间延长至4~8 h。
6.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述步骤②中dsMsDorsal的注射体积控制在30μL以内,根据养殖周期每1~2周注射一次。
7.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述Dorsal基因核苷酸序列编号为GenBank: KX219631.1。
8.根据权利要求1所述的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,其特征在于,所述dsMsDorsal的注射浓度为4μg/g。
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