用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法
阅读：1028发布：2020-07-15
专利汇可以提供用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于核酸提取的裂解液、核酸提取 试剂 盒 及核酸提取方法。本发明的核酸提取裂解液包括0.5～2M钠盐、2～5M胍盐、1～5mM 金属离子 络合剂、0.25％～1％非离子 表面活性剂 和1％～3％PEG，其中，所述PEG的分子量为6000～10000Da，优选为8000Da。本发明的裂解液配比合理，能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，使得细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度和纯度更高的核酸，有利于提高核酸的 质量 和提取效率；并且本发明的裂解液和试剂盒在整个核酸提取过程中不需要借助蛋白酶K进行 蛋白质 的消化去除，以及不使用醇类沉淀核酸，获得的核酸纯度高， 片段 完整。，下面是用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法专利的具体信息内容。
1.一种核酸提取裂解液，其特征在于，所述裂解液包括0.5～2M钠盐、2～5M胍盐、1～
5mM金属离子络合剂、0.25％～1％非离子表面活性剂和1％～3％PEG。
2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述PEG的分子量为6000～10000Da。
3.根据权利要求2所述的裂解液，其特征在于，所述PEG的分子量为8000Da。
4.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述钠盐为醋酸钠，所述胍盐为盐酸胍，所述金属离子络合剂为EDTA，所述非离子表面活性剂为TritonX-100。
5.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4之一所述的裂解液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一洗涤缓冲液，所述第一洗涤缓冲液包括15～30mM Tris-base，10～20mM EDTA，150～200mM氯化钠和50～
60％无水乙醇，pH＝9.6。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二洗涤缓冲液，所述第二洗涤缓冲液包括75％无水乙醇。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括DEPC处理过的超纯水溶液。
9.如权利要求1～4任一项所述的裂解液、权利要求5～8任一项所述的核酸提取试剂盒在用于提取生物样品中的核酸中的应用。
10.一种核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将核酸提取裂解液、核酸吸附物和生物样品混合并反应，得到吸附有核酸的所述吸附物，其中，所述裂解液包括0.5～2M钠盐、2～5M胍盐、1～5mM金属离子络合剂、0.25％～
1％非离子表面活性剂和1％～3％PEG；
2)采用洗涤缓冲液清洗吸附有核酸的所述核酸吸附物，所述洗涤缓冲液包括第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液，其中，所述第一洗涤缓冲液包括15～30mM Tris-base，10～20mM EDTA，150～200mM氯化钠和50～60％无水乙醇，pH＝9.6；所述第二洗涤缓冲液包括75％无水乙醇；
3)采用洗脱液处理吸附有核酸的所述核酸吸附物，让核酸与所述核酸吸附物分离，得到所述核酸，其中，所述洗脱液包括DEPC处理过的超纯水溶液。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述核酸吸附物为磁珠。
12.PEG8000在制备用于提取核酸的裂解液中的用途，其特征在于，所述PEG8000用于与所述核酸的至少一部分结合，其中，所述裂解液不含乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇。
用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法
技术领域
[0001] 本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法。
背景技术
[0002] 核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命必不可少的组成物质，广泛存在于动植物细胞、微生物体内，分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。目前，在分子生物学科的各个研究检测领域都离不开核酸的检测，核酸的提取纯化是分子生物学研究和临床检测的基础。
[0003] 现有的核酸提取方法主要包括碱裂解法、酚氯仿抽提法、螯合树脂法、离心柱膜吸附法以及磁珠法等。其中，碱裂解法等由于在提取过程中使用了有毒有害的有机溶剂，具有核酸质量不佳、操作步骤繁琐、耗时较长的缺陷。相较于其他方法，磁珠法操作更为简便，适用于多种样品类型，并且对样品要求较低。表面经过修饰的纳米磁珠，能够在高盐低PH的溶液环境中对核酸进行特异性的吸附，在外部磁场和洗涤液的作用下将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开，再通过改变溶液的pH值将磁珠与核酸进行分离，即可获得高质量的核酸；并且利用磁珠法进行核酸的提取纯化还能配合自动化核酸提取仪器进行，使得核酸的提取实现自动化、高通量化。
[0004] 现有的利用磁珠进行核酸提取的方法虽然取得了进步，但仍存在较多缺陷。首先，磁珠法提取核酸普遍使用的裂解液中通常含有蛋白酶K，需要借助蛋白酶K对生物样本中的蛋白质进行消化，尤其对于全血类样本，必须要加蛋白酶K才能保证能够提取得到高质量的核酸，蛋白酶K容易残留，提取时间较长，并且提取过程还需进行加热。其次，现有技术的核酸提取操作中，往往将样本的裂解和磁珠与DNA的结合分步进行，相对应的试剂盒往往包括独立分装的裂解液和结合液，这不仅使得核酸提取过程复杂，而且很大程度上增加了核酸污染的机率，不利于后续的检测以及检测的准确性。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法，以期实现快速，高效，安全的提取生物样品中的核酸。
[0006] 作为本发明的第一方面，本发明提供了一种核酸提取裂解液。
[0008] 其中，所述钠盐能够给溶液环境提供钠离子，促使带负电的核酸能与核酸吸附物特异性的结合在一起，并且钠盐能够改变生物样品的渗透压，以使生物样品更容易裂解，所述钠盐可以为醋酸钠、氯化钠、碘化钠等；所述胍盐是一种强蛋白质变性剂，采用胍盐来裂解细胞，能使核酸从蛋白质中释放出来；所述PEG能够选择性的沉淀核酸，使得核酸在溶液中集聚，更利于核酸核酸吸附物对核酸的吸附作用。
[0009] 在本发明中，核酸吸附物是指能够将核酸特异性地吸附在其表面，并在特定的条件下能够特异性地与核酸相分离的物质。在一些优选的方式中，所述核酸吸附物为磁珠。在另一些优选的方式中，所述核酸吸附物为吸附膜，例如硅胶吸附膜。
[0010] 作为优选，所述PEG的分子量为6000～10000Da。
[0011] 作为优选，所述PEG的分子量为8000Da。
[0012] 作为优选，所述钠盐为醋酸钠，所述胍盐为盐酸胍，所述金属离子络合剂为EDTA，所述非离子表面活性剂为TritonX-100。
[0013] 盐酸胍不仅能够快速的破坏细胞膜，还能够变性蛋白质，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕；EDTA即乙二胺四乙酸，其能够与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合，而减少金属离子对核酸质量的影响；TritonX-100即聚乙二醇辛基苯基醚-100，能够溶解脂质以增加细胞膜的通透性。
[0014] 作为优选，所述裂解液的pH值为7.0～7.5。
[0015] 作为优选，所述裂解液的pH值为7.4。
[0016] 作为本发明的第二方面，本发明提供一种核酸提取试剂盒。
[0017] 作为优选，所述试剂盒包括如上所述的裂解液。
[0018] 作为优选，所述裂解液包括0.5～2M钠盐、2～5M胍盐、1～5mM金属离子络合剂、0.25％～1％非离子表面活性剂和1％～3％PEG。
[0019] 作为优选，所述PEG的分子量为6000～10000Da。
[0020] 作为优选，所述PEG的分子量为8000Da。
[0021] 作为优选，所述钠盐为醋酸钠，所述胍盐为盐酸胍，所述金属离子络合剂为EDTA，所述非离子表面活性剂为TritonX-100。
[0022] 作为优选，所述裂解液的pH值为7.0～7.5。
[0023] 作为优选，所述裂解液的pH值为7.4。
[0024] 作为优选，所述试剂盒还包括第一洗涤缓冲液，所述第一洗涤缓冲液包括15～30mM Tris-base，10～20mM EDTA，150～200mM氯化钠和50～60％无水乙醇，pH＝9.6。其中，Tris-base能够维持待提取样品裂解后释放的核酸的稳定性，以避免核酸的降解，提高核酸的浓度和纯度；所述无水乙醇能够使DNA在溶液中呈不融解状态，并能够增强核酸吸附物对核酸的吸附，保证核酸不溶解到水中；所述氯化钠和EDTA能够除去核酸表面的多余的蛋白质，并使核酸保持稳定。
[0025] 作为优选，所述试剂盒还包括第二洗涤缓冲液，所述第二洗涤缓冲液包括75％无水乙醇。其中，所述75％的无水乙醇能够充分的解离核酸表面的盐离子以及杂质。
[0026] 作为优选，所述试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括DEPC处理过的超纯水溶液。所述DEPC处理过的超纯水溶液不含醇类物质，能够很好保护核酸不被降解。
[0027] 需要说明的是，洗脱液不限于DEPC处理过的超纯水溶液，还可以为其他洗脱液，只要能够将核酸从核酸吸附物上洗脱下即可
[0028] 作为优选，所述试剂盒还包括核酸吸附物，该核酸吸附物能够特异性地吸附生物样品裂解后所释放的核酸，并且能够借助外力将核酸与生物样品的其他物质或生物样品裂解后所释放的其他物质进行分离。
[0029] 作为优选，所述核酸吸附物为磁珠或吸附膜；当吸附物为磁珠时，可以将裂解后的生物样品与磁珠混合而使核酸吸附到磁珠上，再通过磁力将携带核酸的磁珠从裂解后的生物样品中分离出；当吸附物为吸附膜时，以将裂解后的生物样品与吸附膜混合而使核酸吸附到吸附膜上，再通过外力，例如给与吸附膜一定压力将携带核酸的吸附膜与裂解后的生物样品分离。
[0030] 作为优选，所述磁珠为直径100～500nm超顺羟基纳米磁性，所述吸附膜为硅胶吸附膜。
[0031] 作为优选，所述磁珠的直径为200nm。
[0032] 示例性地，当所述核酸吸附物为磁珠时，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
[0033] (1)向裂解液中加入一定量的生物样本和磁珠，样本细胞在裂解液的作用下破碎，释放核酸，让核酸与蛋白质分离并且聚集，同时特异性地与磁珠相结合，在外部磁场作用下，将磁珠与含有生物样本碎片的裂解液分离；
[0034] (2)向吸附有核酸的磁珠中加入第一洗涤缓冲液进行洗涤，以除去核酸表面多余的蛋白质，在外部磁场作用下，将磁珠与第一洗涤缓冲液分离；
[0035] (3)向吸附有核酸的磁珠中加入第二洗涤缓冲液进行洗涤，以除去核酸表面的盐离子，在外部磁场作用下，将纳米磁珠与第二洗涤缓冲液分离；
[0036] (4)向洗涤后的吸附有核酸的磁珠中加入洗脱液，让核酸与磁珠分离，回收溶液，即得核酸。
[0037] 作为本发明的第三方面，本发明提供了如上所述的裂解液在用于提取生物样品中的核酸中的应用。
[0038] 作为本发明的第四方面，本发明提供了如上所述的核酸提取试剂盒在用于提取生物样品中的核酸中的应用。
[0039] 在本发明的一个实施例中，生物样品包括细胞、全血、动物组织均浆液、血清、血浆、组织提取液、拭子、尿液、体液、病毒、支原体和衣原体。需要说明的是，生物样品不限于上述指出的样品，还可以为其他含有核酸的待提取的样品。
[0040] 作为本发明的第五方面，本发明提供了一种核酸提取方法。
[0041] 作为优选，所述方法包括如下步骤：
[0042] 1)将核酸提取裂解液、核酸吸附物和生物样品混合并反应，得到吸附有核酸的所述吸附物，其中，所述裂解液包括0.5～2M钠盐、2～5M胍盐、1～5mM金属离子络合剂、0.25％～1％非离子表面活性剂和1％～3％PEG；
[0043] 2)采用洗涤缓冲液清洗吸附有核酸的所述核酸吸附物，所述洗涤缓冲液包括第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液，其中，所述第一洗涤缓冲液包括15～30mM Tris-base，10～20mM EDTA，150～200mM氯化钠和50～60％无水乙醇，pH＝9.6；所述第二洗涤缓冲液包括
75％无水乙醇；
75％无水乙醇；
[0044] 3)采用洗脱液处理吸附有核酸的所述核酸吸附物，让核酸与所述核酸吸附物分离，得到所述核酸，其中，所述洗脱液包括DEPC处理过的超纯水溶液。
[0045] 作为优选，所述核酸吸附物为磁珠。
[0046] 作为本发明的第六方面，本发明提供了PEG8000在制备用于提取核酸的裂解液中的用途。
[0047] 作为优选，所述PEG8000用于与所述核酸的至少一部分结合，其中，所述裂解液不含乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇。
[0048] 所述PEG8000用于与所述核酸的至少一部分结合是指所述PEG8000能够与生物样品裂解后所释放的部分核酸或全部核酸结合，导致该部分核酸或全部核酸沉淀，便于核酸吸附物对核酸的捕获，并且能够促进核酸与核酸吸附物之间的疏水性作用，使核酸与核酸吸附物的结合更加牢靠。
[0049] 进一步地，所述裂解液中不含用于沉淀核酸的醇类，例如乙醇、甲醇、丙醇和/或异丙醇，而利用PEG8000代替醇类作为核酸沉淀试剂。一方面，醇类对核酸的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子以及一些盐类在醇的浓度达到一定水平后都可能被同步沉淀下来，导致所提取的核酸纯度不够；另一方面，就核酸而言，醇沉淀要求有某一比例的醇用量，体系中醇的含量会影响沉淀效果以及核酸得率。在本发明中，PEG8000为易溶于水的固体粉末，而构成本发明裂解液的其他试剂均为溶于水的试剂，使得本发明的裂解液在配置时能够最大限度的使用水溶液进行溶解，不用考虑裂解液中醇类物质的体积，使得本发明的裂解液质量稳定，避免了在储存过程中发生醇类挥发而影响效果。
[0050] 本发明的有益效果：
[0051] (1)本发明的裂解液配比合理，能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，使得细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度和纯度更高的核酸，有利于提高核酸的质量和提取效率，保证后续操作的准确性。
[0052] (2)本发明的裂解液和试剂盒在整个核酸提取过程中不需要借助蛋白酶K进行蛋白质的消化去除，以及不使用醇类沉淀核酸，获得的核酸纯度高，片段完整；并且裂解生物样本不需要进行加热，降低了实验设备要求。
[0053] (3)本发明的试剂盒实现了样品裂解和核酸结合的同步进行，与现有的试剂盒相比降低了试剂成本，并且使用更加便捷；此外，所有试剂均可常温保存与运输，方便了试剂盒的保存和运输。
[0054] (4)本发明核酸提取方法步骤简单，用时较短，配合仪器能够实现核酸提取的自动化和高通量化，提取32个样本时间只需要15-20min；并且提取过程中使用的所有试剂均为无毒无害的，对实验操作人员进行了有效的保护。附图说明
[0055] 图1是使用本发明试剂盒以及Takara试剂盒对非洲猪瘟病毒全血样本进行核酸提取后进行PCR检测得到的曲线图。
[0056] 图2是使用本发明试剂盒以及Takara试剂盒对HCV RNA进行核酸提取后进行PCR检测得到的曲线图。
具体实施方式
[0057] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0058] 在本发明的实施例中，裂解液中所包括的PEG的量为质量百分含量，TritonX-100的量为体积百分含量；第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液中所包括的无水乙醇的量为体积百分含量。本发明的实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
[0059] 实施例1
[0060] 本实施例以申请人所采集的正常人来源的唾液为样品，提取样品中的核酸。本实施例的核酸提取过程如下：
[0061] 1、取样本100μL加入离心管中，向离心管中加入400μL的裂解液，以及粒径为200nm的超顺羟基纳米磁性，室温混匀4min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸去上清液；其中，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG8000 1％，所述裂解液pH＝7.4；
[0062] 2、向离心管中加入500μL第一洗涤缓冲液，洗涤混匀1min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸去上清液；其中，所述第一洗涤缓冲液的组成成分为：Tris-base 15mM，EDTA 10mM，氯化钠150mM，无水乙醇50％，pH＝9.6；
[0063] 3、向离心管中加入500μL第二洗涤缓冲液，洗涤混匀1min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸去上清液；然后开盖凉干1min；其中所述第二洗涤缓冲液的组成成分为75％无水乙醇；
[0064] 4、向离心管中加入60μL洗脱液，混匀5min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸取上清液到干净的离心管子中，即得核酸；其中，所述洗脱液为DEPC处理过的超纯水溶液。
[0065] 实施例2
[0066] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠1M，EDTA 3mM，盐酸胍4M，TritonX-100 0.5％，PEG8000 2％，所述裂解液pH＝7.0。
[0067] 实施例3
[0068] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠2M，EDTA 5mM，盐酸胍5M，TritonX-100 1％，PEG8000 3％，所述裂解液pH＝7.5。
[0069] 实施例4
[0070] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG6000 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0071] 实施例5
[0072] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG10000 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0073] 实施例6
[0074] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG12000 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0075] 实施例7
[0076] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG4000 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0077] 实施例8
[0078] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG800 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0079] 实施例9
[0080] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG200 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0081] 实施例10
[0082] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：氯化钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG8000 1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0083] 实施例11
[0084] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，乙醇1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0085] 实施例12
[0086] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，异丙醇1％，所述裂解液pH＝7.4。
[0087] 实施例13
[0088] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 1mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，所述裂解液pH＝7.4。
[0089] 实施例14
[0090] 本实施例中，所采用的样品、核酸提取过程、裂解液、第二洗涤缓冲液、洗脱液的组成同实施例1，不同的是，所述的第一洗涤缓冲液组成成分为：Tris-base 30mM，EDTA 20mM，氯化钠200mM，无水乙醇60％，pH＝9.6。
[0091] 不同上述实施例1～14所提取的核酸的测试：
[0092] 采用nanodrop分光光度仪测定实施例1～14的核酸的浓度和纯度，其中，核酸纯度为A260与A280的比值，A260表示核酸在波长为260nm下的吸光值，A280表示核酸在波长为280nm下的吸光值，实验结果如下所示：
[0093] 表1不同实施例所提取的核酸的浓度和纯度测定结果
[0094]实验组 浓度(ng/μL) 纯度
实施例1 89.6 1.87
实施例2 90.3 1.85
实施例3 87.9 1.88
实施例4 80.7 1.81
实施例5 82.5 1.80
实施例6 68.9 1.64
实施例7 71.5 1.72
实施例8 69.6 1.61
实施例9 67.3 1.59
实施例10 76.5 1.77
实施例11 56.7 1.48
实施例12 59.1 1.52
实施例13 55.0 1.43
实施例14 87.1 1.82
实施例1 89.6 1.87
实施例2 90.3 1.85
实施例3 87.9 1.88
实施例4 80.7 1.81
实施例5 82.5 1.80
实施例6 68.9 1.64
实施例7 71.5 1.72
实施例8 69.6 1.61
实施例9 67.3 1.59
实施例10 76.5 1.77
实施例11 56.7 1.48
实施例12 59.1 1.52
实施例13 55.0 1.43
实施例14 87.1 1.82
[0095] 从实施例1～9的结果可以看出，所含有的PEG的分子量在6000～10000的裂解液所提取的核酸的浓度和纯度显著高于PEG12000、PEG4000、PEG800和PEG200，其中含PEG8000的裂解液的效果最好，说明特定分子量的PEG有助于核酸沉淀，有利于磁珠对核酸的捕获。
[0096] 从实施例1、实施例11和实施例12的结果可以看出，本发明的裂解液相较于以醇类作为沉淀剂的裂解液所提取的核酸的浓度和纯度更高。
[0097] 从实施例1和实施例13的结果可以看出，在裂解液中加入PEG8000后所提取的核酸的浓度和纯度显著提高，说明本发明的裂解液能够特异性强地获得样本中的目的核酸。
[0098] 综上所述，采用本发明的裂解液所提取的核酸的浓度和纯度较高，纯度均大于1.8，说明本发明的裂解液能够提取得到质量较高的核酸。虽然PEG能够沉淀核酸，而本发明通过上述实验发现，只有含有PEG分子量为6000～10000的裂解液有利于获得浓度和纯度均相对较高的核酸。
[0099] 实施例15
[0100] 本实施例以非洲猪瘟病毒全血样本作为样品，分别采用本发明试剂盒及市售TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0进行核酸提取，本发明试剂盒实验过程如下：
[0101] 1、取非洲猪瘟病毒全血样本100μL加入离心管中，向离心管中加入400μL的裂解液，以及粒径为200nm的超顺羟基纳米磁性，室温混匀4min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸去上清液；其中，所述裂解液的组成成分为：醋酸钠0.5M，EDTA 5mM，盐酸胍2M，TritonX-100 0.25％，PEG8000 1％，所述裂解液pH＝7.4；
[0102] 2、向离心管中加入500μL第一洗涤缓冲液，洗涤混匀1min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸去上清液；其中，所述第一洗涤缓冲液的组成成分为：Tris-base 15mM，EDTA 10mM，氯化钠150mM，无水乙醇60％，pH＝9.6；
[0103] 3、向离心管中加入500μL第二洗涤缓冲液，洗涤混匀1min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸去上清液；然后开盖凉干1min；其中所述第二洗涤缓冲液的组成成分为75％无水乙醇；
[0104] 4、向离心管中加入60μL洗脱液，混匀5min，将离心管置于磁力架上，磁吸20s，吸取上清液到干净的离心管子中，即得核酸；其中，所述洗脱液为DEPC处理过的超纯水溶液。
[0105] 对照组采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，提取过程如上所述，样本量为200μL，洗脱液体积为50μL。
[0106] 提取结束后，分别取所提取的核酸2μL进行荧光定量PCR实验。实验结果如下如图1和表2所示：
[0107] 表2非洲猪瘟病毒全血样本检测的平均CT值
[0108]
[0109] 从实验结果可以看出，与对照组相比，本发明的试剂盒的提取效率更高。
[0110] 实施例16
[0111] 本实施例以提取HCV RNA为例，分别使用本发明的试剂盒和TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，配合BFEX-32核酸提取仪进行核酸提取，提取步骤程序如下：
[0112] 表3 BFEX-32核酸提取仪提取程序
[0113]
[0114] 提取结束后，分别取HCV核酸2μL进行荧光定量PCR实验，实验结果如图2和表4所示例：
[0115] 表4 HCV RNA检测的平均CT值
[0116]
[0117] 从实验结果可以看出，与对照组相比，本发明的试剂盒的提取效率更高。
[0118] 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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