GmXTH91蛋白在调控植物抗逆性和株高中的应用
阅读：3发布：2020-07-10
专利汇可以提供GmXTH91蛋白在调控植物抗逆性和株高中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了GmXTH91蛋白在调控 植物 抗逆性和株高中的应用，GmXTH91蛋白的 氨 基酸序列如SEQ ID No：1所示。实验证明，在野生型拟南芥中表达GmXTH91基因可以降低拟南芥的抗旱性，抗旱性降低表现为 种子 萌发率降低和根长减小；在东农50中表达GmXTH91基因可以降低大豆的抗旱性，抗旱性降低表现为种子萌发率降低。GmXTH91蛋白可以调控植物的抗旱性和/或株高。本发明具有重要的应用价值。，下面是GmXTH91蛋白在调控植物抗逆性和株高中的应用专利的具体信息内容。
1.GmXTH91蛋白的应用，为S1)或S2)或S3)或S4)：
S1)调控植物抗逆性；
S2)培育抗逆性改变的转基因植物；
S3)调控植物株高；
S4)培育株高改变的转基因植物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GmXTH91蛋白为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID No：1所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID No：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID No：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性和/或株高相关的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述GmXTH91蛋白的核酸分子的应用，为S1)或S2)或S3)或S4)：
S1)调控植物抗逆性；
S2)培育抗逆性改变的转基因植物；
S3)调控植物株高；
S4)培育株高改变的转基因植物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码GmXTH91蛋白的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQ ID No：3所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID No：3所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列是SEQ ID No：2所示的DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求
1或2中所述GmXTH91蛋白的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述GmXTH91蛋白的DNA分子。
5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：
所述调控植物抗逆性为降低植物抗逆性；
所述培育抗逆性改变的转基因植物为培育抗逆性降低的转基因植物；
所述调控植物株高为增加植物株高；
培育株高改变的转基因植物为培育株高增加的转基因植物。
6.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中权利要求1或2中所述GmXTH91蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性降低和/或株高增加。
7.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述“提高出发植物中所述GmXTH91蛋白的表达量和/或活性”通过向出发植物中导入编码所述GmXTH91蛋白的核酸分子实现。
8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1或2所述GmXTH91蛋白的含量和/或活性，从而降低抗逆性和/或增加株高。
9.如权利要求1至5任一所述的应用或权利要求6至8任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
10.如权利要求1、2、3、4、5或9所述的应用或权利要求6至9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；
c4)大豆；c5)大豆品种东农50；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。
GmXTH91蛋白在调控植物抗逆性和株高中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。
[0003] 在干旱、高盐和养分缺乏等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。
[0004] 干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，从而提高植物品种的抗逆性，成为植物遗传研究及植物品种改良的重要任务之一。
[0005] 作物株高是重要农艺性状。具有矮生性状的作物茎秆的抗倒伏能力强，群体利用光能的效率高。通过塑造理想株型的矮秆品种，并进行合理密植，有望突破国内大豆的单产水平。大豆的株高一般由品种自身所决定，有时还会受到栽培条件等因素的影响。
发明内容
[0006] 本发明的目的是调控植物的抗逆性(如抗旱性)和/或株高。
[0007] 本发明首先保护GmXTH91蛋白的应用，可为S1)或S2)或S3)或S4)：
[0008] S1)调控植物抗逆性；
[0009] S2)培育抗逆性改变的转基因植物；
[0010] S3)调控植物株高；
[0011] S4)培育株高改变的转基因植物。
[0012] 上述应用中，所述GmXTH91蛋白可为a1)或a2)或a3)：
[0014] a2)在SEQ ID No：1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0015] a3)将SEQ ID No：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆性和/或株高相关的蛋白质。
[0016] 其中，SEQ ID No：1由316个氨基酸残基组成。
[0017] 为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No：1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0018] 表1.标签的序列
[0019] 标签 残基 序列Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0020] 上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0021] 上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0022] 上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No：3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0023] 本发明还保护编码所述GmXTH91蛋白的核酸分子的应用，可为S1)或S2)或S3)或S4)：
[0024] S1)调控植物抗逆性；
[0025] S2)培育抗逆性改变的转基因植物；
[0026] S3)调控植物株高；
[0027] S4)培育株高改变的转基因植物。
[0028] 上述应用中，所述编码GmXTH91蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
[0029] b1)编码区是SEQ ID No：3所示的DNA分子；
[0030] b2)核苷酸序列是SEQ ID No：3所示的DNA分子；
[0031] b3)核苷酸序列是SEQ ID No：2所示的DNA分子；
[0032] b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GmXTH91蛋白的DNA分子；
[0033] b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GmXTH91蛋白的DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 其中，SEQ ID No：3由951个核苷酸组成，SEQ ID No：3的核苷酸编码SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。
[0036] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述GmXTH91蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述GmXTH91蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述GmXTH91蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0037] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成的GmXTH91蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0038] 上述任一所述的应用中，所述调控植物抗逆性可为降低植物抗逆性。
[0039] 上述任一所述的应用中，所述培育抗逆性改变的转基因植物可为培育抗逆性降低的转基因植物。
[0040] 上述任一所述的应用中，所述调控植物株高可为增加植物株高。
[0041] 上述任一所述的应用中，培育株高改变的转基因植物可为培育株高增加的转基因植物。
[0042] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述GmXTH91蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性降低和/或株高增加。
[0043] 上述方法中，所述“提高出发植物中所述GmXTH91蛋白的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中上述任一所述GmXTH91蛋白的表达量和/或活性的效果。
[0044] 上述方法中，所述“提高出发植物中所述GmXTH91蛋白的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入编码所述GmXTH91蛋白的核酸分子实现。
[0045] 上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述GmXTH91蛋白的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述GmXTH91蛋白的核酸分子，得到的重组质粒。
[0046] 所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91。所述重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91具体可为将pCAMBIA3300表达载体的限制性内切酶XbaI和BamHI识别序列之间的DNA小片段替换为SEQ ID No：2所示的DNA分子，得到的重组质粒。
[0047] 所述转基因植物具体可为实施例2提及的C1、C7和C9。此时出发植物为拟南芥，具体为野生型拟南芥Columbia-0亚型。
[0048] 所述转基因植物具体可为实施例3提及的OE#15、OE#25和OE#45。此时出发植物为大豆，具体为东农50。
[0049] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述GmXTH91蛋白的含量和/或活性，从而降低抗逆性和/或增加株高。
[0050] 上述任一所述抗逆性可为抗旱性。
[0052] 上述任一所述降低抗逆性可表现为种子萌发率降低(出发植物为大豆)。
[0053] 上述任一所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)大豆；c5)大豆品种东农50；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。
[0054] 实验证明，在野生型拟南芥中表达GmXTH91基因可以降低拟南芥的抗旱性，抗旱性降低表现为种子萌发率降低和根长减小；在东农50中表达GmXTH91基因可以降低大豆的抗旱性，抗旱性降低表现为种子萌发率降低。GmXTH91蛋白可以调控植物的抗逆性(如抗旱性)和/或株高。本发明具有重要的应用价值。附图说明
[0055] 图1为实施例2步骤五中BGmXTH91基因对拟南芥抗旱性的影响。
[0056] 图2为实施例2中步骤六GmXTH91基因对拟南芥株高的影响。
[0057] 图3为实时荧光定量检测T3代纯合转GmXTH91基因大豆不同株系中GmXTH91基因的表达量。
[0058] 图4为T3代纯合转GmXTH91基因大豆不同株系的蛋白水平检测结果。
[0059] 图5为实施例3中步骤六培养至24h种子的萌发状态。
[0060] 图6为实施例3中步骤六培养至48h种子的萌发状态。
[0061] 图7为实施例3中步骤六培养至72h种子的萌发状态。
具体实施方式
[0062] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0063] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0064] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0065] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0066] 野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.在下文中，野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。
[0067] pGM-T克隆载体、pCAMBIA3300表达载体、根癌农杆菌EHA105、大豆品种Charleston、东农594和东农50均由东北农业大学大豆科学研究所提供。在下文中，大豆品种Charleston简称Charleston，东农594简称DN594，东农50简称DN50。
[0068] 植物RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司的产品。DNA Marker为上海华舜生物技术有限公司的产品。
[0069] 实施例1、GmXTH91基因的克隆
[0070] 1、以CharlestonV1时期叶片的基因组DNA为模板，采用引物GmXTH91-F：5’-GCTCTAGAGCGTTAGAAAGTGAGAAGCCAAAT-3’(下划线为限制性内切酶XbaI的识别位点)和GmXTH91-R：5’-CGGGATCCCGATTTTACACCTGACCTTTGAA-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，回收约2457bp的DNA片段。
[0071] 2、将步骤1回收的DNA片段和pGM-T克隆载体连接，得到重组质粒pGM-T-GmXTH91。
[0072] 将重组质粒pGMT-GmXTH91进行测序。测序结果表明，重组质粒pGM-T-GmXTH91中含有SEQ ID No：2所示的DNA分子。SEQ ID No：2所示的DNA分子即GmXTH91基因的基因组序列。
[0073] GmXTH91基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，编码SEQ ID No：1所示的GmXTH91蛋白。
[0074] 实施例2、转GmXTH91基因拟南芥的获得及GmXTH91基因对抗旱性和株高的影响[0075] 拟南芥的培养条件均为：22℃；16h光照/8h黑暗；光照强度为12000Lx。
[0076] 一、重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91的构建
[0077] 1、用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切pCAMBIA3300表达载体，回收约8.5kb的载体骨架。
[0078] 2、用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切重组质粒pGM-T-GmXTH91，回收约2450bp的酶切产物。
[0079] 3、将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91。
[0080] 将重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91进行测序。测序结果表明，重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91为将pCAMBIA3300表达载体的限制性内切酶XbaI和BamHI识别序列之间的DNA小片段替换为SEQ ID No：2所示的DNA分子，得到的重组质粒。
[0081] 重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91编码SEQ ID No：1所示的GmXTH91蛋白。
[0082] 二、EHA105/pCAMBIA3300-GmXTH91的获得
[0083] 将重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3300-GmXTH91。
[0084] 三、转GmXTH91基因拟南芥的获得
[0085] 1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将EHA105/pCAMBIA3300-GmXTH91转至野生型拟南芥中，获得T1代转GmXTH91基因拟南芥种子。
[0086] 2、将T1代转GmXTH91基因拟南芥种子播种于含有5.5mg/L PPT的MS固体培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转GmXTH91基因阳性苗，T1代转GmXTH91基因阳性苗收到的种子即为T2代转GmXTH91基因拟南芥种子。
[0087] 3、将不同株系的T2代转GmXTH91基因拟南芥种子播种于含有5.5mg/L PPT的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GmXTH91基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转GmXTH91基因拟南芥种子。
[0088] 4、将T3代转GmXTH91基因拟南芥种子再次播种于含有5.5mg/L PPT的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转GmXTH91基因拟南芥。T3代纯合转GmXTH91基因拟南芥收到的种子即为T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥种子。
[0089] 5、将T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥种子再次播种于含有5.5mg/L PPT的MS固体培养基上，结果显示均为抗性苗，即T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥。将其中3个T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥株系分别命名为C1、C7和C9，并进行后续实验。
[0090] T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥收到的种子即为T5代纯合转GmXTH91基因拟南芥种子。
[0091] 四、分子鉴定
[0092] 待测拟南芥种子为C1的T4代种子、C7的T4代种子、C9的T4代种子或野生型拟南芥种子。
[0093] (1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。
[0094] (2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，培养7天，得到待测拟南芥幼苗。
[0095] (3)提取待测拟南芥幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-CAATCCCACTATCCTTCGC-3’和5’-CCACGTCATGCCAGTTCC-3’组成的35S-bar引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约403bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测拟南芥幼苗为转化载体成功的阳性苗。
[0096] 结果表明，C1的T4代种子、C7的T4代种子和C9的T4代种子获得的幼苗均为阳性苗。
[0097] 五、GmXTH91基因对拟南芥抗旱性的影响
[0098] A、种子萌发耐旱实验
[0099] 待测拟南芥种子为C1的T5代种子、C7的T5代种子、C9的T5代种子或野生型拟南芥种子。
[0100] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0101] 1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。
[0102] 2、完成步骤1后，将20粒所述待测拟南芥种子转移至固体培养基(MS固体培养基、含100μmol/L甘露醇的MS固体培养基、含150μmol/L甘露醇的MS固体培养基、含200μmol/L甘露醇的MS固体培养基或含300μmol/L甘露醇的MS固体培养基)，培养3天。培养期间，每天统计萌发种子数(萌发标志为胚尖突破种皮)，计算萌发率。萌发率＝萌发种子数/20×100％。
[0103] 萌发率的部分统计结果见表2。结果表明，在MS固体培养基上，野生型拟南芥和3个T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥株系(C1、C7和C9)的萌发率无显著差异；一定浓度的甘露醇处理后，与野生型拟南芥相比，3个T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥株系(C1、C7和C9)的萌发率均显著降低。
[0104] 表2
[0105]
[0106] B、根长耐旱实验
[0107] 待测拟南芥种子为C1的T5代种子、C7的T5代种子、C9的T5代种子或野生型拟南芥种子。
[0108] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0109] 1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。
[0110] 2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，培养5天，得到待测拟南芥幼苗。
[0111] 3、完成步骤2后，取50株生长状态基本一致的待测拟南芥幼苗，随机分成五组，每组10株；然后进行如下处理：
[0112] 第一组：将待测拟南芥幼苗转移至MS固体培养基上，竖直培养7天；
[0113] 第二组：将待测拟南芥幼苗转移至含100μmol/L甘露醇的MS固体培养基上，竖直培养7天；
[0114] 第三组：将待测拟南芥幼苗转移至含150μmol/L甘露醇的MS固体培养基上，竖直培养7天；
[0115] 第四组：将待测拟南芥幼苗转移至含200μmol/L甘露醇的MS固体培养基上，竖直培养7天；
[0116] 第五组：将待测拟南芥幼苗转移至含300μmol/L甘露醇的MS固体培养基上，竖直培养7天。
[0117] 4、完成步骤3后，观察各组待测拟南芥幼苗的根长。
[0118] 实验结果见图1(A为MS固体培养基，B为含100μmol/L甘露醇的MS固体培养基，C为含150μmol/L甘露醇的MS固体培养基，D为含200μmol/L甘露醇的MS固体培养基，E为含300μmol/L甘露醇的MS固体培养基，CK为野生型拟南芥种子获得的幼苗，转化苗为C7的T5代种子获得的幼苗)。结果表明，在MS固体培养基上，野生型拟南芥和3个T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥株系(C1、C7和C9)的根长均无显著差异；随着甘露醇浓度的增加，拟南芥的根长逐渐减小；一定浓度的甘露醇处理后，与野生型拟南芥相比，3个T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥株系(C1、C7和C9)的根长显著减小。
[0119] 由此可见，在野生型拟南芥中表达GmXTH91基因可以降低拟南芥的抗旱性，抗旱性降低表现为：种子萌发率降低和根长减小。
[0120] 六、GmXTH91基因对拟南芥株高的影响
[0121] 待测拟南芥种子为C1的T4代种子、C7的T4代种子、C9的T4代种子或野生型拟南芥种子。
[0122] 1、取20粒待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。
[0123] 2、完成步骤1后，将待测拟南芥种子转移至MS固体培养基，培养2周，得到待测拟南芥幼苗。
[0124] 3、完成步骤2后，将待测拟南芥幼苗转移至营养土中，温室培养至成熟期。观察成熟期的株高。
[0125] 结果见图2(CK为野生型拟南芥种子，C1为C1的T5代种子，C7为C7的T5代种子，C9为C9的T5代种子)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T4代纯合转GmXTH91基因拟南芥株系(C1、C7和C9)的株高显著增加。
[0126] 实施例3、转GmXTH91基因大豆的获得及鉴定
[0127] 一、重组质粒pCAMBIA3300-GmXTH91的构建
[0128] 同实施例2中步骤一。
[0129] 二、EHA105/pCAMBIA3300-GmXTH91的获得
[0130] 同实施例2中步骤二。
[0131] 三、转GmXTH91基因大豆的获得
[0132] 筛选纯合阳性苗的方法为：以待测大豆幼苗的基因组DNA为模板，采用5’-CAATCCCACTATCCTTCGC-3’和5’-CCACGTCATGCCAGTTCC-3’组成的35S-bar引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中仅含有约403bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测大豆幼苗为转载体成功的纯合阳性苗。
[0133] 1、采用农杆菌介导的大豆子叶节法，将EHA105/pCAMBIA3300-GmXTH91转至DN50，获得T1代转GmXTH91基因大豆。
[0134] 2、以T1代转GmXTH91基因大豆幼苗的基因组DNA为模板，采用5’-CAATCCCACTATCCTTCGC-3’和5’-CCACGTCATGCCAGTTCC-3’组成的35S-bar引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约403bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的幼苗为转载体成功的阳性苗。将阳性苗自交，获得T2代转GmXTH91基因大豆。
[0135] 3、筛选T2代转GmXTH91基因大豆中的纯合阳性苗，连续自交，分别获得T3代纯合转GmXTH91基因大豆和T4代纯合转GmXTH91基因大豆。
[0136] 将其中8个T2代纯合转GmXTH91基因大豆的株系依次编号为14、15、18、20、24、25、45和74。
[0137] 四、实时荧光定量检测转GmXTH91基因大豆中GmXTH91基因的表达量[0138] 1、分别将T4代纯合转GmXTH91基因大豆、T3代纯合转GmXTH91基因大豆、T2代纯合转GmXTH91基因大豆生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。取DN50种子，28℃光暗交替培养10天，得到待测大豆幼苗；将该待测大豆幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。
[0139] 2、采用植物RNA提取试剂盒提取待测样本的总RNA，然后采用反转录试剂盒反转录出第一链cDNA，将该cDNA用无菌水稀释50倍作为模板，实时定量PCR检测GmXTH91基因的相对表达量(Actin基因为内参基因)。
[0140] 检测GmXTH91基因的引物为5’-GCGTGCCAAAATCTATGAGAAT-3’和5’-TTACTGTTCCAGCAGAGTTACC-3’。
[0141] 检测Actin基因的引物为5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATT-3’和5’-GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3’。
[0142] 部分检测结果见图3(CK为DN50，14、15、18、20、24、25、45和74均为T3代纯合转GmXTH91基因大豆的不同株系)。结果表明，与DN50相比，T4代纯合转GmXTH91基因大豆、T3代纯合转GmXTH91基因大豆和T2代纯合转GmXTH91基因大豆的不同株系中GmXTH91基因的相对表达量均有不同程度的增加。
[0143] 五、蛋白水平的检测
[0144] 1、取T4代纯合转GmXTH91基因大豆、T3代纯合转GmXTH91基因大豆、T2代纯合转GmXTH91基因大豆V1时期三出叶片，采用Quick Stix Kit for Liberty Link(Enviro Logix公司)进行检测，然后进行如下判断：如果试纸条显示两条红色条带，为阳性苗；如果试纸条显示一条红色条带，为非阳性苗。
[0145] 结果表明，14、15、18、20、24、25、45和74均为阳性苗。
[0146] 2、分别提取T4代纯合转GmXTH91基因大豆、T3代纯合转GmXTH91基因大豆、T2代纯合转GmXTH91基因大豆生长至10天的幼苗和DN50生长至10天的幼苗的总蛋白，然后以PPT蛋白为一抗，进行Western Blot。
[0147] 部分检测结果见图4(M为蛋白Marker，14、15、18、20、24、25、45和74均为T3代纯合转GmXTH91基因大豆的不同株系)。结果表明，与DN50相比，T4代纯合转GmXTH91基因大豆、T3代纯合转GmXTH91基因大豆和T2代纯合转GmXTH91基因大豆的不同株系中GmXTH91蛋白的表达量均有不同程度的增加。
[0148] 步骤四和步骤五中，3个T2代纯合转GmXTH91基因大豆株系中GmXTH91基因的相对表达量和GmXTH91蛋白的表达量最高，将其依次命名为OE#15、OE#25和OE#45，并进行后续实验。
[0149] 六、GmXTH91基因对大豆抗旱性的影响
[0150] 待测大豆种子为OE#15的T4代种子、OE#25的T4代种子、OE#45的T4代种子或DN50种子。
[0151] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0152] 1、取待测大豆种子，用氯气灭菌消毒16h，然后清洗残留氯气，以防止影响种子活性降低萌发率。
[0153] 2、完成步骤1后，将20粒待测大豆种子转移至35mL液体(水、浓度为30g/L PEG的水溶液、浓度为40g/L PEG的水溶液、浓度为50g/L PEG的水溶液、浓度为60g/L PEG的水溶液、浓度为100g/L PEG的水溶液、浓度为150g/L PEG的水溶液或浓度为200g/L PEG的水溶液)中，常温培养。培养至24h、48h或72h，每天统计萌发种子数(萌发标志为胚根突破种皮)，计算萌发率。萌发率＝萌发种子数/20×100％。
[0154] 培养至24h的实验结果见图5，培养至48h的实验结果图6，培养至72h的实验结果图7。图5、图6和图7中，A1为水，A2为浓度为30g/L PEG的水溶液，A3为浓度为40g/L PEG的水溶液，A4为浓度为50g/L PEG的水溶液，B1为浓度为60g/L PEG的水溶液，B2为浓度为100g/L PEG的水溶液，B3为浓度为150g/L PEG的水溶液，B4为浓度为200g/L PEG的水溶液。萌发率的部分统计结果见表3。结果表明，与DN50种子相比，3个T4代纯合转GmXTH91基因大豆株系(OE#15、OE#25和OE#45)的萌发速率显著减缓，萌发率也显著降低。
[0155] 表3
[0156]
[0157] 由此可见，在DN50中表达GmXTH91基因可以降低大豆的抗旱性，抗旱性降低表现为：种子萌发率降低。
[0158] 七、GmXTH91基因对大豆株高的影响
[0159] 待测大豆种子为OE#15的T2代种子、OE#25的T2代种子、OE#45的T2代种子或DN50种子。
[0160] 1、取待测大豆种子，用氯气灭菌消毒16h，然后清洗残留氯气，以防止影响种子活性降低萌发率。
[0161] 2、完成步骤1后，将待测大豆种子种植于营养土中，温室培养至成熟期。观察成熟期的株高、分枝数、结荚数和种子数。
[0162] 统计结果见表4。结果表明，与DN50种子相比，3个T3代纯合转GmXTH91基因大豆株系(OE#15、OE#25和OE#45)的株高显著增加。
[0163] 表4
[0164] 株高cm 分枝数 结荚数 种子数OE#45 49.75±6.55** 1.38±0.50 5.88±1.11 15.25±3.87
OE#15 38.00±1.00 1.67±0.33 4.33±1.20 12.67±2.33
OE#25 38.33±2.91 2.33±1.20 4.00±0.58 11.67±2.60
DN50 34.33±5.15 0.50±0.50 4.50±1.04 10.25±3.82
OE#15 38.00±1.00 1.67±0.33 4.33±1.20 12.67±2.33
OE#25 38.33±2.91 2.33±1.20 4.00±0.58 11.67±2.60
DN50 34.33±5.15 0.50±0.50 4.50±1.04 10.25±3.82
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