水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途
阅读：580发布：2024-02-18
专利汇可以提供水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程技术领域，具体涉及 水 稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途。本发明所要解决的技术问题是为提高水稻产量提供一种新选择。本发明的技术方案是水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途。本发明还提供了调控水稻单粒重的 试剂 ，其主要活性成分为水稻粒宽突变基因GW10编码的 蛋白质 ，表达水稻粒宽突变基因GW10编码的载体或宿主细胞。本发明提供了一个水稻粒宽突变基因GW10的核苷酸序列及其编码蛋白序列，为水稻转基因研究提供了有 力 的工具，可促进高产优质水稻的育种研究。，下面是水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途专利的具体信息内容。
1.水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途为水稻粒宽突变基因GW10在提高水稻产量中的用途。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述用途为水稻粒宽突变基因GW10在提高水稻单粒重中的用途。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的水稻粒宽突变基因GW10编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的水稻粒宽突变基因GW10具有如SEQID No.1所示的核苷酸序列。
6.调控水稻单粒重的试剂，其特征在于：其主要活性成分为水稻粒宽突变基因GW10编码的蛋白质，表达水稻粒宽突变基因GW10编码的载体或宿主细胞。
7.如权利要求6所述的调控水稻单粒重的试剂，其特征在于：所述的水稻粒宽突变基因GW10编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6或7所述的调控水稻单粒重的试剂，其特征在于：所述的水稻粒宽突变基因GW10具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途。
背景技术
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物，约21％的人口以其为主食；因基因组较小、具有较高的同源性、是最早测序的禾谷类粮食作物，水稻也成为了单子叶植物分子生物学研究的模式植物。“绿色革命”极大提高了农作物产量，成功解决了60年代以来的全球粮食危机。90 年代后，粮食生产遇到瓶颈，而人口仍持续增长，粮食安全再次成为全球关注的焦点话题。有效穗、穗粒数和千粒重是水稻产量构成的主要因子，是其遗传育种中最重要的选择性状，克隆水稻产量性状调控基因，从分子水平阐释其形成机理，不仅对水稻分子设计育种具有指导作用，也为其他禾谷类作物的分子改良提供了借鉴。因此，克隆水稻产量性状调控基因并进行作用机理研究具有重要的理论意义和潜在的生产应用价值。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题是为提高水稻产量提供一种新选择。
[0004] 本发明的技术方案是水稻粒宽突变基因GW10在水稻育种中的用途。
[0005] 具体的，水稻粒宽突变基因GW10在提高水稻产量中的用途。
[0006] 具体的，水稻粒宽突变基因GW10在提高水稻单粒重中的用途。
[0008] 具体的，所述的水稻粒宽突变基因GW10具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0009] 本发明还提供了调控水稻单粒重的试剂，其主要活性成分为水稻粒宽突变基因GW10编码的蛋白质，表达水稻粒宽突变基因GW10编码的载体或宿主细胞。
[0010] 具体的，所述的水稻粒宽突变基因GW10编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0011] 具体的，所述的水稻粒宽突变基因GW10具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0012] 本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明提供了一个水稻粒宽突变基因GW10的核苷酸序列及其编码蛋白序列，为水稻转基因研究提供了有力的工具，可促进高产优质水稻的育种研究。经过实验验证，该基因具有调控水稻粒宽的作用，为改良水稻品种提供的新的选择与方向。附图说明
[0013] 图1为野生型(WT)和突变体gw10的表型鉴定，其中A为野生型和gw10的籽粒表型； B-D分别为野生型和gw10的粒长、粒宽和千粒重统计图；E为野生型和gw10颖壳的横切解剖图(a和b为整体解剖图，c和d为局部放大图)；F-H分别为野生型和gw10颖壳横切结构内层薄壁细胞总长度、细胞数目和单个细胞平均长度统计图；I-K分别为扫面电镜下观察到的外稃内表皮细胞长度、细胞宽度和细胞数目统计图；L为野生型和gw10的颖壳图片(a和b) 和扫面电镜下观察到的外稃外表皮(c和d)和内表皮结构(e和f)；M为野生型和gw10植株整体结构图。
[0014] 图2为突变基因GW10的遗传和物理图谱，其中A为GW10的初定位，在第10染色体长臂末端SSR标记RM3123和RM1162之间；B为GW10的精细定位，在Indel标记Ind10-2 与Ind10-3之间123.7kb的范围内；C为GW10候选野生型基因LOC_Os10g41310.1的结构及突变位置；D为突变体gw10和野生型WT的LOC_Os10g41310.1基因表达量。
[0015] 图3为突变基因GW10Q-PCR结果，其中SAM代表顶端分生组织，YP1-YP36代表不同长度的小穗，数字即为小穗长度。
[0016] 图4为突变基因GW10与野生型基因的序列比对图，突变基因GW10cDNA在第1935位发生了一个碱基G的缺失。
[0017] 图5为突变基因GW10编码蛋白与野生型基因编码蛋白的序列比对及保守结构域分析图；第1-59位氨基酸位DUF630结构域，第325-631位氨基酸为DUF632结构域，突变基因GW10编码蛋白由于移码突变在第645位发生了赖氨酸(K)到天冬酰胺(N)的变异，且在第716位由甲硫氨酸(M)突变为终止密码子TGA，以致氨基酸编码提前终止。
[0018] 图6为GW10野生型基因重组植物互补载体的构建图；其中pBR322 ori为pBR322载体复制起始位点；pBR322 bom site为pBR322载体bom基因位点；pVS1 rep为pVS1载体rep 基因位点；pVS1 sta为pVS1载体sta基因位点；CaMV 35S promoter为花椰菜花叶病毒(CaMV) 的35S强启动子；GUS为GUS基因编码序列；Nos poly–A为GUS信号终止位点；T BORDER (R)和T BORDER(L)为融合进宿主基因组上的片段两端位点；MCS为多克隆位点(multiple cloning site，MCS)；GW10COM为插入的GW10基因的全部编码序列和上游启动子序列以及下游序列；Bam HI和Kpn I为构建互补载体时所用的两个单一酶切位点；Catalase Intron 为过氧化氢酶内含子；hygromycin为抗生素潮霉素的编码序列；Poly–A site为Poly–A 信号位点；kanamycin(R)为抗生素卡那霉素编码序列。
[0019] 图7为GW10野生型基因重组植物超表达载体的构建图；其中pBR322 ori为pBR322载体复制起始位点；pBR322 bom为pBR322载体bom基因位点；pVS1 rep为pVS1载体rep基因位点； pVS1 sta为pVS1载体sta基因位点；RB(right border)和LB(left border)为融合进宿主基因组上的片段两端位点；GUS为GUS基因编码序列；Nos为GUS信号终止位点；ubiquitin promoter为泛素强启动子；PTCKF和PTCKR为PTCK303载体检测通用引物对；Bam HI、Sac I和Spe I为多克隆酶切位点；GW10CDS为插入的GW10基因全部CDS序列；GFP为插入的GFP融合表达蛋白编码序列；Nos Term为终止信号位点；CMV 35S为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S强启动子； hygromycin为抗生素潮霉素的编码序列；CaMV35S poly A为Poly–A信号位点；kanamycin(R) 为抗生素卡那霉素编码序列。
[0020] 图8为GW10野生型基因重组植物干涉载体的构建图；pBR322 ori为pBR322载体复制起始位点；pBR322 bom为pBR322载体bom基因位点；pVS1 rep为pVS1载体rep基因位点；pVS1 sta 为pVS1载体sta基因位点；RB(right border)和LB(left border)为融合进宿主基因组上的片段两端位点；GUS为GUS基因编码序列；Nos为GUS信号终止位点；ubiquitin promoter为泛素强启动子；Bam HI、Kpn I、Spe I和Sac I为多克隆酶切位点；其中GW10BK为插入的正义链特异片段；GW10AP为插入的反义链特异片段。Nos Term为终止信号位点；CMV
35S为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S强启动子；hygromycin为抗生素潮霉素的编码序列；
CaMV35S poly A 为Poly–A信号位点；kanamycin(R)为抗生素卡那霉素编码序列。
35S为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S强启动子；hygromycin为抗生素潮霉素的编码序列；
CaMV35S poly A 为Poly–A信号位点；kanamycin(R)为抗生素卡那霉素编码序列。
[0021] 图9为突变体gw10的互补(COM)表型分析，其中A为野生型WT、突变体gw10、转基因阳性植株COM籽粒；B为野生型WT、突变体gw10、转基因阳性植株COM的粒宽统计分析。
[0022] 图10为GW10的超表达(OE)和干涉(Ri)分析，其中A为野生型和超表达阳性植株籽粒， B-E分别为野生型和超表达阳性植株籽粒粒长、粒宽、千粒重和表达量分析；F为野生型和干涉阳性植株籽粒，G-J分别为野生型和干涉阳性植株粒长、粒宽、千粒重和表达量分析。
具体实施方式
[0024] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例中使用的材料：野生型缙恢10号和水稻粒宽突变体gw10由西南大学水稻研究所提供；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、T4 DNA连接酶、Trizol试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)为Sigma 公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404由西南大学水稻研究所提供；表达载体pCAMBIA1301和PTCK303均由西南大学水稻所提供。
[0026] 实施例一前期研究
[0027] 在前期研究工作中，西南大学水稻研究所提供了：利用EMS诱变优良恢复系缙恢10号获得了一个遗传稳定的水稻粒宽突变体(命名为gw10)，表现为籽粒长与野生型相比无明显差异，籽粒宽则显著增加，最终导致千粒重显著增加(图1A～D)。用表型正常的不育系西农1A与突变体gw10杂交，F1代表型正常，说明该突变体受隐性基因控制。F2代群体中出现明显的分离，分别表现双亲性状，其中正常单株1094株，gw10突变单株324株。经卡方测验，正常株﹕突变株符合3∶1分离比(χ2＝3.49<χ20.05＝3.84)，表明gw10突变体受隐性单基因控制，命名为GW10。通过石蜡切片(参照博士学位论文：水稻维管束发育相关基因AVB 基因的图位克隆和功能分析，2016年，33-34页)进行细胞学观察发现，该基因主要影响细胞的分裂和延伸，造成籽粒颖壳变宽，从而引起宽粒的表型(图1E～L)。以西农1A/gw10 杂交的F2群体作为定位群体，共获得324个突变株，用于基因定位。选用400对均匀分布于 12条染色体上的SSR标记对F2代定位群体突变单株进行单株验证(参照硕士学位论文：水稻叶缘白化突变体mal的遗传分析与基因定位，2014年，22页)，结果位于第10染色体的 SSR标记RM3123和RM1162与gw10突变位点表现连锁。在两标记间进一步设计SSR引物和Indel引物，其中Indel10-1、Indel10-2、Indel10-3和SSR10-1在两亲本间表现出多态性(引物序列见表1)，最终将gw10定位在Indel标记Indel10-2和Indel10-3之间，物理距离为123.7kb (图2A～C)。
[0028] 表1基因定位所用引物及其序列
[0029]引物名称 引物序列(5’-3’) 序列号
RM3123F ACGCTCTTAATTGATCCGTTCG SEQ ID No.5
RM3123R CAAAGTCCAGTTCCGTTGATCC SEQ ID No.6
RM1162F ATCCGGAGGAGTTCATTTGAGG SEQ ID No.7
RM1162R AAATGCTCTGGGTGGGCTAGG SEQ ID No.8
SSR10-1F TGGTACGGAAAGACGAGAGATG SEQ ID No.9
SSR10-1R GTGAGGCGAGTGTCTGATAACTG SEQ ID No.10
Ind10-1F GTCACCAACCACCCAATCAAC SEQ ID No.11
Ind10-1R GTTAGTCGTCGCTGACGACAG SEQ ID No.12
Ind10-2F GAGCTGTATGATTGTTTTGGCT SEQ ID No.13
Ind10-2R GTGCTCTTCTTCTAGGCCAAG SEQ ID No.14
Ind10-3F AGACATCTGGGACGAGCTGAA SEQ ID No.15
Ind10-3R ATTAAGGCCATATCCTTCGCA SEQ ID No.16
RM3123F ACGCTCTTAATTGATCCGTTCG SEQ ID No.5
RM3123R CAAAGTCCAGTTCCGTTGATCC SEQ ID No.6
RM1162F ATCCGGAGGAGTTCATTTGAGG SEQ ID No.7
RM1162R AAATGCTCTGGGTGGGCTAGG SEQ ID No.8
SSR10-1F TGGTACGGAAAGACGAGAGATG SEQ ID No.9
SSR10-1R GTGAGGCGAGTGTCTGATAACTG SEQ ID No.10
Ind10-1F GTCACCAACCACCCAATCAAC SEQ ID No.11
Ind10-1R GTTAGTCGTCGCTGACGACAG SEQ ID No.12
Ind10-2F GAGCTGTATGATTGTTTTGGCT SEQ ID No.13
Ind10-2R GTGCTCTTCTTCTAGGCCAAG SEQ ID No.14
Ind10-3F AGACATCTGGGACGAGCTGAA SEQ ID No.15
Ind10-3R ATTAAGGCCATATCCTTCGCA SEQ ID No.16
[0030] 在前期对突变基因GW10精细定位的基础上，本发明通过在线基因预测(http:// mendel.cs.rhul.ac.uk)、BLAST在线比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)及基因功能互补分析。基因功能互补分析：将LOC_Os10g41310.1候选基因的全部编码序列连同上游启动子序列以及下游序列重组到表达载体pCAMBIA 1301上(扩增引物：GW10COM-KF，GW10COM-BR，序列见表2)，通过农杆菌转化的方法转到gw10突变体，得到转基因阳性植株，其籽粒表型恢复到野生型水平，初步确定了DUF630/DUF632基因(LOC_Os10g41310.1)为水稻粒宽突变基因GW10的候选野生型基因(图2)。
[0031] 表2测序、Q-PCR及载体构建所用引物及其序列
[0032]引物名称 引物序列(5’-3’) 序列号
41310F CAAGTCCGTGGTCTGGTAGAC SEQ ID No.17
41310R CTACCGCACCGATCCAGC SEQ ID No.18
GW10QF TAAGGCAGTGGAGGTAAC SEQ ID No.19
GW10QR GCTATGGCTTGGAACATT SEQ ID No.20
GW10COM-KF GCCggtaccCTAATTAAGTAATTAGGACTCACCTAAGCCAAT SEQ ID No.21 GW10COM-BR GCCggatccTGACTAATCCCTTCGCGGCT SEQ ID No.22
GW10Ri-BKF GCCggatccGCCACCATTGGCTGTTCGCT SEQ ID No.23
GW10Ri-BKR GCCggtaccCATTGTCACGCACCCTGACAAT SEQ ID No.24
GW10Ri-APF GCCgagctcGCCACCATTGGCTGTTCGCT SEQ ID No.25
GW10Ri-APR GCCactagtCATTGTCACGCACCCTGACAAT SEQ ID No.26
GW10OE-BF CGCggatccAGAGGGCGTTAGATCGAATC SEQ ID No.27
GW10OE-PR CGGactagtCCGCACCGATCCAGCT SEQ ID No.28
41310F CAAGTCCGTGGTCTGGTAGAC SEQ ID No.17
41310R CTACCGCACCGATCCAGC SEQ ID No.18
GW10QF TAAGGCAGTGGAGGTAAC SEQ ID No.19
GW10QR GCTATGGCTTGGAACATT SEQ ID No.20
GW10COM-KF GCCggtaccCTAATTAAGTAATTAGGACTCACCTAAGCCAAT SEQ ID No.21 GW10COM-BR GCCggatccTGACTAATCCCTTCGCGGCT SEQ ID No.22
GW10Ri-BKF GCCggatccGCCACCATTGGCTGTTCGCT SEQ ID No.23
GW10Ri-BKR GCCggtaccCATTGTCACGCACCCTGACAAT SEQ ID No.24
GW10Ri-APF GCCgagctcGCCACCATTGGCTGTTCGCT SEQ ID No.25
GW10Ri-APR GCCactagtCATTGTCACGCACCCTGACAAT SEQ ID No.26
GW10OE-BF CGCggatccAGAGGGCGTTAGATCGAATC SEQ ID No.27
GW10OE-PR CGGactagtCCGCACCGATCCAGCT SEQ ID No.28
[0033] 系统进化树分析(参照博士学位论文：水稻黄绿叶基因YGL8和YGL9的克隆与功能分析，2016年，30-31页)发现，DUF630/DUF632基因家族在高粱、玉米、水稻和拟南芥中均存在直系同源蛋白，其中已报道的有水稻REL2，拟南芥APSR1和NRG2。其中，REL2 通过调节水稻泡状细胞发育影响叶片卷曲度，APSR1和NRG2分别影响P和N的代谢调控根的发育。
[0034] 实施例二水稻粒宽突变基因GW10的克隆、测序及功能验证
[0035] 1、水稻粒宽基因GW10的克隆及测序
[0036] 在上述基因定位的基础上，根据Gramene数据库(http://ensembl.gramene.org/genome _browser/index.html)给出的日本晴参考序列，对定位区间的候选基因在野生型和突变体gw10 间进行测序，结果发现，突变基因GW10全长CDS为2304bp，由4个外显子组成，共编码 768个氨基酸；与野生型基因(LOC_Os10g41310.1)相比，突变基因GW10在第1935位碱基有G的缺失(图4)(测序引物：41310F,41310R，序列见表2)，并导致其编码蛋白在第 645位氨基酸发生移码突变并导致氨基酸编码提前终止(图5)。保守结构域查询数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查询表明，LOC_Os10g41310.1编码一个DUF630/DUF632结构域蛋白，初步将该基因确定为GW10的候选基因。
[0037] 2、水稻粒宽基因GW10的功能验证
[0038] 通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)(定量引物：GW10QF，GW10QR，序列见表2)的手段(参照博士学位论文：水稻小穗发育相关基因MFS1的图位克隆与功能分析，2013年，29 页)，对野生型和突变体的DUF630/DUF632基因(LOC_Os10g41310.1)进行表达量分析发现，突变体gw10中LOC_Os10g41310.1基因的表达量相对野生型明显下调(图2D)，且LOC_Os10g41310.1在水稻各个部位均有表达，在发育前期的小穗和茎秆中表达最高(图3)。然后，本发明构建了GW10野生型基因重组植物互补载体(图6)并将其转化水稻宽粒突变体gw10，性状观察显示转基因阳性植株籽粒变窄，完全恢复为野生型粒宽水平(图9)，从而确定了突变基因GW10就是DUF630/DUF632基因(LOC_Os10g41310.1)的突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。
[0039] 进一步扩增了野生型植株的GW10基因的CDS(扩增引物：GW10OE-BF，GW10OE-PR，序列见表2)，重组到表达载体PTCK303上，构建超表达载体(图7)并通过农杆菌转化(参照博士学位论文：水稻小穗发育相关基因MFS1的图位克隆与功能分析，2013年，37—39页) 的手段转化到野生型植株。另外还通过BLAST在线比对工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝OGP__4530__9512)选取了野生型GW10 基因CDS的一段高度特异的片段，分别扩增其正义链和反义链同时连接到表达载体PTCK303 上(扩增引物：GW10Ri-BKF，GW10Ri-BKR，GW10Ri-APF，GW10Ri-APR，序列见表2)，构建干涉载体(图8)并通过农杆菌转化的方法转化到野生型植株。超表达和干涉转基因植株观察发现，超表达阳性植株的籽粒相对野生型显著变窄，千粒重减少(图10A-E)，相反，干涉阳性植株籽粒相对野生型变宽，千粒重增加(图10F-J)，说明GW10是一个水稻籽粒宽度的负调控因子。
[0040] 实施例三水稻粒宽突变基因GW10的生物信息学分析
[0041] 将水稻粒宽突变基因GW10序列利用NCBI中的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)进行开放阅读框识别。结果显示，突变基因GW10由一个完整且连续的开放阅读框组成。
[0042] 将水稻粒宽突变基因GW10的编码蛋白序列利用CDD(conserved domain database) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行蛋白质保守结构域分析。结果显示，突变基因GW10编码蛋白有2个高度保守区域即DUF630和DUF632，而由基因突变导致的氨基酸突变位点在DUF632结构域后第14位氨基酸位置(图5)。
[0043] 将水稻粒宽突变基因GW10编码蛋白序列利用MEGA5软件进行序列比对及系统进化树的生成。序列比对结果显示，突变基因GW10与高粱、玉米、大麦和短柄草编码蛋白的同源性高达50％以上。系统进化树如图11所示。
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