带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用
阅读：36发布：2024-02-27
专利汇可以提供带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种带安全 开关 的嵌合 抗原 受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用。该嵌合抗原受体包括依次连接的第一 信号 肽、c-Met单链 抗体 、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt。实验结果表明，上述嵌合抗原受体修饰的NK细胞，嵌合抗原受体免疫反应可控，安全性能好， 治疗 副作用 少，特异性高。，下面是带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞及应用专利的具体信息内容。
1.一种带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt；其中，所述c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述改造的EGFRt的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述c-Met单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述改造的EGFRt的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为：
(a)由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，
(b)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
5.根据权利要求1或4所述的带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为：
(a)由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，
(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
6.一种表达基因，用于表达带安全开关的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt；其中，所述c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述改造的EGFRt的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.根据权利要求6所述的表达基因，其特征在于，所述表达基因为：
(a)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或，
(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述嵌合抗原受体活性的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求6或7所述的表达基因。
9.一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞中能够表达如权利要求1～5任一项所述的嵌合抗原受体，或者所述NK细胞中导入了如权利要求6～7任一项所述的表达基因，或者所述NK细胞中转染了如权利要求8所述的表达载体。
10.如权利要求1～5任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求6～7任一项所述的表达基因、如权利要求8所述的表达载体、或如权利要求9所述的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备抗肿瘤的药物中的应用。
带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的NK细胞
及应用
技术领域
背景技术
[0002] 人间质表皮转化因子c-Met(Mesenchymal Epithelial Transition Factor，c-Met)是肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)的受体，属于酪氨酸激酶受体超家族成员。c-Met通过与HGF结合，激活HGF/c-Met信号通路，降低细胞间的黏附力，有利于肿瘤细胞的转移。近年来研究发现，c-Met在我国发病率较高的肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、脑胶质瘤等肿瘤组织中呈现异常高表达、突变或活性改变。因此，c-Met已经成为抗肿瘤治疗的一个重要靶点。
[0003] 近年来过继性细胞治疗技术中，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)技术在治疗肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。但是，传统的嵌合抗原受体修饰的T细胞，不能根据需要启动或停止发挥免疫作用，治疗副作用多、特异性差。最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及系统性神经毒性等高风险因素。
[0004] 自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK细胞)是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，来源于造血干细胞，在骨髓内发育成熟。NK细胞具有很多特点：固有免疫细胞、非特异性直接杀伤靶细胞、不需要预先由抗原致敏、不需要抗体参与、无MHC限制性、发挥免疫杀伤作用早。因此，运用嵌合抗原受体修饰的NK细胞已经成为新的抗肿瘤研究方向。
[0005] 然而，传统的嵌合抗原受体修饰的NK细胞存在安全性能较差、治疗副作用多、特异性差等问题。
发明内容
[0006] 基于此，有必要提供一种能够修饰的NK细胞，且使得修饰后的NK细胞的安全性能好、治疗副作用少、特异性高的带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因。
[0007] 此外，还提供一种表达载体以及一种安全性能较好、治疗副作用少、特异性高的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞及其应用。
[0008] 一种带安全开关的嵌合抗原受体，包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt；其中，所述c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述改造的EGFRt的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009] 在一个实施方式中，编码所述c-Met单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0010] 在一个实施方式中，编码所述改造的EGFRt的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0011] 在一个实施方式中，所述嵌合抗原受体为：
[0012] (a)由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，
[0013] (b)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0014] 在一个实施方式中，所述嵌合抗原受体为：
[0015] (a)由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，
[0016] (b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0017] 一种表达基因，用于表达带安全开关的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt；其中，所述c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述改造的EGFRt的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0018] 在一个实施方式中，所述表达基因为：
[0019] (a)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或，
[0020] (b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述嵌合抗原受体活性的核苷酸序列。
[0021] 一种表达载体，所述表达载体中含有上述的表达基因。
[0022] 一种带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞，所述NK细胞中能够表达上述任一项所述的嵌合抗原受体，或者所述NK细胞中导入了上述任一项所述的表达基因，或者所述NK细胞中转染了上述的表达载体。
[0023] 上述任一项所述的嵌合抗原受体、如上述任一项所述的表达基因、上述8所述的表达载体、或上述的带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备抗肿瘤的药物中的应用。
[0024] 上述嵌合抗原受体包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt。利用筛选的抗c-Met的单克隆抗体序列作为嵌合抗原受体(CAR)载体中的scFv序列，并加入改造的表面生长因子受体(EGFRt)。改造的EGFRt其结构仅包含EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV及跨膜结构域，不包含胞内酪氨酸激酶结构域。改造的EGFRt中的胞外结构域III(SEQ ID No.2所示的第1号氨基酸～第172号氨基酸)和胞外结构域IV(SEQ ID No.2所示第173号氨基酸～第312号氨基酸)是西妥昔单抗的结合位点。实验结果表明，上述嵌合抗原受体能够在NK细胞中稳定表达，从而形成嵌合抗原受体修饰的NK细胞。且该嵌合抗原受体能够靶向c-Met，并带有安全开关，嵌合抗原受体结构和EGFRt开关结构用自裂解多肽T2A分别表达于NK细胞表面。当上述嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR-NK细胞)输注给患者后产生细胞因子风暴及系统性神经毒性等副作用时，则可注射商品化西妥昔单抗，通过NK细胞自身的ADCC作用，可清除体内基因工程改造以表达CAR的自然杀伤细胞。因此西妥昔单抗可作为NK细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，安全性能好，治疗副作用少，特异性高。
附图说明
附图说明
[0025] 图1为实施例1中带EGFRt开关的c-Met嵌合抗原受体的结构示意图；
[0026] 图2为实施例1中构建的慢病毒表达质粒pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt的质粒谱图；
[0027] 图3为实施例1中慢病毒表达质粒pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt酶切产物的电泳结果图；
[0028] 图4为人肝癌细胞HepG-2和正常肝细胞L-O2细胞裂解后的检测c-Met的表达量的Western Blotting检测结果图；
[0029] 图5为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在不同条件下体外杀伤细胞的流式散点结果比对图；
[0030] 图6为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在不同条件下细胞活率的统计结果比对图。
具体实施方式
[0031] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0032] 一实施方式的带安全开关的嵌合抗原受体(CAR)，包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt。其中，c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，改造的EGFRt的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0033] 具体地，利用筛选的抗c-Met的单克隆抗体序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列，得到如SEQ ID No.1所示的c-Met单链抗体的氨基酸序列。其中，SEQ ID No.1中第1号氨基酸～第97号氨基酸为VH(重链)序列，第98号氨基酸～第112号氨基酸为连接肽，第113号氨基酸～第218号氨基酸为VL(轻链)序列。
[0034] 进一步地，经过密码子优化，获得编码c-Met单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0035] 具体地，改造的EGFRt的氨基酸仅包含EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV及跨膜结构域，不包含胞内酪氨酸激酶结构域。改造的EGFRt中的胞外结构域III(SEQ ID No.2所示的第1号氨基酸～第172号氨基酸)和胞外结构域IV(SEQ ID No.2所示第173号氨基酸～第312号氨基酸)是西妥昔单抗的结合位点，能够特异性的结合西妥昔单抗。
[0036] 进一步地，经过密码子优化，获得编码改造的EGFRt的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0037] 本实施方式中，嵌合抗原受体为：(a)由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0038] 具体地，SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中，第1号氨基酸～第22号氨基酸为第一信号肽，第23号氨基酸～第240号氨基酸为c-Met单链抗体，第245号氨基酸～第315号氨基酸为CD8结构域(包括铰链区及跨膜结构域)，第316号氨基酸～第357号氨基酸为41BB胞内结构域(共刺激信号胞内结构域)，第358号氨基酸～第405号氨基酸为DAP12-ITAM结构域(DAP12免疫受体酪氨酸活化基序ITAM结构域)，第410号氨基酸～第430号氨基酸为T2A(自裂解多肽)，第431号氨基酸～第452号氨基酸为第二信号肽，第453号氨基酸～第787号氨基酸为改造的EGFRt。此外，嵌合抗原受体中还有两个酶切位点(第241号氨基酸～第244号氨基酸，以及第406号氨基酸～第409号氨基酸)。
[0039] 进一步地，嵌合抗原受体为：(a)由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有嵌合抗原受体活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0040] 可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有嵌合抗原受体重组抗原活性的蛋白质，或在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有重组抗原活性的衍生的蛋白，得到的蛋白与嵌合抗原受体没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
[0041] 经过不断的研究探索，成功设计出上述功能结构的带安全开关的嵌合抗原受体(CAR)。该带安全开关的嵌合抗原受体(CAR)，包括依次连接的第一信号肽、c-Met单链抗体、CD8结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、T2A、第二信号肽以及改造的EGFRt。该嵌合抗原受体经试验验证能够靶向c-Met，并带有安全开关，嵌合抗原受体结构和EGFRt开关结构用自裂解多肽T2A分别表达于NK细胞表面。当上述嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR-NK细胞)输注给患者后产生细胞因子风暴及系统性神经毒性等副作用时，则可注射商品化西妥昔单抗，通过NK细胞自身的ADCC作用，可清除体内基因工程改造以表达CAR的自然杀伤细胞。
[0042] 上述带安全开关的嵌合抗原受体(CAR)能够运用在抗肿瘤的药物中。
[0043] 此外，本申请还提供一实施方式的表达基因，该表达基因用于表达带安全开关的嵌合抗原受体。
[0044] 具体地，嵌合抗原受体的特征请参见上文的描述，在此不作赘述。
[0045] 具体地，该表达基因为：(a)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或，(b)在SEQ ID No.6所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有嵌合抗原受体活性的核苷酸序列。
[0046] 上述表达基因能够表达带安全开关的嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体经试验验证能够靶向c-Met，并带有安全开关，能够在NK细胞中稳定表达、安全性能好、治疗副作用少、特异性好。
[0047] 上述表达基因能够运用在抗肿瘤的药物中。
[0048] 此外，本申请还提供一实施方式的表达载体，该表达载体中含有上述表达基因。
[0049] 在一个实施方式中，该表达载体为含有上述表达基因的慢病毒。
[0050] 该表达载体能够用于表达上述嵌合抗原受体，表达效率高，表达量稳定，能够运用在抗肿瘤的药物中。
[0051] 此外，本申请还提供一种实施方式带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞。该NK细胞能够表达上述的嵌合抗原受体，或者该NK细胞中导入了上述的表达基因，或者该NK细胞中转染了上述的表达载体。
[0052] 具体地，嵌合抗原受体的特征请参见上文的描述，在此不作赘述。
[0053] 实验结果表明，上述带安全开关的嵌合抗原受体修饰的NK细胞对肿瘤具有特异性的高效杀伤作用。且当上述嵌合抗原受体修饰的NK细胞(CAR-NK细胞)输注给患者后产生细胞因子风暴及系统性神经毒性等副作用时，则可注射商品化西妥昔单抗，通过NK细胞自身的ADCC作用，可清除体内基因工程改造以表达CAR的自然杀伤细胞。因此西妥昔单抗可作为NK细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，安全性能好，治疗副作用少，特异性高，能够运用在抗肿瘤的药物中。
[0054] 下面为具体实施例部分。
[0055] 以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。单位mM表示mmol/L，M表示mol/L。
[0056] 实施例1
[0057] 1、带EGFRt开关的c-Met嵌合抗原受体慢病毒载体的构建
[0058] 1.1 c-Met scFv序列
[0059] 利用本实验室筛选的抗c-Met的单克隆抗体序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列。
[0060] 1.2带EGFRt开关的c-Met CAR序列合成
[0061] 根据CAR各组分的序列，全长序列中含有信号肽SP、c-Met单链抗体(scFv)、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域、T2A、信号肽SP、EGFRt，合称为SP-c-Met scFv-CD8-41BB-DAP12-T2A-SP-EGFRt，结构图如图1所示。在整个框架5’端和3’端分别添加限制性酶切位点EcoR I和XhoI，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成整个表达框，合成后的序列(如SEQ ID No.6所示)克隆在pUC57载体，质粒命名为pUC57-c-Met/CAR-EGFRt。
[0062] 1.3 c-Met/CAR-EGFRt序列Gateway入门克隆的构建
[0063] (1)pUC57-c-Met/CAR-EGFRt质粒及Gateway入门载体pENTR 11vector分别用EcoR I/Xho I双酶切，体系如下表1所示。
[0064] 表1：酶切体系
[0065]质粒或载体 1ng
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
10×Buffer 5μL
加入ddH2O至总体积 50μL
EcoR I 1μL
Xho I 1μL
10×Buffer 5μL
加入ddH2O至总体积 50μL
[0066] 酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h。
[0067] (2)分别胶回收c-Met/CAR-EGFRt片段和pENTR 11载体酶切后大片段。
[0068] (3)c-Met/CAR-EGFRt片段和pENTR 11载体片段连接，体系如下表2所示。
[0069] 表2：连接体系
[0070]10×T4 DNA ligase buffer 2.5μL
c-Met/CAR-EGFRt片段 0.3pmol
pENTR 11载体片段 0.03pmol
T4DNA ligase 1μL
加入ddH2O至总体积 25μL
c-Met/CAR-EGFRt片段 0.3pmol
pENTR 11载体片段 0.03pmol
T4DNA ligase 1μL
加入ddH2O至总体积 25μL
[0071] 连接条件：16℃连接12小时。
[0072] (4)取连接产物转化至DH5α感受态细菌中，放置37℃细菌培养箱中过夜培养，挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切鉴定，将正确的Gateway入门克隆质粒命名为pENTR-c-Met/CAR-EGFRt。
[0073] 1.4 pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt慢病毒表达质粒的构建
[0074] (1)LR反应
[0075] LR反应是入门克隆pENTR-c-Met/CAR-EGFRt和目的载体pLenti7.3/V5-DEST vector发生的重组反应，重组之后得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt，其质粒谱图如图2所示。
[0076] LR反应体系如下表3所示。
[0077] 表3：LR反应体系
[0078]pENTR-c-Met/CAR-EGFRt(150ng/反应) 1μL～7μL
pLenti7.3/V5-DEST vector(150ng/μl) 1μL
TE Buffer，pH 8.0 加至总体积8μL
pLenti7.3/V5-DEST vector(150ng/μl) 1μL
TE Buffer，pH 8.0 加至总体积8μL
[0079] 冰上解冻 LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。加入1μL蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。
[0080] (2)LR反应产物的转化至DH5α感受态细菌中，步骤同上。
[0081] (3)阳性克隆的筛选与扩增
[0082] a).用枪头分别少量蘸取3个克隆后，将枪头置于10μL无菌水中，反复吹打。
[0083] b).吸取1μL菌液用于PCR，反应体系和条件如下表4所示。
[0084] 表4：阳性克隆的扩增反应体系
[0085]菌液 1μL
attB1引物(20μM) 1μL
V5反向引物(20μM) 1μL
Bio-rad super mix 6.25μL
ddH2O 15.75μL
总体积 25μL
attB1引物(20μM) 1μL
V5反向引物(20μM) 1μL
Bio-rad super mix 6.25μL
ddH2O 15.75μL
总体积 25μL
[0086] 反应条件如下表5所示。
[0087] 表5：阳性克隆的扩增反应条件
[0088]
[0089]
[0090] c).三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在2.6kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。
[0091] d).提取质粒，获得慢病毒表达质粒pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt，同时保存菌种。随机挑取LB平板上的三个克隆，用attB1引物和V5反向引物进行PCR扩增，产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，在2.6kb处出现清晰的条带(图3)，说明c-Met/CAR-EGFRt基因成功插入到pLenti7.3/V5-DEST表达载体中。
[0092] 2、带EGFRt开关的c-Met嵌合抗原受体慢病毒的包装制备
[0093] 2.1 Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10mL 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
[0094] 2.2Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5mL含10％FBS的Opti- I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
[0095] 2.3DNA- 2000复合物的制备
[0096] (a).将1.5mL无血清的Opti- I培养液加入5mL离心管中，加入9μg ViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt，轻柔混合。
[0097] (b).将1.5mL无血清的Opti- I培养液加入另一个5mL离心管中，加入36μL2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
[0098] (c).将(a)、(b)两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
[0099] (d).室温下孵育20min，得到DNA- 2000复合物。
[0100] 2.4将得到的DNA- 2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
[0101] 2.5 Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10mL DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48h～72h。
[0102] 2.6 Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15mL离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
[0103] 2.7吸取上清液，收集pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt慢病毒，分装入1mL冻存管中，置于-80℃长期保存。
[0104] 3、带EGFRt开关的c-Met特异性CAR-NK细胞的制备
[0105] 3.1分离健康志愿者PBMC细胞
[0106] (1)抽取健康志愿者外周血25mL，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自体血浆4℃保存备用。
[0107] (2)取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50mL，混匀，缓慢加到装有20mL人淋巴细胞分离液的50mL离心管中，室温离心(800g，15min)。
[0108] (3)吸取白膜层细胞，加入到装有5mL RPMI 1640的50mL离心管中。
[0109] (4)RPMI 1640洗涤两次(600g，10min离心)，收集细胞即为PBMC细胞。
[0110] 3.2 CAR-NK细胞的制备
[0111] (1)用含50ng/mL CD16单抗、1000U/mL IL-2、100ng/mL IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/mL，转入六孔板中，2mL/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
[0112] (2)每3天调整细胞密度为1×106/mL，添加含1000U/mL IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
[0113] (3)第7天，将NK细胞分成2组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μL/孔，每组设三个复孔。
[0114] 第1组：转染pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt，命名为c-Met/CAR-EGFRt组。按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)加入含有pLenti7.3-c-Met/CAR-EGFRt慢病毒颗粒的原液，取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μL，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。
[0115] 第2组：空白NK细胞对照组，命名为NC组。
[0116] 每组分别加入终浓度为6μg/mL的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
[0117] 第8天，细胞取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，用200μL Alys-505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
[0118] 第10天，收获成熟的细胞用于后续分析。
[0119] 测试一：
[0120] Western Blotting检测肿瘤细胞中c-Met的表达
[0121] 选取对数生长期的人肝癌细胞HepG-2和正常肝细胞L-O2，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取细胞蛋白，进行Western Blotting检测。结果如图4所示，肝癌细胞HepG-2检测到c-Met的表达，而正常肝细胞L-O2检测不到c-Met的表达。说明肝癌细胞中有c-Met表达。
[0122] 测试二：
[0123] 带EGFRt开关的c-Met特异性CAR-NK细胞体外抗肿瘤活性检测
[0124] (1)以实施例1制备的c-Met/CAR-EGFRt组细胞和NC组细胞分别作为效应细胞，CFSE标记的肝癌细胞HepG-2和正常肝细胞L-O2作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀，置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
[0125] (2)24h后，加入1μg/mL PI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检测CFSE+PI+细胞(死亡的HepG-2细胞和L-O2细胞)的百分率。
[0126] 具体地，以各组细胞作为效应细胞，用CFSE标记肝癌细胞HepG-2和正常肝细胞L-O2，作为靶细胞，应用流式细胞术检测NK细胞对肝癌HepG-2细胞和正常肝细胞L-O2的杀伤效率，实验结果如图5所示，c-Met/CAR-EGFRt组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为72.93％，NC组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为24.87％，c-Met/CAR-EGFRt组细胞对正常肝细胞L-O2的杀伤率约为1.2％，NC组细胞对正常肝细胞L-O2的杀伤率约为1.7％。说明实施例1制备的c-Met特异性CAR-NK细胞对肝癌细胞具有高效的杀伤作用，而对正常肝细胞无杀伤作用。
[0127] 测试三：
[0128] EGFRt开关有效性试验
[0129] 将c-Met/CAR-EGFRt组细胞和NC组细胞分别按照1×105/孔接种到六孔板，各设2个组，设为给药组和不给药组，给药组给予1ug/ml的西妥昔单抗(爱必妥)；培养72h后，台盼蓝染色计算活细胞比例。结果如图6所示，给药的c-Met/CAR-EGFRt组细胞活率为23.8％，不给药的c-Met/CAR-EGFRt组细胞活率为96.4％。NC组给药和不给药活率均为95％以上。说明实施例1制备的带EGFRt开关的c-Met特异性CAR-NK细胞可通过给予西妥昔单抗(爱必妥)终止其发挥作用，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。
[0130] 测试四：
[0131] 带EGFRt开关的c-Met特异性CAR-NK细胞动物体内抗肿瘤活性检测及开关安全性检测
[0132] 取对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1mL于裸鼠肩胛部皮下注射。实验分组及治疗情况见下表，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量裸鼠体重，观察体重变化情况；隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体积＝1/12π×a×b2。第(3)组治疗结束后第13天计算各组裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1-治疗组肿瘤平均体积/阴性对照组肿瘤平均体积)×100％。
[0133] 实验分组及治疗情况如下表6所示。
[0134] 表6：实验分组及治疗情况
[0135]
[0136]
[0137] *FAC化疗方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；环磷酰胺500mg/M2，第一天给药，21天一个疗程。
[0138] 实验结果表明，带EGFRt开关的c-Met特异性CAR-NK细胞进行体内抗肿瘤实验发现，各组裸鼠均存活，以阴性对照组裸鼠为参照，化疗组裸鼠体重下降，肿瘤体积减小，但进食及活动减少。
[0139] c-Met/CAR-EGFRt-NK治疗组裸鼠存活状况较为良好，体重无明显下降，且肿瘤体积明显较小，抑瘤率达到76.0％。而开关安全性测试组裸鼠存活状况较c-Met/CAR-EGFRt-NK治疗组有所下降，抑瘤率达仅为10.1％。体重情况和肿瘤抑制率统计结果见表7。
[0140] 表7：各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率的比较
[0141]
[0142]
[0143] 以上实验结果说明制备的带EGFRt开关的c-Met特异性CAR-NK细胞能够有效抑制体内肿瘤的生长，且开关具有有效性。西妥昔单抗可作为NK细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，安全性能好，治疗副作用少，特异性高。
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