抑菌微量元素螯合物及其在动物饲料中的用途
阅读：1072发布：2020-07-27
专利汇可以提供抑菌微量元素螯合物及其在动物饲料中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及微量元素有机O螯合或N螯合复合化合物，用于抑制兼性病原性细菌。本发明进一步涉及包括所述化合物的组合物、 饲料 添加剂或饲料，及其制备方法和其在动物 畜牧业 中的用途。，下面是抑菌微量元素螯合物及其在动物饲料中的用途专利的具体信息内容。
1.一种微量元素有机螯合复合化合物，用于抑制病原性细菌，具有通式
(M)n(X)m(Y)o
其中，M是Zn、Cu、Fe、Mn、Ag；
X是NH4、H2O；
Y是氨基酸(优选选自由20种天然氨基酸构成的组)，脂肪酸(优选甲酸、乙酸或丙酸)、羟基酸(优选顺丁烯二酸、乳酸)和/或聚氨基-羧基酸(优选氮三乙酸或乙二胺四乙酸)；
n为0-6；
m为1-6；
o为1-8。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述兼性病原性细菌选自由沙门氏菌、大肠杆菌、梭菌属、短螺旋菌属、隐秘杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、劳森氏菌属和埃默氏菌属(Eimerella sp)构成的组。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述病原性细菌选自由肠炎沙门氏菌、肠炎沙门氏菌亚种血清型肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、鸡沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、马流产沙门氏菌、爪哇沙门氏菌、霍乱沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、仙台沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、巴氏梭菌、索氏梭菌、肉毒梭菌A-F、诺氏梭菌A、B、C、D、腐败梭菌、气肿疽梭菌、海斯特里提科姆梭菌、生孢梭菌、破伤风梭菌、猪痢疾短螺旋菌、结肠菌毛样短螺旋菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、胞内劳森氏菌构成的组。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，用于治疗或预防选自由下述疾病组成的组的疾病：家禽肠道疾病，猪肠道疾病，牛肠道疾病；以及用于表皮处理、例如家禽的伴有坏死性皮炎的溃疡性蹄皮炎，乳牛的乳腺炎，乳牛的子宫炎，蹄类动物的蹄病变和其他动物的肠道和表皮疾病。
5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物，选自由下述化合物组成的组：四铵·双-甘氨酸螯合锌、顺丁烯二酸螯合锌、二铵·顺丁烯二酸螯合锌、四铵·顺丁烯二酸螯合锌、二铵·蛋氨酸螯合锌、二铵·赖氨酸螯合铜、二铵·氨基酸螯合锌，优选单-甘氨酸螯合锌、二-甘氨酸螯合锌、双-甘酸螯合锌、单-甘氨酸螯合铜、二-甘氨酸螯合铜、双-甘酸螯合铜、二铵·双-顺丁烯二酸螯合锌、双-顺丁烯二酸螯合锌、双-顺丁烯二酸螯合铜、二铵·双-顺丁烯二酸螯合铜，更优选单-甘氨酸螯合锌、单-甘氨酸螯合铜、二铵·双-顺丁烯二酸螯合锌、二铵·双-顺丁烯二酸螯合铜、二铵·乙二胺四乙酸螯合锌、二铵·乙二胺四乙酸螯合铜，更优选二铵·双-顺丁烯二酸螯合铜、二铵·乙二胺四乙酸螯合锌、(H2O)2·乙二胺四乙酸螯合锌、(H2O)2·顺丁烯二酸螯合锌、二铵·乙二胺四乙酸螯合铜、(H2O)2·乙二胺四乙酸螯合铜、(H2O)2·双-甘氨酸螯合铜、(H2O)2·双-甘氨酸螯合铜、铵·双-甘氨酸螯合铜。
6.根据权利要求1-5任一项所述的化合物，用于抑制在消化道的小肠部分中或在皮肤表皮上增生的、且在这些地方引起疾病的细菌，和/或用于预防或治疗由所述细菌引起的疾病。
7.组合物，所述组合物包括根据权利要求1-6任一项所述的化合物，可选地还包括标准添加剂。
8.组合物，所述组合物包括根据权利要求1-6任一项所述的至少两种协同地作用的化合物，可选地还包括标准添加剂。
9.饲料添加剂，所述饲料添加剂包括根据权利要求1-6任一项所述的化合物或根据权利要求7或8任一项所述的组合物。
10.根据权利要求9所述的饲料添加剂，所述饲料添加剂以可释放形式来自适用的载体物质，所述载体物质为粉末和/或微颗粒，所述饲料添加剂含水量不超出12％-14％，优选12％。
11.饲料，所述饲料包括根据权利要求1-6任一项所述的化合物、或根据权利要求7或
8任一项所述的组合物、或根据权利要求9或10任一项所述的饲料添加剂。
12.制备饲料添加剂的方法，所述方法包括将根据权利要求1-6任一项所述的化合物、或根据权利要求7或8任一项所述的组合物，可选地进一步和标准饲料添加剂成份混合。
13.制备饲料的方法，所述方法包括将根据权利要求1-6任一项所述的化合物、或根据权利要求7或8任一项所述的组合物、或根据权利要求9或10任一项所述的饲料添加剂混合至标准饲料。
14.根据权利要求1-6任一项所述的化合物、或根据权利要求7或8任一项所述的组合物、或根据权利要求9或10任一项所述的饲料添加剂或根据权利要求11所述的饲料在畜牧业中用于提高增重、和/或提高饲料利用率、和/或提高蛋产量、和/或降低家禽群体和/或猪群体和/或奶牛群体的死亡率的用途，所述家禽优选为肉鸡或蛋鸡或火鸡，所述猪优选为肥猪或猪仔。
抑菌微量元素螯合物及其在动物饲料中的用途
[0002] 矿物质对活生物体的生理和生化运作(operation)起到多种多样且必不可少的作用。矿物质是酶(Zn、Cu、Mn、Mg、Fe)和维生素(Co)及其他的组成成份。矿物质在不同的保护机制中具有决定性作用(Cu、Zn、Fe、Se)。矿物质在造血中起作用(Cu、Fe)，矿物质在繁殖中起作用(P、Cu、K、Mn、Zn、Mg)。它们促进核酸和蛋白质的合成。饲料农作物的矿物质含量取决于若干因素，例如植物的分类类别(taxonomical place)、土壤的组成和pH、降水年分布、农艺技术，并且显示出非常高的差异性。在干旱期间，饲料农作物的矿物质含量降低。饲料农作物的矿物质含量在植物的物候期初期增加，然后在到达中期后开始降低。收割时出现的浸出或者旗瓣植物的叶片损失的情况，也伴有重大的矿物质含量损失。在土壤补充期间，放弃牲畜粪肥的使用打断了土壤的再循环平衡，土壤继续被酸化并变贫瘠。
[0003] 在牲畜之中，为了确定喂食饲料(fodder)的动物(猪、家禽)对矿物质的最低需求，相比于喂食粗饲料(roughage)的那些牲畜，我们现在可以更好地依靠如饲料表中所提供的饲料农作物的矿物质含量。在植物的胚芽部分(例如种子)，矿物质含量的起伏不及茎叶部分(例如茎、叶子)大。但即使如此，种子中的变化可能是2-3倍。然而，培育出高产量的牲畜需要升高的且平衡的矿物质(包括微量元素)补充。目前，仅主要使用不同的矿物质盐通过将微量元素混合进所提供的饲料中来满足这一需求。
[0004] 所需补充的水平在不知道基础饲料的组成和饲料添加剂(additional fodder)的数量的情况下不能按计划进行。该需求根据物种、年龄组、使用方式而不同。可以以两种方式确定饲料中供给的矿物质不足。首要不足是当指定的元素在饲料中不足的时候。次要不足发生在身体不能利用添加至饲料中的元素的时候，例如，吸收元素所必要的因子的缺失，或者对抗性元素的显性(dominance)抑制了指定元素的吸收。(库卡克-施密特(Kakukk-Schmidt)，1988)。
[0005] 微量元素属于一组矿物质化合物，以非常小的量出现于植物或动物体内的金属或非金属元素。基于它们的功能，它们可以用作为静态的、稳态的或酶的(Fe、Zn、Cu、Mn、Mo、I、Ni、Se、Cr)元素。在缺乏它们的情况下，可以将其归类为必需元素，然而，在高浓度时它们可能是有毒的。因此某些微量元素取决于它们存在于有机体中的浓度，可能是必需的或有毒的(库卡克-施密特，1988)。这些矿物质可以以离子形式吸收，如阳离子或阴离子，或耦合至载体蛋白，或通过有机体内的主动转运(除了钾)。金属离子可以与电子供体配体可逆地形成键合的金属复合物，这就是所谓的螯合物。这一过程消耗大量的三磷酸腺苷(ATP)(库卡克-施密特，1988)。正电荷金属离子充当水环境中的路易斯酸，这样能够与电子供体(路易斯碱)反应而形成复合物、配合物和配离子。螯合物的静电效应仅仅可以在水相(aquachelates)中观察到。这样，其他不溶性化合物在以金属复合物形式被溶解后成为可溶性的。以海藻水解物或海藻酸盐产生的腐殖酸和腐殖酸螯合物进行的早期研究，证明了金属螯合物比金属盐更好地被利用。它们没有广泛扩散，因为它们虽然所需很少，但生产的成本非常高(库卡克-施密特，1988)。
[0006] 元素的生物效应极大地受到它们的化学形式的影响。金属盐，例如氯酸盐、硫酸盐，要比氧化物或碳酸盐更好地被利用(库卡克-施密特，1988)。尽管事实是这些元素主要以有机化合物存在于植物体内，但产生预混合的工厂使用微量元素的无机形式。过去10-15年的科学研究明确表明：对比于无机形式，使用有机键合的微量元素是有利的。含金属的有机复合物是形成于生物系统中的一种主要化合物。金属离子占据复合物的中心位置，离子、分子、天然有机化合物(氨基酸、多肽、蛋白、碳水化合物等)，即配体连接到金属离子上。当某些离子连接至配体的两个或多个原子上时，该金属离子与有机化合物之间的化学反应产生螯合物。具有金属-配体交互作用的螯合化合物对生物体是最有价值的，因为这些复合5 7
物中的金属活性比离子形式中的金属活性高出了10-10倍。
物中的金属活性比离子形式中的金属活性高出了10-10倍。
[0007] 螯合物基于它们的功能可以是转移螯合物、贮存螯合物或代谢螯合物。代谢螯合2+ 2+
物是具有卟啉支架的化合物(例如血红蛋白、叶绿素)，在核内具有Fe 、Cu 离子及其他。
转移螯合物通常是氨基酸(例如甘氨酸、胱氨酸、组氨酸)，且很少情况下也可以是多肽(库卡克-施密特，1988)。就多数微量元素来说，形成下述螯合物：以氨基酸、蛋白质、有机酸等形成的复合物，其中，蛋白质(氨基酸)微量元素复合物是基本的。为了降低动物的充分的
2+ 2+ 2+ 2+ 3+
Fe 、Mn 、Cu 、Zn 和Cr 离子需求，比牲畜饲养领域中目前可用的一种饲料添加剂更好利用的饲料添加剂是必要的。由文献可知，有机形式提供的微量元素更好地被利用，但利用水平取决于所用的化合物的化学结构。除更好的微量元素利用之外，就微量元素混合至饲料来说，元素的交互可能被显著降低(杜(Du)，1994；史(Shi)等，1995；马汉(Mahan)，1997)。
物是具有卟啉支架的化合物(例如血红蛋白、叶绿素)，在核内具有Fe 、Cu 离子及其他。
转移螯合物通常是氨基酸(例如甘氨酸、胱氨酸、组氨酸)，且很少情况下也可以是多肽(库卡克-施密特，1988)。就多数微量元素来说，形成下述螯合物：以氨基酸、蛋白质、有机酸等形成的复合物，其中，蛋白质(氨基酸)微量元素复合物是基本的。为了降低动物的充分的
2+ 2+ 2+ 2+ 3+
Fe 、Mn 、Cu 、Zn 和Cr 离子需求，比牲畜饲养领域中目前可用的一种饲料添加剂更好利用的饲料添加剂是必要的。由文献可知，有机形式提供的微量元素更好地被利用，但利用水平取决于所用的化合物的化学结构。除更好的微量元素利用之外，就微量元素混合至饲料来说，元素的交互可能被显著降低(杜(Du)，1994；史(Shi)等，1995；马汉(Mahan)，1997)。
[0008] 根据研究结果和实践经验，有机键合的微量元素的吸收和生物效应是更有利的，然而，必须为每一微量元素和每一动物物种确定适用于满足需求的量。这甚至是更重要的，因为饲料内可给予的微量元素的最大水平，由于严格的饲料安全和环境管制(理当如此)连续降低。降低意味着某些情况下，动物的微量元素需求只可以用更优地或很好地被吸收的微量元素供应来满足。
[0009] 同时，若干无机化合物具有抑菌作用(例如，硫酸铜、氧化锌)。在我们自己的实验中，我们发现含金属产物(酿酒酵母(Se-yeast)产物)也具有抑菌性质，该含金属产物为有机键合的金属复合物。然而，这一作用不能实际使用，因为所用的微量元素的水平对动物是有毒的。在工业发酵期间也应用了CuSO4和ZnSO4的相似作用，其中，有毒的微量元素的浓度是更随意的。惠特克(Whittaker)及其工作伙伴(1993)在他们的实验中发现螯合键合的含有金属盐的金属化合物例如对抵制幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是有用的。美国专利NO.6429225报道了相似的发现。应注意的是，幽门螺杆菌由于若干理由是特别的病原体，例如幽门螺杆菌在胃的高度酸性环境中存在。此外，关于普遍存在于肠道菌群中的细菌是否且如何对有机金属螯合化合物作出反应，以及如果真的发生反应，应该尝试什么类型的该化合物，由现有技术的螯合物的抗-幽门螺旋杆菌的性质，并没有得出确定性结论。
[0010] 若干专利申请公开了金属螯合复合物在畜牧业中的用途。
[0012] 专利申请NO.CN101941931A(湖北神州化工有限公司；2011，01，12)公开了蛋氨酸金属螯合物的制备方法。蛋氨酸和可溶金属盐(例如硫酸铜、氯化铜、硫酸锌、氯化锌、三氯化铜、硫酸铁、氯化铁)在乙醇的存在下混合在一起，且在40-150℃下保持该混合1-8小时，然后过滤并干燥。该蛋氨酸金属螯合物用于动物饲料。
[0013] 专利申请NO.CN101838214A(中国科学院亚热带农业生态研究所；2010，09，22)公开了DL-苏氨酸螯合铜的制备方法。该DL-苏氨酸螯合铜由精氨酸螯合铜和乙醛制备。该DL-苏氨酸螯合铜也用于动物饲料。
[0014] 专利申请NO.CN101744120A(河北农业大学；2010，06，23)公开了制备用于乳猪的微量元素饲料。该饲料包括双-精氨酸螯合铁、精氨酸锌、精氨酸铜、硫酸锰、碘化钾和酵母。
[0015] 专利申请NO.CN102150751A(唐山师范学院；2011，08，17)公开了在毛皮动物饲料中有帮助的预混合。除其他外，该预混合包括铁、锌、锰、铜、硒的氨基酸螯合物，且优选地在毛皮动物的孕期和哺乳期使用。
[0016] 上述文献的目标在于具有更好吸收性能的金属化合物的制备。
[0017] WO 2009/066117公开了EDTA或其盐用于治疗由猪痢疾短螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriaea.)引起的猪痢疾的用途。
[0018] WO2004/080210公开了锌和铜的金属盐，以及无机酸的和有机酸的简单复合物，还公开了它们的抑菌性质，通过用微包衣(micro-encapsulation)工艺使它们在消化道的第一段不被吸收。
[0019] 我们在有机螯合物的作用机制中的新发现是某些复合化合物——其自身或组合物——能够在肠道内抑制病原体细菌的增殖，因此允许正常肠道菌群(乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium))的有用成员的优势(predominance)。现有技术没有表明氨基酸微量元素螯合复合物的抑菌作用。
[0020] 因此，本发明涉及一种微量元素有机螯合复合物，用于抑制病原性细菌，具有通式[0021] (M)n(X)m(Y)o
[0022] 其中，M是Zn、Cu、Fe、Mn、Ag；
[0023] X是NH4、H2O；
[0025] n为0-6；
[0026] m为1-6；
[0027] o为1-8。
[0028] WO2009/066117公开了EDTA及其盐用于治疗由猪痢疾短螺旋菌引起的猪痢疾的用途。在这里使用的EDTA或EDTA钠的有效性次于根据本发明所述的微量元素EDTA水螯合复合物或微量元素EDTA铵螯合复合物的有效性。用水分子或铵分子形成的螯合复合物产生类似的有利的螯合物结构，其充当铁载体类似物和/或抗生素结合和/或QS信号分子结合分子，并以约10-500mg/kg的最小浓度抑制病原性细菌。
[0029] 在WO2004/080210中，化合物由于其微包衣技术在消化道的第一段中是不被吸收的，化合物据此发挥它们的抑菌作用，与WO2004/080210相比，本发明基于如下发现：如果除了微量元素的复合物，我们制备了微量元素的O螯合物和N螯合物，则如此形成的特殊化合物的微生物活性要高于这些微量元素的简单复合物的微生物活性。根据这一新发现，除了O和N螯合复合形成的化合物，水分子或另一O螯合形成的分子、或铵或另一N螯合形成的分子应该存在配位键，这取决于微生物。
[0030] 所用的氨基酸优选选自由20种天然氨基酸构成的组。
[0031] 所用的脂肪酸优选选自由甲酸、乙酸、丙酸和丁酸构成的组。
[0032] 所用的羟基酸优选为顺丁烯二酸或乳酸。
[0034] 在进一步的实施例中，本发明涉及一种化合物，其中，病原性细菌选自由下述细菌构成的组：肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、肠炎沙门氏菌亚种血清型肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica subp.Enterica serovar enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)、鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarium)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、马流产沙门氏菌(S.abortus-equi)、爪哇沙门氏菌(S.java)、霍乱沙门氏菌(S.cholerae)、猪伤寒沙门氏菌(S.typhi-suis)、仙台沙门氏菌(S.sendai)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、索氏梭菌(Cl.Sordellii)、肉毒梭菌A-F(Cl.botulinum A-F)、诺氏梭菌A、B、C、D(Cl.novyy A,B,C,D)、腐败梭菌(Cl.septicum)、气肿疽梭菌(Cl.chuvoei)、海斯特里提科姆梭菌(Cl.hystoliticum)、生孢梭菌(Cl.sporogenes)、破伤风梭菌(Cl.tetani)、猪痢疾短螺旋菌(Brachyspira hyodysenteriaea)、结肠菌毛样短螺旋菌(Brachyspira pilosicoli)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium piogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)。
[0035] 在优选实施例中，本发明涉及一种化合物，用于治疗或预防疾病，该疾病选自由下述疾病构成的组：家禽肠道疾病，猪肠道疾病，牛肠道疾病；以及用于表皮处理、例如家禽的伴有坏死性皮炎的溃疡性蹄炎，乳牛的乳腺炎，乳牛的子宫炎，蹄类动物的蹄病变和其他动物的肠道疾病和表皮疾病。
[0036] 在特别优选的实施例中，本发明涉及一种化合物，该化合物选自由以下组成的组：四铵·双-甘氨酸螯合锌、顺丁烯二酸螯合锌、二铵·顺丁烯二酸螯合锌、四铵·顺丁烯二酸螯合锌、二铵·蛋氨酸螯合锌、二铵·赖氨酸螯合铜、二铵·氨基酸螯合锌，优选地，单-甘氨酸螯合锌、二-甘氨酸螯合锌、双-甘氨酸螯合锌、单-甘氨酸螯合铜、二-甘氨酸螯合铜、双-甘氨酸螯合铜、二铵·双-顺丁烯二酸螯合锌、双-顺丁烯二酸螯合锌、双-顺丁烯二酸螯合铜、二铵·双-顺丁烯二酸螯合铜，更优选地，单-甘氨酸螯合锌、单-甘氨酸螯合铜、二铵·双-顺丁烯二酸螯合锌、二铵·双-顺丁烯二酸螯合铜、二铵·乙二胺四乙酸螯合锌、二铵·乙二胺四乙酸螯合铜，更优选地，二铵·双-顺丁烯二酸螯合铜、二铵·乙二胺四乙酸螯合锌、乙二胺四乙酸螯合铜。在上述化合物的例子中，该螯合物的类别包括：除了盐，还有所谓的O螯合，例如H2O，还有所谓的N螯合，例如铵。
[0037] 在进一步的实施例中，本发明涉及一种化合物，用于抑制消化道小肠部分细菌增殖和细菌引起疾病，和/或用于预防或治疗所述细菌引起的疾病。
[0038] 另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包括根据本发明所述化合物，可选地还包括标准添加剂。
[0039] 在进一步优选实施例中，本发明提供一种组合物，该组合物包括根据本发明所述的至少两种协同地作用的化合物，可选地还包括标准添加剂。
[0040] 在特别优选实施例中，该组合物包括根据本发明所述的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或更多种不同的、协同地作用的化合物，可选地还包括标准添加剂。
[0041] 另一方面，本发明提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂包括根据本发明所述的化合物或组合物。
[0042] 在进一步的实施例中，本发明涉及一种饲料添加剂，该饲料添加剂以可释放形式存在于适用的载体上，该载体优选为颗粒。
[0043] 在更进一步的实施例中，本发明涉及一种饲料，该饲料包括根据本发明所述的化合物、组合物或饲料添加剂。
[0044] 在进一步的实施例中，本发明涉及一种饲料添加剂的制备方法，所述方法包括将根据本发明所述的化合物或组合物混合，可选地进一步和标准添加剂成份混合。
[0045] 在更进一步的实施例中，本发明涉及一种饲料的制备方法，所述方法包括将将根据本发明所述的化合物、组合物或饲料添加剂混合至标准饲料。
[0046] 在另一实施例中，本发明涉及根据本发明所述的化合物、组合物、饲料添加剂或饲料在畜牧业中用于提高增重、和/或提高饲料利用率、和/或提高蛋产量、和/或降低家禽群体和/或猪群体和/或奶牛群体的死亡率的用途。
[0047] 通过选择合理的配体，金属有机螯合物的用途的优势进一步得到脂肪的支持，添加剂也更便宜。组合物的生产非常便宜，这样提供了雄厚的价格优势。它们因其抑菌/杀菌性质作为预防剂，在经济生产中起到重要作用。该组合物对恢复肠道菌群的平衡、对肠道菌群的生产以及对抗对动物的健康有风险的兼性病原性微生物是有效的。除了不良饲料的使用导致的经济损失和动物损失，具有感染种群的农场的抗生素年度花费是非常高的。在一些例子中，例如，在指定工厂的猪养殖中用于对抗猪痢疾的组合物的花费可能超出所用药剂的花费的70％。治疗费用大约为平均2-7.5美元($)/动物。这一治疗可以替换为微量元素金属有机螯合物预混合料。
[0048] 此时，以有机形式提供的甘氨酸铜和甘氨酸锌不仅应用较好，而且出人意料地具有微生物抑制作用。彼此相互组合的有机键合型微量元素螯合物组合物对恢复肠道菌群的平衡、对肠道菌群的生产以及对抗对动物的健康有风险的兼性病原性微生物是有效的。该有机螯合复合物对于由若干兼性病原性细菌引起的病因复杂的疾病可能是有效的，例如猪结肠炎。
[0049] 表1.猪养殖中病原性细菌的发生率
[0050]
[0051] 有机螯合物的作用机制的一个重要因子是它们能够抑制肠道内病原性细菌的增殖，因此允许正常肠道菌群的有用成员的优势。我们已研究了若干类型的微量元素化合物以确定它们对细菌/真菌增殖的影响，例如单-甘氨酸螯合物、二-甘氨酸螯合物、双-甘氨酸螯合物、蛋氨酸螯合物、赖氨酸螯合物、顺丁烯二酸螯合物、丙酸螯合物、硬脂酸螯合物、戊酸螯合物、丁酸螯合物、O螯合物和/或N螯合物。在确定单独的微量元素螯合物的MIC值的过程中，我们选择了具有经济效益的最佳组合，且该研究继续关注螯合物的交互作用如何影响它们的生物性质。此外，服用(administration)微量元素的一个基本问题是如何预防金属离子在吸收前与肠道菌群的其他成份的交互作用，且这可以通过提供目前在专利保护下的配方来实现。
[0052] 微量元素，例如铁、铜、锌，在专性好氧微生物和兼性好氧微生物的代谢中起主要作用，但它们以微量存在于环境中。植物内铁的可用度的低水平主要是由于氢氧化三铁聚合物的低溶解性。举例来说，在充分氧化的植物器官内，铁的溶解度主要取决于Fe(OH)3。这-38 3+ -17些化合物的溶解度常数(Ksol＝10 )非常小，因此pH为7时Fe 的浓度为10 ，而允许植-6
物正常生长的最小浓度是10 M[尼兰兹等(1987)]。正是指定微环境的细菌菌群的微量元素获取策略负责解决上述矛盾。在这样的环境中，大多数具有精细构造且具有高效的铁获取机制和/或微量元素获取机制的那些物种可以生存或“称霸(dominate)”。植物针对这些目的利用了微生物的帮助。
物正常生长的最小浓度是10 M[尼兰兹等(1987)]。正是指定微环境的细菌菌群的微量元素获取策略负责解决上述矛盾。在这样的环境中，大多数具有精细构造且具有高效的铁获取机制和/或微量元素获取机制的那些物种可以生存或“称霸(dominate)”。植物针对这些目的利用了微生物的帮助。
[0053] 微生物可以使用三种主要的机制去溶解不溶性的微量元素和/或如Fe(Ⅲ价)的氧化物：质子化、还原和螯合形成(chelate forming)。质子化通过转换平衡常数引起例如Fe(OH)3复合物的解离增加(pH减小一个单位导致Fe(Ⅲ)离子的溶解度增加1000倍)。显然的是，这只可以与自然界中的一些限定一起使用。在同一pH，Fe(Ⅲ)转换至Fe(Ⅱ)导致溶解度显著地增加。然而，这一过程的步骤具有高能量需求。
[0054] 在现实领域普遍的螯合形成借助于所谓的铁载体发生，主要通过微生物产生。在当微生物环境中的可用微量元素较少的情况下，许多生物体开始产生低分子量的代谢物、3+
铁载体和部分的外膜蛋白，它们对物种(species)具有特异性且对例如Fe 离子具有亲和力(外膜蛋白在Fe-铁载体复合物的识别和铁的吸附中具有作用[威戈(Weger)等(1986)])，这些成份溶解来自矿物质和有机化合物(例如转运蛋白和乳铁蛋白)的微量元素。铁载体是小分子量、物种专一的、二价配体分子，该分子主要在八面体方向上利用六个
3+
键通过氧原子连接至Fe(Ⅲ)离子，并以螯合物形式占有来自环境的Fe 且将他们转运至微生物细胞中[尼兰兹，J.B.(1981)；梁(Leong)，J.(1986)]。微量元素转运至细胞的细胞质中这一过程由专一的膜受体以及识别铁-铁载体复合物的运输系统调节。这样，具有轻度酸性、中性或碱性环境的小肠内的微生物的铁载体的产生是重要且普遍的现象，该现象是微生物的增殖能力所必须的。
铁载体和部分的外膜蛋白，它们对物种(species)具有特异性且对例如Fe 离子具有亲和力(外膜蛋白在Fe-铁载体复合物的识别和铁的吸附中具有作用[威戈(Weger)等(1986)])，这些成份溶解来自矿物质和有机化合物(例如转运蛋白和乳铁蛋白)的微量元素。铁载体是小分子量、物种专一的、二价配体分子，该分子主要在八面体方向上利用六个
3+
键通过氧原子连接至Fe(Ⅲ)离子，并以螯合物形式占有来自环境的Fe 且将他们转运至微生物细胞中[尼兰兹，J.B.(1981)；梁(Leong)，J.(1986)]。微量元素转运至细胞的细胞质中这一过程由专一的膜受体以及识别铁-铁载体复合物的运输系统调节。这样，具有轻度酸性、中性或碱性环境的小肠内的微生物的铁载体的产生是重要且普遍的现象，该现象是微生物的增殖能力所必须的。
[0055] 具有专业喂养知识的专业人员由实践经验得知，用缺乏微量元素(Zn、Cu、Fe、Mn等)的饲料喂养的动物更易于患有肠道疾病。该疾病不能通过服用微量元素被解除，但伴有平衡的微量元素供应，肠道起源的疾病的发生率是较小的。
[0056] 正常肠道菌群的成份以显著量存在，以大约109-1010CFU/ml存在于小肠内。在多数例子中，这些成份是主要产生乳酸且提供轻度酸性pH的有益的乳酸菌、双歧杆菌，因此它们不需要产生铁载体。所谓的病原性细菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌、短螺旋菌，以5
小于10CFU/ml的最大量存在于健康的肠道菌群内。
小于10CFU/ml的最大量存在于健康的肠道菌群内。
[0057] 根据最新文献，肠道系统内病原性微生物和非病原性微生物之间的平衡归因于pH。这一假设有实际基础，因为乳酸菌在酸性pH范围内增殖并产生酸，例如乳酸。病原性微生物在中性或轻度碱性范围内增殖，在该范围内，正常肠道菌群的成员不能增殖。这一关于pH的发现是畜牧业中含有益生菌、乳酸菌的组合物的数十年长期使用的基础。必须注意的是，该处理的结果是多变的，在一些例子中它出人意料地有效，但在其他例子中完全无效。
[0058] 我们想要为肠道问题的治疗提供一种相比于本领域的最新状态，全新的出人意料的可能性。微量元素螯合物由于它们的专一性结构具有更好的吸收和应用性质且出人意料地能够抑制兼性病原性微生物的增殖。用于治疗的化合物的范围是广泛的。在益生菌的情况中，使用了若干不同的微生物且所用的微生物的组合根据所期望的效果是变化的。在禽类和猪的情况中使用了不同的微生物。基于我们的最新发现，这是完全必要的，因为在禽类的情况中引发问题的病原性微生物的组合不同于用于猪的组合。
[0059] 我们推断所谓的铁载体螯合物形成配体对正常微生物群落与病原性微生物的比例的形成起主要作用，由于产生铁载体的病原性细菌“渴望”金属离子，这种作用在小肠内轻度碱性或中性环境内具有优势。因此，当根据本发明所述的微量元素螯合物出人意料地连接至细菌的与膜受体结合的铁载体时，病原性细菌在它们的微量元素摄取中将不具有优势并因此不再增殖。
[0060] 大肠内肠道菌群的成份完全不同于小肠内肠道菌群的成份。并不是例如乳酸菌称霸肠道菌群，而是例如梭菌称霸肠道菌群，即大肠具有病原性称霸的肠道菌群。然而，已知的是，微量元素的吸收发生在小肠后段。基于此，我们也推断铁载体螯合物形成因子(是包含一种或多种微量元素的复合化合物)在长期发炎的大肠内为细菌产生这些铁载体配体提供了独有的优势——这是于禽类中所发现的频繁的临床状态。基于上面的内容，紧随而至的是必须要发现一种微量元素化合物，该微量元素化合物可以抑制存在于肠道内的病原性的、产生铁载体的微生物，且该微量元素化合物由微量元素和有机化合物的结合体构成。此外，如果用于使含微量元素的铁载体受体饱和的作用是真实的，则需要对小肠进行搜索以找到这样的化合物：该化合物能够以低浓度抑制病原性微生物的增殖而以较高浓度影响非病原性的但产生铁载体的、形成正常肠道菌群的肠道菌。
[0061]
[0062] 铁载体结构：A、B和C型铁载体和D、E和I型铜载体(copper siderophores)。
[0063] 进一步的作用是微量元素有机螯合铁载体型配体与抗生素分子耦合，该抗生素分子抑制繁殖或细胞合成，因此病原性细菌用其铁载体受体占用了抗生素分子。这样，可以用抗生素耦合的有机螯合物实现比单独的抗生素化合物更有效的抑制或致死作用。
[0064] 进一步的作用是通过细菌细胞之间的信息交流——群体效应(QS)——细菌能够同步它们的遗传作用并当其大量增殖时产生某些化合物。当细菌达到他们所称的繁殖且形成一层“菌膜”的数量时，上述过程就会发生，例如在肠表面上或伤口区域上。当它们在血液中足量，达到受袭生命体的最远点时，上述过程也会发生。所分泌的QS信号分子的浓度的增加是细菌开始集中增殖的信号。该QS分子主要是长链脂肪酸、醌醇、脂肪酸甲酯、N-酰基高丝氨酸化合物，且近似于铁载体，并连接至细菌的专一性受体。根据我们的假设，这些受体——近似于铁载体——可以专一地受到微量元素有机螯合化合物的饱和，这样，该QS信号分子不能发挥其作用。这阻止了细菌之间的信息交流及其增殖、定殖以及菌膜形成。
[0065] 在我们的实验中，我们研究了在有机结合中主要由Zn、Cu、Mn和Fe作为微量元素的化合物。随着更有效的微量元素源对某些病原性微生物具有选择性抑制作用，我们确定已知的微量元素甘氨酸物(trace element malonates)、微量元素蛋氨酸物、微量元素丙二酸物等已用于饲料业。通过微量元素螯合物(O螯合物和N螯合物)的组合可以提高选择性和生物活性。用氨基酸可以实现选择性的生物活性，例如蛋氨酸、赖氨酸、甘氨酸等，单价酸(monovalent acid)，例如乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸等，羟基酸，例如乳酸等，双羧酸，顺丁烯二酸，聚羧酸。上述酸的带Zn、Cu、Mn和Fe的盐。出人意料地，在O螯合物形成的例子中，优选用水分子螯合，或者N螯合物形成的例子中，优选用铵螯合，微生物活性显著增加。
[0066] 提及的微量元素是所谓的螯合形成化合物，因此我们针对带有生物效应的上述微量元素的N螯合化合物和O螯合化合物扩展了我们的研究。
[0067] 进一步地，我们制备了螯合化合物，该螯合化合物除了上述描述的N螯合和O螯合的形成，包含0-6个氨分子或0-6个水分子与中心金属离子螯合结合。
[0068] 微量元素的甘氨酸螯合物可以极其近似于铁载体的结构，这样通过连接至细胞的铁载体受体可以防止微生物对微量元素(例如铁)的利用，进而细胞死亡。因此，铁、锌、铜、锰的甘氨酸螯合复合物因为其结构而能够占用细菌细胞的膜受体，优选地，利用其对指定细菌细胞的物种专一性膜受体的专一性亲和力，直接影响微量元素的供给且因此影响活性、繁殖，因此优选地影响细胞死亡。该作用取决于指定细菌物种、菌株的受体敏感性，因此某些物种或菌株可能是不敏感的，从而可以这么说，微量元素螯合物的作用是物种专一性的，且每一细菌组需要单独的微生物措施以获得适当有效的MIC和/或优选有效的CID效果。
[0069] 根据一些研究，所开发的微量元素螯合物，例如微量元素的甘氨酸螯合物，完全抑制了甚至在血液中存在的革兰氏阳性菌的增殖。微量元素螯合物对假单胞菌菌株的增殖的抑制作用较弱，但对其他革兰氏阴性菌以及对真菌的作用较强。目前为止用不同的微量元素螯合提取物进行的研究明显证明了它们对多样化的病原性微生物和食品变质微生物的作用。根据这些研究，微量元素螯合物对革兰氏阳性菌的活性较高，高于对革兰氏阴性菌的活性，而在其他组合物中，在体外条件下我们也发现了对革兰氏阴性菌所声称的作用。
[0070] 在禽类(肉鸡、蛋鸡、火鸡)的坏死性肠炎的例子和急性猪痢疾的例子中，在肠道菌群中，肠球菌(enterococci)和乳酸菌的数量显著降低，但此时，梭杆菌(fusobacteria)、拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、大肠杆菌和某些大肠型细菌，以及梭菌属细菌的数量增加了。在长久持续的例子中，梭菌属细菌的增加是明显的。由于所有的这些结果，我们的研究进行至这一方向：根据我们的液体培养和琼脂扩散试验，微量元素的甘氨酸螯合物部分地或完全地抑制藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌菌株的生长。对每一菌株用生物学检测法测量并确定最小抑制浓度或最小致死浓度(MIC或CID)。
[0071] 通过将铜和锌的氨基酸螯合化合物组合在一起，我们能够提高细菌抑制能力。以琼脂扩散试验和液体培养生物学鉴定法确定微量元素螯合物的混合物的优选比例。当以微生物学观点研究金属螯合复合物的作用时，我们看到，当以某些浓度服用时，这些螯合物对某些病原性微生物的生长是有效的，而在同一浓度下，形成正常肠道菌群的微生物种群的繁殖是无恙的。当使用不同的金属离子制备不同的金属螯合化合物时，可以测量到不同的抗微生物作用。用于制备复合物的Zn、Cu、Fe、Mn离子，以不同的浓度发挥它们对微生物的作用——即使在复合物形成过程中，我们使用相同的配体。在实验过程中，我们发现，在体外组合的微量元素螯合物(Zn、Cu的甘氨酸螯合物)以双重协同组合用于预防由检查过的肠炎沙门氏菌引起的肠道疾病，且以三重协同组合用于预防由检查过的产气荚膜梭菌引起的疾病，而选择性作用于正常肠道菌群(例如乳酸菌、酵母菌)预防兼性病原性微生物的增殖而不抑制形成正常肠道菌群的乳酸菌和酵母菌。主要引起表皮疾病的病原体巴氏梭菌、索氏梭菌、肉毒梭菌A-F、诺氏梭菌A、B、C、D、腐败梭菌、气肿疽梭菌、海斯特里提科姆梭菌、生孢梭菌、破伤风梭菌相似地对铜和锌有机螯合物，优选地，氨基酸螯合化合物敏感。
[0073] 图1、单-甘氨酸螯合锌的IR谱图。
[0074] 图2、单-甘氨酸螯合铜的IR谱图。
[0075] 图3、产气荚膜梭菌在TSA琼脂培养基上形成抑菌圈。
[0076] 实施例1—制备双-甘氨酸螯合锌
[0077] 向1mol ZnO(79.5g)中添加200ml蒸馏水、2.1mol NH4OH和48.5g CO2。在120℃和10-12bar压力下反应4小时后，反应产物为Zn(NH4)2CO3。所获得的螯合化合物的pH用CO2调节为8.0。此时，形成ZnCO3沉淀物。过滤所获得的该沉淀物，然后与2mol甘氨酸反应。这样，形成具有结构(Ⅰ)的下述化合物：
[0078]
[0079] (M)(甘氨酸)2，其中，M为Zn或Cu。该通式化合物的优选实施例为Zn(甘氨酸)2。
[0080] 优选为该化合物的制备进行干燥步骤，以便通过保留适宜的含水量保持该微量元素螯合化合物的含水量。在该产物被干燥至含水量为12％-14％的情况中，获得通式(Ⅰ)化合物的粉末制剂。如果产物被干燥至无水至大约3％的含水量，则该产物损失了通过配位键连接至中心金属原子的含水量。后一产物的生物活性是不同的，它将显著低于通式(Ⅰ)化合物的生物活性。该产物为浓的、吸湿的、粘性的化合物，在水中具有高溶解性。
[0081] 实施例2—制备二铵·双-甘氨酸螯合锌
[0082] 向1mol ZnO(79.5g)中添加150ml蒸馏水、2.2mol NH4OH和48.5g CO2。在120℃和10-12bar压力下反应4小时后，反应产物为Zn(NH4)4CO3。所获得的沉淀物直接与2mol甘氨酸反应。获得具有结构(Ⅱ)的下述化合物：
[0083]
[0084] (M)(NH4)2(甘氨酸)2，其中，M为Zn或Cu。甘氨酸可替换为任意的氨基酸，例如蛋氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等。根据通式(Ⅱ)的优选化合物为Zn(NH4)2(甘氨酸)2。
[0085] 实施例3—制备四铵·双-甘氨酸螯合锌
[0086] 向1mol ZnO(79.5g)中添加100ml蒸馏水、4.2mol NH4OH和48.5g CO2。在120℃和10-12bar压力下反应4小时后，反应产物为Zn(NH4)4CO3。所获得的螯合化合物直接与2mol甘氨酸反应。获得具有结构(Ⅲ)的下述化合物：
[0087]
[0088] (M)(NH4)4(甘氨酸)2，其中，M为Zn、Cu或Fe。甘氨酸可替换为任意的氨基酸，例如蛋氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等。根据通式(Ⅲ)的优选化合物为Zn(NH4)4(甘氨酸)2。
[0089] 实施例4—制备顺丁烯二酸螯合锌
[0090] 向如实施例1所述制备的ZnCO3化合物中，以水溶液添加2.0mol顺丁烯二酸。获得具有结构(Ⅳ)的下述化合物：
[0091]
[0092] Zn(顺丁烯二酸)。该顺丁烯二酸可替换为任意的羟基酸，例如甘醇酸、乳酸、羟丁酸、柠檬酸等。锌可以替换为另一种微量元素，例如铜等。
[0093] 优选为该化合物的制备进行干燥步骤，以便通过保留适宜的含水量保持该微量元素的螯合化合物的含水量。在该产物被干燥至含水量为10％-12％的情况中，获得通式(Ⅳ)化合物的粉末制剂。如果产物被干燥至无水至大约3％的含水量，则该产物损失了通过配位键连接至中心金属原子的含水量。后一产物的生物活性是不同的，它将显著低于通式(Ⅳ)化合物的生物活性。
[0094] 实施例5—制备二铵·顺丁烯二酸螯合锌
[0095] 向如实施例2所述制备的Zn(NH4)2CO3化合物中以水溶液添加2.0mol顺丁烯二酸。获得下述化合物：
[0096]
[0097] Zn(二铵)(顺丁烯二酸)。该顺丁烯二酸可以替换为任意的羟基酸，例如甘醇酸、乳酸、羟丁酸、柠檬酸等。锌可以替换为另一种微量元素，例如铜等。
[0098] 实施例6—制备四铵·顺丁烯二酸螯合锌
[0099] 向如实施例3所述制备的Zn(NH4)4CO3化合物中以水溶液添加2.0mol顺丁烯二酸。获得具有结构(Ⅵ)的下述化合物：
[0100]
[0101] Zn(四铵)顺丁烯二酸。该顺丁烯二酸可以替换为任意的羟基酸，例如甘醇酸、乳酸、羟丁酸、柠檬酸等。锌可以替换为另一种微量元素，例如铜等。
[0102] 实施例7—制备二铵·蛋氨酸螯合锌
[0103] 向如实施例2所述制备的Zn(NH4)2CO3化合物中以水溶液添加2mol蛋氨酸。
[0104]
[0105] Zn(二铵)(蛋氨酸)。
[0106] 实施例8—制备二铵·赖氨酸螯合锌
[0107] 向如实施例2所述制备的1mol Zn(NH4)2CO3化合物添加2mol赖氨酸。
[0108]
[0109] Zn(二铵)(赖氨酸)。
[0110] 实施例9—制备微量元素氨基酸螯合物
[0111] 向如实施例1所述制备的1mol ZnCO3或CuCO3化合物添加2mol选择的氨基酸。获得的化合物为Zn(氨基酸(aminate))2螯合物。
[0112] 在产物被干燥至含水量为12％-14％的情况中，随后形成Zn(H2O)(氨基酸)2。如果产物被干燥至无水至大约3％的含水量，则该产物损失了通过配位键连接至中心金属原子的含水量。后一产物的生物活性是不同的，它将显著低于Zn(H2O)(氨基酸)2化合物的生物活性。
[0113] 实施例10—制备微量元素二铵螯合物
[0114] 向如实施例2所述制备的1mol Zn(NH4)2CO3化合物添加2mol选择的氨基酸。获得的化合物为二铵·氨基酸螯合Zn。
[0115] 实施例11—制备微量元素EDTA螯合物
[0116] 向如实施例1所述制备的ZnCO3化合物以水溶液添加1molEDTA。反应完全后，优选应用到载体的最终产物被干燥至含水量为10％，以获得下述O螯合化合物。
[0117]
[0118] 实施例12—制备微量元素二铵EDTA螯合物
[0119] 如实施例2所述制备的1mol Zn(NH4)2CO3化合物与1mol EDTA反应，以获得下述化合物。锌可以替换为铜、铁或锰，作为形成螯合物的微量元素。
[0120]
[0121] 实施例13—工厂化制备单-甘氨酸螯合锌
[0122] 我们用8000升的反应器进行螯合物的制备，这样生产微量元素螯合物。向4000升水中加入2875kg七水硫酸锌和750kg甘氨酸。在90℃下反应4小时后，形成单-甘氨酸锌产物，该单-甘氨酸锌产物在流化床干燥器中转化为微颗粒，从而获得该产物。
[0123] 所获得的产物的螯合键的构造通过结构确定技术(配位滴定金属离子分析、热重实验、酸碱滴定、中心IR光谱记录)和通过记录所获得的产物的远IR光谱得到证实。图1示出了单-甘氨酸螯合锌的IR光谱。IR光谱评价：
[0124] 2000-4000cm-1：
[0125] 出现两个明显的波段，波段最大值分别在3160-3211cm-1和3456-3390cm-1。在后+一波段中，在较高的波数范围内有肩峰(shoulder)。前一波段可以被指定为NH3基团的NH价键振动(基于甘氨酸、甘氨酸盐酸的光谱)。后一波段可以被指定为配位水分子。“肩峰”的存在表明存在与变化强度相关的水分子(例如，配位的和未配位的、仅通过氢桥结合)。
[0126] 在1600、1400cm-1及其附近的波段：
[0127] 在两种情况中，分别可以观察到一个尖的且强的波段最大值(1643、1643、1649、-1 -11652、1651cm )和(1412、1411、1410、1409、1410cm )。这表明甘氨酸的羧酸基团在每种情-1
况中均被配位。各自的波段最大值的差异(231、222、239、243、241cm )表明了双齿配位，即两个氧都被配位了。可以假设为桥型键，因为基于X-射线衍射数据[3]，Cu(甘氨酸)SO4x2H2O、Zn(甘氨酸)SO4x2H2O复合物的情况暗示了桥型键。
况中均被配位。各自的波段最大值的差异(231、222、239、243、241cm )表明了双齿配位，即两个氧都被配位了。可以假设为桥型键，因为基于X-射线衍射数据[3]，Cu(甘氨酸)SO4x2H2O、Zn(甘氨酸)SO4x2H2O复合物的情况暗示了桥型键。
[0128] 1500cm-1及其附近：
[0129] 在每一样品中，可以观察到中等强度的波段，波段最大值在大约1500cm-1处-1 +(1492、1480、1478、1478、1476cm )，这明显表明质子化了的甘氨酸(NH3)的存在，与在-1
2000-4000cm 范围内观察到的结果相符合。
2000-4000cm 范围内观察到的结果相符合。
[0130] 1100、600cm-1及其附近：
[0131] 在每一样品中，在波数1100和600cm-1附近(分别是1100、1081、1108、1113、1113、-11114和631、617、618、618、617cm )可以观察到强的波段。同时，在较高的波数范围可以观察到肩峰，这表明硫酸根离子作为离子或/和以单配位基的方式(利用单个氧)，被配位至金属离子。
[0132] 甘氨酸所在处，可以存在任意的其他氨基酸，例如蛋氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等。锌可以替换为另一微量元素，例如铜、锰等。
[0133] 实施例14—工厂化制备单-甘氨酸螯合铜
[0134] 向1.8立方米水中，在60-70℃下加入375kg甘氨酸。向这一溶液中，当加热至80℃时加入1250kg结晶CuSO4，然后冷却30分钟。反应产物在流化床干燥器中被干燥至微颗粒。
[0135] 该工厂化产物铜-螯合-甘氨酸的配位在IR光谱上非常明显。甘氨酸分子通过羧基基团被配位，且氨基基团仍是质子化了的。该羧基基团被配位为双齿配位桥。可以看到甘氨酸分子的两种类型在不同环境中被配位。甘氨酸通过羧基基团被配位，作为双齿配位桥配体。甘氨酸的氨基基团仍是质子化了的。硫酸根离子以单配位基和/或双配位基方式被配位。图2示出了单甘氨酸螯合铜的IR光谱。
[0136] 2000-4000cm-1：分别在波数3138和3192cm-1处，波段最大值是明显的，在较低的波数范围内具有若干较小的最大值。
[0137] 1600、1400cm-1及其附近：每一波段最大值中有2个是明显的，分别在1647、-11580(在两种情况中)和1458、1410及1463、1409cm 波数值处。
[0138] 1500cm-1及其附近：分别在1512和1502cm-1的数值处，中等强度的峰是明显的。
[0139] 1100和600cm-1及其附近：分别有3和2个波段最大值是明显的，具有肩峰。
[0140] 总结：甘氨酸的羧基基团是配位了的，氨基基团是质子化了的。硫酸根离子以双齿配位方式结合至铜离子。
[0141] 实施例15—制备单-甘氨酸螯合锌和单-甘氨酸螯合铜的混合物
[0142] 1000升如实施例11所制备的单-甘氨酸螯合Zn与250升如实施例12所制备的单-甘氨酸螯合Cu于60℃在叶片搅拌反应器中混合，然后这样获得的混合物在流化床干燥器中被干燥至微颗粒。
[0143] 实施例16—确定微量元素螯合物对兼性病原性微生物和肠道菌群的正常成份的MIC和CID
[0144] 用于研究抑菌活性的传统方法——从实用性、有效性的医疗观点，抗菌剂的抗菌谱来看——是纸片扩散法或琼脂孔扩散分析法以及于液体培养中进行的稀释实验。在标准(美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)、德国标准(DIN)等)纸片扩散法或孔扩散分析法中，基于扩散至琼脂培养皿表面上的检测微生物的生长，研究抗菌剂的效果。在琼脂扩散分析法中，例如，在琼脂皿上制备细菌菌苔，然后根据实验室设计的程序，用琼脂皿切割装置在接种过的平板中间打孔。然后将10-100μL分析样品置于该孔中。检测化合物由置于细菌菌苔上的检测纸片或琼脂皿中的孔扩散进入培养基，这样就形成了围绕该皿或孔的生长-繁殖抑制圈。基于琼脂扩散试验，可以毫无疑义地确定所研究的菌株对检测化合物的敏感性。根据临床实验，近似于抑菌剂的标准分析(其中，抑制圈的直径与试剂的浓度成比例)，我们根据围绕皿孔形成的敏感区进行分类。在每一试剂的情况中，基于该区直径，微生物被描述为抵抗指定试剂或对指定试剂敏感。对新抑菌剂的使用需要高度谨慎。也就是，我们并不知道什么影响抑菌剂的扩散(在琼脂扩散分析中)，例如培养基的pH、溶解的O2或CO2的浓度、培养基成份的交互作用，因此必须基于多重因素为指定试剂和微生物选择适宜的技术和适用的培养基。在培养基稀释试验中，在液体培养中制备适宜浓度的微生物，然后通过显微镜和/或光学技术证实生长和繁殖的进展。这一试验能够确定感兴趣的试剂对于指定微生物的最小抑制浓度(MIC)。进一步地，在也检查到试管内未显示生长的微生物死亡的时候，用以确定试剂是否仅具有静态作用(生长抑制剂)或cid作用(即，具有微生物致死活性)，然后也确定最小cid浓度(MCC)。MCC/MIC的比率给出了试剂的体内有效性的必要信息：如果这一数值是高的，则试剂的体内有用性有可能是低的。
[0145] 表2.本研究中检查过的菌株：
[0146]
[0147]
[0148] 直到在分析试验中使用前，菌株用25％无菌甘油在-80℃下冰冻或冻干，以悬浮形式保藏于胰蛋白胨(TSB)液体培养基(沙尔劳微生物学(Scharlau Microbiology))中。
[0149] 猪痢疾短螺旋菌菌株(B/06)的分离
[0150] 猪痢疾短螺旋菌菌株分离于养殖于匈牙利不同地区的、示出了猪痢疾临床症状的生长猪和育肥猪。在屠宰场屠宰后，示出临床特征的猪的结肠勒除器被系紧(tie down)，并在6个小时内运至实验室。打开结肠部分后，样品被提供为来自结肠粘膜的刮片(scraping)。在每一情况中，划线(streaker)上的粘膜刮片扩散至新鲜制备的、补充有10％去纤维蛋白的牛血液和400μg/ml奇霉素(西格玛-奥德里奇卡夫食品)的TSA(胰蛋白胨-大豆)琼脂表面(沙尔劳微生物学)。接种后，该培养物在严格厌氧条件下在42℃下培养96小时。厌氧条件通过使用厌氧产气袋(Oxoid(奥克欧德)，气体生成试剂盒，厌氧体系BR0038B)和厌氧培养广口瓶(Oxoid，厌氧广口瓶)获得。确定初级和二级生化特性并通过标准技术(奎恩(Quinn)等，1994)进行菌株的鉴别。
[0151] 体外抑制实验
[0152] 指定量(ppm、mg/kg、μg/ml)的微量元素从储备液添加至微生物培养基。在24孔格雷钠(Greiner)组织培养平板上在液体培养基中，连续2倍(2x)稀释具有不同组成的样品液，然后用生理盐水制备的5μL 0.5麦克法兰(MacFarland)密度的样品细菌悬浮液被量取到不同浓度的液体培养基中。在分析活性成份的组合物的情况中，使用交叉稀释技术，此时从两个方向在平板表面上稀释两种不同溶液在被分析细菌所需的厌氧条件下，培养该平板24小时。然后读取结果，从而确定检测化合物的最小抑制浓度(MIC)。在分析最小致死浓度(CID)的时候，在培养期后孔没有示出不透明性，10μL溶液接种到血液琼脂表面并核查在培养期后在培养基表面上是否发生任何细菌的生长。
[0153] 琼脂凝胶扩散
[0154] 产气荚膜梭菌：生长于有氧或厌氧器皿中的菌株在无菌琼脂上繁殖，用无菌生理盐水以0.5MacFarland密度从上述琼脂制备悬浮液，然后用棉签接种到培养基表面。用专业打孔工具在接种过的培养基挖孔，然后50μL的不同浓度的微量元素螯合复合物的检测液被量取至孔中。通过视觉检查对培养进行评价。围绕孔形成的抑制圈的存在表明检测液的效果。
[0155] 猪痢疾短螺旋菌(B/06)：在这些分析中，由血液琼脂(改良的胰蛋白胨大豆琼脂，增补了5-10％的去纤维蛋白的牛血液)上的已解冻的细菌团制备预培养物。从明显发生良好溶血的预培养琼脂平板中，切除8-10个差不多同样大小(误差±5％)的接种琼脂块，然后用具有直径大约5mm的圆形末端的无菌玻璃棒扩散至直径90mm的新鲜制备的琼脂平板。平板以覆盖形式干燥5分钟。
[0156] 根据实验室设计的程序，用琼脂皿切割装置在接种平板的中间打孔。将检测化合物的100μL指定稀释液置于直径为5mm的孔中。以已知浓度滴下该稀释液后，将平板置于厌氧瓶(anaerostat)(Oxoid厌氧产气袋或广口瓶)中15分钟，并在37℃下无氧环境中培养4-5天。
[0157] 置于琼脂皿中部的孔中的微量元素抑制产气荚膜梭菌的细菌培养。扩散进入琼脂的化合物形成依赖于浓度的良好限定的、同心形的抑菌圈，且由于稀释的作用，在一定距离后抑制作用停止了，并且在抑菌圈外，培养物示出了生长(见图3)。
[0158] 确定CID值
[0159] 正是活性组分的浓度导致了微生物的完全死亡。在层状箱中无菌条件下，由培养了24小时的液体培养基制备稀释系列，然后将每100μL稀释系列置于琼脂皿并用无菌玻璃棒扩散。在有利于微生物生长的条件下，培养期为24小时，然后计数琼脂皿上的菌落数量。
[0160] 评价时，考虑了两个选项：
[0161] 1、在琼脂皿上没有可见的菌落。
[0162] 2、在琼脂皿上有可见的、可以计数的菌落。
[0163] 当培养后在培养基上没有可见的菌落时的情况中，这表明了微量元素螯合物的细菌致死作用(CID)。在琼脂皿上生长的可计数的菌落的数量给出了指定的微量元素螯合物的真实的MIC值。
[0164] 实施例17—微量元素(锌、铜、铁、锰)螯合(单-、二-、和双-氨基酸、脂肪酸、羟基脂肪酸和聚氨基羧酸)化合物的微生物指标MIC和CID结果
[0165] 微生物指标分析系统示出了不同浓度的所研究的微量元素螯合复合物样品的生物活性。
[0166] 由所进行的实验的结果可以看出，分析样品具有不同的MIC值。检查过的病原体和兼性病原体的敏感性显著高于正常肠道菌群的成份、真菌和乳酸生产者的敏感性。由体外实验可以得出结论，将这些检测化合物混进饲料将会是预防性的，它除了保持平衡外还阻止了病原体和兼性病原体的生长。经确定，所研究的螯合化合物具有不同的MIC值。
[0167] 表3.微量元素螯合化合物的最小抑制浓度(MIC)ppm(mg/kg)
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172] 由上述结果可以得出若干结论。然后针对一种或多种兼性病原体，确定所研究的微量元素螯合化合物的最小抑制浓度(MIC)。毫无例外地可以确定，所有的微量元素螯合化合物均能够抑制病原体微生物。60-200ppm浓度的滕黄微球菌、和/或70-400ppm浓度的大肠杆菌、和/或80-488ppm浓度的肠炎沙门氏菌、和/或40-498ppm浓度的金黄色葡萄球菌、和/或10-427ppm浓度的无乳链球菌、和/或65-167ppm浓度的产气荚膜梭菌、和/或90-494ppm浓度的猪痢疾短螺旋菌、和/或21-184ppm浓度的化脓隐秘杆菌受到抑制。
[0173] 正常肠道菌群的成份、乳酸生产者乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)和干酪鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus casei v.rhamnosus)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc.mesenteroide)和/或酿酒酵母(LSE)在500ppm浓度处或以上才能受到抑制，优选地，在800-1000ppm浓度处受到抑制。
[0174] 实施例18—微量元素(锌、铜、铁、锰)单-甘氨酸螯合物的双重协同作用检查。微量元素成份的协同作用研究
[0175] 当两种或多种化合物的生物效应通过它们之间的交互作用被提高时，在这两种或多种化合物之间有协同作用。知道MIC和CID值是非常重要的，以确保微量元素螯合物的选择性。为了实现这一目标，将微量元素螯合物们放在一起研究以继续实验，寻求协同作用。
[0176] 表4.未示出协同作用和拮抗作用的组合物
[0177]
[0178] 表5.示出协同作用的组合物
[0179]
[0180]
[0181] 基于这些结果，确定了病原体肠炎沙门氏菌的6种微量元素螯合物的最小抑制浓度(MIC)。这些微量元素螯合物浓度对肠道菌群的正常成份(LSE和乳酸菌)几乎没有作用(800ppm)。在兼性病原体大肠杆菌的例子中，这6种微量元素螯合物中的5种组合物具有协同作用的MIC值。
[0182] 实施例19—微量元素(锌、铜)和阴离子(氨基酸、有机酸和羟基酸等)螯合物的多重协同作用检查
[0183] 除了实施例18所示出的，不仅当微量元素被组合时可以发现协同作用，而且当化合物的阴离子部分(即氨基酸、酸)被组合时也识别到协同作用(表5)。
[0184] 基于表中数据可以得出，如果存在不同金属的螯合化合物被最优混合，以及阴离+子部分也被最优混合，则存在超过基础化合物的协同作用，且如果包括NH4、H2O配体的螯合物被混合，则可以获得集合作用(aggregate effect)。
[0185] 表6.示出六重协同作用的组合物
[0186]
[0187] 说明：
[0188] 微量元素阴离子螯合物的锌(铵)(碳酸)(氨基酸(甘氨酸(gly)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、丙氨酸(ala))的六重组合在49-390ppm浓度处具有协同作用，微量元素阴离子螯合物氨基酸锌还在37-238ppm浓度处具有六重协同作用，铜(铵)(氨基酸)在浓度15-117ppm处具有六重协同作用，上述物质在体外是有用的，用以通过干预兼性病原体微生物的增殖预防由大肠杆菌和肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌引起的可能的疾病。
[0189] 实施例20—微量元素(锌、铜、铁)单甘氨酸螯合物的多重协同作用检查。微量元素成份的协同作用研究
[0190] 知道了微量元素螯合物的双重协同作用对病原体微生物给出50-80％的结果，进一步进行三重作用研究。接近于双重协同作用的微量元素螯合物，添加了三种微量元素螯合物。为了确定三重协同作用，应用了所有的分析方法，且当液体法以及微孔板法这两种方法给出同样的结果时，示出所获得的最终结果。
[0191] 表7.未示出三重协同作用的组合物
[0192]
[0193] 表8.示出了三重协同作用的组合物
[0194]
[0195] 微量元素螯合物在体外是有用的，通过选择性禁止兼性病原体微生物的增殖，但并不抑制形成正常肠道菌群的乳酸菌和酵母菌，用于在双重协同组合中预防由所检查的大肠杆菌和沙门氏菌引起的肠内疾病以及在三重协同组合中预防由所检查的梭菌微生物引起的肠内疾病。
[0196] 实施例21—微量元素(锌、铜、铁、锰)单甘氨酸螯合物的有效cid或静态浓度的确定
[0197] 如实施例14所述确定最小致死浓度(CID)。
[0198] 表9
[0199]
[0200]
[0201] 在沙门氏菌株的例子中，锌螯合物的CID值比MIC值高30倍，而在梭菌菌株的例子中，铜螯合物的CID值仅仅是MIC值的两倍。这一差异也可以用微生物物种的不同敏感性解释。然而，在正常肠道菌群成份的例子中应该考虑的是，两种螯合物具有同样浓度的MIC和CID值，该结果指示在正常肠道菌群成份的例子中，在这些浓度处，不是抑制微生物的增殖，而是杀死微生物。
[0202] 实施例22—用组合包含(H2O)2·乙二胺四乙酸螯合锌和(H2O)2·乙二胺四乙酸螯合铜的组合物进行中试饲养实验。
[0203] 在中试环境条件下，在两个不同时机对携带有猪痢疾短螺旋菌的家畜，对生长猪进行实验饲养。
[0204] 对照组和实验组都由100只育肥猪组成。后一组，以实验室测试确定的1kg/ton的饲料剂量接受实验组合物。在第一组研究中，对照组在饲料中接受预防性剂量的抗生素(表10)。在第二组研究中，只有遭受了痢疾的猪被单独治疗(表11)。所研究的参数：治疗量、发展损失、平均屠宰体重和饲料利用率。
[0205] 表10.组合物对育肥猪(对照组接受预防性的抗生素治疗)的产率和健康的影响[0206]
[0207] 表11.组合物对育肥猪(对照组通过注射接受单独的抗生素治疗)的产率的影响[0208]对照组 实验组
动物数量 100 100
初始平均体重kg 28.4 28.1
通过肌内注射单独治疗 21 2
实验期间死亡量 0 0
屠宰体重kg 105.8 109.8
饲料利用率kg/kg 3.23 2.96
动物数量 100 100
初始平均体重kg 28.4 28.1
通过肌内注射单独治疗 21 2
实验期间死亡量 0 0
屠宰体重kg 105.8 109.8
饲料利用率kg/kg 3.23 2.96
[0209] 在第一组实验中(表10)，同样长的育肥时间后，实验组与对照组相比，屠宰体重平均高出2.8kg，即2.6％，且产生1kg活畜重量所必要的饲料量少于0.2kg，这意味着饲料利用率增加了6％。
[0210] 在第二组实验中(表11)，与对照组相比，实验组的屠宰体重高出3.9％，而实验组的饲料利用率更好，高出9.1％的值。
[0211] 实施例23—用包含(H2O)2·双-甘氨酸铜的组合物进行中试饲养实验
[0212] 对感染有胞内劳森氏菌的家畜用动物配对的方法在中试环境条件下，对生长猪进行实验饲养。对照组接受通常的混进饲料中的抗生素添加剂。实验组的饲料增补有二铵·双-甘氨酸铜的组合物，以1kg/t定量配给。
[0213] 所研究的参数：治疗量、发展损失、平均屠宰体重和饲料利用率。
[0214] 表12.对配对动物实验的产率的治疗的影响
[0215]实验组 对照组
动物数量 326 331
育肥天数 101 101
初始平均体重kg 30.86 33.74
增重kg 76.15 71.73
平均屠宰体重kg 107.01 105.47
饲料利用率kg/kg 3.10 3.31
动物数量 326 331
育肥天数 101 101
初始平均体重kg 30.86 33.74
增重kg 76.15 71.73
平均屠宰体重kg 107.01 105.47
饲料利用率kg/kg 3.10 3.31
[0216] 实验组的屠宰体重高出1.6％。实验组的增重高出6.2％。实验组的饲料利用率比对照组的该值高出6.8％。
[0217] 实施例24—对示出了由产气荚膜梭菌感染引起的坏死性肠炎的农场，以氨·双-甘氨酸螯合铜进行中试实验
[0218] 实验在两个畜棚中进行，每个畜棚容纳有17100只罗斯308(ROSS-308)小鸡仔。该农场频繁受到产气荚膜梭菌感染引起的瘟疫。这需要批次的抗生素治疗。
[0219] 第一个畜棚容纳对照组的个体，而第二个畜棚容纳实验组的个体。对照组在饲料中没有添加剂。容纳在实验畜棚中的畜群的饲料增补有二铵·双-甘氨酸铜，以1.0kg/t的剂量应用到载体中。
[0220] 结果总结于表13。
[0221] 表13.喂食实验组合物对饲养的肉鸡的影响
[0222]所研究的参数 对照组 实验组 差异
饲养天数 42 42
开始时的小鸡数 17 100 17 100
出仓的小鸡数 16 242 16 238 4
总活畜体重,kg 31 005 32 395 1390(4.5％)
总增重,kg 30 298 31 681 1383(4.6％)
总饲料用量,kg 59 260 59 880 620
平均屠宰体重t,g 1909 1995*** 86(4.5％)
相对饲料利用率kg/kg 1.96 1.89 3.6％
饲养天数 42 42
开始时的小鸡数 17 100 17 100
出仓的小鸡数 16 242 16 238 4
总活畜体重,kg 31 005 32 395 1390(4.5％)
总增重,kg 30 298 31 681 1383(4.6％)
总饲料用量,kg 59 260 59 880 620
平均屠宰体重t,g 1909 1995*** 86(4.5％)
相对饲料利用率kg/kg 1.96 1.89 3.6％
[0223] ＊＊＊＝p≤0.001处差异是显著的
[0224] 实验组的增重比对照组的增重超出了4.6％，而对于单位活体增重，实验组肉鸡需要的饲料少了3.6％。
[0226] 当喂食实验组合物时没有观察到任何副作用。
[0227] 实施例25—在产气荚膜梭菌感染后在蛋鸡畜群中喂食铵·乙二胺四乙酸铜的影响
[0228] 在实验室条件下，将108只32周大的蛋鸡置于笼子中，动物密度为每笼3只鸡。在该禽类进入实验之前，使用泄殖腔棉拭子检测病原体产气荚膜梭菌。证实了该畜群被产气荚膜梭菌适度感染。
[0229] 108只禽类形成三个同样的组，每组36只蛋鸡。
[0230] 1、阴性对照组Ⅰ-产气荚膜梭菌阴性。
[0231] 2、阳性对照组Ⅱ-产气荚膜梭菌阳性，通过胃管用2ml 106CFU/ml产气荚膜梭菌培养接种。
[0232] 3、增补的、治疗组Ⅲ-产气荚膜梭菌阳性，通过胃管用2ml 106CFU/ml产气荚膜梭菌培养接种。
[0233] 结果示出于表14.
[0234] 表14.受产气荚膜梭菌感染的蛋鸡的产率参数
[0235]
[0236] 与阴性对照组相比，由于产气荚膜梭菌感染，阳性对照组中蛋产率降低了超过13％。响应于治疗，与阴性对照组相比，蛋产率增加了6.7％；与阳性对照组相比，蛋产率增加了22.4％。在实验期间，总蛋重示出了相似的趋势。在个体蛋的测量上有不同的趋势，因为阳性对照组的个体蛋是最大的。
[0237] 实施例26—通过服用(H2O)2·顺丁烯二酸锌预防在断奶期发生腹泻疾病的喂食实验
[0238] 32天大的断奶的小猪喂食含铵·顺丁烯二酸锌添加剂的饲料。该实验动物被大肠杆菌感染。对照组在喂食中接受标准的抗生素添加剂以控制大肠杆菌感染。
[0239] 生产产率示出于表15。
[0240] 表15.实验期间生产产率参数
[0241]对照组 实验组
动物数量 28 31
初重(kg) 9.11 9.19
实验持续时间(天) 45 38
实验期间死亡 1 0
实验末的体重(kg) 21.26 24.05
日增重(g) 270 391
饲料利用率(kg/kg) 2.31 2.04
动物数量 28 31
初重(kg) 9.11 9.19
实验持续时间(天) 45 38
实验期间死亡 1 0
实验末的体重(kg) 21.26 24.05
日增重(g) 270 391
饲料利用率(kg/kg) 2.31 2.04
[0242] 实验组的平均日增重比对照组高出了45％。实验组的饲料利用率比对照组高出了13％。在实验期间，实验组没有死亡，而对照组有一个动物死亡(3.6％)。
[0243] 参考文献
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