柯萨奇病毒A16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法
阅读：834发布：2020-05-13
专利汇可以提供柯萨奇病毒A16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16)病毒株、用途、 疫苗 及其制备方法。在本发明提供的柯萨奇病毒A16型病毒株中，所述的病毒株的保藏编号为CGMCC No.6954。本发明所提供的CA16病毒株具有如下优点：毒 力 强，可用于CA16疫苗的评价，也可以用于CA16 病毒感染 机制的研究。本发明所提供的用于柯萨奇病毒A16型感染动物模型的建立方法能够提供稳定的动物模型，为柯萨奇病毒A16型疫苗研制和抗病毒药物的筛选以及CA16病毒感染机制的研究提供了 基础 。由本发明的CA16型病毒株制备的疫苗具有有效的免疫活性。，下面是柯萨奇病毒A16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16)病毒株，所述的病毒株的保藏编号为CGMCC No.6954，其中所述病毒株为C1基因亚型。
2.根据权利要求1所述的病毒株，其中所述病毒株的全基因序列为SEQ ID No.：1所示的序列。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的病毒株在制备用于预防和/或治疗手足口病的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述的药物为疫苗。
5.一种用于预防和/或治疗手足口病的疫苗，其包含：
1)经灭活的权利要求1-2中任意一项所述的病毒株；以及
任选的2)佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中，以病毒蛋白含量计，所述的病毒株的含量为0.1～
4μg/ml。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其中，所述的佐剂为氢氧化铝，以及所述的氢氧化铝的含量为0.5～1.5μg/ml。
8.一种根据权利要求5-7中任意一项所述的疫苗的制备方法，其包括：将权利要求1-2中任意一项所述的病毒株进行培养，并进行灭活、纯化，从而制备得到所述的疫苗。
9.一种制备抗体或抗血清的方法，其中，以根据权利要求1-2中任意一项所述的病毒株或权利要求5-7中任意一项所述的疫苗为免疫原进行制备。
10.根据权利要求1-2中任意一项所述的病毒株在制备用于建立动物模型的制剂中的用途，其中所述的动物模型为柯萨奇病毒A16型感染的动物模型。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述动物模型为用于评价柯萨奇病毒A16型疫苗效果的动物模型。
柯萨奇病毒A16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种柯萨奇病毒A16型病毒株及其用途、用于预防和/或治疗手足口病的疫苗及其制备方法、抗体或杂交瘤细胞或抗血清及其制备方法、和柯萨奇病毒A16型感染的动物模型的建立方法。
背景技术
[0002] 手足口病(Hand，foot and mouth disease，简称为HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种急性传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，以手、足、口腔等部位皮肤粘膜的皮疹、疱疹、溃疡为典型表现，少数患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑脊髓膜炎、脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)和肠病毒71型(Enterovirus71，EV71)最为常见。1957年新西兰首次报道HFMD，1958年分离出柯萨奇病毒，早期发现的HFMD主要是CA16型。近年来，在全国各地相继出现了HFMD的大规模爆发流行，CA16和EV71感染交替出现。
[0003] 在预防该病的特异性疫苗的研制过程中，柯萨奇病毒A16型病毒疫苗属于预防人类传染病的新型疫苗，国内研究均停留在临床前研究阶段。目前尚未开发出针对预防该病的特异性疫苗、药物等。其原因主要在于：首先，由于不同基因型毒株间、相同基因型不同基因亚型毒株间、甚至相同基因亚型不同毒株间抗原性和免疫原性可能存在差异，从而导致不同毒株的交叉保护水平可能存在差异，对疫苗株的选择提出了严峻的挑战。其次，虽然CA16感染已流行多年，但近年来CA16感染多次爆发，其致病机制仍不清楚；这些均使CA16疫苗的研制存在一定的困难。再次，虽然目前已有专利文献披露了其中的CA16病毒株通过中和试验检测时具有高的血清抗体效价，但是其中和试验采用了CA16病毒不敏感的RD细胞作为中和用细胞，且中和时间为3天，与常规公认的中和时间6-7天差距较大，在病毒未完全充分复制增长的情况下判定结果，其通过三次免疫的血清中和抗体结果的可靠性值得商榷。
[0004] 此外，国内外柯萨奇病毒A16型疫苗的研发还受困于稳定的动物模型，因此建立成熟稳定的动物模型显得尤为重要。
发明内容
[0005] 为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种柯萨奇病毒A16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法、抗体或杂交瘤细胞或抗血清及其制备方法、动物模型建立方法。
[0006] 具体而言，本发明提供：
[0007] (1)一种柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16)病毒株，所述的病毒株的保藏编号为CGMCC No.6954。
[0008] (2)根据(1)所述的病毒株，其中所述病毒株的全基因序列为SEQ ID No.：1所示的序列。
[0009] (3)根据(1)所述的病毒株，其中所述病毒株为C1基因亚型。
[0010] (4)根据(1)-(3)中任意一项所述的病毒株在制备用于预防和/或治疗手足口病的药物中的用途。
[0011] (5)根据(4)所述的用途，其中，所述的药物为疫苗。
[0012] (6)一种用于预防和/或治疗手足口病的疫苗，其包含：
[0013] 1)经灭活的(1)-(3)中任意一项所述的病毒株；以及
[0014] 任选的2)佐剂。
[0015] (7)根据(6)所述的疫苗，其中，以病毒蛋白含量计，所述的病毒株的含量为0.1～4μg/ml。
[0017] (9)一种根据(6)-(8)中任意一项所述的疫苗的制备方法，其包括：将(1)-(3)中任意一项所述的病毒株进行培养，并进行灭活、纯化，从而制备得到所述的疫苗。
[0018] (10)一种制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中，以根据(1)-(3)中任意一项所述的病毒株或(6)-(8)中任意一项所述的疫苗为免疫原进行制备。
[0019] (11)根据(10)的制备方法得到的抗体或杂交瘤细胞或抗血清。
[0020] (12)根据(1)-(3)中任意一项所述的病毒株在建立柯萨奇病毒A16型感染的动物模型中的用途；优选地，所述动物模型用于评价柯萨奇病毒A16型疫苗的效果。
[0021] (13)根据(12)所述的用途，其中，所述的病毒株用作攻击毒株。
[0022] (14)根据(1)-(3)中任意一项所述的病毒株在制备用于建立动物模型的制剂中的用途，其中所述的动物模型为柯萨奇病毒A16型感染的动物模型；优选地，所述动物模型为用于评价柯萨奇病毒A16型疫苗效果的动物模型。
[0023] (15)一种柯萨奇病毒A16型感染的动物模型的建立方法，其包括：
[0024] 1)将(1)-(3)中任意一项所述的病毒株进行培养，从而得到病毒培养液；以及[0025] 2)将步骤1)所得的病毒培养液施予动物，从而制备得到所述的动物模型。
[0026] (16)根据(15)所述的制备方法，其中，所述的动物为小鼠，优选为1-14日龄的乳鼠。
[0027] 本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0028] 1.本发明提供了一种新的柯萨奇病毒A16型病毒株，以及使用该病毒株所生产的用于预防手足口病的疫苗。根据本发明所述的病毒株所生产的疫苗，采用常规方法制备，免疫动物后，具有有效的免疫活性，能刺激机体产生高效价的特异性血清中和抗体。
[0029] 2.本发明所提供的CA16病毒株还可用作攻毒用病毒株，其具有如下优点：毒力强，能使乳鼠出现明显的麻痹、瘫痪甚至死亡等典型的CA16感染症状，可用于CA16疫苗或药物的评价以及CA16病毒感染机制的研究等。
[0030] 3.本发明还提供了用于柯萨奇病毒A16型感染动物模型的建立方法，该方法能够提供稳定的动物模型，为柯萨奇病毒A16型疫苗研制和抗病毒药物的筛选以及CA16病毒感染机制的研究提供了基础。
[0031] 保藏信息：
[0032] 关于保藏编号为CGMCC No.6954的柯萨奇病毒A16型病毒株：该病毒的分类命名为人柯萨奇病毒A16型(Human Coxsackievirus A16)，拉丁文学名为Coxsackievirus A16，是于2012年12月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)进行的保藏，保藏编号为CGMCC No.6954。附图说明
[0033] 图1为采用本发明的CA16疫苗免疫动物后的中和抗体水平的图；
[0034] 图2为采用本发明的CA16疫苗免疫动物后IgG抗体水平的图，其中每一个点代表一只小鼠的IgG抗体效价，图中各组中的横线代表该组IgG抗体效价的几何平均值；
[0035] 图3为采用本发明的CA16病毒株颅内攻击后乳鼠生存率曲线图；
[0036] 图4为采用本发明的CA16病毒株腹腔攻击后乳鼠生存率曲线图；
[0037] 图5为采用本发明的CA16病毒株腹腔攻击后乳鼠发病表现图，其中A图为正常对照组正常乳鼠，B图为病毒组后肢麻痹、瘫痪乳鼠；
[0038] 图6为采用本发明的CA16病毒株颅内攻击后乳鼠病理照片；其中A图为正常乳鼠脑部蛛网膜下腔照片，B图为病毒组发病乳鼠脑部蛛网膜下腔照片，其中箭头以及椭圆形指的是脑内蛛网膜下腔血管充血；
[0039] 图7为采用本发明的CA16病毒株与对照病毒株颅内攻击后乳鼠发病表现图，其中A图为对照病毒组乳鼠，B图为本发明的CA16病毒组后肢麻痹、瘫痪乳鼠。
具体实施方式
[0040] 以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0041] 在本发明中，所述的“柯萨奇病毒A16型”也可称为柯萨奇A16病毒，或柯萨奇病毒A组16型等。
[0042] 在本发明中，所述的“攻击毒株”、“攻毒用毒株”或“攻毒株”是指能引起动物发病的病毒株。本发明的柯萨奇病毒A16型病毒株既可用作攻毒株，也可经灭活后用作制备柯萨奇病毒A16型疫苗。
[0043] 本发明人在进行大量地选育与纯化工作后，出人意料地筛选出了可用于预防手足口病的柯萨奇病毒A16型病毒株，该病毒株能刺激机体产生高效价的特异性血清中和抗体。本发明人在此发现的基础上，进一步得到了本发明的技术方案。
[0044] 本发明第一方面提供了一种柯萨奇病毒A16型病毒株。该病毒的分类命名为人柯萨奇病毒A16型(Human Coxsackievirus A16)，拉丁文学名为Coxsackievirus A16，是于2012年12月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)进行的保藏，保藏编号为CGMCC No.6954。所述病毒株的全基因序列可如SEQ ID No.：1所示。所述病毒株为C1基因亚型，其中C1基因亚型指的是：柯萨奇病毒A16型病毒株根据其基因测序可分为A、B、C三个基因型，C型又分为C1、C2、C3三个基因亚型。
[0045] 本发明第二方面提供了一种上述柯萨奇病毒A16型在制备用于预防和/或治疗手足口病的药物中的用途。
[0046] 优选的是，所述的药物为疫苗。
[0047] 本发明第三方面提供了一种用于预防和/或治疗手足口病的疫苗，其包含：1)经灭活的所述的柯萨奇病毒A16型病毒株；以及任选的2)佐剂。
[0048] 本领域技术人员可以根据需要确定CA16病毒株在本发明的疫苗中的含量。优选的是，以病毒蛋白含量计，所述的病毒株的含量为0.1～4μg/ml。其中蛋白含量可采用(例如)BCA方法(可参见以下文献中公开的方法：李海玲，彭书明，李凛，张雪梅，4种常用蛋白浓度测定方法的比较.中国生化药物杂志，2008，29(4)：277-282.)进行检测。
[0049] 优选的是，所述的疫苗中含有佐剂。佐剂可以为本领域公知的常用的佐剂，例如：氢氧化铝佐剂、CpG佐剂等。并且本领域技术人员可以根据需要确定佐剂在本发明的疫苗中的含量。更优选的是，所述的佐剂为氢氧化铝。以及所述氢氧化铝的含量优选为0.5～1.5μg/ml。
[0050] 优选的是，每剂疫苗为0.1～2ml；更优选的是，每剂疫苗为0.5ml。
[0051] 本发明第四方面提供了所述的疫苗的制备方法，其包括：将所述的柯萨奇病毒A16型病毒株进行培养，并进行灭活、纯化，从而制备得到所述的疫苗。优选地，所述纯化在所述灭活之前进行并且/或者在所述灭活之后进行。
[0052] 优选地，本发明的制备方法包括：
[0053] 1)提供Vero细胞或人二倍体细胞；
[0054] 2)在步骤1)得到的Vero细胞或人二倍体细胞中，对所述的柯萨奇病毒A16型病毒株进行培养，从而得到病毒悬液；
[0055] 3)将步骤2)得到的病毒悬液进行纯化并灭活，从而得到疫苗原液；以及[0056] 4)将步骤3)得到的疫苗原液进行稀释，从而得到所述的疫苗。
[0057] 优选的是，本领域技术人员可以根据需要用常规方法制备柯萨奇病毒A16型灭活疫苗，其中疫苗的常规制备方法可采用(例如)以下方法：用生物反应器(发酵罐)、细胞工厂或WAVE生物反应器培养Vero细胞或人二倍体细胞，在细胞长成致密单层或细胞在微载体上生长至合适密度时，接种病毒，36±1℃培养4-7天后收获病毒悬液，经过浓缩、纯化灭活等步骤后，制备出疫苗原液。可经过换算稀释加入诸如A1(OH)3之类的佐剂吸附配制成含佐剂半成品，也可不加入佐剂配制成不含佐剂半成品。分装为0.5ml/支，即可得到柯萨奇病毒A16型灭活疫苗。也可参见(例如)以下中国专利申请文件中描述的方法：中国专利申请No.：CN201110418439.2，一种肠道病毒71性病毒株及其用途、疫苗和制备方法。
[0058] 在本文中，Vero细胞是指非洲绿猴肾传代细胞，可得自ATCC公司；人二倍体细胞来源于正常人胎儿组织，可得自ATCC公司。在进行病毒接种前，可将Vero细胞或人二倍体细胞在细胞工厂或生物反应器中进行培养。可在细胞长成合适密度的致密单层或细胞在微载体上生长至合适密度时，接种病毒。其中，所述微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、通常是透明的小颗粒，能使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。
[0059] 在本文中，细胞工厂是指一种细胞培养的耗材，它和细胞培养皿、瓶类似，均用于细胞培养，只是细胞工厂用于较大规模的细胞培养，可得自(例如)NUNC公司；生物反应器是指动物细胞体外培养时，为细胞提供的一个适宜的生长环境的容器，使之快速增殖并达到较高密度，常用于大规模、高密度细胞培养，其可得自(例如)SARTORIS公司。
[0060] 优选的是，所述的培养在生物反应器(发酵罐或WAVE生物反应器)或细胞工厂中进行。优选的是，所述的培养在生物反应器中进行，培养条件为温度36±1℃、pH值7.0±0.5、溶解氧浓度20～80％、转速20～80rpm。培养可进行4-7天。
[0061] 优选的是，可以先进行纯化、再进行灭活，也可以先进行灭活、再进行纯化。
[0062] 纯化方式可为本领域常用的方法，如超滤浓缩及层析，层析可包括：凝胶过滤层析(例如采用Sepharose4FF、Sepharose6FF、或Sephacryl S400介质的层析)和/或离子交换层析(如阴离子交换层析(如采用DEAE-Sepharose FF介质的层析))。
[0063] 灭活方式可为本领域常用的方法，如采用甲醛作为灭活剂，按1∶1500-1∶4000比例于34-38℃灭活2-7天。也可用β-丙内酯灭活，按1∶2000-1∶4000比例于2-8℃灭活2-3天，然后37℃水解2-4小时。
[0064] 优选地，在步骤4)中，用氢氧化铝溶液对步骤3)得到的疫苗原液进行稀释，使得在所得疫苗中，以病毒蛋自含量计，所述病毒株的含量为0.1～4μg/ml，并且所述氢氧化铝的含量为0.5～1.5μg/ml。
[0065] 本发明第五方面提供了一种制备抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中，以所述的柯萨奇病毒A16型病毒株或所述的用于预防和/或治疗手足口病的疫苗为免疫原进行制备。可以根据本领域常用的方法，来制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。例如，家兔背部多点皮下注射法制备抗血清及细胞融合法制备杂交瘤细胞，辛酸沉淀法及亲和层析法纯化多克隆或单克隆抗体。
[0066] 本发明第六方面提供了根据所述的制备方法得到的抗体或杂交瘤细胞或抗血清。
[0067] 本发明第七方面提供了一种所述的柯萨奇病毒A16型病毒株在建立柯萨奇病毒A16型感染的动物模型中的用途；优选地，所述动物模型用于评价柯萨奇病毒A16型疫苗的效果。
[0068] 优选的是，在所述的用途中，所述的病毒株用作攻击毒株。
[0069] 所述攻毒用毒株具有如下特点：毒力强，能使乳鼠出现明显的麻痹、瘫痪甚至死亡等典型的柯萨奇病毒A16型感染症状，可用于柯萨奇病毒A16型疫苗或药物的评价。
[0070] 本发明第八方面提供了一种所述的柯萨奇病毒A16型病毒株在制备用于建立动物模型的制剂中的用途，其中所述的动物模型为柯萨奇病毒A16型感染的动物模型；优选地，所述动物模型为用于评价柯萨奇病毒A16型疫苗效果的动物模型。
[0071] 本发明第九方面提供了一种柯萨奇病毒A16型感染的动物模型的建立方法，其包括：
[0072] 1)将所述的柯萨奇病毒A16型病毒株进行培养，从而得到病毒培养液；以及[0073] 2)将步骤1)所得的病毒培养液施予动物，从而制备得到所述的动物模型。
[0074] 优选的是，所述的病毒培养液中病毒的含量为104～107CCID50/ml。
[0075] 优选的是，所述的动物可以采用本领域常用的动物，例如：小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等。所述的动物优选为小鼠，更优选为1-14日龄的乳鼠，所述的乳鼠可采用本领域常用的方法获得。更优选的是，所述的小鼠的品系为ICR、BALB/c、NIH或昆明品系。
[0076] 优选的是，在步骤2)中，所述的病毒培养液是注射到动物体内的。更优选的是，所述注射为颅内注射或腹腔注射，所述的病毒培养液的注射量优选为每只小鼠1000-10000CCID50。
[0077] 以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
[0078] 在以下实施例中，DMEM培养基可得自GIBCO公司；Vero细胞或人二倍体细胞可得自ATCC公司；牛血清可得自GIBCO公司；抗CA16免疫血清可得自ATCC公司；199细胞生长液可得自SIGMA公司；胰酶可得自GIBCO公司；细胞工厂可得自NUNC公司；超滤膜可得自MILLIPORE公司；Sepharose4FF、DEAE-Sepharose FF介质可得自GE公司；β-丙内酯可得自SIGMA公司；ICR、BALB/c、NIH、昆明小鼠可得自北京维通利华试验动物科技有限公司。
[0079] 实施例1：CA16病毒株的分离
[0080] 收集手足口病患者(分离自河北省石家庄市一名3岁重症手足口病患儿冯××)咽拭子标本，在4℃条件下，2000～4000rpm/min离心30min，取上清用0.2μm滤器过滤除菌，将过滤后的上清接种Vero细胞或人二倍体细胞。接种标本前，倒掉生长液，每瓶细胞(8×106个/瓶)接种0.2～1ml的标本悬液，培养温度为36±1℃；吸附1～2小时后，换上含2％(v/v)牛血清的DMEM培养基10ml继续培养。使用倒置显微镜逐日观察细胞病变，若7天无细胞病变效应(CPE)的出现，盲传1代继续观察7天，直到75％～90％的细胞发生变化，然后储藏在-20℃以备二次传代。第二代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后-70℃冻存，阴性则废弃。从而得到CA16病毒株，送至中国微生物菌毒种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为：CGMCC No.6954。
[0081] 实施例2：CA16病毒株的鉴定方法
[0082] (1)形态学观察：在光学显微镜下观察实施例1的CA16病毒株在Vreo细胞上的病变，细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加。超滤浓缩后，经2％磷钨酸溶液负染后，置电镜下可观察到球形病毒颗粒，直径约30nm。
[0083] (2)免疫学试验鉴定：将CA16病毒株的病毒培养液与等量的抗CA16免疫血清于36±1℃中和1～2小时后，接种于细胞培养板，继续培养7天，观察病变细胞孔数，同时设血清和细胞对照，病毒对照的滴度应不低于500CCID50/ml。结果显示病毒对照组孔全部出现细胞病变，血清对照组、细胞对照组细胞均未出现病变；候选毒株均可被抗CA16免疫血清中和，证明它们确为CA16病毒株。
[0084] (3)分子生物学鉴定：取病毒液0.2-0.5ml，提取病毒RNA，采用CA16特异性引物进行全基因扩增、序列测定和基因分型，以上步骤可由北京诺赛基因组研究中心进行。结果显示，其基因组全长7409bp，属于C1基因亚型。全基因序列如SEQ ID No.：1所示，对保守区序列进行分析，其与参考株：人柯萨奇病毒A16型病毒株SZ/HK08-7(全基因序列GenBank No.：GQ279371)的序列相比，核苷酸同源性在96.6％；其与参考株：人柯萨奇病毒A16型病毒株G10(全基因序列GenBank No.：U05876)相比，核苷酸同源性在78.9％。其中，SZ/HK08-7是C基因型，G10是A基因型。
[0086] 按照《中国药典》关于种子库建立方法的要求，疫苗生产用毒种应以病毒种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批，种子批细胞均需于-60℃以下冷冻保存。原始种子批应验明其记录、历史来源和生物特性。主种子批，应进行全面检定，检定内容包括鉴别试验、无菌试验、支原体检查、病毒滴定、病毒外源因子检查、免疫原性检查等项目。工作种子批进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、病毒滴定等项目检定，合格后方可使用。
[0087] 以Vero细胞为例，简述三级种子批的建立方法(但本发明不限于此)：将来自原始种子批的病毒接种至长成单层的Vero细胞(M.O.I＝0.001～1)，使用倒置显微镜逐日观察细胞病变，直至出现75％～90％的细胞病变时，将培养物置于-20℃冷冻，室温融化二次后，按照上述方法接种至新的Vero细胞单层细胞，直至出现75％～90％的细胞病变，如此反复进行病毒传代。每一批收获物记为一代。
[0088] 实施例4：CA16病毒株的培养方法
[0089] 从液氮罐中取出实施例1得到的冻存细胞，移植细胞悬液1ml(浓度：8×106个/ml)于10ml199细胞生长液中，置于36±1℃的温度下培养，4小时后更换培养液，继续置于36±1℃的温度下培养，待生长成致密单层后进行传代。弃去瓶中原有199细胞生长液，加入10ml0.25％(w/v)胰酶消化，待细胞脱壁后，补充6ml199细胞生长液，吹打至细胞呈分散悬液状，取1ml细胞悬液接种至25cm2细胞培养瓶中，进行细胞扩增，培养4～7天后，待细胞长
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满后，将细胞扩增至225cm 细胞培养瓶，继续培养4～7天后，将细胞转移在生物反应器中培养，培养条件为温度36±1℃、pH值7.0±0.5、溶解氧浓度20～80％、转速20～80rpm。培养可进行4-7天，确定病毒接种时间，按病毒接种量为M.0.I＝0.001～1的比例加入30L含2％(w/v)牛血清的DMEM培养基，混匀，接种至长成单层的细胞中，继续培养观察病变，待接种病毒后48-120小时，细胞出现明显病变后，收获病毒培养液。
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满后，将细胞扩增至225cm 细胞培养瓶，继续培养4～7天后，将细胞转移在生物反应器中培养，培养条件为温度36±1℃、pH值7.0±0.5、溶解氧浓度20～80％、转速20～80rpm。培养可进行4-7天，确定病毒接种时间，按病毒接种量为M.0.I＝0.001～1的比例加入30L含2％(w/v)牛血清的DMEM培养基，混匀，接种至长成单层的细胞中，继续培养观察病变，待接种病毒后48-120小时，细胞出现明显病变后，收获病毒培养液。
[0090] 实施例5：CA16疫苗及其制备方法
[0091] (1)超滤浓缩病毒：将按照实施例4所述的方法制备获得的病毒收获液，经截留分子量为100-1000KD的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍数约为20-200倍。
[0092] (2)病毒的纯化
[0093] 凝胶过滤层析：将病毒浓缩液加入至用pH6.0-8.00.1M～0.5MPBS平衡好的Sepharose4FF介质进行凝胶过滤层析，收集病毒峰。
[0094] 离子交换层析：将凝胶过滤层析后收集液加入至用pH6.0-8.00.1M～0.5M PBS平衡好的DEAE-Sepharose FF介质中进行离子交换层析，洗脱液为含0.1M～0.5M NaCl的pH6.0-8.00.1M～0.5M PBS，收集病毒峰。
[0095] 病毒灭活：采用甲醛作为灭活剂，按1∶2000比例于35℃灭活7天。也可用β-丙内酯灭活，按1∶2000比例于2-8℃灭活2天，然后37℃水解2小时。去除灭活剂后，即为疫苗原液5～40μg/ml。
[0096] (3)CA16疫苗的配制
[0097] CA16灭活疫苗半成品与成品(氢氧化铝佐剂吸附)的配制
[0098] 将实施例5获得的CA16灭活疫苗原液与氢氧化铝溶液(铝含量为10-20mg/ml)混合，使氢氧化铝含量为0.5～1.5mg/ml、蛋白含量为1～4μg/ml，即可获得CA16灭活疫苗半成品。将制成的半成品分装至无菌西林瓶(或预充式注射器)中，即可得到CA16灭活疫苗成品。
[0099] 实施例6：CA16疫苗免疫原性分析
[0100] 本发明人对根据实施例5的方法制备的CA16疫苗进行了免疫原性分析。
[0101] 动物免疫：将CA16灭活疫苗分为不同剂量组：0.3、1、3微克/ml，将实验动物BALB/c小鼠按疫苗接种剂量进行随机分组，每组10只。取CA16灭活疫苗，免疫动物，腹腔注射，1ml/只，免疫2次，间隔2～4周，于初次免疫后每周采血，共采6次，分离血清，按下述方法检测血清中和抗体效价。对照组中采用同样方式对10只BALB/c小鼠进行腹腔注射，不同的是所注射的为生理盐水。
[0102] 测定血清中和抗体效价方法：待测血清在96孔微量滴定板上进行2倍系列稀释，每个稀释度2孔，将中和用病毒(实施例4得到的病毒)分别稀释至100CCID50/50μl，滴加至微量滴定板上(血清、细胞对照除外)，50μl/孔。至36℃培养箱，中和2小时。中和结束后，将Vero细胞用胰酶消化后制备成细胞悬液，1×105/ml，加入96孔板中，100μl/孔，36℃、5％CO2继续培养7天后，观察细胞病变，判定结果，中和结束后进行病毒回滴，设立病毒对照、血清对照和细胞对照(此处3个对照是中和试验时设立的实验对照，病毒对照是指加病毒和细胞，不加血清是为了验证病毒能使细胞病变。血清对照是指加血清和细胞，不加病毒是为了验证血清对细胞没有干扰，不产生病变。细胞对照指的是只加细胞，不加病毒和血清，是为了验证细胞能够正常生长)。
[0103] 结果判定：当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，最高稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价(即，稀释时是2倍、4倍、8倍...稀释，相对应的中和效价则用1∶2、1∶4、1∶8...表示)；当最高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则最高稀释度与相邻低稀释度的平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的CA16中和抗体效价。
[0104] 结果显示，使用本发明制备的CA16疫苗，从免疫后第1周开始，就可诱发产生抗CA16抗体，第二次免疫后，抗体水平明显升高，如图1所示，且血清中和抗体水平与疫苗剂量存在明显的量效关系，0.3、1、3μg/ml组，血清中和抗体阳转率均达到100％，对照组未产生中和抗体，血清中和抗体阳转率为0％。各组血清中和抗体GMT达1∶(32～527)，对照组GMT低于1∶8。阳性判定标准：中和效价大于1∶8。
[0105] 实施例7：ELISA检测血清抗体
[0106] 用间接ELISA方法检测实施例6中所免疫的小鼠血清，即第二次免疫后2周的血清样品。
[0107] 主要步骤如下：用0.05M的碳酸盐缓冲液将实施例5步骤(2)纯化的样品稀释成浓度为1μg/ml的CA16抗原样品，然后包被酶标板，每孔100μl。37℃封闭1h后，用洗液洗涤3次。然后每孔加入系列稀释的待检测的免疫小鼠血清100μl，同时设阴性对照和空白对照，阴性对照为1∶50倍稀释的免疫前血清，空白对照为0.05M的碳酸盐缓冲液，37℃孵育1h后，用洗液洗涤3次。再次每孔加入100μl羊抗鼠IgG(购自Southern Biotech公司)，37℃孵育1h后，用洗液洗涤3次。接下来每孔加入100μl显色液，25℃避光反应10min后，每孔再加入50μl终止液。最后在酶标仪上测450nm/620nm下的OD值。按以下方法计算血清效价：(样品吸光值-空白吸光值)/(阴性吸光值-空白吸光值)≥2.1的最高稀释度即为血清效价。
[0108] 结果显示，使用本发明制备的CA16疫苗，在第二次免疫后第2周具有很高的IgG抗体水平，各组抗体效价均值都在1∶100000以上，如图2所示，且血清IgG抗体水平与疫苗剂量存在量效关系。
[0109] 实施例8：颅内注射CA16感染动物模型的建立方法
[0110] 主要步骤如下：取1-14日龄ICR乳鼠，颅内注射按实施例4方法制备的攻毒用毒株的病毒培养液，浓度为105CCID50/ml，10-30μl/只，即获得CA16感染动物模型。
[0111] 具体操作步骤如下：
[0112] (1)动物分组
[0113] 取1-14日龄乳鼠两组(每组10只)，分别设为病毒组和正常对照组，病毒组颅内注射攻毒用毒株培养液，正常对照组注射DMEM培养液。
[0114] (2)颅内注射
[0115] 用无菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培养液，颅内注射乳鼠，10-30μl/只，正常对照组注射病毒培养液，10-30μl/只，逐日观察乳鼠发病情况。
[0116] (3)乳鼠发病情况观察
[0117] 颅内注射后第1天和第2天病毒组和正常对照组均无异常，病毒攻击后第3天病毒组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，正常对照组无异常。病毒攻击后第4天病毒组乳鼠全部死亡，而正常对照组无异常，实验组乳鼠生存率曲线如图3所示，证明动物模型建立成功。
[0118] 实施例9：腹腔注射CA16感染动物模型的建立方法
[0119] 主要步骤如下：取1-14日龄ICR乳鼠，腹腔注射按实施例4方法制备的攻毒用毒株的病毒培养液，浓度为105CCID50/ml，100μl/只，即获得柯萨奇病毒A16型病毒的腹腔感染动物模型。
[0120] 具体操作如下：
[0121] (1)动物分组
[0122] 取1-14日龄乳鼠两组(每组10只)，分别设为病毒组和正常对照组，病毒组腹腔注射攻毒用毒株病毒培养液，正常对照组注射DMEM培养液。
[0123] (2)腹腔注射
[0124] 用无菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培养液，腹腔注射病毒组乳鼠，100μl/只；正常对照组注射DMEM培养液，100μl/只。逐日观察乳鼠发病情况。
[0125] (3)乳鼠发病情况观察
[0126] 腹腔注射后第1天和第2天病毒组和正常对照组均无异常，病毒攻击后第3天病毒组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，正常对照组无异常。病毒攻击后第4天实验组乳鼠全部死亡，而正常对照组无异常，如图5所示，其中，A图为正常对照组正常乳鼠，B图为病毒组后肢麻痹、瘫痪乳鼠。实验组乳鼠生存率曲线如图4所示，证明动物模型建立成功。
[0127] 实施例10：CA16感染动物模型乳鼠病理改变
[0128] 1)动物攻毒
[0129] 用实施例8所示方法，对乳鼠攻毒。
[0130] 2)攻毒后取乳鼠脏器
[0131] 病毒攻击后，病毒攻击后第3～4天乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，解剖乳鼠，分别采集乳鼠的心、脑、肺、肝、脾、肾、肠、脊柱、肌肉各个组织。
[0132] 3)病理分析
[0133] 经过组织固定、切片，通过苏木精-伊红染色。心、肺、肝、脾、肾、肠、脊柱、肌肉各个组织未见明显病理变化，而在脑组织中镜下可以看见脑内蛛网膜下腔血管充血。如图6B示出，镜下可以看见脑内蛛网膜下腔血管充血。而图6A示出正常对照乳鼠未见病理变化。证明动物模型建立成功。
[0134] 比较例1：本发明的CA16病毒株与对照CA16病毒攻毒比较
[0135] 主要步骤如下：取1-14日龄ICR乳鼠，颅内注射按实施例4方法制备的攻毒用毒株的病毒培养液和对照CA16病毒(人柯萨奇病毒A16型病毒株G10(全基因序列GenBank No.：U05876)，浓度为105CCID50/ml，10-30μl/只，进行攻毒比较。
[0136] 具体操作如下：
[0137] (1)动物分组
[0138] 取1-14日龄乳鼠两组(每组10只)，分别设为本发明病毒组和对照病毒组，本发明病毒组颅内注射攻毒用毒株病毒培养液，对照病毒组注射对照CA16病毒。
[0139] (2)颅内注射
[0140] 用无菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培养液，颅内注射本发明病毒组乳鼠，10-30μl/只；对照病毒组注射对照CA16病毒，10-30μl/只。逐日观察乳鼠发病情况。
[0141] (3)乳鼠发病情况观察
[0142] 颅内注射后第1天和第2天本发明病毒组和对照病毒组均无异常，病毒攻击后第3天本发明病毒组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，对照病毒组无异常。病毒攻击后第4天本发明病毒组乳鼠全部死亡，而对照病毒组无异常，如图7所示，其中，A图为对照病毒组乳鼠，B图为本发明病毒组后肢麻痹、瘫痪乳鼠。实验结果表明与对照CA16病毒相比，本发明毒株可以使乳鼠致病死亡。
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