具有2FL和LNnT的营养组合物，用于通过作用于肠道微生物群生态失调来预防和/或治疗非轮状病毒腹泻
阅读：1086发布：2020-05-27
专利汇可以提供具有2FL和LNnT的营养组合物，用于通过作用于肠道微生物群生态失调来预防和/或治疗非轮状病毒腹泻专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种营养组合物，该营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，用于通过在非轮状病毒腹泻之前和/或之后作用于 微 生物 群的生态失调来 预防 和/或 治疗 婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。所述组合物可以是婴儿配方食品，并且特别是用于主要用婴儿配方食品喂养的0至12月龄之间的婴儿。所述组合物促进健康的肠内菌群并且具有有益的短期和长期效果。，下面是具有2FL和LNnT的营养组合物，用于通过作用于肠道微生物群生态失调来预防和/或治疗非轮状病毒腹泻专利的具体信息内容。
1.一种营养组合物，所述营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，用于通过在婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调来预防和/或治疗所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。
2.根据权利要求1用于所述用途的营养组合物，其中所述岩藻糖基化低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖I、乳糖-N-岩藻五糖II、乳糖-N-岩藻五糖III、乳糖-N-岩藻五糖V、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖I、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖I、岩藻糖基乳糖-N-新六糖II、二岩藻糖基乳糖-N-六糖I、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖I、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖II、岩藻糖基-对-乳糖-N-六糖以及它们的任意组合。
3.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述岩藻糖基化低聚糖包含2'-岩藻糖基-表位。
4.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述岩藻糖基化低聚糖为2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的营养组合物，其中所述N-乙酰化低聚糖为乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(LNnT)或者它们的任意组合。
6.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述N-乙酰化低聚糖为乳糖-N-新四糖(LNnT)、对-乳糖-N-新六糖(对-LNnH)或它们的任意组合，优选地其中所述N-乙酰化低聚糖为乳糖-N-新四糖(LNnT)。
7.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，包含2'-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖(LNnT)，或包含由2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)和乳糖-N-新四糖(LNnT)组成的低聚糖混合物。
8.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中
以干重计，所述一种或多种岩藻糖基化低聚糖的总量为0.5-3g/L诸如0.8-1.5g/L的所述组合物，和/或总量为0.38-2.32g/100g诸如0.62-1.16g/100g的所述组合物；以及/或者以干重计，所述一种或多种N-乙酰化低聚糖的总量为0.05-1g/L诸如0.5-0.8g/L的所述组合物，和/或总量为0.03-0.78g/100g诸如0.39-0.62g/100g的所述组合物。
9.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，包含至少另外的一种或多种低聚糖和/或其纤维和/或前体，选自GOS、FOS、XOS、菊粉、聚葡萄糖、唾液酸化低聚糖、唾液酸、岩藻糖以及它们的任意组合。
10.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，所述组合物还包含至少一种益生菌，所述益生菌的量为103cfu/g所述组合物至1012cfu/g所述组合物(干重)。
11.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述营养组合物为婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大或2段婴儿配方食品、早产儿配方食品、幼儿食品、婴儿谷物组合物、强化剂或补充剂。
12.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其用于6月龄以下婴儿。
13.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述非轮状病毒腹泻是因大肠杆菌(ETEC、EPEC和/或EAEC)、沙门氏菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属和/或弯曲菌属所致。
14.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述肠道内整体微生物群涉及肠道内整个微生物群的组成和/或功能，诸如所述微生物群的相对分类丰度、多样性、活性和/或功能性。
15.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，与主要或完全用不含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，通过将婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群促进和/或诱导成更接近这些婴儿或幼儿未患非轮状病毒腹泻时的整体微生物群和/或更接近完全母乳喂养的婴儿或幼儿的整体微生物群。
16.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群和/或主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，所述促进和/或诱导涉及双歧杆菌属群体的上调以及/或者埃希氏菌属和/或消化链球菌科群体的下调。
17.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群和/或主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，所述促进和/或诱导涉及病原体的减少，尤其是细菌病原体艰难梭菌的量的减少以及/或者毒力因子的减少。
18.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群和/或主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，所述促进和/或诱导涉及减少产生游离氨基酸和/或刺激产生乳酸盐。
19.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群和/或主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，所述促进和/或诱导的婴儿和/或幼儿肠道内整体微生物群在α多样性方面显著减少。
20.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群和/或主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，所述促进和/或诱导的婴儿和/或幼儿肠道内整体微生物群在α多样性方面至少减少0.10单位，诸如至少0.12单位，或至少
0.15单位，例如0.19单位。
21.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中例如在1、4、6或8周龄时或之后，并且例如在用所述营养组合物喂养1、4、6或8周之后能够在所述婴儿或幼儿的粪便中测量肠道内整体微生物群的所述促进和/或诱导。
22.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中在生命的前1、2、4、8或12周期间，或在生命的前2、4、6、8、12、24或36个月期间喂养或打算喂养所述营养组合物。
具有2FL和LNnT的营养组合物，用于通过作用于肠道微生物群
技术领域
[0001] 本发明涉及用于婴儿或幼儿的营养组合物及其健康效果。此类组合物包含特定低聚糖，并且可有效预防和/或治疗婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。具体地讲，本发明涉及包含诱导整体肠道微生物群更接近正常情况的人乳低聚糖(HMO)的婴儿配方食品。
背景技术
[0002] 建议所有婴儿采用母乳喂养。然而，在一些情况下，由于某些医学原因，母乳喂养并不足够或不成功，或者母亲不选择母乳喂养。人们已针对这些情况开发出了营养组合物，诸如婴儿配方食品。
[0004] 然而，已经知道人类母乳代表婴儿的营养方面终极的黄金标准。因此，婴儿配方食品制造商已经做出了许多尝试来引起与人类母乳的益处接近或类似的营养健康效果。然而，许多研究表明，婴儿配方食品与人类母乳相比，不会对身体引起同样的效应。例如，喂食婴儿配方食品的婴儿和喂食人类母乳(HBM)的婴儿可表现出不同的肠道微生物群。
[0005] 生命的婴儿期，尤其是前几个星期、前3个月、前6个月或前12个月，对于建立平衡的肠道微生物群是至关重要的时期。
[0006] 已知婴儿期肠道微生物群的调节对于身体的未来健康状况可预期具有重大影响。例如，肠道菌群可对日后的强健的免疫系统的发育、正常的生长具有影响，并且甚至对日后的肥胖的出现具有影响。
[0007] 然而，在婴儿的发育过程中，肠道微生物群及其进化是许多肠道细菌种群的存在和繁衍(数量)之间的精密平衡。关于肠道细菌对婴儿整体健康的影响，一些肠道细菌被归类为“总体正面的”，而其他肠道细菌是“总体负面的”(或致病性的)。
[0008] 相比于母乳喂养的婴儿，某些种类的“总体正面的”细菌(诸如双歧杆菌属)，在喂食常规婴儿配方食品的婴儿中可能不足。类似地，一些细菌种群被认为是致病性的，并且在肠道微生物群中应保持低繁衍。
[0009] 的确，用婴儿配方食品喂养的婴儿可能不能获益于仅用或主要用人类母乳喂养的婴儿的天然、良好平衡的肠道菌群(肠道微生物群)。在母乳喂养的婴儿中观察到的这样的天然微生物群的确随着时间推移被很好地控制(随着时间推移而进化)并且是复杂的。许多微生物类群共存于肠道/肠内的高度复杂微环境中，每一者以依序限定的比例存在。当限定婴儿或幼儿的微生物群时，应该考虑数量维度和质量维度。此外，肠道微生物群随时间推移的变化增加了复杂性。
[0010] 健康的肠内菌群是婴儿健康的指标，并且改变的肠内微生物群可能是异常健康事件诸如腹泻、营养物质吸收不足、绞痛、改变的睡眠和/或改变的生长和发育的指标(和/或起因)。
[0011] 腹泻(diarrhea或diarrhoea)是每天有至少三次松散或液体肠运动的病症。它通常持续几天，并且可由于流体损耗而导致脱水。脱水的迹象通常首先表现为皮肤丧失正常弹性和性情格变化。当脱水进一步加重时，可继续发展为排尿减少、皮肤失去颜色、心率加快以及反应能力下降。腹泻还涉及在腹泻事件之前和之后出现的整体肠道微生物群生态失调。腹泻是儿童死亡率的一个主要原因，多年以来都是撒哈拉以南非洲和南亚地区死亡的四大原因之一。据估计，全世界5岁以下儿童的腹泻死亡比例为约15％。最常见的原因是由于病毒、细菌或寄生虫造成的肠感染；即称为胃肠炎的病症。大肠杆菌(Escherichia coli)是排在轮状病毒之后的导致发展中国家儿童患腹泻的主要病原体。生存也存在风险。2岁之前频繁患腹泻与未来平均少长高3.6cm、锻炼后心率升高、IQ低10分以及上学晚约一年均相关。因此，十分重要的是不仅减少腹泻发作，而且也提高康复率和改善患病之后的康复期。
[0012] 此类肠感染一般是自限制的病症，但非特异性疗法可为一些患者提供缓解，并且特定疗法可缩短疾病的持续时间并且消除生物体的粪便脱落。在护理腹泻和脱水患者时，主要治疗考虑因素包括流体和电解质疗法、饮食控制(但喂养恢复对于减少营养缺陷十分重要)、采用止泻化合物的非特定疗法(以减轻症状)和采用抗微生物剂的特定疗法(一般仅对于痢疾情况)。
[0013] 然而，由于婴儿和幼儿年龄太小且虚弱，这些现有解决方案不是很适合婴儿和幼儿，尤其是未批准将止泻药化合物用于2岁以下的幼儿。
[0014] 抗生素也不适宜，不仅因为婴儿和幼儿年龄太小，而且也因为大肠杆菌对许多抗生素具有抗性(Jiang ZD等人，Prevalence of enteric pathogens among international travelers with diarrhea acquired in Kenya(Mombasa),India(Goa),or Jamaica(Montego Bay)J Infect Dis.2002；185(4):497-502(肠病原体在肯尼亚(Mombasa)、印度(Goa)或牙买加(Montego Bay)患上痢疾的国际旅行者中泛滥，《感染病杂志》，2002年，第
185卷第4期，第497-502页))。
185卷第4期，第497-502页))。
[0015] 因此，开发出替代疗法。
[0016] 针对大肠杆菌腹泻研究了噬菌体治疗 (Brüssow H .http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16000704)。对许多细菌感染包括大肠杆菌腹泻的噬菌体鸡尾酒在俄罗斯的药房有售，但其功效尚未记载于详细的科学报告中。在其中儿童主要感染肠毒素大肠杆菌(ETEC)的实验性临床试验中，T4类或商用俄罗斯大肠杆菌噬菌体鸡尾酒均不对定量腹泻标准具有任何影响。粪便ETEC峰短暂、滴度低，并且仅有一半的粪便大肠杆菌分离物是噬菌体敏感的。
[0017] 科学家着重研究了益生菌的用途。例如，类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株ST11改善了孟加拉国儿童的非轮状病毒腹泻的治疗成果，但它对于轮状病毒腹泻没有效果(A.Sarker,Pediatric,2005(A.Sarker，《儿科》，2005年))。益生菌不是整体治疗或预防腹泻的最合适解决方案，因为它们只能增加特定的微生物群类群。的确，益生菌被认为是存活的微生物制剂，其通过维持肠内的天然微生物群落来提升个体的健康。我们认为，益生菌附着于肠粘膜、定殖于肠道内，还可防止有害微生物附着于其上。益生菌要发挥作用，先决条件是必须以适当、存活的形式到达肠粘膜，而不被胃肠道上段破坏，尤其是不受胃中普遍很低的pH影响。另一个难处在于肠道微生物群是非常多样化和复杂的，并且细菌之间有各种相互作用。
[0018] 还探讨了其它成分，例如非消化性碳水化合物(益生元)。人乳低聚糖(HMO)专门被报道为可缩短配方食品喂养的猪的轮状病毒腹泻持续时间(根据Li等人2014年在ISME杂志上的文章和伊利诺伊州大学2015年开展的一项研究)。
[0019] 这些物质可在肠道中用作可溶性诱饵受体，保护新生儿免受肠道病原体的侵害(Newburg等人，Human milk glycans protect infants against enteric pathogens(人乳聚糖保护婴儿免受肠道病原体的侵害)，《营养学年鉴》，2005年，第25卷，第37-58页)，并且可也直接与肠上皮细胞相互作用，产生可能干扰宿主-微生物相互作用的变化(Bode等人，2012年)。
[0020] 来自Glykos的EP1531832涉及HMO的属性充当结合病原体的天然受体。其尤其涉及与腹泻大肠杆菌结合的含低聚糖的物质或受体。在HMO的示例中引用了2FL和LNnT。
[0021] 类似地，来自Abbott的WO9956754描述了具有防止大肠杆菌或霍乱弧菌附接到宿主细胞受体的2FL的组合物。
[0022] 然而，由于这些物质通常用作诱饵受体，因此对病原体类型是非常特异性的。这些解决方案也不考虑腹泻事件之前、期间和之后的微生物群生态失调。
[0023] 也已知益生元可影响特定肠道微生物的促生。例如，已证实某些低聚半乳糖(GOS)和/或某些低聚果糖(FOS)可促进肠道尤其是婴儿肠道中的双歧杆菌属的生长和繁衍。
[0024] 来自Abbott的WO9843495涉及含有有效量的乳糖-N-新四糖的营养配制物，以模拟婴儿双歧杆菌的生长和/或代谢活动。
[0025] 来自Nestec SA的WO2009060073涉及低聚糖诸如乳糖-N-四糖或乳糖-N-新四糖用以促进在婴儿生命的前几个星期中有益的肠微生物群的发育的用途，该有益的肠微生物群与母乳喂养的婴儿中发现的相当，尤其是由可观的双歧杆菌属和乳杆菌种群体占主导地位的肠微生物群，排除其他群体诸如拟杆菌属、梭菌属和链球菌属。
[0027] 然而，这些研究中的大多数提供的解决方案不针对非轮状病毒腹泻情况和整体相关症状的目标治疗或预防。它们可能仅通过调节特定微生物群类群来作用于微生物群，例如，它们导致双歧杆菌属数目增加或梭菌数目减少。
[0028] 然而，目前没有任何解决方案可通过使整体肠道微生物群(即整体/整个/所有/全部微生物群)接近正常水平来治疗或预防非轮状病毒腹泻。
[0029] 现有的解决方案似乎也不考虑肠道微生物功能。
[0030] 因此，对于婴儿或幼儿而言，需要降低非轮状病毒腹泻风险和/或改善康复期，具体方式包括缩短非轮状病毒腹泻的持续时间和/或减轻非轮状病毒腹泻的症状和后果，尤其是在所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调。
[0031] 需要对婴儿或幼儿在非轮状病毒腹泻情况下观察到的异常总体肠道微生物群进行补偿。需要在组合物和功能方面实现此类总体肠道微生物群的再平衡。
[0032] 在建立这种平衡时，需要在出生后的头几周期间增强婴儿的总体肠道微生物群的良好平衡，尤其是通过下调或抑制致病性细菌的生长。
[0033] 需要用于婴儿或幼儿的营养组合物，该营养组合物提供与正常情况(即，健康，非腹泻情况)和/或母乳喂养婴儿所获得的更接近的整体微生物群和代谢标记。
[0034] 需要为所述婴儿或幼儿提供最好的营养，使得整体肠道微生物群的发育接近未患有非轮状病毒腹泻和/或母乳喂养婴儿的情况，所述发育为短期的(即，在营养干预期间)和/或长期的(即，在营养干预之后)。
[0035] 需要用于婴儿或幼儿的营养组合物，该营养组合物提供不允许非轮状病毒腹泻的出现和/或促进更快地从非轮状病毒腹泻中康复的微生物群组合物。
[0036] 需要以下列方式向这些婴儿或幼儿递送此类健康益处：不引发副作用的方式和/或不仅容易递送，还能获得父母或健康护理人员广泛认可的方式。
发明内容
[0037] 本发明涉及一种营养组合物，该营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，用于通过在婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调来预防和/或治疗所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。
[0038] 由于该营养组合物，所述婴儿或幼儿的整体肠道微生物群将变得更接近未患有非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的整体肠道微生物群。
[0039] 与主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，它还使得婴儿或幼儿更接近完全母乳喂养的婴儿或幼儿肠道的整体微生物群。
[0040] 本发明的营养组合物具有以下优点：对肠中整个微生物群的组成和/或功能诸如所述微生物群的相对分类丰度(或量)、多样性、活性和/或功能性提供影响。
[0041] 在一个特别有利的实施方案中，该营养组合物包含2'-岩藻糖基乳糖(2-FL)和乳糖-N-新四糖(LNnT)。在一个特别有利的实施方案中，其包含量为0.8至1.5g/L营养组合物的2'-岩藻糖基乳糖(2-FL)和量为0.5至0.8g/L营养组合物的LNnT。附图说明
[0042] 图1表示在急性腹泻发作期间在住院婴儿和幼儿的连续粪便样本中总细菌、大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌的滴度发展。
[0043] 图1A：通过通用细菌16S rDNA引物进行的实时qPCR测定的粪便细菌总数的四分位数范围的中值滴度；对于健康本地对照婴儿和幼儿(H)和住院后指定日子的腹泻患者表示为log10cfu/g粪便当量。只有H明显不同于其他时间点(Dumm的多重比较测试)。
[0044] 图1B：McConkey琼脂上的四分位数范围活大肠杆菌计数的中值，对于住院后指定日子的腹泻患者测定为log10cfu/g新鲜粪便(纵坐标)。
[0045] 图1C至图1D：在住院的腹泻患者(从微生物角度确认患ETEC感染)的粪便中，热稳定(st-ETEC，C)和热不稳定(lt-ETEC，D)的携带肠毒素的细菌的滴度分布和中值滴度。通过实时PCR测定的滴度用于所指示的住院天数，并且与健康对照婴儿和幼儿(H)进行比较。滴度以ETEC cfu当量表示为log 10中值滴度。
[0046] 图2涉及患急性细菌性腹泻的住院婴儿和幼儿连续粪便样本中通过16S rRNA基因测序进行的粪便微生物群分析。
[0047] 图2A：来自20个健康对照婴儿和幼儿(H)和56例腹泻患者在所指示的住院日子(第1天到第21天)的粪便样本的细菌群落结构特征图。图示给出了用右侧图例标识的细菌属的相对丰度百分比。
[0048] 图2B、2C和2D：与健康对照婴儿和幼儿(H)相比，所指示细菌属(分别是双歧杆菌属、链球菌、埃希氏菌属)在所指示的腹泻日子的中值丰度百分比。
[0049] 图3表示如通过16S rRNA基因谱测量的母乳喂养参考(BF)、对照配方食品(Ctrl)和含HMO的测试配方食品组之间的属水平的整体平均微生物群的一般概况。
[0050] 图4表示如通过16S rRNA基因谱测量的三个主要分类群的三个组(BF组、对照组和测试组)的相对组成，其显示了测试组和对照组之间具有显著差异：双歧杆菌属(Bifidobacterium)(图4A)，埃希氏菌属(Escherichia)(图4B)和未分类消化链球菌科
(Peptostreptococacceae uncl)(图4C)。描述了具有四分位数范围的中值。显著差异由*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001指示。BF，母乳喂养参考组。
(Peptostreptococacceae uncl)(图4C)。描述了具有四分位数范围的中值。显著差异由*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001指示。BF，母乳喂养参考组。
[0051] 图5表示三个组(BF组、对照组和测试组)的整体微生物群的α多样性，其使用基于16S rRNA谱的PD_whole_tree计算。显著差异由*，p<0.05；**，p<0.01指示
[0052] 图6表示基于如通过16S rRNA基因谱测量的属水平数据的冗余分析，并且显示了三个组的显著分离。p<0.001。
[0053] 图7是示出如通过宏基因组学测量的编码已知毒力因子的检出基因列表的表格。C/T、C/B和T/B分别代表对照组与测试组，对照组与母乳喂养组以及测试组与母乳喂养组之间的显著差异。如果需要的话，通过拟合负二项式回归模型来评估组间重要性，该模型考虑了零膨胀计数数据。每个组还显示具有检出基因的婴儿数量。
[0054] 图8是示出如通过宏基因组学测量的编码已知抗生素抗性基因的检出基因列表的表格。C/T、C/B和T/B分别代表对照组与测试组，对照组与母乳喂养组以及测试组与母乳喂养组之间的显著差异。如果需要的话，通过拟合负二项式回归模型来评估组间重要性，该模型考虑了零膨胀计数数据。每个组还显示具有检出基因的婴儿数量。
[0055] 图9表示来源于与氨基酸和其他有机酸代谢相关的1H NMR波谱学粪便数据的重要代谢物的相对浓度：苯丙氨酸(图9A)、酪氨酸(图9B)、乳酸盐(图9C)和异亮氨酸(图9D)。*指示由Kruskal-Wallis得出的显著差异(p<0.05)。BF，母乳喂养参考组。
具体实施方式
[0056] 如本文所用，下列术语具有如下含义。
[0057] 术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童。
[0058] 表述“幼儿”是指年龄介于一岁和三岁之间的儿童，也称为学步儿童。
[0059] “剖腹产婴儿或幼儿”是指通过剖腹产术分娩的婴儿或幼儿。这意味着婴儿或幼儿不是经阴道分娩的。
[0060] “顺产婴儿或幼儿”是指经阴道分娩而不是通过剖腹产术分娩的婴儿或幼儿。
[0061] “早产儿”是指不足月生产的婴儿或幼儿。通常是指在37周妊娠期完成之前出生的婴儿或幼儿。
[0062] 表述“小于胎龄儿”或“SGA”意指个头小于同胎龄出生的正常标准(最常被定义为体重在同胎龄的第10个百分位以下)的婴儿或幼儿。在一些实施方案中，SGA可能与宫内生长受限(IUGR)相关联，其中IUGR是指胎儿无法达到其潜在个头的病症。
[0063] 表述“低出生体重”应理解为出生时体重不足2500g。
[0064] 表述“营养组合物”是指供给个体养分的组合物。这种营养组合物通常为口服或静脉内施用，并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。
[0065] 在一个具体实施方案中，本发明的营养组合物是低变应原性的营养组合物。表述“低变应原性的营养组合物”是指不大可能引起变态反应的营养组合物。
[0066] 在一个具体实施方案中，本发明的营养组合物是“合成的营养组合物”。表述“合成的营养组合物”是指采用化学和/或生物方法制出的混合物，该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同(也就是说，合成组合物不是母乳)。
[0067] 如本文所用，表述“婴儿配方食品”是指旨在专用于供给出生后头几个月内的婴儿营养，而且本身满足这类人群的多种营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/EEC 2006/141/EC号指令中第2(c)条的规定)。也涉及旨在用于婴儿的营养组合物，如在食品法典委员会(法典STAN 72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食品)中所定义的那样。表述“婴儿配方食品”既涵盖“1段婴儿配方食品”，也涵盖“2段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”。在一些实施方案中，婴儿配方食品是早产儿配方食品。
[0068] “2段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始提供。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
[0069] 表述“幼儿食品”是指旨在专用于供给不满一岁的婴儿或幼儿营养的食料。
[0070] 表述“婴儿谷物组合物”是指旨在专用于供给不满一岁的婴儿或幼儿营养的食料。
[0071] 术语“强化剂”是指适宜与母乳或婴儿配方食品混合的液态或固态营养组合物。
[0072] 术语“HMO”是指(一种或多种)人乳低聚糖。这些碳水化合物高度耐受酶促水解，这表明其表现的重要功能可能不与其热值直接相关。本领域已特别指出，这些碳水化合物在婴儿和幼儿的早期发育(诸如，免疫系统的成熟)过程中发挥关键作用。在人乳中发现了许多不同种类的HMO。每种单独的低聚糖都以葡萄糖、半乳糖、唾液酸(N-乙酰神经氨酸)、岩藻糖和/或N-乙酰基葡糖胺与这些分子间各式各样的键的组合为基础，因此人乳含有大量种类各不相同的低聚糖，迄今已鉴定出逾130种此类结构。几乎所有低聚糖的还原端都有乳糖分子，且非还原端的末端位置都由唾液酸和/或岩藻糖(如果有的话)占据。HMO可以呈酸性(例如，含带电唾液酸的低聚糖)，也可以呈中性(例如，岩藻糖基化低聚糖)。
[0073] “岩藻糖基化低聚糖”是具有岩藻糖残基的低聚糖。这种低聚糖呈中性。一些示例为2-FL(2'-岩藻糖基乳糖)、3-FL(3-岩藻糖基乳糖)、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖(例如，乳糖-N-岩藻五糖I、乳糖-N-岩藻五糖II、乳糖-N-岩藻五糖III、乳糖-N-岩藻五糖V)、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖I、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-六糖I、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖II以及这些物质的任意组合。
[0074] 表述“包含2'-岩藻糖基表位的岩藻糖基化低聚糖”和“2-岩藻糖基化低聚糖”涵盖了具有一定同源形式的岩藻糖基化低聚糖，这些同源形式的岩藻糖基化低聚糖都包含2’-岩藻糖基表位，因而可推测它们具有一定同源功能。
[0075] 表述“N-乙酰化低聚糖”涵盖“N-乙酰氨基乳糖苷”和“含N-乙酰氨基乳糖苷的(一种或多种)低聚糖”两者。这种低聚糖是具有N-乙酰氨基乳糖苷残基的中性低聚糖。合适的示例为LNT(乳糖-N-四糖)、对-乳糖-N-新六糖(对-LNnH)、LNnT(乳糖-N-新四糖)以及它们的任意组合。其他示例为乳糖-N-六糖、乳糖-N-新六糖、对-乳糖-N-六糖、对-乳糖-N-新六糖、乳糖-N-八糖、乳糖-N-新八糖、异-乳糖-N-八糖、对-乳糖-N-八糖和乳糖-N-十糖。
[0076] 表述“至少一种岩藻糖基化低聚糖”和“至少一种N-乙酰化低聚糖”是指“至少一种类型的岩藻糖基化低聚糖”和“至少一种类型的N-乙酰化低聚糖”。
[0077] “HMO前体”是用于制备HMO的关键化合物，诸如唾液酸和/或岩藻糖。
[0079] 本发明的营养组合物可为固体形式(例如，粉末)或液体形式。各种成分(例如低聚糖)的量在组合物为固体形式(例如粉末)时可按照以干重计的g/100g组合物来表示，或者在组合物是指液体形式时表示为g/L组合物的浓度(后者还涵盖可由粉末在液体(诸如乳、水…)中重构之后获得的液体组合物，例如重构的婴儿配方食品或较大/2段婴儿配方食品或婴儿谷物产品或任何其他被设计用于为婴儿提供营养的配制物)。它们也可以g/100kcal表示。
[0080] 表述“离乳期”是指在婴儿或幼儿的饮食中逐步用其它食物替代母乳的时期。
[0081] 表述“X天龄/周龄/月龄/年龄”、“生命的X天/周/月/年”和“出生X天/周/月/年”可互换使用。
[0082] “母乳”应理解为母亲的母乳或初乳。HBM是指人类母乳。
[0083] 表述“只用人类母乳喂养的婴儿/幼儿”、“仅用母乳喂养的婴儿或幼儿”、“完全母乳喂养的婴儿或幼儿”和“母乳喂养的婴儿/幼儿”可互换使用。他们是指用大多数(即，至少90％、或至少95％、或至少99％)或全部(100％)源自人类母乳的营养物质和/或能量喂养的婴儿或幼儿。
[0084] 表述“只用营养组合物喂养的婴儿或幼儿”是指用大多数(即，至少90％、或至少95％、或至少99％)或全部(100％)源自合成营养组合物(诸如婴儿配方食品、后续乳或成长乳)的营养物质和/或能量喂养的婴儿或幼儿。
[0085] 表述“主要用营养组合物喂养的婴儿或幼儿”是指用主要源自合成营养组合物(诸如婴儿配方食品、后续乳或成长乳)的营养物质和/或能量的营养源喂养的婴儿或幼儿。“主要”是指那些营养物质和/或能量的至少50％(或至少60％或至少75％)，诸如50％至90％、或60％至80％。
[0086] 表述“促进和/或诱导”婴儿或幼儿中的肠道内特定整体微生物群是指所述婴儿或幼儿中的特定整体微生物群的发育、增加、建立、出现和/或改变。
[0087] 表述“常规营养组合物”是指标准合成营养组合物，诸如市场中已经可见的婴儿配方食品、后续乳或成长乳。“不包含所述低聚糖的常规营养组合物”是指不包含“至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖”的标准营养组合物。
[0088] 术语“微生物”、“微生物群落”和“微生物群”可互换使用。
[0089] 表述“肠道内微生物群”、“肠道的微生物群”“肠道微生物群”和“肠微生物群”可互换使用。
[0090] 术语“整体”、“总体”、“全部”、“整个”和“全体”可互换使用，特别是在“整体微生物群”的表述中。表述“肠道内整体微生物群/肠道的整体微生物群”或“整体肠道微生物群”是指肠道中的总体(或整个、全部、全体)微生物群。其涵盖：
[0091] -整体微生物群组成，即，肠道中整个微生物群的相对分类丰度(或量)和/或多样性，也就是说该微生物群的“定量”和/或“定性”方面；以及/或者
[0092] -整体微生物群功能，即，肠道中整个微生物群的活性和/或功能，特别是代谢活性/功能。其可通过由宏基因组学测量预测基因的相对丰度，或通过主要代谢物的定量剖析来评估，所述主要代谢物包括氨基酸、主要有机酸(乳酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐…)和/或碳水化合物。
[0093] 合适和健康的肠道微生物群是婴儿的粘膜免疫系统发育的关键因素。
[0094] 术语“生态失调”是指体内的微生物不平衡。表述“(整体)肠道微生物群生态失调”或“(整体)肠道微生物群的生态失调”是指肠道中的(整体)微生物不平衡。
[0095] 表述“作用于整体肠道微生物群的生态失调”涵盖“预防和/或治疗(整体)肠道微生物群的生态失调”，即：
[0096] -预防肠道中的整体微生物群生态失调：例如避免发生整体肠道微生物群生态失调(无论是在腹泻发作之前、期间、之后或全部这些情况，优选地为在期间)；
[0097] -治疗肠道中的整体微生物群生态失调：例如减轻或减少或限制在腹泻情况下发生的整体肠道微生物群生态失调(无论在腹泻发作之前、期间、之后或全部这些情况，优选地为在期间)；以及/或者
[0098] -包括这两种作用。
[0099] 表述“腹泻”、“痢疾”和“腹泻发作”可互换使用。表述“非轮状病毒腹泻”可指因大肠杆菌(Escherichia coli)引起的腹泻，大肠杆菌也命名为E.coli(例如肠毒素大肠杆菌ETEC、致肠病大肠杆菌EPEC和/或肠聚集性大肠杆菌EAEC)、沙门氏菌属、志贺氏杆菌属、气单胞菌属和/或弯曲杆菌属。
[0100] 在一个优选的实施方案中，其涉及因大肠杆菌引起的腹泻。
[0101] 表述“下调”和“下降”可互换使用。
[0102] 表述“预防(preventing或prevention)”是指避免身体状况、病症或其后果发生以及/或者降低其发生率(即减少频率)。
[0103] 表述“治疗(treating或treatment)”是指减少身体状况、病症或其后果的持续时间和/或严重程度。
[0104] 身体状况、病症或其后果的预防和/或治疗可发生在治疗期间(即，在本发明的组合物的施用期间，要么紧接在施用开始之后或要么在施用开始的一段时间之后，例如在开始后几天或几周)。但是其也可涵盖日后的预防和/或治疗。表述“日后的”涵盖干预或治疗结束后的效果。这种效果“日后的”可维持1周至数月，例如，2至4周、2至6周、2至8周、1至6个月，或2至12个月。
[0105] 术语“益生元”是指通过选择地刺激健康细菌(诸如，人体结肠中的双歧杆菌属)的生长和/或其活性，而对宿主产生有利作用的非消化性碳水化合物(Gibson GR,Roberfroid MB.Dietary modulation of the human colonic microbiota:introducing the concept of prebiotics.J Nutr.1995；125:1401-12 Gibson GR.、Roberfroid MB.，“饮食调节人体结肠微生物群：介绍益生菌的概念”，《营养学杂志》，1995年，第125卷，第1401-1412页))。
[0106] 术语“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态具有有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。(Salminen S,Ouwehand A.Benno Y.et al.“Probiotics:how should they be defined”Trends Food Sci.Technol.1999:10 107-10(Salminen S.、Ouwehand A.、Benno Y.等人，“如何定义益生菌”《，食品科学与技术趋势》，1999年，第10卷，第107-110页))。微生物细胞一般为细菌或酵母。
[0107] 术语“cfu”应理解为菌落形成单位。
[0108] 除非另外指明，否则所有百分比均按重量计。
[0109] 另外，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”不排除其它可能的要素。本发明的组合物(包括本文所述的多个实施方案)可包含下列要素、由或基本上由下列要素组成：本文所述的本发明的基本要素和必要限制，以及本文所述的或视需求而定的任何其它或可选成分、组分或限制。
[0112] 因此本发明的第一目的是一种营养组合物，该营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，用于通过在婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调来预防和/或治疗所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。
[0113] 如实施例2中所示，本发明人已证明在非轮状病毒腹泻发作期间和之后，患有非轮状病毒腹泻的婴儿的整体肠道微生物群发生改变(即，整体肠道微生物群存在生态失调)。就非轮状病毒婴儿腹泻而言，链球菌尤其显著增加，埃希氏菌属小幅增加，双歧杆菌属显著减少。
[0114] 如实施例3中所示，本发明人还证实，包含至少一种岩藻糖基化低聚糖(2FL)和至少一种N-乙酰化低聚糖(LNnT)的组合物可有利地用于在婴儿中提供肠道内整体微生物群，该整体微生物群与用不包含所述低聚糖的常规婴儿配方食品喂养的婴儿的肠道内整体微生物群相比更接近只用人类母乳喂养的婴儿的整体微生物群。粪便微生物群和代谢标记共同表明，加入2种单独的和结构上非常特异的人乳低聚糖(HMO)使粪便中评估的总体肠道微生物群在组成和功能两方面朝着母乳喂养的婴儿中观察到的总体肠道微生物群转变。不希望受理论束缚，据信，这些低聚糖协同作用以对肠道中的整体微生物群产生这样的影响。尤其是双歧杆菌属的丰度显著地增加并且埃希氏菌属减少。
[0115] 因此，这些特定的HMO对非轮状病毒腹泻的恢复甚至是发生率产生积极影响，这归功于其对整体肠道微生物群的影响，从而抗衡在非轮状病毒腹泻情况下观察到的生态失调。
[0116] 本发明的营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖。可存在一种或若干种类型的岩藻糖基化低聚糖。(一种或多种)岩藻糖基化低聚糖实际上可选自包括以下项的列表：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖(诸如，乳糖-N-岩藻五糖I、乳糖-N-岩藻五糖II、乳糖-N-岩藻五糖III、乳糖-N-岩藻五糖V)、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖I、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖(诸如，岩藻糖基乳糖-N-新六糖I、岩藻糖基乳糖-N-新六糖II)、二岩藻糖基乳糖-N-六糖I、二岩藻糖基-乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖I、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖II、岩藻糖基-对-乳糖-N-六糖、三岩藻基-对-乳糖-N-六糖I以及它们的任意组合。
[0117] 在一些具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖包含2'-岩藻糖基表位。该岩藻糖基化低聚糖可选自包括以下项的列表：2’-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-六糖、二岩藻糖基-乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖、岩藻糖基-对-乳糖-N-六糖以及它们的任意组合。
[0118] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的营养组合物包含2’-岩藻糖基乳糖(或2FL、或2’FL、或2-FL或2’-FL)。在一个具体实施方案中，不存在除2’-岩藻糖基乳糖以外的其它类型的岩藻糖基化低聚糖，即，本发明的营养组合物仅包含2’-岩藻糖基乳糖作为岩藻糖基化低聚糖。
[0119] 可通过层析技术或过滤技术从天然源诸如动物乳来分离(一种或多种)岩藻糖基化低聚糖。或者，也可利用特殊的岩藻糖基转移酶和/或岩藻糖苷酶，通过生物技术手段，通过使用基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术或微生物发酵技术，来制备岩藻糖基化低聚糖。在后一者情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可被工程改造成能够产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受体底物开始形成岩藻糖基化低聚糖，从DP＝1开始。另选地，可以通过由乳糖和游离岩藻糖化学合成来制备岩藻糖基化低聚糖。岩藻糖基化低聚糖也可从例如日本协和发酵工业株式会社(Kyowa,Hakko,Kogyo)购得。
[0120] 本发明的营养组合物还包含至少一种N-乙酰化低聚糖。可存在一种或若干种类型的N-乙酰化低聚糖。(一种或多种)N-乙酰化低聚糖可以是例如乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(LNnT)或它们的任意组合。在一些具体实施方案中，N-乙酰化低聚糖为乳糖-N-新四糖(LNnT)、对-乳糖-N-新六糖(对-LNnH)或它们的任意组合。在一些具体实施方案中，N-乙酰化低聚糖为LNnT。在一些具体实施方案中，N-乙酰化低聚糖为LNT。在一些其它具体实施方案中，N-乙酰化低聚糖为LNT与LNnT的混合物。在一些具体实施方案中，组合物包含LNT和LNnT两者，LNT:LNnT的比率为5:1至1:2，或2:1至1:1，或2:1.2至2:1.6。
[0121] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的营养组合物包含乳糖-N-新四糖(LNnT)。在一个具体实施方案中，除了乳糖-N-新四糖(LNnT)之外不包含其它类型的N-乙酰化低聚糖，即本发明的营养组合物只包含乳糖-N-新四糖(LNnT)作为N-乙酰化低聚糖。
[0122] (一种或多种)N-乙酰化低聚糖可采用酶转移法，即使用糖基转移酶将供体部分的糖单元转移到受体部分来化学合成，如例如美国专利5,288,637和WO 96/10086所述。另选地，LNT和LNnT可通过将游离的或与低聚糖(例如，乳果糖)结合的酮-六糖(例如，果糖)化学转化成N-乙酰六糖胺或包含N-乙酰六糖胺的低聚糖来制备，如Wrodnigg,T.M.；Stutz,A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38:827-828中所述。然后可将用这种方式制得的N-乙酰氨基乳糖苷转移到作为受体部分的乳糖。
[0123] 在本发明的特别有利的实施方案中，该营养组合物包含2'-岩藻糖基乳糖(2FL)和乳糖-N-新四糖(LNnT)。
[0124] 在另一个具体实施方案中，本发明的营养组合物包含由2’-岩藻糖基乳糖(2-FL)与乳糖-N-新四糖(LNnT)组成的低聚糖混合物。换句话讲，本发明的营养组合物仅包含2’-岩藻糖基乳糖(2-FL)作为岩藻糖基化低聚糖并且仅包含乳糖-N-新四糖(LNnT)作为N-乙酰化低聚糖。
[0125] 一种或多种岩藻糖基化低聚糖可以0.5-3g/L(诸如0.8-1.5g/L)组合物的总量存在于根据本发明的营养组合物中。在一些实施方案中，一种或多种岩藻糖基化低聚糖的总量可为0.85-1.3g/L组合物，诸如0.9-1.25g/L、或0.9-1.1g/L、或1-1.25g/L、或1-1.2g/L组合物。
[0126] 以干重计，一种或多种岩藻糖基化低聚糖可以0.38-2.32g/100g(诸如0.62-1.16g/100g)组合物的总量存在于营养组合物中。一种或多种岩藻糖基化低聚糖的总量可为0.66-1g/100g组合物，诸如0.70-0.97g/100g、或0.70-0.85g/100g、或0.78-0.97g/100g、或0.78-0.93g/100g组合物。
[0127] 一种或多种N-乙酰化低聚糖可以0.5-0.8g/L组合物的总量存在于根据本发明的营养组合物中。
[0128] 在一些实施方案中，一种或多种N-乙酰化低聚糖的总量可为0.5-0.75g/L、或0.5-0.7g/L、或0.5-0.6g/L组合物。
[0129] 以干重计，一种或多种N-乙酰化低聚糖可以0.39-0.62g/100g组合物的总量存在于营养组合物中，诸如0.39-0.58g/100g、或0.39-0.54g/100g、或0.39-0.47g/100g。
[0130] 这些不同范围可全部组合在一起。
[0131] 因此，在本发明的一个实施方案中，营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，其中：
[0132] -以干重计，一种或多种岩藻糖基化低聚糖的总量为0.8-1.5g/L组合物，和/或总量为0.62-1.16g/100g组合物；以及/或者
[0133] -以干重计，一种或多种N-乙酰化低聚糖的总量为0.5-0.8g/L组合物，和/或总量为0.39-0.62g/100g组合物。
[0134] 在另一个具体实施方案中，本发明的营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，其中：
[0135] -以干重计，一种或多种岩藻糖基化低聚糖的总量为0.9-1.25g/L组合物，和/或总量为0.70-0.97g/100g组合物；以及/或者
[0136] -以干重计，一种或多种N-乙酰化低聚糖的总量为0.5-0.7g/L组合物，和/或总量为0.39-0.54g/100g组合物。
[0137] 在另一个具体实施方案中，本发明的营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，其中：
[0138] -以干重计，一种或多种岩藻糖基化低聚糖的总量为1-1.2g/L组合物，和/或总量为0.78-0.93g/100g组合物；以及/或者
[0139] -以干重计，一种或多种N-乙酰化低聚糖的总量为0.5-0.6g/L组合物，和/或总量为0.39-0.47g/100g组合物。
[0140] 根据本发明的营养组合物中所含的一种或多种岩藻糖基化低聚糖和一种或多种N-乙酰化低聚糖通常以2:0.54至2:2.26的一种或多种岩藻糖基化低聚糖:一种或多种N-乙酰化低聚糖比率存在，诸如2:0.76至2:1.8或2:0.8至2:1.4。在特别有利的实施方案中，该比率为2:1或约2:1。
[0141] 根据本发明的营养组合物可还包含至少另外的一种或多种低聚糖(即，除了必需存在于组合物中的一种或多种岩藻糖基化低聚糖和一种或多种N-乙酰化低聚糖以外)和/或至少一种纤维和/或至少一种其前体。另一种低聚糖和/或纤维和/或其前体可选自低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、菊粉、低聚木糖(XOS)、聚右旋糖、唾液酸化低聚糖、唾液酸、岩藻糖以及它们的任意组合。它们的量可为组合物的0重量％至10重量％。
[0142] 除了包含在低聚糖混合物中的低聚糖外，可用以制备根据本发明的营养组合物的合适商用产品包括FOS与菊粉的组合，诸如由BENEO公司以商标Orafti出售的产品，或者由泰莱公司(Tate&Lyle)以商标 出售的聚右旋糖。
[0143] 在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含每100kcal组合物至少约0.4g或至少0.7g低聚果糖，诸如每100kcal约0.4至约0.9g、约0.4至约0.7g、约0.4至约0.5g、约0.7至约0.8g、或约0.7至约0.9g低聚果糖。
[0144] 在一些实施方案中，低聚果糖具有2至10的聚合度。在一些实施方案中，至少80％、90％、95％、99％或100％的低聚果糖具有2至8(介于2和8之间)的聚合度。
[0145] 在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含GOS。低聚半乳糖是包含两个或更多个半乳糖分子的低聚糖，其不带电荷，也不具有N-乙酰基残基。也可添加在根据本发明的营养组合物中的合适低聚半乳糖包括Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,6Glc、Galβ1,3Galβ1,3Glc、Galβ1,4Galβ1,4Glc和Galβ1,4Galβ1,4Galβ1,4Glc，但也包括它们的任何混合物。合成的低聚半乳糖诸如Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,6Glc、Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,4Galβ
1,4Glc和Galβ1,4Galβ1,4Galβ1,4Glc以及它们的混合物可以商标 和 商
购获得。低聚糖的其它供应商为Dextra Laboratories、Sigma-Aldrich Chemie GmbH和Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.。另选地，可使用特定的糖基转移酶(诸如半乳糖基转移酶)来产生中性低聚糖。
1,4Glc和Galβ1,4Galβ1,4Galβ1,4Glc以及它们的混合物可以商标 和 商
购获得。低聚糖的其它供应商为Dextra Laboratories、Sigma-Aldrich Chemie GmbH和Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.。另选地，可使用特定的糖基转移酶(诸如半乳糖基转移酶)来产生中性低聚糖。
[0146] 在一个具体实施方案中，营养组合物可还包含至少一种牛乳低聚糖。可以使用用于对牛乳衍生低聚糖中的牛乳级分进行分级分离和富集的常规技术(这种常规技术包括柱过滤、树脂过滤、纳滤、酶处理(特别是使用β-半乳糖苷酶)、蛋白质沉淀、乳糖的结晶和分离等)。一些富含低聚糖的牛乳级分是可商购获得的，或者已在例如EP2526784A1中有所描述。
[0147] 在一个具体实施方案中，营养组合物可还另外包含低聚糖混合物(“BMOS”)，该低聚糖混合物包含0.1至4.0重量％的一种或多种N-乙酰化低聚糖，92.0至98.5重量％的一种或多种低聚半乳糖以及0.3至4.0重量％的一种或多种唾液酸化低聚糖。
[0148] 在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含一种或多种唾液酸化低聚糖。可存在一种或若干种唾液酸化低聚糖。
[0149] 该(一种或多种)唾液酸化低聚糖可选自包括下列各项的组：3'-唾液酸乳糖(3-SL)、6'-唾液酸乳糖(6-SL)以及它们的任意组合。在本发明的一些实施方案中，该组合物包含3-SL和6-SL。在一些具体实施方案中，3'-唾液酸乳糖(3-SL)与6'-唾液酸乳糖(6-SL)之间的比率可在5:1至1:10、或3:1至1:1、或1:1至1:10的范围内。
[0150] 在一些具体实施方案中，该组合物中的唾液酸化低聚糖为6'-唾液酸乳糖(6-SL)。
[0151] 可通过层析技术或过滤技术从天然源(诸如，动物乳)分离(一种或多种)唾液酸化低聚糖。或者，也可使用特殊的唾液酸转移酶或唾液酸酶、唾液酸苷酶，通过生物技术手段，通过基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术、通过化学合成或通过微生物发酵技术，来制备唾液酸化低聚糖。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受体底物开始形成唾液酸化低聚糖，从DP＝1开始。另选地，可通过由乳糖和游离N'-乙酰神经氨酸(唾液酸)的化学合成来产生唾液酸乳糖。唾液酸乳糖也可从例如日本的Kyowa Hakko Kogyo商购获得。
[0152] 在具体示例中，该组合物可包含0.05至5g/L的一种或多种唾液酸化低聚糖，或0.1至4g/L、或0.3至2g/L、或0.4至1.5g/L、或0.4至1g/L，例如0.5或0.9g/L的一种或多种唾液酸化低聚糖。在一些具体实施方案中，该组合物可包含0.8至1.7g/l的一种或多种唾液酸化低聚糖。
[0153] 根据本发明的组合物以干重计每100g可包含0.03至3.88g的一种或多种唾液酸化低聚糖，例如以干重计每100g组合物0.08至3.10g、或0.23至1.55g、或0.31至1.16g、或0.31至0.77g、或0.39至0.7g、或0.62至1.32g的一种或多种唾液酸化低聚糖。
[0154] 在本发明的一些具体实施方案中，以干重计，营养组合物以不足0.1g/100g组合物的量包含一种或多种唾液酸化低聚糖。
[0155] 在本发明的一些具体实施方案中，营养组合物不含任何一种或多种唾液酸化低聚糖。
[0156] 根据本发明的组合物可任选地还包含至少一种低聚糖前体。可存在一种或若干种低聚糖前体。例如，人乳低聚糖的前体为唾液酸、岩藻糖或者它们的混合物。在一些具体实施方案中，该组合物包含唾液酸。
[0157] 在具体示例中，该组合物包含0至3g/L的一种或多种低聚糖前体，或0至2g/L、或0至1g/L、或0至0.7g/L、或0至0.5g/L、或0至0.3g/L、或0至0.2g/L的一种或多种低聚糖前体。
[0158] 以干重计，根据本发明的组合物可包含0g至2.1g一种或多种低聚糖前体/100g组合物，例如0g至1.5g、或0g至0.8g、或0g至0.15g一种或多种低聚糖前体/100g组合物。
[0159] 本发明的营养组合物可还包含至少一种益生菌(或益生菌菌株)，诸如益生细菌菌株。
[0160] 最常用的益生微生物主要是以下属的大部分细菌和酵母：乳酸杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)、链球菌属菌种(Streptococcus spp.)、肠球菌属菌种
(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium spp.)和酵母属菌种
(Saccharomyces spp.)。
(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium spp.)和酵母属菌种
(Saccharomyces spp.)。
[0161] 在一些具体实施方案中，益生菌为益生细菌菌株。在一些具体实施方案中，其具体为双歧杆菌属(Bifidobacteria)和/或乳酸杆菌(Lactobacilli)。
[0162] 合适的益生细菌菌株包括得自芬兰瓦利奥公司(Valio Oy,Finland)的商标为LGG的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ATCC 53103、鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CNCM I-2116、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)CNCM I-1225、新西兰BLIS科技有限公司(BLIS Technologies Limited,New Zealand)以商品名KI2销售的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)DSM 13084、丹麦汉森公司(Christian Hansen company,Denmark)以商标Bb12特别销售的乳酸双歧杆菌
(Bifidobacterium lactis)CNCM 1-3446、日本森永乳业株式会社(Morinaga Milk
Industry Co.Ltd.,Japan)以商标BB536销售的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
ATCC BAA-999、丹尼斯克公司(Danisco)以商标Bb-03销售的短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、森永(Morinaga)以商标M-16V销售的短双岐杆菌、宝洁公司(Procter&GambIe Co.)以商标Bifantis销售的婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)，以及加拿大Rosell生物研究所(Institut Rosell-Lallemand)以商标R0070销售的短双岐杆菌。
(Bifidobacterium lactis)CNCM 1-3446、日本森永乳业株式会社(Morinaga Milk
Industry Co.Ltd.,Japan)以商标BB536销售的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
ATCC BAA-999、丹尼斯克公司(Danisco)以商标Bb-03销售的短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、森永(Morinaga)以商标M-16V销售的短双岐杆菌、宝洁公司(Procter&GambIe Co.)以商标Bifantis销售的婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)，以及加拿大Rosell生物研究所(Institut Rosell-Lallemand)以商标R0070销售的短双岐杆菌。
[0163] 在一个具体实施方案中，益生菌是乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，诸如乳酸双歧杆菌CNCM 1-3446。
[0164] 根据本发明的营养组合物以干重计每g组合物可包含10e3至10e12cfu的益生菌菌株，更优选地包含10e7至10e12cfu，诸如10e8至10e10cfu的益生菌菌株。
[0165] 在一个实施方案中，益生菌是活的。在另一个实施方案中，益生菌是非复制的或失活的。在一些其它实施方案中，可同时存在活的益生菌和失活的益生菌。
[0166] 本发明的营养组合物可还包含至少一种噬菌体(细菌噬菌体)或噬菌体的混合物，这些噬菌体优选地针对病原性链球菌、嗜血杆菌(Haemophilus)、莫拉氏菌(Moraxella)和葡萄球菌(Staphylococci)。
[0167] 根据本发明的营养组合物可为例如婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大或2段配方食品、早产儿配方食品、幼儿食品、婴儿谷物组合物、强化剂(诸如，人乳强化剂)或补充剂。在一些具体实施方案中，本发明的组合物为旨在用于4月龄或6月龄婴儿的婴儿配方食品、强化剂或补充剂。在一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物是婴儿配方食品。
[0168] 在一些其他实施方案中，本发明的营养组合物是强化剂。强化剂可为母乳强化剂(例如，人乳强化剂)或配方食品强化剂(诸如婴儿配方食品强化剂或较大/2段婴儿配方食品强化剂)。
[0169] 当营养组合物是补充剂时，其可以单位剂量的形式提供。
[0170] 本发明的营养组合物可为固形物(例如粉末)、液体或凝胶形式。
[0171] 根据本发明的营养组合物通常含有蛋白质源。蛋白质的量可为1.6至3g/100kcal。在一些实施方案中，特别是当组合物旨在用于早产儿时，蛋白质的量可为2.4至4g/100kcal或高于3.6g/100kcal。在一些其他实施方案中，蛋白质的量可低于2.0g/100kcal，例如介于
1.8至2.1g/100kcal、或1.8至2g/100kcal之间、或者蛋白质的量为1.9至2.1g/100kcal，或者量低于1.8g/100kcal，诸如1.4-1.8g/100kcal或1.5-1.7g/100kcal。
1.8至2.1g/100kcal、或1.8至2g/100kcal之间、或者蛋白质的量为1.9至2.1g/100kcal，或者量低于1.8g/100kcal，诸如1.4-1.8g/100kcal或1.5-1.7g/100kcal。
[0172] 只要满足必需氨基酸含量的最低要求并确保令人满意的生长，蛋白质的类型被认为对本发明无关紧要。因此，可使用基于乳清、酪蛋白以及它们的混合物的蛋白质源，也可使用基于大豆的蛋白质源。就所关注的乳清蛋白而言，蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或它们的混合物，并且可包含任何所需比例的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。“α-乳白蛋白”是指高质量、易消化的乳清蛋白，其占总人类母乳(HBM)蛋白质的20％-25％并且是HBM中存在的主要蛋白质。α-乳白蛋白的结构由123个氨基酸和4个二硫键组成，并且该蛋白质具有14.2K道尔顿的分子量。由于α-乳白蛋白具有高含量的必需氨基酸(具体地色氨酸)，所以它是低蛋白婴儿配方食品的理想选择。在一个实施方案中，本发明的营养组合物以约0.2至约0.4g/100kcal的营养组合物的量，或以至少1.7g/L、或至少2.0g/L、或至少2.3g/L、或至少
2.6g/L的营养组合物的量包含α-乳清蛋白。
2.6g/L的营养组合物的量包含α-乳清蛋白。
[0173] 在一些有利的实施方案中，蛋白质源以乳清为主(即多于50％的蛋白质来自乳清蛋白，诸如60％或70％)。
[0174] 该蛋白质可为完整的或水解的，或为完整蛋白质和水解蛋白质的混合物。所谓的术语“完整的”是指蛋白质的主要部分是完整的，即分子结构未发生改变，例如至少80％的蛋白质未发生改变，诸如至少85％的蛋白质未发生改变，优选地，至少90％的蛋白质未发生改变，甚至更优选地，至少95％的蛋白质未发生改变，诸如至少98％的蛋白质未发生改变。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质未发生改变。
[0175] 术语“水解的”是指在本发明的上下文中，蛋白质已被水解或分解成其组成氨基酸。
[0176] 该蛋白质可以是完全(即，广泛)水解或部分水解的。例如，对于被认为处于发生牛乳变应性风险的婴儿或幼儿而言，提供部分水解的蛋白质(水解程度为2％至20％)可能是可取的。如果需要水解的蛋白质，则可根据需要并且如本领域已知的那样进行水解过程。例如，可通过在一个或多个步骤中对乳清级分进行酶法水解来制备乳清蛋白水解产物。如果用作原料的乳清级分基本上不含乳糖，则发现该蛋白质在水解过程中经受少得多的赖氨酸封闭(lysine blockage)。这使得能够将赖氨酸封闭的程度从约15重量％的总赖氨酸降至低于约10重量％的赖氨酸；例如约7重量％的赖氨酸，这大大地提高了蛋白质源的营养质量。
[0177] 在本发明的一个实施方案中，至少70％的蛋白质被水解，优选地，至少80％的蛋白质被水解，诸如至少85％的蛋白质被水解，甚至更优选地，至少90％的蛋白质被水解，诸如至少95％的蛋白质被水解，特别地至少98％的蛋白质被水解。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质被水解。
[0178] 在一个具体实施方案中，营养组合物的蛋白质是水解的、完全水解的或部分水解的。蛋白质的水解程度(DH)可为8至40、或20至60、或20至80，或大于10、20、40、60、80或90。
[0179] 在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物是低变应原性的组合物。在另一个具体实施方案中，根据本发明的组合物是低变应原性的营养组合物。
[0180] 根据本发明的营养组合物通常含有碳水化合物源。这在本发明的营养组合物为婴儿配方食品的情况下是特别优选的。在这种情况下，可使用通常存在于婴儿配方食品中的任何碳水化合物源，诸如乳糖、蔗糖(sucrose)、糖精(saccharose)、麦芽糖糊精、淀粉及其混合物，但是优选的碳水化合物源之一是乳糖。
[0181] 根据本发明的营养组合物通常包含脂质源。这在本发明的营养组合物为婴儿配方食品的情况下是特别相关的。在这种情况下，脂质源可以是适合用于婴儿配方食品中的任何脂质或脂肪。一些合适的脂肪源包括棕榈油、高油酸葵花油和高油酸红花油。也可加入必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸，以及少量包含大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的油，诸如鱼油或微生物油。脂肪源中n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比率可为约5:1至约15:1，例如约8:1至约10:1。
[0182] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含具有高sn-2棕榈酸酯的甘油三酯，优选地为在sn-2位具有超过33％的棕榈酸的甘油三酯。
[0183] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含约5或6g/100kcal的脂肪，并且例如至少约7.5重量％的该脂肪，例如约7.5-12.0％由sn-2位中的棕榈酸组成。
[0184] 在本发明的一个实施方案中，该组合物包含至少7.5％、优选地8％、更优选地至少9.6％的脂肪，该脂肪是sn-2棕榈酸酯，例如约7.8至11.8％、约8.0至11.5重量％、约8.5至
11.0％或约9.0至10.0重量％的脂肪在甘油三酯的sn-2位为棕榈酸。
11.0％或约9.0至10.0重量％的脂肪在甘油三酯的sn-2位为棕榈酸。
[0185] 在一些实施方案中，棕榈酸占配方食品的总脂肪酸含量的约15至约25重量％，诸如约15至约20重量％，并且至少约30％、例如约35至约43％的总棕榈酸含量处于sn-2位。
[0186] 由脂类营养公司(Lipid Nutrition)出售的可商购获得的组合物是BetapolTM B-55，其为来源于植物油的甘油三酯混合物，其中至少54％的棕榈酸处于甘油分子的sn-2位。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含约40至50重量％的BetapolTM B-55，例如约
43重量％至约45重量％的脂肪含量。本领域技术人员将会理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，配方食品中所使用的高sn-2脂肪的百分比以及sn-2棕榈酸酯的总量可以有所变化，并且可使用不同的高sn-2棕榈酸酯油。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含约40至50重量％的BetapolTM B-55，例如约
43重量％至约45重量％的脂肪含量。本领域技术人员将会理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，配方食品中所使用的高sn-2脂肪的百分比以及sn-2棕榈酸酯的总量可以有所变化，并且可使用不同的高sn-2棕榈酸酯油。
[0187] 本发明的营养组合物可还包含被认为是日常饮食所必需的所有维生素和矿物质，这些维生素和矿物质以营养显著量存在于组合物中。已确定某些维生素和矿物质的最低需求量。矿物质、维生素和任选地存在于本发明组合物中的其他营养物质的示例包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和左旋肉碱。矿物质通常以盐的形式添加。特定矿物质和其它维生素的存在和量将根据适用人群而有所不同。
[0188] 如有必要，本发明的营养组合物可包含乳化剂和稳定剂，诸如大豆、卵磷脂、柠檬酸甘油单酯和柠檬酸甘油二酯等。
[0189] 本发明的营养组合物可还包含可能具有有益效果的其它物质，诸如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。
[0190] 本发明的营养组合物可还包含(一种或多种)类胡萝卜素。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的营养组合物不包含任何类胡萝卜素。
[0191] 根据本发明的营养组合物可通过任何合适的方式制备。现将以举例的方式描述组合物。
[0192] 例如，可通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适当的比例共混在一起来制备配方食品诸如婴儿配方食品。如果使用乳化剂，则可在此时加入。可在此时加入维生素和矿物质，但其通常在稍后加入以避免热降解。在共混之前，可先将任何亲脂性维生素、乳化剂等物质溶解于脂肪源中。然后可混入水(优选地经受反渗透的水)，以形成液体混合物。合适的水温在介于约50℃和约80℃之间的范围内以有助于分散成分。可使用可商购获得的液化剂来形成液体混合物。
[0193] 尤其是如果最终产物是液体形式，则可在此阶段加入(一种或多种)岩藻糖基化低聚糖和(一种或多种)N-乙酰化低聚糖。如果最终产物为粉末，可根据需要同样在此阶段加入这些成分。
[0194] 然后，例如以两个阶段对液体混合物进行均质化。
[0195] 然后，可对液体混合物进行热处理以减少细菌载量，例如通过将液体混合物快速加热到约80℃至约150℃范围内的温度并且持续约5秒至约5分钟的持续时间。这可通过蒸汽注入、高压灭菌器或热交换器(例如，板式热交换器)来进行。
[0196] 然后，例如通过急速冷却将液体混合物冷却至介于约60℃和约85℃之间。然后再次例如以两个阶段对液体混合物进行均质化，其中第一阶段的压力介于约10MPa和约30MPa之间，第二阶段的压力介于约2MPa和约10MPa之间。然后可将均质化的混合物进一步冷却以添加任何热敏组分，诸如维生素和矿物质。此时便利地调节均质化的混合物的pH和固体含量。
[0197] 如果最终产物将为粉末，则将该均质化的混合物转移至合适的干燥装置，诸如喷雾干燥器或冷冻干燥器，然后将其转化为粉末。该粉末的含水量应小于约5重量％。还可以或作为替代在此阶段加入(一种或多种)岩藻糖基化低聚糖和(一种或多种)N-乙酰化低聚糖，方法是通过将其与(一种或多种)益生菌菌株(如果使用)干混，或通过以晶体的糖浆形式与(一种或多种)益生菌菌株共混，然后对混合物进行喷雾干燥或冷冻干燥。
[0198] 如果优选液体组合物，可对该均质化的混合物进行杀菌，然后在无菌条件下将其装入合适的容器中，也可以先将其装入容器中，再进行灭菌。
[0199] 在另一个实施方案中，本发明的组合物可为补充剂。
[0200] 补充剂可以是例如片剂、胶囊、锭剂或液体的形式。补充剂可还含有保护性亲水胶体(诸如胶类、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、包囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油类、脂肪类、蜡类、卵磷脂类等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂和凝胶形成剂。补充剂可还含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于：水、任何来源的明胶、植物胶、木素磺酸盐、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、风味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。
[0201] 另外，补充剂可包含适用于口服或非肠道施用的有机或无机载体材料，以及维生素、矿物质微量元素和根据政府机构(诸如USRDA)推荐的其它微量营养素。
[0202] 根据本发明的营养组合物用于婴儿或幼儿。该营养组合物特别适于6月龄以下的婴儿。
[0203] 营养组合物的施用(或给予或喂养)年龄和持续时间取决于需求以及是用于预防还是治疗用途。
[0204] 在一些实施方案中，婴儿或幼儿是0至36月龄，诸如0至12月龄或0至6月龄。可以预见的是，本发明的组合物对于刚出生(0至4周或0至8周)的婴儿可能更有利，因为它们的肠道可能更脆弱。
[0205] 在一些具体实施方案中，营养组合物可以是婴儿配方食品，并且可以特别用于主要用婴儿配方食品喂养的0至12月龄之间的婴儿。
[0206] 在一些具体实施方案中，营养组合物用于6至12月龄或12至36月龄的婴儿或幼儿。在这些时期，婴儿或幼儿尤其面临风险，因为来自母乳的保护减少并且病原体的暴露增加。
[0207] 在一些实施方案中，营养组合物可例如在婴儿出生后立即施用。本发明的组合物可还在婴儿出生后头1周期间、或在出生后头2周期间、或在出生后头3周期间、或在出生后头1个月期间、或在出生后头2个月期间、或在出生后头3个月期间、或在出生后头4个月期间、或在出生后头6个月期间、或出生后头8个月期间、或在出生后头10个月期间、或在出生后头1年期间、或在出生后头2年期间、或甚至更长时间内给予。在本发明的一些特别有利的实施方案中，营养组合物在婴儿出生后前4或6个月提供(或施用)给所述婴儿。
[0208] 在一些其他实施方案中，本发明的营养组合物在出生后几天(例如，1天、2天、3天、5天、10天、15天、20天…)、或几周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周…)或几个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月…)给予。
[0209] 在一些有利的实施方案中，在患有非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿开始出现非轮状病毒腹泻事件后立即施用营养组合物。
[0210] 本发明的营养组合物可根据需要提供数天(1天、2天、3天、4天、5天、6天…)、或数周(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或甚至更多周)、或数月(1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或甚至更多个月)。
[0211] 在一些实施方案中，提供营养组合物，直至非轮状病毒腹泻的症状在患有非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿身上消失，或直至所述消失后几天或几周或几个月。
[0212] 在一些实施方案中，根据本发明的组合物可用于离乳期前和/或离乳期过程中。
[0213] 在一个实施方案中，将本发明的组合物作为母乳的补充组合物提供给婴儿或幼儿。在一些实施方案中，婴儿或幼儿在至少前2周、或前1、2、4或6个月接受母乳喂养。在一个实施方案中，本发明的营养组合物在用母乳提供营养的这段时间之后提供给婴儿或幼儿，或者在用母乳提供营养这段时间内与母乳一起提供给婴儿或幼儿。在另一个实施方案中，在至少一段时间内(例如，在生命的至少1、2、4个月后)，在至少1、2、4或6个月期间，将该组合物作为唯一或主要的营养组合物提供给婴儿或幼儿。
[0214] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物是完全营养组合物(满足个体全部或大部分营养需求)。在另一个实施方案中，营养组合物是用来例如补充人乳或者补充婴儿配方食品或较大/2段婴儿配方食品的补充剂或强化剂。
[0215] 婴儿或幼儿可为足月儿或早产儿。在一个具体实施方案中，本发明的营养组合物用于早产婴儿或幼儿。在一个具体实施方案中，本发明的营养组合物用于早产婴儿。
[0216] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物可还用于小于胎龄出生或出生体重低的婴儿或幼儿。
[0217] 低出生体重的婴儿或幼儿可能是或可能不是早产儿，类似地，小于胎龄的婴儿或幼儿可能是或可能不是早产儿。
[0218] 本发明的营养组合物可还用于剖腹产或经阴道分娩的婴儿或幼儿。
[0219] 所有婴儿和幼儿都可以从本发明受益，因为他们全都容易或者可能在某个年龄时容易获得不平衡的肠/肠道微生物群。
[0220] 在本发明的一些有利的实施方案中，营养组合物用于已存在脆弱或不平衡的微生物群或微生物群生态失调的婴儿或幼儿，诸如早产婴儿、剖腹产出生的婴儿、小于胎龄出生或具有低出生体重的婴儿、住院的婴儿/幼儿、接受抗生素治疗或已接受过抗生素治疗的婴儿/幼儿、以及/或者患有或曾经患有肠道感染和/或肠道炎症的婴儿/幼儿。
[0221] 在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物针对过早出生、或剖腹产出生、或小于胎龄出生或具有低出生体重、或表现出不平衡或异常的肠道微生物群、或者患有或曾患有肠道感染和/或肠道炎症的婴儿，特别是当婴儿是0至6月龄时。不受理论的约束，据信年幼的婴儿从本发明的组合物中受益甚至更多，特别是当婴儿具有不平衡的肠道微生物群(或有具有不平衡的肠道微生物群的风险)。在此类婴儿中，获得与母乳喂养的婴儿(优选地为完全母乳喂养的婴儿)的肠道微生物群接近的肠道微生物群是特别有利的。的确其为他们提供大量的健康要素，这些健康要素可以是有利的，尤其对于那些脆弱的婴儿而言。
[0222] 本发明的营养组合物对于出生时肠道微生物群可能受损的婴儿或脆弱的婴儿/幼儿(诸如过早出生的婴儿和/或剖腹产出生的婴儿)的确更有益。
[0223] 另外可以预见的是，本发明的组合物对于特别是在出生后，例如在出生后头4周期间表现出肠道疾病(诸如腹泻、感染或绞痛)的婴儿/幼儿甚至更有益。
[0224] 在一个特别有利的实施方案中，营养组合物用于患有非轮状病毒腹泻(例如大肠杆菌腹泻)或面临患上非轮状病毒腹泻的高风险(例如生活在高风险地区诸如撒哈拉以南非洲和南亚等)的婴儿或幼儿。本发明的营养组合物将使得婴儿或幼儿：
[0225] -获得更接近正常(或至正常情况)的肠道中的整体微生物群，例如获得更平衡的微生物群，例如接近他们未患非轮状病毒腹泻时所具有的整体肠道微生物群。当婴儿或幼儿已经患有非轮状病毒腹泻时尤其属于这种情况。
[0226] -与主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，在肠道中得到更接近完全母乳喂养的婴儿或幼儿的整体微生物群。当婴儿或幼儿已经患有非轮状病毒腹泻或面临非轮状病毒腹泻的风险时尤其属于这种情况。
[0227] 本发明的营养组合物对婴儿或幼儿个体的总体微生物群具有积极效果：其促进和/或诱导用本发明的营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群，该整体微生物群与主要或完全用不包含所述低聚糖(即，不包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖)的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，更接近正常或更接近完全母乳喂养的婴儿或幼儿的整体微生物群。
[0228] 本发明的营养组合物的主要和令人惊讶的健康益处在于其以全面方式调节用本发明的营养组合物喂养的婴儿的整体微生物群以使其更接近母乳喂养的婴儿。不仅微生物群的某些特定分类群变化，而且营养组合物尤其引起整体微生物群组成朝向由母乳喂养诱导的整体微生物群组成的转变。此外，如实验所示，肠道微生物群组成(即，整体微生物群的相对分类丰度和/或多样性)和肠道微生物群功能(即，其活性和/或功能性，例如所得代谢物)更接近母乳喂养的婴儿。所以就肠道微生物群组成而言，诱导/促进的微生物群围绕2个方面是特定的：
[0229] “定量”：肠道菌群包含更多的有益菌和更少的无益菌或有害菌；
[0230] “定性”：细菌分类群的多样性更类似于母乳喂养的婴儿的微生物群。
[0231] 整体微生物群的多样性可能是α多样性(细节在实施例部分中指出)，并且其可例如由Faith的系统发育多样性指数(PD_whole_tree)所测得的那样示出。
[0232] 由本发明的营养组合物提供的健康效果可以在0和36月龄之间，任选地在0和12月龄之间的婴儿或幼儿中测量。在使用该组合物几天或几周后(例如，在使用4周、或6周、或8周后)可以观察到该健康效果。然而，这种促进/诱导的整体微生物群的观察可能需要4、6或8周才能观察到。例如可以在婴儿/幼儿的粪便中测量该整体微生物群。
[0233] 在本发明的上下文中，健康益处使得婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群更接近正常和/或更接近完全母乳喂养的婴儿或幼儿的微生物群。当将其与未接受本发明组合物的婴儿或幼儿相比时尤其观察到如此。
[0234] 在一些实施方案中，与主要或完全用不含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，本发明的营养组合物能够将婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群促进和/或诱导成更接近这些婴儿或幼儿未患非轮状病毒腹泻时的整体微生物群和/或更接近完全母乳喂养的婴儿或幼儿的整体微生物群。
[0235] 这样的积极效果可包括：i)致病菌的生长的下调、降低或抑制或者致病菌载量的减少，以及/或者ii)有益菌的生长的上调、增加或促进。在一些实施方案中，与主要或完全用常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，本发明的营养组合物涉及(或包括、或伴随有、或特征在于)双歧杆菌属群体的上调以及/或者埃希氏菌属和/或消化链球菌科群体的下调。例如在1、4、6或8周龄时或之后，并且例如在用所述营养组合物喂养1、4、6或8周之后可以在所述婴儿或幼儿的粪便中测量该效果。粪便微生物群组成可例如基于16S rDNA分析或宏基因组分析来测量(细节在实施例部分中指出)。
[0236] 通过下调、降低和/或抑制致病菌种群的生长，和/或诱导更多有益菌，从数量上和从质量上而言，本发明的组合物提供积极的健康效应。这样的健康的肠道/肠微生物群最终与适当的营养物质吸收、充分的生长、较少的绞痛、较少的感染、较少的腹泻和较好的肠道健康有关。
[0237] 本发明的效果可以是预防性的(例如，避免肠道微生物群不平衡，避免非轮状病毒腹泻，维持健康的肠微生物群，诱导健康的肠微生物群)或治愈性的(在肠道微生物群受损时恢复健康的肠道微生物群，帮助消除或减少肠道/肠内非轮状病毒病原体数量，帮助从非轮状病毒腹泻中恢复，在非轮状病毒腹泻造成损害后诱导健康的微生物群)。
[0238] 在一些实施方案中，与主要或完全用不包含低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，本发明的营养组合物涉及(或包括、或伴随有、或特征在于)一种或多种病原体的减少和/或一种或多种毒力因子的减少。例如在1、4、6或8周龄时或之后，并且例如在用所述营养组合物喂养1、4、6或8周之后可以在所述婴儿或幼儿的粪便中测量这些效果。
[0239] 一种或多种病原体的减少意味着一种或多种病原体出现和/或量(例如，载量、数量)的减少。其可通过例如使用Luminex PCR方法来测量(细节在实施例部分中指出)。可能减少的病原体可以是病毒、细菌和/或原生生物。病毒病原体的具体示例是诺瓦克病毒(例如，诺瓦克GI/GII)和/或轮状病毒(例如，轮状病毒A)。细菌病原体的具体示例是艰难梭菌(Clostridium difficile)(例如，艰难梭菌毒素A/B)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如，大肠杆菌O157)。原生生物病原体的具体示例是隐孢子虫(Cryptosporidium)。
[0240] 在特定实施方案中，本发明的营养组合物涉及非轮状病毒病原体的减少。
[0241] 在一个具体示例中，营养组合物涉及细菌病原体艰难梭菌的减少。
[0242] 在另一个具体示例中，营养组合物涉及细菌病原体大肠杆菌的减少。
[0243] 一种或多种毒力因子可以是毒力基因和/或抗生素抗性基因，其可例如通过宏基因组分析来检测(细节在实施例部分中指出)。毒力基因的具体示例是来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)LT2的gi:16767513(yjcB-推定的内膜蛋白)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MW2的gi:21284341(cna-胶原粘附素前体)、来自大肠杆菌536的gi:24528016(l7045-L7045)、来自弗氏志贺菌(Shigella flexneri)YSH6000的gi:15808725(fecB-FecB)以及来自金黄色葡萄球菌MW2的gi:21282741(isdA-细胞表面蛋白)。
[0244] 在一些实施方案中，与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比和/或与主要或完全用不包含低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，本发明的营养组合物涉及(或包括、或伴随有、或特征在于)减少产生游离氨基酸和/或刺激产生乳酸盐。
[0245] 乳酸盐由乳酸菌(如乳杆菌和双歧杆菌属)产生，并且其可以阻止包括病原体在内的其他细菌的生长。游离氨基酸的具体示例是苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸。例如在1、4、6或8周龄时或之后，并且例如在用所述营养组合物喂养1、4、6或8周之后可以在所述婴儿或幼儿的粪便中测量这些效果。该测量可使用基于质子核磁共振光谱法(1H NMR)的公认代谢组学方法进行(Moco et al,2013,Metabolomics perspectives in Pediatric Research,Pediatr.Res.73,570-576(Moco等人，2013年，代谢组学在儿科研究中的前景，《儿科研究》，第73卷，第570-576页))。
[0246] 提供给婴儿或幼儿的健康效果可通过如以下示例中所示的各种方法来测量。
[0247] 在一个实施方案中，通过计算每个样本的α多样性并且分析它们的分布来测量对整体微生物群的影响(细节在实施例部分中指出)。
[0248] 在一个实施方案中，通过使用考虑OTU(操作分类单位)之间的系统发生距离的度量(例如UniFrac方法)计算各组之间的β多样性并且分析它们的分布来测量对整体微生物群的影响。或者，对照组、测试组和母乳喂养组之间的β多样性可通过多变量排序利用基于随机化程序(例如，典范对应分析(CCA)、冗余分析(RDA))的假设检验、或者多变量参数或非参数检验(例如，Adonis、ANOSIM、多变量ANOVA)进行评估。在一个具体示例中，使用RDA来计算β多样性。
[0249] 在本发明的一个实施方案中，与未患非轮状病毒腹泻的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比和/或与主要或完全用不包含存在于本发明营养组合物中的低聚糖(例如，至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖)的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比，用本发明的营养组合物喂养的婴儿和/或幼儿的促进和/或诱导的肠道内整体微生物群具有显著降低的α多样性(例如，降低至少0.10个单位，诸如至少0.12个单位或至少0.15个单位，例如0.19个单位)，因此更接近母乳喂养婴儿的整体微生物群。
[0250] 本发明的营养组合物可用于预防和/或治疗目的。
[0251] 在一个具体方面，本发明还涉及营养组合物，该营养组合物用于提供健康的生长，用于提供健康的免疫系统，用于提供健康的肠道功能，以及/或者用于预防和/或治疗婴儿或幼儿的肠道微生物群生态失调。
[0252] 由本发明的组合物提供的有益健康益处可以是短期、中期和/或长期效果。
[0253] 该效果可能在施用本发明的组合物后立即出现，以及/或者日后的出现，即在施用组合物后，例如所述施用后1周至数月，例如2至4周、2至6周、2至8周、1至6个月或2至12个月。
[0254] 其他目的：
[0255] 本发明的另一个目的是至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖在制备营养组合物时的用途，即用于通过在婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调来预防和/或治疗所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。
[0256] 本发明的另一个目的是一种药物组合物，该营养组合物包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖，用于通过在婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调来预防和/或治疗所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻。
[0257] 本发明的另一个目的涉及一种通过在婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻之前、期间和/或之后作用于整体肠道微生物群的生态失调来预防和/或治疗所述婴儿或幼儿的非轮状病毒腹泻的方法，所述方法包括向所述婴儿或幼儿施用包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖的营养组合物。
[0258] 此前提及的实施方案和示例(例如，涉及低聚糖的类型和量、营养组合物、施用、目标群体…)也适用于这些各种目的(即，用途、药物组合物、方法…)。
[0259] 实施例
[0260] 以下实施例示出了根据本发明所使用的组合物的一些特定实施方案。这些实施例仅出于举例说明目的而给出，不应被理解为是对本发明的限制，因为在不脱离本发明的实质的前提下，可对其作出多种改变。
[0261] 实施例1
[0262] 下表1给出了根据本发明的营养组合物(例如，婴儿配方食品)的组成的示例。该组成仅以举例的方式给出。
[0263]
[0264]
[0265] 表1：根据本发明的营养组合物(例如，婴儿配方食品)的组成的示例
[0266] 实施例2
[0267] 临床研究说明
[0268] 120名患急性腹泻的住院治疗婴儿和幼儿参与该前瞻性单中心研究。试验中包括6至24月龄的男性(为了更容易地从尿液中分离粪便)婴儿和幼儿，他们具有小于48小时的水性腹泻病史，并且收到了他们父母的书面同意。患有全身性感染、营养不良(Z得分<-3)或重大医疗异常的婴儿和幼儿被排除。接受过抗生素或需要抗生素的婴儿和幼儿也被排除在试验之外。加入试验的婴儿和幼儿必须满足以下条件：对侵袭性腹泻呈阴性，暗视野显微镜检查显示对霍乱弧菌呈阴性，以及粪便中的ELISA对轮状病毒呈阴性。调查粪便样本是否存在ETEC、EPEC或EAEC，依据icddr,b的标准程序(Svenungsson B等人，Enteropathogens in adult patients with diarrhea and healthy control subjects:a 1-year prospective study in a Swedish clinic for infectious diseases.Clin Infect
Dis.2000May；30(5):770-8(成年腹泻患者和健康对照个体的肠道病原体：瑞典诊所针对感染性疾病的1年期前瞻性研究，《临床感染疾病》，2000年5月，第30卷第5期，第770-778页)；
Vidal M等人，Single multiplex PCR assay to identify simultaneously the six categories of diarrheagenic Escherichia coli associated with enteric
infections.J Clin Microbiol.2005Oct；43(10):5362-5(单多路复用PCR测定以同时鉴定与肠道感染相关的六种致泻性大肠杆菌，《临床微生物学杂志》，2005年10月，第43卷第10期，第5362-5365页))。
Dis.2000May；30(5):770-8(成年腹泻患者和健康对照个体的肠道病原体：瑞典诊所针对感染性疾病的1年期前瞻性研究，《临床感染疾病》，2000年5月，第30卷第5期，第770-778页)；
Vidal M等人，Single multiplex PCR assay to identify simultaneously the six categories of diarrheagenic Escherichia coli associated with enteric
infections.J Clin Microbiol.2005Oct；43(10):5362-5(单多路复用PCR测定以同时鉴定与肠道感染相关的六种致泻性大肠杆菌，《临床微生物学杂志》，2005年10月，第43卷第10期，第5362-5365页))。
[0269] 早期引入针对年龄的适当喂养，采用自由采食母乳喂养或标准化医院饮食，以提供约100kcal能量/kg体重/天。
[0270] 材料和方法
[0271] 粪便中的总细菌计数以及大肠杆菌毒力基因检测和定量通过PCR完成，如以下文献中所述：Nadkarni等人，Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range(universal)probe and primers set.Microbiology.2002Jan；148(Pt 1):257-66(使用宽范围(通用)探针和引物集合通过实时PCR测定细菌载量，《微生物学》，2002年1月，第148卷(Pt 1)，第257-266页)；以及Guion等人，Detection of diarrheagenic Escherichia coli by use of melting-curve analysis and real-time multiplex
PCR.J Clin Microbiol.2008May；46(5):1752-7(使用多曲线分析和实时多路服用PCR检测致泻性大肠杆菌，《临床微生物学杂志》，2008年5月，第46卷第5期，第1752-1757页))。
PCR.J Clin Microbiol.2008May；46(5):1752-7(使用多曲线分析和实时多路服用PCR检测致泻性大肠杆菌，《临床微生物学杂志》，2008年5月，第46卷第5期，第1752-1757页))。
[0272] 排泄物DNA提取
[0273] 遵循制造商的说明书使用QIAamp DNA粪便小提试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))来提取总DNA，不同之处在于增加了使用FastPrep装置和Lysing Matrix B管(MP生化公司(MP Biochemicals))进行的一系列机械破碎步骤(11次×45秒)(Junick J、Blaut M，Quantification of human fecal bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting the groEL gene.Appl Environ
Microbiol.2012Apr；78(8):2613-22.doi:10.1128/AEM.07749-11.Epub 2012Feb 3(通过使用以groEL基因为目标的定量实时PCR分析进行人类粪便双歧杆菌属种定量，《应用环境微生物学》，2012年4月，第78卷第8期，第2613-2622页，doi：10.1128/AEM.07749-11，2012年
2月3日电子发布))。
Microbiol.2012Apr；78(8):2613-22.doi:10.1128/AEM.07749-11.Epub 2012Feb 3(通过使用以groEL基因为目标的定量实时PCR分析进行人类粪便双歧杆菌属种定量，《应用环境微生物学》，2012年4月，第78卷第8期，第2613-2622页，doi：10.1128/AEM.07749-11，2012年
2月3日电子发布))。
[0274] 16S基因的焦磷酸测序和分析
[0275] 在Roche 454GS-FLX-Titanium测序仪上对16S可变区V1至V3进行PCR扩增和测序，如以下文献中所述：Sanchez M等人，Effect of Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724supplementation on weight loss and maintenance in obese men and
women.Br J Nutr.2014Apr 28；111(8):1507-19(鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724营养补剂对肥胖男性和女性体重减轻和维持的效果，《英国营养学杂志》，2014年4月28日，第111卷第8期，第1507-1519页)。将原始序列数据沉积在GenBank短读数存档上并使用以下软件包进行分析：Mothur 1.33.0版(Schloss,P.D.等人，2009年，“Introducing mothur:Open-source,platform-independent,community-supported software for describing and
comparing microbial communities.”Applied and Environmental Microbiology 75(23):7537-7541(介绍mothur：用于描述和比较微生物群落的开源、独立于平台、群落支持的软件，《应用环境微生物学》，第75卷第23期，第7537-7541页))，以及QIIME 1.8版(Caporaso,J.G.等人，2010b，QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.Nat Methods 7:335-336(QIIME允许分析高通量群落测序数据，《自然方法》，第7卷，第335-336页))。对焦磷酸测序读数进行去噪，使用PyroNoise的Mothur实施(Quince,C.、Lanzen,A.、Curtis,T.P.、Davenport,R.J.、Hall,N.、Head,I.M.等人，2009年，Accurate determination of microbial diversity from 454pyrosequencing data.Nat Methods6:639-641(准确确定454焦磷酸测序数据中的微生物多样性，《自然方法》，第6卷，第639-641页))，依据是描述于以下文献的454SOP：Schloss等人，2011年，Assessing and improving methods used in operational taxonomic unit-based approaches for 16S rRNA gene sequence analysis.Appl Environ Microbiol 77:3219-3226(针对16S rRNA基因序列分析评估和改善在基于操作分类单位的方案中使用的方法，《应用环境微生物学》，第77卷，第3219-3226页)。在QIIME中使用usearch61确定嵌合体(Edgar等人，2011年，UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.Bioinformatics 27:
2194-2200(UCHIME改善嵌合体检测的灵敏度和速度，《生物信息学》，第27卷，第2194-2200页))。然后如Mothur 454SOP中所述对序列进行修剪，以使序列与相同的16S区域重叠。使用uclust以97％同一性执行OTU从头挑选(de novo picking)(Edgar R.C.，2010年，Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.Bioinformatics 26:2460-
2461(搜索和群集比BLAST快几个数量级，《生物信息学》，第26卷，第2460-2461页))。使用RDP分类器以及置信阈值0.6的OTU代表序列的分类法分配(Wang Q.等人，2007年，Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new
bacterial taxonomy.Appl Environ Microbiol 73:5261-5267(用于将rRNA序列快速分配到新细菌分类的朴素贝叶斯分类器，《应用环境微生物学》，第73卷，第5261-5267页))，基于Greengenes参考数据库13.8版(McDonald D等人，2012年，An improved Greengenes
taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of
bacteria and archaea.ISME J 6:610-618(具有明确排名的改善Greengenes分类法，适用于细菌和古菌的生态和进化分析，《ISME杂志》，第6卷，第610-618))。在QIIME中执行多样性分析，并使用位于http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso的Calypso进行关联。在Mothur中完成狄利克雷多项式混合模型(Holmes I等人，2012年，Dirichlet Multinomial
mixtures:Generative models for microbial metagenomics.PLoS One 7:e30126(狄利克雷多项式混合：微生物宏基因组的生成模型，PLoS One 7:e30126))分析。
women.Br J Nutr.2014Apr 28；111(8):1507-19(鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724营养补剂对肥胖男性和女性体重减轻和维持的效果，《英国营养学杂志》，2014年4月28日，第111卷第8期，第1507-1519页)。将原始序列数据沉积在GenBank短读数存档上并使用以下软件包进行分析：Mothur 1.33.0版(Schloss,P.D.等人，2009年，“Introducing mothur:Open-source,platform-independent,community-supported software for describing and
comparing microbial communities.”Applied and Environmental Microbiology 75(23):7537-7541(介绍mothur：用于描述和比较微生物群落的开源、独立于平台、群落支持的软件，《应用环境微生物学》，第75卷第23期，第7537-7541页))，以及QIIME 1.8版(Caporaso,J.G.等人，2010b，QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.Nat Methods 7:335-336(QIIME允许分析高通量群落测序数据，《自然方法》，第7卷，第335-336页))。对焦磷酸测序读数进行去噪，使用PyroNoise的Mothur实施(Quince,C.、Lanzen,A.、Curtis,T.P.、Davenport,R.J.、Hall,N.、Head,I.M.等人，2009年，Accurate determination of microbial diversity from 454pyrosequencing data.Nat Methods6:639-641(准确确定454焦磷酸测序数据中的微生物多样性，《自然方法》，第6卷，第639-641页))，依据是描述于以下文献的454SOP：Schloss等人，2011年，Assessing and improving methods used in operational taxonomic unit-based approaches for 16S rRNA gene sequence analysis.Appl Environ Microbiol 77:3219-3226(针对16S rRNA基因序列分析评估和改善在基于操作分类单位的方案中使用的方法，《应用环境微生物学》，第77卷，第3219-3226页)。在QIIME中使用usearch61确定嵌合体(Edgar等人，2011年，UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.Bioinformatics 27:
2194-2200(UCHIME改善嵌合体检测的灵敏度和速度，《生物信息学》，第27卷，第2194-2200页))。然后如Mothur 454SOP中所述对序列进行修剪，以使序列与相同的16S区域重叠。使用uclust以97％同一性执行OTU从头挑选(de novo picking)(Edgar R.C.，2010年，Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.Bioinformatics 26:2460-
2461(搜索和群集比BLAST快几个数量级，《生物信息学》，第26卷，第2460-2461页))。使用RDP分类器以及置信阈值0.6的OTU代表序列的分类法分配(Wang Q.等人，2007年，Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new
bacterial taxonomy.Appl Environ Microbiol 73:5261-5267(用于将rRNA序列快速分配到新细菌分类的朴素贝叶斯分类器，《应用环境微生物学》，第73卷，第5261-5267页))，基于Greengenes参考数据库13.8版(McDonald D等人，2012年，An improved Greengenes
taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of
bacteria and archaea.ISME J 6:610-618(具有明确排名的改善Greengenes分类法，适用于细菌和古菌的生态和进化分析，《ISME杂志》，第6卷，第610-618))。在QIIME中执行多样性分析，并使用位于http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso的Calypso进行关联。在Mothur中完成狄利克雷多项式混合模型(Holmes I等人，2012年，Dirichlet Multinomial
mixtures:Generative models for microbial metagenomics.PLoS One 7:e30126(狄利克雷多项式混合：微生物宏基因组的生成模型，PLoS One 7:e30126))分析。
[0276] 结果
[0277] 对来自第一批56名患者的连续粪便进行详细的微生物分析：77％在医院化验室中培养产生大肠杆菌病原体(ETEC：23名患者；肠聚集性(EAEC)：10名患者；肠致病性(EPEC)：2名患者；混合大肠杆菌：8名患者)。对整个粪便DNA进行PCR确认大肠杆菌诊断：28名ETEC(23名elt+est+；3名elt+；2名est+)；5名EPEC(4名eae+bfp+；1名eae+)；7名EAEC(daaD+)。
[0278] 通过qPCR计算的总粪便细菌计数在住院期间是稳定的，但低于对照组(参见图1A)。活的大肠杆菌计数占腹泻患者的所有粪便细菌的不到5％(图1B)，并且ETEC患者仅比非大肠杆菌腹泻患者多10倍。通过微生物确认的ETEC感染中热稳定(图1C)和热不稳定(图
1D)毒素基因数在住院的第2天达到峰值滴度(代表<所有粪便细菌的1％)，随后全部三个治疗组中迅速下降。如图1所示，大肠杆菌在开始时小幅增加然后减少，但大肠杆菌不主导大肠杆菌儿童腹泻中的肠道微生物群。
1D)毒素基因数在住院的第2天达到峰值滴度(代表<所有粪便细菌的1％)，随后全部三个治疗组中迅速下降。如图1所示，大肠杆菌在开始时小幅增加然后减少，但大肠杆菌不主导大肠杆菌儿童腹泻中的肠道微生物群。
[0279] 图2示出在腹泻的急性阶段，链球菌占粪便细菌的52％，埃希氏菌属占7％(图2C和图2D)。非轮状病毒大肠杆菌腹泻尤其伴随着链球菌的大幅增加、埃希氏菌属小幅增加以及双歧杆菌属的显著减少。在住院期间，观察到双歧杆菌属的交替增加和链球菌丰度的降低(图2B和2C)。在第4天，整体粪便微生物群组合物类似于住院后第21天，但没有恢复为健康婴儿/幼儿的组合物(图2A)。
[0280] 值得注意的是，与患腹泻时间较长(>5天)的婴儿和幼儿相比，患有早期腹泻(<4天)的婴儿和幼儿还表现出双歧杆菌属/链球菌之比的早期正常化和更低的埃希氏菌属百分比。
[0281] 腹泻患者表现出大量自然生长的粪便链球菌相继被双歧杆菌属取代，从而康复。
[0282] 实施例3
[0283] 临床研究说明
[0284] 在意大利巴勒莫的AOUP“Paolo Giaccone”的母婴科、新生儿科和新生儿重症监护室(Dipartimento Materno Infantile，UnitàOperativa Complessa di Neonatologia e Terapia Intensiva Neonatale)以及比利时哈瑟尔特的幼儿科(Kinderartsenpraktijk)进行了安全性试验。
[0285] 该研究是2个并行配方食品喂养组的随机、对照、双中心介入临床试验。配方食品喂养组的研究人群包括健康的足月的男性和女性婴儿，入选时只有0到14天，这些婴儿在入选时只用配方食品喂养。符合条件的婴儿被随机分配到两个研究配方食品(对照或测试)中的一个，使用分娩方法(顺产或剖腹产)和性别作为分层因素。对于第1阶段，随机的婴儿从入选至4月龄以适合于其体重、年龄和食欲的量接受测试或对照配方食品的排他性喂养。父母/护理人员、调查人员、研究支持人员和临床项目经理对研究配方食品的种类不知情。
[0286] 用于研究中的婴儿配方食品如下：
[0287] ·将对照配方食品给予对照组：其为含有LC-PUFA且不含益生菌的标准乳清为主的1段婴儿配方食品(66.9kcal/100mL重构配方食品、乳清：酪蛋白比例为71.6％:28.4％的1.889g蛋白/100kcal粉末，详细组成参见表2)。
[0288] ·将测试配方食品给予测试组：其为对照配方食品，不同之处在于一部分乳糖已以下面的量替换为2种HMO(2FL和LNnT)：每升重构配方食品0.5-0.6g LNnT和1.0-1.2g 2’FL(详细组成参见表2)。
[0289] 作为参照组(母乳喂养组＝BF组)，招募至少3个月完全母乳喂养的婴儿以便在3月龄时进行粪便取样。
[0290]
[0291]
[0292]
[0293] 表2：对照配方食品和测试配方食品的组成
[0294] 在3月龄时使用不同技术来对每个组的粪便微生物群进行评估，参见表3。
[0295]
[0296] 表3：意向治疗组(ITT)、符合方案组(PP)的婴儿数量和可从符合方案组或母乳喂养参照组获得的粪便样本的数量，用于通过整体16S rDNA测序、病原体特异性Luminex PCR扩增、整体宏基因组测序和基于NMR的代谢物谱来进行微生物群分析。
[0297] 材料和方法
[0298] 粪便收集
[0299] 所有个体的父母在为期3个月的访视前48小时内在家收集粪便样本。为此，向父母提供了试剂盒(隔离袋、冰袋、刮刀罐、可密封的塑料袋、说明书)。要求父母收集2个样本，将样本储存在家中-20℃的冰箱内，并且将包含冷冻冰袋的隔离袋内的粪便样本运送到访视地点，在此将样本在-80℃下冷冻保存。然后将样本置于干冰上运输到瑞士的雀巢研究中心(Nestle Research Center,Switzerland)，并冷冻保存在-80℃下直到分析。
[0300] 排泄物DNA提取
[0301] 遵循制造商的说明书使用QIAamp DNA粪便小提试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))来提取总DNA，不同之处在于增加了使用FastPrep装置和Lysing Matrix B管(MP生化公司(MP Biochemicals))进行的一系列机械破碎步骤(11次×45秒)(Junick and Blaut,2012,Quantification of human fecal bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting the groEL gene.Appl Environ Microbiol 78:
2613-2622(Junick和Blaut，2012年，通过使用以groEL基因为目标的定量实时PCR分析进行人类粪便双歧杆菌属种定量，《应用环境微生物学》，第78卷第2613-2622页))。
2613-2622(Junick和Blaut，2012年，通过使用以groEL基因为目标的定量实时PCR分析进行人类粪便双歧杆菌属种定量，《应用环境微生物学》，第78卷第2613-2622页))。
[0302] 16S基因的扩增以及测序
[0303] 然后，使用通用引物对16S可变区V3至V4进行PCR扩增(Klindworth等人，2013年，Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies.Nucleic Acids Res 41:e1(用于基于传统和下一代测序的多样性研究的通用16S核糖体RNA基因PCR引物的评估，《核酸研究》，第41卷，第e1页))，并且用此前所述的Illumina Miseq技术来进行测序(Caporaso等人，2012年，Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.ISME J 6:1621-1624(在Illumina HiSeq和MiSeq平台上的超高通量微生物群落分析，《国际微生物生态学会会刊》，第6卷，第1621-1624页))。
[0304] 16S数据分析
[0305] 在质量过滤之后，6’710’039个序列描述了符合方案(PP)组的154个样本的微生物群(参见表3)，平均覆盖率为每个样本有42’739个序列归入173个OTU中。从16S rDNA分析中排除了具有少于10’000个序列的三个样本。
[0306] 综合使用Mothur(Schloss等人，2009年，Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and
comparing microbial communities.Appl Environ Microbiol 75:7537-7541(介绍
mothur：用于描述和比较微生物群落的开源、独立于平台、群落支持的软件，《应用环境微生物学》，第75卷，第7537-7541页))和QIIME(Caporaso等人，2010年，QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.Nat Methods 7:335-336(QIIME允许分析高通量群落测序数据，《自然方法》，第7卷，第335-336页))软件包来分析原始序列数据。按照所述的方式对末端配对的序列进行去多重化和连接(Kozich等人，2013年，
Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for
analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing
platform.Appl Environ Microbiol 79:5112-5120(用于分析Illumina排序平台上扩增子序列数据的双指标测序策略和屏模途径的开发，《应用环境微生物学》，第79卷，第5112-
5120页))。然后，使用Mothur命令[deunique.seqs()、degap.seqs()和split.groups()]对于每个样本将序列分割为单独的fasta文件。在QIIME中使用add_qiime_labels.py执行向QIIME格式的转换并执行后续的分析步骤。使用Uchime通过pick_open_reference.py以
97％同一性执行嵌合体检查和OTU拾取(Edgar等人，2011年，UCHIME improves
sensitivity and speed of chimera detection.Bioinformatics 27:2194-2200(UCHIME提高嵌合体检测的灵敏度和速度，《生物信息学》，第27卷，第2194-2200页))。使用RDP分类器以0.6的置信度阈值对代表性序列进行分类学分配(Wang等人，2007年，Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial
taxonomy.Appl Environ Microbiol 73:5261-5267(用于将rRNA序列快速分配到新细菌分类的朴素贝叶斯分类器)，《应用环境微生物学》，第73卷，第5261-5267页))。使用PyNast方法(Caporaso等人，2010年，PyNAST:a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.Bioinformatics 26:266-267(PyNAST：用于将序列与模板比对进行比对的灵活工具，《生物信息学》，第26卷，第266-267页))和Uclust作为成对比对方法来比对OTU代表性序列。然后过滤所得的多重比对并且用于以FastTree方法构建系统发生树(Price等人，2009年，FastTree:computing large minimum evolution trees with
profiles instead of a distance matrix.Mol Biol Evol 26:1641-1650(FastTree：用配置文件代替距离矩阵来计算较大的最小进化树，《分子生物与进化》，第26卷，第1641-
1650页))。在质量过滤(Bokulich等人，2013年，Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.Nat Methods 10:57-59(质量过滤大大改善了Illumina扩增子测序的多样性估计，《自然方法》，第10卷，第57-59页))之后，以属水平利用Calypso网站http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso在QIIME和冗余分析(RDA)中进行α多样性分析(Kindt R和Coe R.，2005年，Tree diversity analysis.A manual and software for common statistical methods for ecological and
biodiversity studies.Nairobi:World Agroforestry Centre-ICRAF(树多样性分析—一种用于生态和生物多样性研究的常用统计方法的手册和软件，内罗比：世界农林中心-ICRAF))。
comparing microbial communities.Appl Environ Microbiol 75:7537-7541(介绍
mothur：用于描述和比较微生物群落的开源、独立于平台、群落支持的软件，《应用环境微生物学》，第75卷，第7537-7541页))和QIIME(Caporaso等人，2010年，QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.Nat Methods 7:335-336(QIIME允许分析高通量群落测序数据，《自然方法》，第7卷，第335-336页))软件包来分析原始序列数据。按照所述的方式对末端配对的序列进行去多重化和连接(Kozich等人，2013年，
Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for
analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing
platform.Appl Environ Microbiol 79:5112-5120(用于分析Illumina排序平台上扩增子序列数据的双指标测序策略和屏模途径的开发，《应用环境微生物学》，第79卷，第5112-
5120页))。然后，使用Mothur命令[deunique.seqs()、degap.seqs()和split.groups()]对于每个样本将序列分割为单独的fasta文件。在QIIME中使用add_qiime_labels.py执行向QIIME格式的转换并执行后续的分析步骤。使用Uchime通过pick_open_reference.py以
97％同一性执行嵌合体检查和OTU拾取(Edgar等人，2011年，UCHIME improves
sensitivity and speed of chimera detection.Bioinformatics 27:2194-2200(UCHIME提高嵌合体检测的灵敏度和速度，《生物信息学》，第27卷，第2194-2200页))。使用RDP分类器以0.6的置信度阈值对代表性序列进行分类学分配(Wang等人，2007年，Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial
taxonomy.Appl Environ Microbiol 73:5261-5267(用于将rRNA序列快速分配到新细菌分类的朴素贝叶斯分类器)，《应用环境微生物学》，第73卷，第5261-5267页))。使用PyNast方法(Caporaso等人，2010年，PyNAST:a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.Bioinformatics 26:266-267(PyNAST：用于将序列与模板比对进行比对的灵活工具，《生物信息学》，第26卷，第266-267页))和Uclust作为成对比对方法来比对OTU代表性序列。然后过滤所得的多重比对并且用于以FastTree方法构建系统发生树(Price等人，2009年，FastTree:computing large minimum evolution trees with
profiles instead of a distance matrix.Mol Biol Evol 26:1641-1650(FastTree：用配置文件代替距离矩阵来计算较大的最小进化树，《分子生物与进化》，第26卷，第1641-
1650页))。在质量过滤(Bokulich等人，2013年，Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.Nat Methods 10:57-59(质量过滤大大改善了Illumina扩增子测序的多样性估计，《自然方法》，第10卷，第57-59页))之后，以属水平利用Calypso网站http://bioinfo.qimr.edu.au/calypso在QIIME和冗余分析(RDA)中进行α多样性分析(Kindt R和Coe R.，2005年，Tree diversity analysis.A manual and software for common statistical methods for ecological and
biodiversity studies.Nairobi:World Agroforestry Centre-ICRAF(树多样性分析—一种用于生态和生物多样性研究的常用统计方法的手册和软件，内罗比：世界农林中心-ICRAF))。
[0307] 宏基因组分析
[0308] 使用具有PE 100读段的Illumina HiSeq仪器对从粪便中分离的DNA进行多重高通量测序，从而测定三组粪便样本的微生物组成。用Nextera XT方案产生DNA文库。将样本在6通道高输出流通池上测序。
[0309] 首先使用来自SolexaQA包的DynamicTrim(v2.1)以0.05的概率截止对读段进行修整(Cox,M.P.等人，《BMC生物信息学》，2010年，SolexaQA:At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data.BMC Bioinformatics
11:485-490(SolexaQA：对Illumina第二代测序数据的一目了然的质量评估，《BMC生物信息学》，第11卷，第485-490页))。然后使用来自SolexaQA包的LengthSort(v2.1)以25bp的长度阈值过滤所得修整的序列。使用bowtie v2.2.5将过滤的读段定位到完整的人类基因组hg19以移除人类读段(Langmead,B.和Salzberg,S.，《自然方法》，2012年，Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.Nature Methods 9:357-359(利用Bowtie 2的快速带空位读段比对《，自然方法》，第9卷，第357-359页))。分别在对照组、测试组和母乳喂养组中识别平均0.9％、0.02％和3.3％的人类读段。为了提高计算效率，使用来自mothur v1.35的unique.seqs函数进一步减少了读段数量(Schloss,P.D.等人，《应用环境微生物学》，2009年，Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities.Appl Environ
Microbiol 75:7537-7541(介绍mothur：用于描述和比较微生物群落的开源、独立于平台、群落支持的软件，《应用环境微生物学》，第75卷，第7537-7541页))，这仅返回发现的唯一序列。该步骤将读段数量减少约50％。在质量过滤之后，从符合方案(PP)组的157个样本中获得了7600万至8000万个序列的中值数目(参见表3)，其中对照组、测试组和BF参照组的覆盖率相等。再次获得均匀分布在各组之间的3600万至4200万个独特序列的中值。一个只有
53661个序列的样本被排除在宏基因组分析之外。然后使用MetaPhlAn v2将其余的读段用于剖析微生物群落的组成(Segata,N.等人，《自然方法》，2012年，Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes.Nature Methods
9:811-814(使用独特的分支特异性标记基因的宏基因组微生物群落剖析《，自然方法》，第9卷，第811-814页))。
11:485-490(SolexaQA：对Illumina第二代测序数据的一目了然的质量评估，《BMC生物信息学》，第11卷，第485-490页))。然后使用来自SolexaQA包的LengthSort(v2.1)以25bp的长度阈值过滤所得修整的序列。使用bowtie v2.2.5将过滤的读段定位到完整的人类基因组hg19以移除人类读段(Langmead,B.和Salzberg,S.，《自然方法》，2012年，Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.Nature Methods 9:357-359(利用Bowtie 2的快速带空位读段比对《，自然方法》，第9卷，第357-359页))。分别在对照组、测试组和母乳喂养组中识别平均0.9％、0.02％和3.3％的人类读段。为了提高计算效率，使用来自mothur v1.35的unique.seqs函数进一步减少了读段数量(Schloss,P.D.等人，《应用环境微生物学》，2009年，Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities.Appl Environ
Microbiol 75:7537-7541(介绍mothur：用于描述和比较微生物群落的开源、独立于平台、群落支持的软件，《应用环境微生物学》，第75卷，第7537-7541页))，这仅返回发现的唯一序列。该步骤将读段数量减少约50％。在质量过滤之后，从符合方案(PP)组的157个样本中获得了7600万至8000万个序列的中值数目(参见表3)，其中对照组、测试组和BF参照组的覆盖率相等。再次获得均匀分布在各组之间的3600万至4200万个独特序列的中值。一个只有
53661个序列的样本被排除在宏基因组分析之外。然后使用MetaPhlAn v2将其余的读段用于剖析微生物群落的组成(Segata,N.等人，《自然方法》，2012年，Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes.Nature Methods
9:811-814(使用独特的分支特异性标记基因的宏基因组微生物群落剖析《，自然方法》，第9卷，第811-814页))。
[0310] 使用ShortBREAD研究编码已知毒力因子的基因或抗生素抗性基因的存在。ShortBRED是管道，其采取一组蛋白质序列，将它们分组成家族，提取一组独特的字符串(“标记”)，然后在宏基因组数据中搜索这些标记并确定感兴趣的蛋白质家族的存在和丰度。毒力因子的标记基于来自致病菌数据库的毒力因子的R3版的所有蛋白质序列(2447个蛋白质序列)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/-Chen,L.H.等人，2012年，Toward the genetic diversity and molecular evolution of bacterial virulence factors.Nucleic
Acids Res 40(Database issue):D641-D645(面向细菌毒力因子的遗传多样性和分子进化，《核酸研究》，第40卷(数据库专刊)，第D641-D645页))。抗生素抗性基因的标记基于来自抗生素抗性基因数据库1.1版的所有蛋白质序列(7828个蛋白质序列)(http://
ardb.cbcb.umd.edu/-Liu,B.和Pop.,M.，NAR，2009年，ARDB-Antibiotic Resistance Genes Database.Nucleic Acids Res 37(Database issue):D443-D447(ARDB-抗生素抗性基因数据库，第37卷(数据库专刊)，第D443-D447页))。
Acids Res 40(Database issue):D641-D645(面向细菌毒力因子的遗传多样性和分子进化，《核酸研究》，第40卷(数据库专刊)，第D641-D645页))。抗生素抗性基因的标记基于来自抗生素抗性基因数据库1.1版的所有蛋白质序列(7828个蛋白质序列)(http://
ardb.cbcb.umd.edu/-Liu,B.和Pop.,M.，NAR，2009年，ARDB-Antibiotic Resistance Genes Database.Nucleic Acids Res 37(Database issue):D443-D447(ARDB-抗生素抗性基因数据库，第37卷(数据库专刊)，第D443-D447页))。
[0311] 如果需要的话，通过拟合负二项式回归模型来评估组间重要性，该模型考虑了零膨胀计数数据。
[0312] 通过Luminex对粪便样本中病原体的检测
[0313] 使用FastPrep装置和Lysing Matrix B管(MP生化公司(MP Biochemicals))使粪便样本经受一系列机械破碎步骤(3×60s)，使用QIAamp MinElute Virus Spin试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))来进行DNA和RNA的同时提取。根据制造商(加拿大多伦多的路明克斯分子诊断公司(Luminex Molecular Diagnostics,Inc.,Toronto,Canada))的建议，使用序列特异性引物的多重胃肠道病原体检测试剂盒(xTAG GPP)通过Luminex 200系统来检测核酸。检测到的分析物是腺病毒血清型40/41、弯曲杆菌属(Campylobacter)(空肠弯曲杆菌
(C.jejuni)、大肠弯曲杆菌(C.coli)和红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari))、艰难梭菌毒素A/B、隐孢子虫(微小隐孢子虫(C.parvum)和人隐孢子虫(C.hominis))、痢疾阿米巴(Entamoeba
histolytica)、大肠杆菌O157、肠毒素大肠杆菌(ETEC)毒素LT/ST、贾第鞭毛虫(Giardia)(蓝氏贾第鞭毛虫(G.lamblia)也称为肠贾第鞭毛虫(G.intestinalis)和十二指肠贾第鞭毛虫(G.duodenalis))、诺瓦克病毒GI/GII、轮状病毒A、产志贺样毒素的大肠杆菌(STEC)stx1/stx2、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia
enterocolitica)。由于对照样本的不一致性，没有考虑检测沙门氏菌属和志贺氏菌属的结果。
(C.jejuni)、大肠弯曲杆菌(C.coli)和红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari))、艰难梭菌毒素A/B、隐孢子虫(微小隐孢子虫(C.parvum)和人隐孢子虫(C.hominis))、痢疾阿米巴(Entamoeba
histolytica)、大肠杆菌O157、肠毒素大肠杆菌(ETEC)毒素LT/ST、贾第鞭毛虫(Giardia)(蓝氏贾第鞭毛虫(G.lamblia)也称为肠贾第鞭毛虫(G.intestinalis)和十二指肠贾第鞭毛虫(G.duodenalis))、诺瓦克病毒GI/GII、轮状病毒A、产志贺样毒素的大肠杆菌(STEC)stx1/stx2、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia
enterocolitica)。由于对照样本的不一致性，没有考虑检测沙门氏菌属和志贺氏菌属的结果。
[0314] 粪便代谢物分析
[0315] 为了获得粪便微生物群的组成方面以外的知识，本发明人使用基于质子核磁共振光谱法(1H NMR)的公认的代谢组学方法探索了粪便的生物化学组成。粪便的1H NMR代谢组学允许定量分析主要代谢产物，包括氨基酸、主要有机酸(乳酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐等)和碳水化合物，并且因此开辟了独特的窗口来监测肠道代谢功能。
[0316] 粪便样本的代谢分析改编自我们以前发布的方法(Martin等人，2014年，Impact of breast-feeding and high-and low-protein formula on the metabolism and growth of infants from overweight and obese mothers.Pediatr Res 75,535-
543.doi:10.1038/pr.2013.250(母乳喂养及高蛋白和低蛋白配方食品对超重和肥胖母亲的婴儿的代谢和生长的影响，《儿科研究》，第75卷，第535-543页，doi:10.1038/
pr.2013.250))。简单地讲，从粪便收集管对80-100mg冷冻的粪便进行取样、称重和冷冻干燥。将干燥的样本悬浮在1.2mL氘化磷酸盐缓冲溶液0.2M KH2PO4中，其含有0.3mM作为抗菌剂的叠氮化钠和1mM作为NMR化学位移参考的3-(三甲基甲硅烷基)-[2,2,3,3-2H4]-1-丙酸钠。将匀浆物以17,000×g离心10分钟，并将5500μL上清液转移至5mm NMR管中。使用标准脉冲序列和具有水抑制的自旋回波脉冲序列，利用配备有300K的5mm冷冻探针的Bruker
Avance III600MHz光谱仪(德国Biospin的布鲁克公司(Bruker,Biospin,Germany))获得1H NMR代谢谱，并使用TOPSPIN(vs 3.2.，布鲁克公司(Bruker))软件包进行处理。数据处理和分析按照先前所报告那样进行(Martin等人，2014年)。从多变量数据分析中识别的重要代谢物通过信号整合进行相对量化，并使用Kruskal-Wallis检验进行分析。由于研究的探索性质，对于多重检验，p值未被校正。
543.doi:10.1038/pr.2013.250(母乳喂养及高蛋白和低蛋白配方食品对超重和肥胖母亲的婴儿的代谢和生长的影响，《儿科研究》，第75卷，第535-543页，doi:10.1038/
pr.2013.250))。简单地讲，从粪便收集管对80-100mg冷冻的粪便进行取样、称重和冷冻干燥。将干燥的样本悬浮在1.2mL氘化磷酸盐缓冲溶液0.2M KH2PO4中，其含有0.3mM作为抗菌剂的叠氮化钠和1mM作为NMR化学位移参考的3-(三甲基甲硅烷基)-[2,2,3,3-2H4]-1-丙酸钠。将匀浆物以17,000×g离心10分钟，并将5500μL上清液转移至5mm NMR管中。使用标准脉冲序列和具有水抑制的自旋回波脉冲序列，利用配备有300K的5mm冷冻探针的Bruker
Avance III600MHz光谱仪(德国Biospin的布鲁克公司(Bruker,Biospin,Germany))获得1H NMR代谢谱，并使用TOPSPIN(vs 3.2.，布鲁克公司(Bruker))软件包进行处理。数据处理和分析按照先前所报告那样进行(Martin等人，2014年)。从多变量数据分析中识别的重要代谢物通过信号整合进行相对量化，并使用Kruskal-Wallis检验进行分析。由于研究的探索性质，对于多重检验，p值未被校正。
[0317] 结果
[0318] 基于16S rDNA分析的粪便微生物群组成
[0319] 三个组的属水平的整体平均概况揭示，尽管对照组和测试组的整体微生物组成显示出类似的配方食品喂养模式，但与对照组相比测试组趋于更类似于与BF组。参见图3，该图提供了3个组的一般概况。
[0320] 统计分析确定了对照组和测试组之间区别地存在若干分类群。事实上，当对属水平的微生物群组成的差异进行统计分析(Wilcoxon秩检验，未对多重检验进行校正)时，对照组和测试组在六个分类群中是不同的(参见表4)。三个分类群在所有组中的中间值为零，仅显示少数异常值的计数。其他在图4中示出。通过随机树林分析(平均降低准确度为0.013至0.006)确认了这三个分类群(双歧杆菌属，埃希氏菌属和未分类消化链球菌科)作为对照组和测试组之间的主要判别的意义。与对照组的整体微生物群相比，尤其存在双歧杆菌属群体的上调以及埃希氏菌属和/或消化链球菌科群体的下调。
[0321]
[0322] 表4：属水平的Wilcoxon秩检验用于评价对照组和测试组之间的显著差异(由p值指示)。BF组不用于统计检验，但数值被示为参考。测试、对照和BF的值是所指示的属的相对丰度的中值。FDR q是在定义的错误发现率下对多重检验进行校正的p值。
[0323] 每个样本的α多样性使用一定度量来计算，该度量考虑到OTU之间的系统发生距离及其在三个比较组中的分布，参见图5。尽管BF组的多样性显著低于两个配方食品组的多样性，但与对照组相比，测试组的多样性显著降低(平均值降低0.19个单位)，因此更接近BF组。
[0324] 通过排序评估三个组的16S rDNA数据中整体微生物组成的差异(参见图6)。基于冗余分析(RDA)的随机排列的统计显示三个组在属水平可显著地分离(p<0.001)。BF组和对照组的质心明显分开，而测试组处于BF组和对照组之间的中间位置。
[0325] 粪便样本中的病原体载量
[0326] 粪便样本的子组可用于由Luminex xTAG多重胃肠道病原体检测试剂盒进行的特定病原体载量的分析。表5示出在3月龄时收集的粪便中检测到至少一种病原体的婴儿的数量。具有可检测的病毒病原体的婴儿的数量在测试组和对照组之间非常相似，分别占28％和31.5％。最常检测到的是诺瓦克病毒。另一方面，14％用测试配方食品喂养的婴儿的粪便中有可检测的细菌病原体，而对照婴儿的粪便中26％显示至少有一种细菌病原体。然而，该差异没有达到统计学显著性(比值比0.46，p＝0.15)。迄今为止，在这些欧洲婴儿中，基于毒素A/B的艰难梭菌是最常检测到的病原体。仅非常罕见地检测到真核(原生生物)病原体，只有2％的测试配方食品喂养的婴儿和5.6％的对照配方食品喂养的婴儿显示出粪便中有隐孢子虫。
[0327]
[0328]
[0329] 表5：3月龄时粪便中存在至少一种病原体的婴儿数量。通过Fisher精确概率检验来计算比值比和双尾p值。
[0330] 还使用宏基因组数据集评估婴儿粪便样本中的病原体载量。对于艰难梭菌，根据宏基因组数据，36％的测试组婴儿和46％的对照组婴儿是携带者。对于艰难梭菌毒素A/B，通过Luminex PCR方法观察到相似的模式，其中14％的测试组婴儿和22％的对照组婴儿具有可检测的水平。
[0331] 粪便微生物群的所选择第一功能方面
[0332] 除了查看病原体之外，本发明人还查询了宏基因组数据集中是否存在编码已知毒力因子的基因或抗生素抗性基因。图8汇总了有和没有多重检验校正的已知毒力基因的结果。本发明人总共检测到编码已知毒力因子的7种基因，其水平在对照组和测试组之间看起来显著不同。在这7种基因中，5种在对照组与测试组之间以及在对照组和BF组之间看起来不同，但在测试组和BF组之间并无不同，这表明测试组更接近这些基因的BF参照。2种另外的差异基因在所有3个组之间看起来不同。
[0333] 就编码抗生素抗性基因的基因而言，本发明人检测到总共8种编码已知抗生素抗性基因的基因，其水平在对照组和测试组之间看起来显著不同，参见图6。在这8种基因中，4种在对照组和测试组之间以及在对照组和BF组之间看起来不同，但在测试组和BF组之间并无不同，这表明测试组更接近这些基因的BF参照。另外4种基因仅在测试组和对照组之间看起来不同，但在配方食品组和BF参照组之间并无不同。
[0334] 粪便代谢标记
[0335] 多变量数据分析识别出重要代谢物，这些代谢物在测试组和对照组与母乳喂养参照组之间区分开(参见图9)。在测试和对照配方食品之间，粪便中一些氨基酸和有机酸的含量相对不同，测试配方食品中观察到的差值朝向在母乳喂养的婴儿的粪便上观察到的值变化。也就是说，苯丙氨酸和异亮氨酸水平在测试组和对照组喂养的婴儿之间是不同的，并且不同于母乳喂养的婴儿的粪便。酪氨酸在测试组和对照组之间没有显著差异，但与母乳喂养参照组不同。另一方面，与对照组相比，测试配方食品喂养的婴儿的粪便中乳酸水平更高，而母乳喂养的参照样本与配方食品喂养的婴儿没有达到统计学显著性差异。
[0336] 结论
[0337] 所有这些不同的分析表明，与对照组(即，用常规营养组合物喂养的婴儿)相比，测试组(即，用根据本发明的婴儿配方食品喂养的婴儿)的整体微生物组成趋于更类似于BF组(即，仅用人类母乳喂养的婴儿)。
[0338] 事实上，该随机安慰剂对照双中心临床试验表明，用2种特定的人乳低聚糖2’FL和LNnT补充标准1段婴儿配方食品在3月龄时调节肠道微生物群，如从粪便样本评估。值得注意的是，测试配方食品喂养的婴儿的整体微生物群组成和功能量度不仅与对照不同，而且更接近母乳喂养参照。具体地讲，在对照组和母乳喂养的参照组之间的测试组粪便微生物群的中间位置见于α-多样性图，属水平的冗余分析，以及属水平的特定分类群的相对丰度比较。对于所观察到的测试组转变到BF参照组的主要贡献者是来自双歧杆菌属、埃希氏菌属和消化链球菌科分类群的细菌。微生物群组成的这种转变进一步由源自乳消化的肠道细菌代谢物的粪便代谢含量的观察到的变化证实，如通过1H-NMR代谢组学观察到的。这表明测试配方食品中的HMO 2’FL和LNnT不仅影响组成，而且影响肠道微生物功能。
[0339] 为了进一步突出婴儿的健康相关优点，本发明人还详尽地研究了特定真实病原体和毒力因子的存在。尽管没有达到统计学显著性，但是与对照相比在测试组中通过毒素A/B特异性PCR扩增和通过宏基因组分析，细菌病原体艰难梭菌显示明显较低的水平，并且接近在BF参照中在宏基因组数据方面观察到的较低水平。值得注意的是，测试组中通过宏基因组分析检测到的若干种已知的毒力和抗生素抗性基因在与对照组婴儿粪便相比时看起来丰度不同，并且类似于BF参照中的丰度。在BF参照是标准的假设下，这些观察共同表明，测试组中的肠道宿主微生物生态可能较不利于允许推定的有害细菌。
[0340] 与BF参照相比，配方食品组中的排泄物游离氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸的较高水平可能与增加的蛋白水解活性或富集在配方食品中但在上肠道中未被吸收的过量氨基酸有关。这表明对膳食蛋白质的细菌处理有所增加。
[0341] 测试配方食品的现有发现表明，将HMO 2’FL和LNnT添加到配方食品中趋于减少粪便中游离氨基酸的含量，同时刺激乳酸盐的产生。这些变化描述了2’FL和LNnT可能诱导肠道微生物代谢变化朝向BF婴儿粪便中所见的代谢物水平，因此诱导与母乳相当的代谢。
[0342] 粪便微生物群和代谢标记共同表明，向1段婴儿配方食品中添加2种单独的、结构上非常特异的HMO使粪便中评估的肠道微生物群在整体组成和功能两方面朝着BF婴儿中观察到的肠道微生物群转变。整体上，测试组婴儿位于在对照配方食品婴儿和BF婴儿之间。然而，对于一些具体的量度，测试组甚至看起来与BF参照组无法区分。
[0343] 包含至少一种岩藻糖基化低聚糖和至少一种N-乙酰化低聚糖(诸如2FL和LNnT)的营养组合物在促进和/或诱导婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群方面在所述婴儿或幼儿中看起来非常有效，该整体微生物群与主要或完全用不包含所述低聚糖的常规营养组合物喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群相比更接近只用人类母乳喂养的婴儿或幼儿的肠道内整体微生物群。
[0344] 因此还认为该营养组合物特别有效地用于预防和/或治疗婴儿或幼儿的肠道微生物群生态失调。
[0345] 实施例4：
[0346] 临床研究说明
[0347] 目的：度量口服HMO干预对因急性腹泻而住院的儿科患者的急性腹泻以及长期持续性腹泻出现的影响。
[0348] 方法：单中心、双盲、随机、受控的临床试验，对象是在孟加拉国达卡的icddr,b,b住院的非母乳喂养的患有急性腹泻的男性和女性儿童。将儿童随机化为(i)HMO和ORS锌(测试产品)或(ii)饮用水和ORS锌(标准治疗护理)。因急性腹泻而住院的母乳喂养儿童的年龄匹配组(iii)在住院期间继续母乳喂养，作为非盲参照组。
[0349] 将满足纳入条件的因急性腹泻而住院的儿童随机分为两组。这两个组均由非母乳喂养的儿童组成，他们将接收为补充有锌的葡萄糖基口服补充液的护理标准物。组(i)额外接收测试产品，即在酸化饮用水中的HMO，剂量为1.5g/天，持续14天。HMO为以2:1的重量比提供的2FL和LNnT。组(ii)仅接收在颜色和味道上无法与测试产品区分开来的安慰剂形式的酸化饮用水。组(i)和(ii)之间的比较将能够评估由两种合成人乳低聚糖组成的测试产品的治疗和预防活性。组(iii)由完全或部分母乳喂养的患急性腹泻的儿童组成，他们仅接收为补充有锌的葡萄糖基口服补充液的护理标准物。组(i)和(iii)之间的比较将能够评估母乳喂养的治疗和预防活性，并且评估相对于(ii)测试产品中的两种合成人乳低聚糖是否重现含有低聚糖和其他保护剂的复杂混合物的母乳的治疗和预防活性。
[0350] 在研究病房对参与试验的儿童就腹泻跟进最多5天。在第5天仍出现腹泻的儿童将被转移至长期病房(LTW)进行观察，直至腹泻治愈。腹泻在研究病房内被治愈的儿童将在腹泻停止之日出院。每名参与试验的儿童将仍然在研究病房中观察至少48小时。出院儿童的母亲/照护者将收到说明、有布里斯托大便分类法(Bristol Stool Scale)的图片和用于每天报告粪便硬度、腹泻复发或不良事件的手机。在出院7天和14天之后，医院将邀请母亲/照护者回访以进行评估。粪便在最后一次访视之前24小时内收集。
[0351] 结果度量/变量：定量腹泻参数(腹泻持续时间、粪便排量、大便次数、呕吐)以及营养状况，用于评估治疗效果。粪便微生物分析将评估HMO对双歧杆菌属自然生长和生态失调重新平衡的刺激效应。
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