专利汇可以提供一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸及其制备方法和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测 试纸 及其制备方法和应用,属于分析化学及医药、环境和 食品安全 检测领域。该检测试纸包括样品垫、金标垫、 硝酸 纤维 素膜、吸 水 垫、PVC 底板 、检测线和质控线;该方法利用金、 银 纳米粒子 易于制备修饰并且可以将 信号 双重放大以及适配体的构象变化实现检测线的光学信号的强弱变化,进而实现对卡那霉素的检测;试纸法检测卡那霉素简便快速,可随时随地检测,结果 可视化 ,检测时间短,只需把试纸条样品垫一端插入到检测液中,10min内即可获得实验结果,可以大幅度的提高检测效率;通过胶体金定量仪读数可进行定量分析,对动物源性食品中卡那霉素残留检测具有重要意义。,下面是一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸的制备方法,其特征是步骤如下:金纳米粒子的制备及功能化、银纳米粒子的制备及功能化、金标垫和样品垫的预处理、硝酸纤维膜的预处理、试纸条的组装、检测试纸条显色情况;具体步骤为:
(1)金纳米粒子的制备及功能化:
制备金纳米粒子之前所有的玻璃仪器均用王水浸泡30min,然后用蒸馏水洗净,超纯水浸泡12h,烘干备用;将100mL 质量浓度0.01%的氯金酸加入250mL圆底烧瓶中,搅拌并加热至沸腾,在剧烈搅拌下快速加入3.5mL质量浓度1%的柠檬酸三钠,继续加热搅拌15min后溶液变成酒红色,停止加热,继续搅拌30min后静置,室温自然冷却,得到粒径13nm的金纳米粒子溶液,4℃保存备用;
将上述金纳米粒子溶液在沸水浴条件下继续加热并不断搅拌,使水分蒸发,直至烧瓶内的溶液为20mL后停止沸水浴,室温自然冷却,得到浓缩的金纳米粒子,4℃保存备用;
将15µL 1mmol/L的三(2-羧乙基)膦TCEP与30 µL 100 µmol/L的适配体Apt混合,进行巯基化反应,然后加入到1mL浓缩的金纳米粒子中,室温下搅拌1h;接着将30 µL 15 mmol/L的三磷酸脱氧腺苷dATP加入到上述溶液中,室温搅拌35min;震荡完成后加入20µL 1mol/L的NaCl溶液室温放置30min,4℃保存6h来增加结合的稳定性;4℃、8000r/min离心10min去除多余的试剂;重悬于1mL含0.5% Tween-20、5% BSA、2% 蔗糖、0.5% TritonX-100的20 mmol/L的Na3PO4缓冲液中,4℃避光保存备用;
(2)银纳米粒子的制备及其功能化:
分别配制0.2mmol/L的硝酸银,2.0mmol/L的脱氧胆酸钠及20mmol/L的硼氢化钠,将硝酸银和脱氧胆酸钠溶液以1︰2的摩尔比在pH7的条件下陈化24 h;将陈化后的溶液加入到圆底烧瓶中,在冰浴条件剧烈搅拌作用下逐滴滴加新鲜配制的硼氢化钠反应10 min,反应后得到黄色胶体银溶液,4℃避光保存备用;
取1mL胶体银溶液于1.5 mL的离心管中,在4℃、12000 r/min条件下离心10 min去除上清,用200 µL含0.5% Tween-20、5% BSA、2% 蔗糖、0.5% TritonX-100的20 mmol/L的Na3PO4缓冲液重悬后即可得到5倍浓缩的胶体银溶液;
将15µL 1mmol/L的TCEP与20 µL 100 µmol/L的DNA1混合,进行巯基化反应,然后加入到1mL 5倍浓缩的胶体银溶液,室温下搅拌1h;接着将30µL 15mmol/L的dATP加入到上述溶液中,室温搅拌35min;震荡完成后逐滴滴加20µL 1mol/L的NaCl溶液室温放置30min,4℃保存6h来增加结合的稳定性;4℃、8000 r/min离心10 min去除多余的试剂,重悬于1mL含0.5% Tween-20、5% BSA、2% 蔗糖、0.5% TritonX-100的20 mmol/L的Na3PO4缓冲液,4℃避光保存备用;
(3)样品垫、金标垫预处理:
将金标垫及样品垫裁剪成合适的大小后在pH 8.2含1% NaCl、0.5% Tween-20、1% BSA、
2%蔗糖、1% TritonX-100的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液中完全浸泡30min,然后放到37℃恒温干燥箱中烘干后,干燥条件保存、备用;
在处理好的金标垫上滴加功能化金、银纳米粒子,即AuNPs-Apt和AgNPs-DNA1,其中DNA1与Apt部分互补,37℃恒温干燥箱中烘干,干燥条件保存,备用;
其中Apt及 DNA1序列如下:
适配体Apt:5’-HS-(CH2)6-TGGGGGTTGA GGCTAAGCCG A-Biotin-3’;
DNA1:5’-HS-(CH2)6-TCAGTCGGCT TAGCCGTCCA ACGTCAGATC C-3’;
(4)硝酸纤维素膜预处理:
将链霉亲和素与生物素修饰的DNA2以1︰4的摩尔比例混合均匀后在4℃的条件下放置
2h,使链霉亲和素和DNA2上修饰的生物素充分结合;取结合好的SA-biotin-DNA2 1µL在硝酸纤维素膜上靠近金标垫一端划检测线T线;取1µL链霉亲和素SA在硝酸纤维素膜上靠近吸水垫一端划质控线C线,将划好T、C线的硝酸纤维素膜在37℃下烘干0.5h,干燥条件下保存备用;
(5)试纸条的组装:胶体金层析试纸条的组成材料主要包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫五部分,先将硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板的对应位置上,轻压,使二者紧密结合,将处理过的样品垫、金标垫,分别粘贴在PVC底板的对应位置上,样品垫与金标垫,金标垫与硝酸纤维素膜各重叠2mm,最后将吸水垫与硝酸纤维素膜重叠2mm粘贴到PVC底板上,多余部分裁掉;然后各部分粘贴牢固,裁成规格为65mm×4 mm的试纸条,干燥条件保存,备用;
组装后的试纸条包括样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)、PVC底板(5)、检测线(6)和质控线(7);所述PVC底板(5)上依次粘贴样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4),其中样品垫(1)搭接金标垫(2),硝酸纤维素膜(3)直接设置于PVC底板(5)上,硝酸纤维素膜(3)一端搭接金标垫(2),硝酸纤维素膜(3)另一端搭接吸水垫(4);所述硝酸纤维素膜(3)上依次还设有检测线(6)和质控线(7);
所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)、各搭接部重叠段为2mm;
所述在硝酸纤维素膜(3)上靠近金标垫(2)的一端用预先孵育过的链霉亲和素和生物素修饰DNA2来划检测线(6),在靠近吸水垫(4)一端用链霉亲和素来划质控线(7);
其中DNA2:5’-biotin-CCGATGGATC TGACGT-3’ 。
2.用权利要求1所述方法制备的基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸的检测方
法,其特征在于:首先将制备好的试纸条置于试纸条卡盒中,在加样孔滴加待检测的溶液于样品垫上后,液体随毛细管作用向吸水垫移动,液体经过硝酸纤维素膜上的检测线和质控线;待试纸条显色完全后,肉眼观察T线颜色深浅可定性或半定量分析,或将试纸条置于胶体金定量仪中进行扫描,得到检测线和质控线的峰面积值,根据标准曲线定量测定出检测液的卡那霉素浓度。
3.如权利要求2所述基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸的检测方法,其特征在于具体步骤如下:将卡盒中的试纸条在样品垫一端滴加检测液,由于毛细管的虹吸作用检测液会从样品垫不断向吸水垫移动经过硝酸纤维素膜;
当检测液中不存在目标物卡那霉素时,T线上的DNA2会与DNA1杂交且DNA1与Apt部分互补,因此在T线上会捕获到功能化的金纳米粒子而显色,C线上的链霉亲和素根据链霉素-生物素作用使金纳米粒子在C线上聚集而显色,此时,T、C线均显色;
当检测液中存在卡那霉素时,Apt会改变其空间构象特异性地与卡那霉素结合,而不再与DNA1结合,AuNPs-Apt会被置换下来,使T线显色变浅或不显色,Apt与卡那霉素结合后其
3’端生物素依然暴露在外,因此可以被C线上的链霉亲和素捕获从而显色,此时,T线显色较浅或完全褪色、C线显色正常;
最后将试纸条置于胶体金定量仪中检测其T、C线的显色强度,根据T线的显色情况来判断所检测的卡那霉素的浓度。
和应用
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