磷酸化HOXA10作为子宫内膜容受性检测的方法
技术领域
[0001] 本
发明属于妇产科学领域，特别涉及一
种子宫内膜容受性检测的方法。
背景技术
[0002] 胚胎的成功着床离不开容受性发育良好的母体内膜。在月经周期后期，受卵巢分泌的雌、孕
激素的影响，正常子宫内膜产生一系列形态、生化方面的规律性变化，发育形成容受性内膜，为胚胎种植做准备。但在IVF-ET周期中，子宫腺肌病、薄型子宫内膜以及不明原因反复种植失败患者的子宫内膜容受性发育
缺陷，造成胚胎种植失败，也是制约IVF-ET临床妊娠率进一步提高的重要原因。同时，随着十八大三中全会明确提出开放“单独二胎”政策，将有近百万个符合政策的高龄妇女或“失独家庭”准备生育二胎。由于高龄或多次人流术后造成子宫内膜损伤，这部分妇女的子宫内膜容受性降低，反复着床失败现象较为常见。需对这部分患者建立较为方便可靠的内膜容受性检测方法，并进一步分析子宫内膜容受性降低原因，以期采取个体化
治疗措施。
[0003] 如何评价子宫内膜容受性是否适合胚胎移植，临床现有的指标主要分为：子宫内膜形态学和超声学指标，但仍然无法准确、有效预测异常子宫内膜的容受性。胞饮突的出现标志着子宫内膜的最佳容受期。研究表明，胞饮突缺乏的患者，胚胎移植后种植反复失败；胞饮突越丰富的患者妊娠率越高。胞饮突被认为是子宫内膜容受性的超微结构性标记，可以准确反应子宫内膜的容受性，但是其检测需要扫描电镜观察，制备过程复杂，很难在临床大规模开展。
[0004] 目前研究普遍认为，转录因子HOXA10是子宫内膜容受性关键性转录调控因子和标志性分子。在子宫内膜容受性的建立过程中，种植“窗口期”形成，HOXA10等分子调控子宫内膜上皮细胞的增殖与分化，确保胚胎的正确
定位和黏附。而HOXA10基因敲除小鼠不孕，表现出着床障碍，而排卵正常。机制研究表明HOXA10基因缺陷导致内膜胞饮突形成缺乏，整合素β3的表达降低和子宫内膜免疫功能紊乱，影响内膜容受性的建立。临床资料分析子宫腺肌病和反复种植失败患者显示子宫内膜中HOXA10的表达量降低，以及其下游调控胚胎着床的关键基因ITGB3和IGFBP-1等表达异常。
[0005] 近期，通过
酵母双杂交筛选和免疫共沉淀技术我们发现子宫内膜组织中丝苏
氨酸激酶MST1与HOXA10生理性相互结合；腺病毒介导的MST1过表达、基因沉默和体外
磷酸化实验证实MST1介导了雌孕激素引起的子宫内膜细胞中HOXA10蛋白T376位苏氨酸的磷化修饰作用；当HOXA10蛋白第376位苏氨酸突变为赖氨酸时，HOXA10的对β3-integrin启动子的转录激活做用丧失，表明HOXA10的磷酸化修饰对其转录活性具有重要调控作用；进一步胚胎与子宫内膜细胞粘附实验表明转录因子HOXA10T376位苏氨酸残基磷酸化修饰参与子宫内膜细胞中容受性标志分子β3-integrin的表达而增加胚胎与内膜间的粘附作用；给予孕1.5天孕鼠宫
角注射HOXA10T376突变腺病毒能明显抑制小鼠胚胎的着床；在此
基础上，我们成功制备了针对HOXA10蛋白第376位苏氨酸残基特异性的磷酸化单克隆
抗体。
临床样本与小鼠围种植期子宫内膜组织免疫印迹实验证实MST1、磷酸化MST1及HOXA10第
376位苏氨酸残基磷酸化修饰
水平能够更好的反映子宫内膜容受性的变化状况。
[0006] 综合文献与我们的研究结果，子宫内膜容受性的状态不仅可以通过MST1和HOXA10蛋白表达量的变化，更可以结合MST1和HOXA10蛋白磷酸化水平综合加以评估。方便快捷检测MST1和HOXA10在子宫内膜组织中的表达及修饰水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态，这也将为子宫内膜容受性低下的快速诊断提供新的手段。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，以解决
现有技术中存在的无法准确、有效预测异常子宫内膜的容受性的问题。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种磷酸化HOXA10作为子宫内膜容受性检测的方法，包括以下步骤：
[0010] (1)细胞培养
[0011] 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含10％FBS和青
链霉素双抗的DMEM/F12培养液中，待细胞长至90％汇集时，用0.25％胰酶细胞消化液常规消化传代，在37℃、5％CO2、饱和湿度中培养；
[0012] (2)免疫印记实验
[0013] 步骤(1)得到的Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗后，加入细胞裂解缓冲液，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定
蛋白质浓度后，取总蛋白进行10％SDS-PAGE胶
电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上，加入以下相应抗体：anti-Myc-HRP,anti-Flag-HRP,anti-MST1,Phospho-MST1(Thr183),anti-phosphothreonine,anti-phosphoserine,anti-HOXA10,anti-β-actin,anti-GAPDH，进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测；
[0014] (3)免疫共沉淀
[0015] HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将Myc-HOXA10和/或Flag-MST1cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c-Myc Beads和/或Flag M2 Beads4℃缓慢摇动孵育过夜，Beads经预冷的RIPA buffer洗3×5分钟后，离心收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白经转移至
硝酸纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况；
[0016] Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入HOXA10抗体与Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜，次日5000g、4℃离心1min收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，
冰上静置5min，离心后取上清进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti-MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况；
[0017] (4)重组His-HOXA10融合蛋白制备
[0018] 以pCMV-Flag-HOXA10质粒为模板，采用 Pfx DNA聚合酶分别扩增HOXA10不同结构域
片段(HOXA10 1-318、HOXA10 318-410及HOXA10 318-410 T376A)，分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)，经酶切，测序获得阳性克隆后，转化入BL21感受态细胞，分别挑取4个克隆于37℃恒温摇床中250rpm扩增12～14h，次日取过夜菌液加入液态琼脂糖培养基，37℃恒温摇床中250rpm扩增3h后，加入终浓度为1mM IPTG，30℃，250rpm诱导蛋白表达，融合蛋白经10％SDS-PAGE胶电泳分离，考
马斯亮蓝
染色及免疫印迹分析正确表达后，选取上清表达的克隆进行大量表达重组His-HOXA10融合蛋白，并经His-Mag Agarose Beads纯化富集后，洗脱蛋白定量后，分装-80℃保存备用；
[0019] (5)体外磷酸化实验
[0020] 重组His-HOXA10融合蛋白与具激酶活性的重组MST1和[γ-32P]混匀于kinase assay buffer,30℃孵育0-120分钟，加入Laemmli样品缓冲液，混匀，95℃加热5分钟终止反应；离心，取上清进行10％SDS-PAGE，干胶，放射自显影，观察目的蛋白的磷酸化状况；或加入非
放射性标记的ATP，采用相应抗体anti-phosphothreonine,anti-phosphoserine和anti-pHOXA10抗体进行Western Blot检测HOXA10蛋白磷酸化修饰情况；
[0021] (6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验
[0022] 利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞
单层上的模型。
[0023] 所述步骤(6)的具体方法如下：
[0024] a.用无水
乙醇配置浓度为10mg/mL的poly-HEMA溶液，37℃摇床摇过夜，以充分溶解，溶液于常温下保存；
[0025] b.构建悬浮培养环境：用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被细胞培养孔板，待用；
[0026] c.胰酶消化生长至融合度为90％的BeWo单层细胞，进行细胞计数，稀释细胞
密度为1x105个细胞/mL，将细胞接种于预先用poly-HEMA处理过的60mm的细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2
培养箱中进行细胞的悬浮培养，并随时观察培养细胞是否成团；
[0027] d.将Ishikawa细胞消化接种于十二孔细胞培养板中，待细胞融合度为80％时，感染50MOI MST1和/或20MOI HOXA10腺病毒进行相应基因的过表达，48hr后，将已培养成球的BeWo细胞球接种于处理过的Ishikawa细胞单层之上，两者共培养1.5hr，预热至37℃的含
钙和镁离子的PBS轻轻漂洗十二孔板两次，4％多聚甲
醛室温固定30min，统计粘附的细胞球数，并计算细胞的粘附效率。
[0028] 所述步骤(1)中，青链霉素双抗为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
[0029] 所述步骤(2)中，细胞裂解缓冲液为50.0mmol/L Tris pH＝7.6,150.0mmol/L NaCl,0.1％SDS,1.0％NP-40,Protease Inhibitor Cocktail,Phosphatase Inhibitor Cocktail(Sigma)。
[0030] 所述anti-pHOXA10抗体的制备方法是：多肽
抗原信息：磷酸化肽(C-RSVHL(pT)DRQVK)，对照肽(C-RSVHLTDRQVK)进行免疫小鼠，按常规流程制备单克隆抗体。
[0031] 本发明的有益效果是：本发明方便快捷检测子宫内膜组织中HOXA10第376位苏氨酸磷酸化修饰水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态。临床样本与小鼠围种植期子宫内膜组织免疫印迹实验证实MST1、磷酸化MST1及HOXA10第376位苏氨酸残基磷酸化修饰水平能够更好的反映子宫内膜容受性的变化状况子宫内膜容受性的状态不仅可以通过MST1和HOXA10蛋白表达量的变化，更可以结合MST1和HOXA10蛋白磷酸化水平综合加以评估。方便快捷检测MST1和HOXA10在子宫内膜组织中的表达及修饰水平，将能直接反映出子宫内膜的容受性状态，这也将为子宫内膜容受性低下的快速诊断提供新的手段。
附图说明
[0032] 图1是MST1与HOXA10相互结合；
[0033] 图2是MST1磷酸化HOXA10第376位苏氨酸残基；
[0034] 图3是MST1磷酸化HOXA10促进胚胎黏附；
[0035] 图4是MST1和HOXA10及其蛋白磷酸化修饰在围种植期孕鼠子宫组织中高表达；
[0036] 图5是HOXA10和磷酸化HOXA10在反复种植失败患者子宫内膜组织中低表达。
具体实施方式
[0037] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
[0038] 一种磷酸化HOXA10作为子宫内膜容受性检测的方法，包括以下步骤：
[0039] (1)细胞培养
[0040] 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含10％FBS和青链霉素双抗(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM/F12培养液中(Gibco BRL/Invitrogen)，待细胞长至90％汇集时，用0.25％胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA，Gibco BRL/Invitrogen)常规消化传代，37℃、5％CO2、饱和湿度中培养。
[0041] (2)免疫印记实验(Western Blot)
[0042] Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗两次后，加入500μL细胞裂解缓冲液[50.0mmol/L Tris pH＝7.6,150.0mmol/L NaCl,0.1％SDS,1.0％NP-40,Protease Inhibitor Cocktail,Phosphatase Inhibitor Cocktail(Sigma)]，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定蛋白质浓度后，取30μg的总蛋白进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上(Millipore)，加入相应抗体[anti-Myc-HRP(1:5000,Invitrogen),anti-Flag-HRP(1:5000,sigma),anti-MST1(1:1000,Cell Signaling Technology),Phospho-MST1(Thr183)(1:1000,Cell Signaling Technology),anti-phosphothreonine(1:1000,sigma),anti-phosphoserine(1:1000,sigma),anti-HOXA10(1:1000,Santa Cruz),anti-β-actin(1:10,000,Abcam),anti-GAPDH(1:10,000,Abcam)]进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测。
[0043] (3)免疫共沉淀
[0044] HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将3μg Myc-HOXA10和/或Flag-MST1cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c-Myc Beads(Invitrogen)和/或Flag M2Beads(Sigma)4℃缓慢摇动孵育过夜。Beads经预冷的RIPA buffer洗3×5分钟后，离心收集Beads，加入30μL 2×SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％SDS-PAGE电泳。蛋白经转移至硝酸
纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况。
[0045] 1mg Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入2μg HOXA10抗体(H-90，Santa Cruz)与2μg Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入30μL ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜。次日
5000g、4℃离心1min收集Beads。加入50μL 2×SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，冰上静置5min，离心后取上清进行10％SDS-PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti-MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况。
[0046] (4)重组His-HOXA10融合蛋白制备
[0047] 以pCMV-Flag-HOXA10质粒为模板，采用 Pfx DNA聚合酶分别扩增HOXA10不同结构域片段(HOXA10 1-318、HOXA10 318-410及HOXA10 318-410 T376A)，分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)，经酶切，测序获得阳性克隆后，转化入BL21感受态细胞。分别挑取4个克隆于37℃恒温摇床中250rpm扩增12～14h，次日取40μL过夜菌液加入2mL液态琼脂糖培养基，37℃恒温摇床中250rpm扩增3h后，加入终浓度为1mM IPTG，30℃，250rpm诱导蛋白表达。融合蛋白经10％SDS-PAGE胶电泳分离，考马斯亮蓝染色及免疫印迹分析正确表达后，选取上清表达的克隆进行大量表达重组His-HOXA10融合蛋白，并经His-Mag Agarose Beads纯化富集后，洗脱蛋白定量后，分装-80℃保存备用。(5)体外磷酸化实验
[0048] 为了证实表达纯化的重组His-HOXA10融合蛋白(见预实验结果Figure 3A)可以体外被MST1磷酸化，进行蛋白质的体外磷酸化实验。2μg的重组His-HOXA10融合蛋白与具激酶活性的重组0.1μg MST1(Upstate)和[γ-32P](PerkinElmer)混匀于20μL2×kinase assay buffer(40mM HEPES-NaOH pH＝7.4,20mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP,1mM Na3VO4,50mM NaF,and complete protease inhibitor[Roche]),30℃孵育0-120分钟，加入10μL 3×Laemmli样品缓冲液，混匀，95℃加热5分钟终止反应。离心，取上清进行10％SDS-PAGE，干胶，放射自显影，观察目的蛋白的磷酸化状况。或加入非放射性标记的ATP，采用相应抗体anti-phosphothreonine,anti-phosphoserine和anti-pHOXA10(T376，自制单抗)抗体进行Western Blot检测HOXA10蛋白磷酸化修饰情况。
[0049] (6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验
[0050] 利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞单层上的模型。具体方法简述如下：
[0051] (1)用无水乙醇配置浓度为10mg/mL的poly-HEMA溶液(sigma货号：041M0024U)，37℃摇床摇过夜，以充分溶解，溶液于常温下保存。
[0052] (2)构建悬浮培养环境：用10mg/mL的poly-HEMA溶液包被细胞培养孔板，以6孔板为例：6孔细胞培养板中每孔加入2mL配置好的终浓度为10mg/mL的poly-HEMA，待乙醇挥发干燥后再重复操作两次，挥发干燥后无菌保存待用，使用之前用无菌PBS清洗3次，超净台紫外灯下照射30min，待用。
[0053] (3)胰酶消化生长至融合度为90％的BeWo单层细胞，进行细胞计数，稀释细胞密度为1x105个细胞/mL，将细胞接种于预先用poly-HEMA处理过的60mm的细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱中进行细胞的悬浮培养，并随时观察培养细胞是否成团。
[0054] (4)将Ishikawa细胞消化接种于十二孔细胞培养板中，待细胞融合度为80％时，感染50MOI MST1和/或20MOI HOXA10腺病毒进行相应基因的过表达。48hr后，将已培养成球的BeWo细胞球接种于处理过的Ishikawa细胞单层之上，两者共培养1.5hr。预热至37℃的含钙和镁离子的PBS轻轻漂洗十二孔板两次，4％多聚甲醛室温固定30min，统计粘附的细胞球数，并计算细胞的粘附效率。
[0055] anti-pHOXA10抗体的制备方法是：多肽抗原信息：磷酸化肽(C-RSVHL(pT)DRQVK)，对照肽(C-RSVHLTDRQVK)进行免疫小鼠，按常规流程制备单克隆抗体。
