本发明涉及在植物和哺乳动物细胞的转化中使用的DNA构建体。 特别地，本发明涉及使细胞功能被破坏，并且任选地，使细胞功能的 破坏逆转的DNA构建体。本发明还涉及使植物衰老进程减缓或被抑制 的DNA构建体。

根据本发明的又一DNA构建体为了提高植物的性能或产率而改变 了蛋白质特别是贮存蛋白的代谢的过程。这样的构建体可以用来延迟 种子的发芽，因为需要防止收获前抽芽。

因此本发明的DNA构建体使用了能抑制细胞功能需要的蛋白质的 DNA序列，或者控制衰老或发芽和/或控制蛋白质特别是贮存蛋白的代 谢的DNA序列。象编码前体蛋白那样的DNA序列在本发明中是有用 的。

具有前酶原或酶原前体蛋白的蛋白质在本发明中是特别有用 的。具有这样的前体蛋白的蛋白质的例子包括蛋白酶。一种这样的蛋 白酶是半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶(CPs)是植物(Praekelt等， 1988；Goetting-Minesky和Mullin,1994)，动物(Wiederanders等， 1992)和原生动物(Mallinson等，1994)中大量多基因家庭的成员。 半胱氨酸蛋白酶作为失活前体合成(Praekelt等，1988)。所述前酶 原导向分泌途径(Marttila等，1995)，并且通过前肽片段的蛋白酶 剪切在液泡中转录后加工而产生活性酶(Hara-Nishimura等，1993 和1994)。

植物半胱氨酸蛋白酶参与生理学重要的不同的代谢作用。在种子 发芽和植物衰老过程中，它们参预蛋白质降解(Jones等， 1995；Valpuesta等，1995；Smart等，1995)并且在发芽期间在贮存 蛋白的活动化中起着关键作用(Boylan和Sussex,1987)。在种子发 育期间，半胱氨酸蛋白酶催化蛋白质前体的翻译后加工以生成其成 熟形式(Hara-Nishimura等，1995)。此外，一些或者受赤霉酸 (Koehler和Ho,1990；Watanabe等，1991)或者受乙烯(Cervantes 等，1994；Jones等，1995)的激素调节。其它在对应激的反应中被诱 导，所述应激如受伤(Linthorst等，1993；Lidgett等，1995)，脱 水(Guerrero等，1990)，受冷(Schaffer和Fischer,1988)，或者 涉及植物-微生物相互作用(Goetting-Minesky和Mullin,1994)。

对于大麦(Marttila等，1995)，稻(Watanabe等，1991)，玉米 (Debarros和Larkins,1994)，小豌豆(chick-pea)(Cervantes等， 1994)，巢菜(Becker等，1994)表征了发芽特异性半胱氨酸蛋白酶， 并且对油菜描述了半胱氨酸蛋白酶(Comai和Harada,1989)。

Taylor等，1995描述了蛋白酶的体外研究。描述了很多蛋白酶， 包括半胱氨酸蛋白酶家族成员。大肠杆菌中产生的木瓜蛋白酶和番木 瓜蛋白酶Ⅳ的重组前区可以作为四种天然存在的番木瓜半胱氨酸蛋 白酶的差别快速结合抑制剂起作用。事实表明蛋白酶前体中的可裂解 的“前”区其功能不只是抑制蛋白酶活性而且还有助于折叠。发现大 肠杆菌中表达的重组前肽在纳摩尔范围内是它们的同源蛋白酶的选 择性抑制剂，而试验的其它半胱氨酸蛋白酶不受存在至多10微摩尔 所述前肽的影响(Volkel等，1996)。但是，没有这样的蛋白酶的任 何用途的教诲或提示或者本发明的DNA构建体的任何提示。

期望提供一种方法，以控制生物体内可逆细胞破坏，衰老和贮存 蛋白代谢这样的功能。

因此，本发明提供一种DNA构建体，包括：

a)第一DNA序列，其包括应答外源诱导物的存在或不存在的诱 导型启动子序列，或者在生物体的选定的组织或选定的发育阶段启动 基因表达的发育基因启动子；

b)第二DNA序列，其包括编码蛋白酶的序列，与(a)中描述的 启动子可操作地连接，且处于其控制之下。

通过外源诱导物的存在或不存在或者在(a)中定义的发育基因启 动子的激活导致所述蛋白酶的表达。外源诱导物调控启动子活性的用 途是公知的。启动子可以由各种各样的因素刺激，例如环境因素，害 虫或病原体的存在或者化学品的存在。特别是，合适的诱导型启动子 由外源化学刺激物诱导，因此外源诱导物是化学品。所述外部化学刺 激物优选是农业可接受化学品，其应用与农业应用相匹配并且对植物 或哺乳动物没有危害。

所述诱导型启动子最优选包括诱导型开关启动子系统，例如，双 成分系统，例如，在我们公开的国际公开No.WO93/21334中描述的 alcA/alcR基因开关启动子系统，在我们国际公开No.WO96/37609 中描述的蜕皮激素开关系统或者在公开的国际专利申请 No.WO90/08826和No.WO93/031294中描述的GST启动子，其教导在 这里引作参考。这样的启动子系统在这里称之为“开关启动子”。在 与所述开关启动子联合使用的开关化学品是使得该系统在本发明的 方法中特别有用的农业可接受化学品。

类似地，发育特异性启动子也是公知的。例如一些启动子，例如 苹果酸合酶(MS)启动子(参见Graham等，1990，植物分子生物学 (Plant Mol Biol.)15,539-549,Comai等，植物生理学(Plant Physiol.)98,53-61)，在植物早期籽苗发育期间是有活性的。其它 的例子包括半胱氨酸蛋白酶启动子本身的启动子，例如WO97/35983 中描述的那些。或者是来自乙醛酸循环体例如异柠檬酸酶的基因的植 物发育启动子和来自糊粉层例如α-淀粉酶的基因的启动子 (Baulcombe等(1987)Mol.&Gen Genet.209,33-40)。盾盖 (scutellum)基因启动子例如羧肽酶基因的启动子或者来自生发基 因(germin gene)的启动子(Lane等，(1991)，生物化学杂志 (J.Biol.Chem.)266,10461)也可以包括在植物发育的特定阶段有活 性的启动子。

使用常规方法也可以分离选择的发育阶段的活性启动子，例如通 过对在选择的发育阶段的生物体的RNA进行逆转录酶多聚酶链反应 (RT-PCR)方法，并且使用RNA印迹分析将这些与来自不同发育阶段的 细胞RNA相比较。然后常规鉴定这些序列并测序并且确定启动子序 列。如下文描述的，对于本发明特殊应用使用诱导衰老启动子。

组织特异性启动子也是本领域公知的或者可以使用相似方法分 离。已知的组织特异性启动子的例子包括花药-和/或绒毡层-特异性 启动子或花粉-特异性启动子。其它这样的启动子可以特别地通过使 用国际专利申请No.WO90/08826中描述的技术分离。

这里使用的术语“蛋白酶”指天然存在的蛋白酶或者其片段或者 它们的变体，前提是其有蛋白酶活性。

这里使用的术语“变体”包括试验产生的变体，或可以通过分子 遗传技术鉴定的相关的天然存在的肽家族的成员。这样的技术例如描 述于美国专利申请5605793,5811238和5830721，其内容在这里引 作参考。该项技术主要涉及亲代基因在微生物表达系统例如大肠杆菌 中的表达。选择的特别的系统一定是经证实的和校正的以保证该生物 活性肽被表达，这已经使用体内生物测定实现了。可以使基因，或者 优选地，来自不同物种的相关基因的集合进行突变聚合酶链反应 (PCR)，这是本领域公知的。将产物片段化并且接着使用PCR修复产 生一系列从亲代变体重组的嵌合基因。这些嵌合体然后在微生物系统 中被表达，这样的微生物可以以常规方式筛选来确定活性突变体，然 后将其分离并测序。反复进行分子进化DNA改组循环可以渐次增强导 致期望的基因性质。该自然技术的优点在于产生和筛选宽范围的不同 突变，包括多突变区段变化。

其它变体是使用例如分子进化技术试验产生的那些。优选地，这 样的变体将具有与天然序列相比提高的活性或功能。合适的提高可能 与该蛋白质的固有特异活性有关，或者通过改变物理性质，例如稳定 性。

其它变体可以使用生物信息学系统鉴定或确定。这样一种系统的 一个例子是W.R.Pearson和D.J.Lipman PNAS(1988)85:2444-2488 的FASTA方法。该方法提供了比较蛋白质序列并测定相似性水平的快 速而简单的方法，并且是分子生物学家使用的标准工具。这样可以通 过分子进化或者通过合成方法从天然来源获得相似序列，并且使用该 方法进行比较达到“选择分数(opt score)”，其指示蛋白质之间 相似性的水平。

思想上受这些条件制约，技术人员应该能够分离该肽家族的其它 成员，例如通过以天然存在的蛋白酶为基础设计探针或引物，而且在 FASTA选择分数范围的限制内。这些探针然后可以使用常规方法用来 筛选例如cDNA或基因组文库这样的文库，以分离具有类似活性的其 它酶。在这些筛选操作期间使用的杂交条件是严格性差或严格性强的 条件，优选严格性强的条件，这是通常在本领域中使用的(参见，例 如“分子克隆，实验室手册”，Sambrook等，冷泉港实验室出版社， 纽约)。一般而言，严格性差的条件定义为在大约室温至大约65℃下 3×SCC，而严格性强的条件定义为在大约65℃下0.1×SSC。SSC是 0.15M NaCl,0.015M柠檬酸三钠缓冲液的名称。3×SSC强度是1× SSC的三倍，依此类推。

一经发现，为了提高其性质也可以使其它家族成员进行这里描述 的分子进化技术或DNA改组。以这种方法获得的所有的肽应该可以认 为是变体。

第二方面，本发明提供包含如上所述的DNA构建体的植物种质。

蛋白酶以可调控方式的表达可以用于各种各样的目的。例如，它 们可以用来破坏细胞功能，这可以例如在例如WO90/08830中描述的 雄性不育的生产中发现应用。优选地，在这样一个例子中，细胞功能 的破坏是可逆的。这可以通过控制性表达破坏蛋白酶的蛋白质在蛋白 质水平上在本发明中实现。

因此，根据本发明的第三方面，提供了一种DNA构建体，包括：-

a)第一DNA序列，其包括应答外源诱导物的存在或不存在的诱 导型启动子序列，或者在生物体的选定的组织或选定的发育阶段启动 基因表达的发育基因启动子；

b)第二DNA序列，其包括编码能破坏细胞功能的蛋白酶的DNA 序列，它与(a)中定义的启动子序列操作连接，且在其调控之下；

c)第三DNA序列，其包括应答外源诱导物的存在或不存在的诱 导型启动子序列，或者在生物体的选定的组织或选定的发育阶段启动 基因表达的发育基因启动子；

d)第四DNA序列，其包括一个DNA序列，其产物能抑制在(b) 中定义的蛋白质，与(c)中定义的启动子序列操作连接且在其调控 之下。

凭借在(a)中定义的外源诱导物的存在或不存在或者发育基因启 动子的表达使得细胞功能被破坏，凭借在(c)中定义的外源诱导物的 存在或不存在或者发育基因启动子的表达防止或减少细胞功能的破 坏。

(c)中对存在或不存在外源诱导物应答的启动子序列或者使用的 发育基因启动子的例子包括上面定义的与(b)相关的那些。

根据本发明的第四方面，提供了植物种质，包括包含如上所述DNA 构建体的植物。

根据本发明的第五方面，提供了包含如上所述DNA构建体的哺乳 动物细胞。

根据本发明的第六方面，提供了如上所述DNA构建体破坏细胞功 能和任选地逆转所述细胞破坏的用途。

优选地，能可逆性破坏细胞功能的DAN构建体的第一DNA序列进 一步包括对包括在第五DNA序列中的DNA序列编码的阻抑蛋白应答的 操纵基因序列，所述第五DNA序列与第六DNA序列操作连接并且处于 其调控下，所述第六DNA序列包括一个对外源诱导物的存在或不存在 应答的诱导型启动子序列。适合用作第六DNA序列的启动子的例子包 括上面对于用作第二DNA序列列出的那些。

优选地，能可逆性破坏细胞功能的该DNA构建体的第四DNA序列 包括天然与(b)中定义的DNA序列相关的蛋白质家族成员的编码DNA 序列。该第四DNA序列优选包括编码蛋白酶前肽的DNA序列。或者， 该蛋白质是抗所述第二DNA序列的产物的一种酶抑制剂甚至是一种抗 体。

优选地，所述蛋白酶是一种导向或非导向半胱氨酸蛋白酶。天然 存在的半胱氨酸蛋白酶和编码它们的核酸序列的例子例如描述于 WO97/35983。

优选地，所述发育基因启动子是一种早期籽苗(early seedling) /种子启动子。或者，其可以是病原体诱导的启动子。

优选地，所述DNA构建体能破坏植物细胞或哺乳动物细胞中的细 胞功能。

根据本发明的第七方面，提供了一种构建体，包括：-

a)第一DNA序列，其包括应答外源诱导物的存在或不存在的诱 导型启动子序列，或者在生物体的选定的组织或选定的发育阶段启动 基因表达的发育基因启动子；

b)第二DNA序列，其包括一个DNA序列，该DNA序列的产物能 抑制植物中控制衰老的蛋白质，与(a)中定义的启动子序列操作连接 且在其调控下，

通过外源诱导物的存在或不存在或者发育基因启动子的活性能 够使能控制衰老的蛋白质的合成减量调节或者使其活性大大降低，从 而使衰老的过程减缓。

根据本发明的第八方面，提供了如上所述的DNA构建体减量调节 所述能控制衰老的蛋白质的合成或者大大降低其活性的用途。

根据本发明的第九方面，提供了植物种质，包括包含根据上面定 义的第七方面的DNA构建体的植物。

优选地，能减缓衰老进程的该DNA构建体的第二DNA序列包括与 能控制衰老的蛋白质天然相关的蛋白质家族成员的编码DNA序列。优 选地，该第二DNA序列包括编码蛋白酶前肽的DNA序列。或者，该 DNA序列编码蛋白酶部分有义或反义RNA。在另一个可选择方面，该 DNA序列编码抗所述第二DNA序列的产物并且能抑制其活性的抗体。

优选地，所述能控制衰老的蛋白质是一种蛋白酶。该蛋白酶可以 自植物，真菌，细菌或动物产生或者可以是具有蛋白酶活性的其片段 或变体。最优选地，该蛋白酶自植物，真菌，细菌或动物产生。

优选地，该蛋白酶是如上所述的导向或非导向半胱氨酸蛋白 酶。

优选地，所述发育基因启动子是诱导衰老的启动子。

优选地，所述DNA构建体能减量调节或者大大降低能在植物细胞 中控制衰老的蛋白质的活性。

根据本发明的第十方面，提供了一种DNA构建体，包括：-

a)第一DNA序列，其包括应答外源诱导物的存在或不存在的诱 导型启动子序列，或者在生物体的选定的组织或选定的发育阶段启动 基因表达的发育基因启动子；和

b)第二DNA序列，其包括一个DNA序列，该DNA序列的产物能 减量调节或抑制植物中能控制贮存蛋白代谢的蛋白质，该DNA序列与 (a)中描述的启动子可操作地相连，且处于其控制之下，

凭借(a)中定义的外源诱导物的存在或不存在或者发育基因启动 子的表达，能够使能控制贮存蛋白的代谢的蛋白质的合成减量调节或 者使其活性大大降低，从而改变植物中贮存产物的性质，转移和/或 分布。

特别地，这样一种构建体可以通过延迟植物的发芽而用来防止收 获前抽芽。

根据本发明的第十一方面，提供了包含如第十方面中定义的DNA 构建体的植物，植物种子或植物细胞。

根据本发明的第十二方面，提供了如上定义的DNA构建体减量调 节能控制贮存蛋白的代谢的蛋白质的合成或者大大降低其活性的用 途，例如这在发芽期间发生。

优选地，能控制贮存蛋白的代谢的所述DNA构建体的第一DNA序 列，进一步包括操纵基因序列，它应答第三DNA序列内的DNA序列编 码的阻抑蛋白，所述第三DNA序列是与第四DNA序列操作连接的并且 处于其调控下，所述第四DNA序列包括应答外源诱导物的存在或不存 在的诱导型启动子序列，借助阻抑蛋白的表达防止贮存蛋白的代谢的 改变。

以这种方式，该构建体对贮存蛋白的代谢的作用可以是可逆的。

可选择地或者优选另外地，所述DNA构建体还包括第五DNA序 列，包括编码异源蛋白质的DNA序列，它与第六DNA序列可操作地连 接并处于其调控下，所述第六DNA序列包括应答外源诱导物的存在或 不存在的诱导型启动子序列，借助该异源基因的表达终止贮存蛋白代 谢的改变。

优选地，能被植物中该DNA构建体中的DNA序列编码的产物抑制 的、能控制贮存蛋白的代谢的蛋白质是一种蛋白酶，合适地是一种内 源蛋白酶。优选地，其是如上所述的导向或非导向半胱氨酸蛋白酶。

优选地，能改变植物中贮存蛋白代谢的所述DNA构建体的所述第 二DNA序列包括编码天然与能改变贮存蛋白代谢的蛋白质相关的产物 的DNA序列。

优选地，所述第二DNA序列包括编码蛋白酶前肽的DNA序列。

优选地，所述第二DNA序列包括编码蛋白酶有义RNA或部分有 义RNA的DNA序列或者编码蛋白酶反义RNA的DNA序列。或者，其可 以编码一种抗体，该抗体对能改变贮存蛋白代谢的蛋白质是特异性的 并且抑制该蛋白。

蛋白酶可以自植物，真菌，细菌或动物产生或者可以包括具有蛋 白酶活性的其片段或变体。最优选地，该蛋白酶自植物，真菌，细 菌或动物产生。

优选地，所述第二DNA序列包括编码半胱氨酸蛋白酶有义，部 分有义或反义RNA的DNA序列。

优选地，该异源蛋白质是一种蛋白酶。

优选地，在这种情况下，该发育基因启动子是早发型籽苗启动 子。

优选地，该DNA构建体能减量调节能改变植物中贮存蛋白代谢的 蛋白质的合成或者大大降低该蛋白质的活性。

根据本发明的优选实施方案，提供了能如上所述可逆性破坏细胞 功能的DNA构建体，其中所述能破坏细胞功能的蛋白质是半胱氨酸蛋 白酶，并且其中所述能抑制所述半胱氨酸蛋白酶的蛋白质是蛋白酶前 肽。

根据本发明的另一个优选实施方案，提供了能如上所述减缓或抑 制衰老的DNA构建体，其中所述能控制衰老的蛋白质是成熟半胱氨酸 蛋白酶，并且其中所述能抑制所述半胱氨酸蛋白酶的蛋白质是蛋白酶 前肽。

根据本发明的另一个优选实施方案，提供了能如上所述改变贮存 蛋白代谢的DNA构建体，其中所述能改变贮存蛋白代谢的蛋白质是半 胱氨酸蛋白酶，并且其中所述半胱氨酸蛋白酶被编码所述半胱氨酸蛋 白酶的完全或部分反义或部分有义RNA的DNA序列抑制。

术语“DNA构建体”-其是例如术语“盒”，“杂种”和“缀合物” 的同义词-包括彼此直接或间接连接例如形成盒的DNA序列。一个间 接连接的例子是假设各DNA序列中插入合适的间隔基团，例如内含子 序列。该DNA序列可以进一步在不同的载体上，因此不必须位于相同 的载体上。

术语“天然相关的”包括感兴趣的蛋白质的完全或部分前体蛋白 或者体外结合感兴趣的蛋白质的蛋白质。这些可以是天然存在的或合 成的。

术语“前体蛋白”包括先前形成的并且转化为特别感兴趣的蛋白 质的蛋白质并且包括前蛋白原和蛋白原组构，即包括成熟酶区，前肽 区和/或靶区的蛋白质。

术语“蛋白质”包括通过肽键共价连接的一个或多个氨基酸链的 多肽，包括通过肽键共价连接的三个或多个氨基酸的寡肽和包括通过 肽键共价连接的两个或多个氨基酸的肽。

术语“蛋白酶”包括能水解蛋白质和肽中的肽键的前酶原，酶原 或成熟酶。这样的蛋白酶可以自植物，真菌，细菌或动物产生。在本 发明中使用的蛋白酶的例子是半胱氨酸蛋白酶(CP)。

术语“产物”包括蛋白质，前体蛋白和对能进行所述功能的DNA 序列反义或部分有义RNA。

本发明的DNA序列可以是基因组DNA序列，其是分离的形式并且 优选地是与它们不天然相连的DNA序列操作连接的，或者所述DNA可 以是合成的DNA或cDNA。

本发明还提供了遗传工程转化的生物体，例如植物和其部分，例 如在生物体的基因组中插入了，优选稳定插入了本发明的DNA构建体 的细胞原生质体和种子。因此，本发明提供一种生物体，其细胞可以 可逆性地被抑制在合适的发育阶段，其中该生物体包含优选地其基因 组中稳定地插入了如上定义的重组DNA构建体。由此看来，能破坏细 胞功能的蛋白质可以被去导向(即变成胞质的)或者再次导向于细胞 的特定区，例如导向于线粒体或叶绿体。然后可以通过特异性抑制该 破坏细胞功能的蛋白质的表达逆转破坏的细胞功能。

本发明的一个优点在于能破坏细胞功能的蛋白质特异性地被包 括在所述DNA构建体中的DNA序列编码的蛋白质抑制。另外，对于这 两种应用，该抑制作用发生在蛋白质水平而不是DNA水平。因此也将 抑制所有的在阻遏发生之前合成的和蓄积的细胞毒性蛋白质。

本发明还提供了一种植物，其中通过表达特异性抑制衰老的蛋白 质的蛋白来减量调节能控制衰老的蛋白质的合成。

本发明的能减缓或抑制衰老的DNA构建体的优点在于这样做其中 插入的植物的产率被提高。在我们的国际专利申请WO95/07793中公 开了调控衰老的进一步的详细说明，该专利在此引作参考。

衰老中涉及的蛋白质的抑制可以通过使用“反义”或“部分有义” 技术来控制。

根据本发明的DNA构建体可以是产生“反义”RNA的“反义”构 建体或者产生“部分有义”RNA的“部分有义”构建体(至少编码部 分功能基因产物)。

“反义RNA”是与相应的mRNA中的碱基的序列互补的RNA序列： 互补的意思是反义序列(以3’-5’意义阅读)中的各碱基(或者大多数碱 基)能与以5’-3’意义阅读的mRNA序列中相应的碱基配对(G对C,A 对U)。通过用合适的DNA构建体转化细胞可以产生这样的反义RNA 该构建体被如此安排，它产生的转录本的至少部分序列与相关基因 (或者表现出基本上与其同源的DNA序列)的至少部分编码链互补。

“部分有义RNA”是一种RNA序列，其与至少部分相应的mRNA 序列基本上同源。通过用正常取向排列的合适的DNA构建体转化可以 产生这样的部分有义RNA，该构建体可以产生具有与至少部分相关基 因(或者表现出基本上与其同源的DNA序列)的编码链相同而没有编码 功能蛋白的能力的序列的转录本。合适的部分有义构建体可以用来抑 制基因表达(如在国际专利申请WO91/08299中描述的)。

衰老中涉及的蛋白质的抑制还可以通过使用衰老过程中涉及的 蛋白酶的前肽来控制。单独超量表达一种前肽将抑制成熟蛋白酶从而 延迟衰老。也可以使用可能的其它方法。

本发明的DNA构建体可以有利地用来优化植物性能和产率。

作为改变植物中贮存蛋白含量，性质或分布的一条途径，我们建 议对植物自始至终选择性减量调节半胱氨酸蛋白酶这样的蛋白质 (Mino和Inoue,1988)。这可以通过使用“有义”或“反义”技术来 实现。因此，通过在种子，子叶，根或茎中部分有义或反义减量调节 这些蛋白酶可以获得有益效果。也曾经描述过很多其它关键的酶在贮 存蛋白转移和/或转运中起作用。使用相同的部分有义或反义策略减 量调节这些基因在本发明中对于提高植物性能也可能是有用的。

也可以通过使用待抑制的蛋白质的前体蛋白来实现这些蛋白质 的抑制。

为了防止或逆转待改变的贮存蛋白代谢，与诱导型启动子结合使 用阻抑物/操纵基因策略可以阻抑部分有义或反义的合成。或者，在 诱导型启动子的控制下，表达其序列与内源蛋白酶基因足够不同的异 源蛋白酶基因。可以避免任何部分有义或反义减量调节的发生。

种子成熟和贮存期间，种子启动子将引发例如部分有义成为半胱 氨酸蛋白酶，这样抑制蛋白质降解，因此减少贮存蛋白的损耗和收获 前抽芽的几率。

应当理解本发明的发育基因启动子的使用将所述与其可操作连 接的序列的表达限制在植物发育的合适的阶段，这也意味着不必要在 植物整个生长期中持续施用外源诱导物。这既有经济利益又有生态学 利益。

半胱氨酸蛋白酶作为包括与成熟酶融合的前肽的失活前体合 成。该前肽看起来象通过在其上折叠来抑制成熟酶。另外，单独在大 肠杆菌中表达该前肽并且分离，表现出体外抑制成熟酶(Taylor等， 1995)。因此通过在诱导型或阶段特异性启动子控制下表达前肽进行 半胱氨酸蛋白酶的抑制，导致蛋白质损失的减少。通过使用阻抑物/ 操纵基因策略减量调节所述前肽的合成或者通过表达异源蛋白酶可 能逆转该生理学作用，其中所述异源蛋白酶的序列与内源序列足以不 同以避免所述前肽的任何结合。

作为获得细胞死亡/抑制系统的另一个方法，可以表达再次导向 的半胱氨酸蛋白酶，例如导向于线粒体或叶绿体。不同细胞构成中半 胱氨酸蛋白酶的表达可以具有抑制结果。该蛋白酶可以与叶绿体或线 粒体导向序列例如来自Nicotiana plumbaginifolia的pre-B融合 (Boutry等，[1987],Nature,328,341)，从而实现这些应答细胞 器中蛋白质降解。CPs还可以再导向于胞质或内质网，与ER定位信号 融合或不融合。

既然CPs表现出与植物中细胞自溶相关(Minami和Fukuda, 1995)，一种替代方法可以来表达不具有导向序列的半胱氨酸蛋白 酶，这样来实现胞质表达。这也可以引起蛋白质降解和细胞死亡。

通过转化将本发明的DNA构建体导入植物中。用于转化植物细胞 的方法对于本发明来说不是特别关键的，可以使用对靶植物合适的任 何方法。通过从转化的细胞再生获得转基因植物。从文献得知多种转 化方法，可以提到的几种例如使用根癌土壤杆菌或者其Ti质粒农杆 菌感染，电穿孔，微注射或植物细胞和原生质体，微粒转化。已知方 法的完全详细描述可以参考文献。

其中插入本发明DNA构建体的植物物种对于本发明也不是特另关 键的。可以转化双子叶植物和单子叶植物。本发明可以应用于转化技 术是可行的或者变为可行的任何植物。因此本发明DNA构建体可以在 各种遗传工程修饰的植物中使用，包括大田农作物，例如canola，向 日葵，烟草，甜菜和棉花；谷物，例如小麦，大麦，稻，玉米和高粱； 水果，例如西红柿，芒果，桃子，苹果，梨，樱桃，香蕉和柠檬；和 蔬菜，例如胡萝卜，莴苣，卷心菜和洋葱。该启动子还适合在各种组 织中使用，包括根，叶，茎和生殖组织。

我们还分离并表征了编码新的半胱氨酸蛋白酶的核酸序列并且 这些描述于我们未结案国际专利申请No.WO97/35983中。

本发明现在参照附图通过非限制性实施例加以描述，其中：-

图1是玉米转化载体pFSE-PAT的构建的示意图。

图2是载体pFUN-β的构建的示意图。

图3是玉米转化载体pFUN-番木瓜酶(caricain)的构建的示意 图。

图4是玉米转化载体pFUN-β-番木瓜酶的构建的示意图。

图5是玉米转化载体pFUN-番木瓜酶原(procaricain)的构建 的示意图。

图6是玉米转化载体pFUN-β-番木瓜酶原的构建的示意图。

图7是玉米转化载体pFPAT-番木瓜酶，pFPAT-β-番木瓜酶， pFPAT-番木瓜酶原和pFPAT-β-番木瓜酶原的构建的示意图。

图8说明半胱氨酸蛋白酶可以抑制植物细胞再生。

实施例1-在玉米愈伤组织中超量表达CPs以证明它们作为抑制基 因的潜力

目的

该项试验的目的是要证明培养的BMS玉米细胞中去导向或再导向 蛋白酶的表达导致细胞生存力的降低，这一点根据转化后建立的转基 因愈伤组织与用不包含该抑制盒的载体转化的愈伤组织的建立相比 较来测定，从而表明胞质中或者线粒体中蛋白酶的表达抑制细胞生 长。作为一个例子，我们选择番木瓜酶(或ω蛋白酶)，一种来自Carica papaya半胱氨酸蛋白酶(EMBL:X66060)。去除前酶原的靶向序列以防 止其进入分泌途径。作为结果，该蛋白酶应该在胞质中表达为酶原 (pFPAT-番木瓜酶原)或成熟蛋白(pFPAT-番木瓜酶)。另外，该蛋白酶 再次作为酶原(pFPAT-β-番木瓜酶原)或成熟蛋白(pFPAT-β-番木瓜 酶)再次导向于叶绿体。

玉米转化载体的构建

pFPAT-番木瓜酶，pFPAT-β-番木瓜酶，pFPAT-番木瓜酶原和 pFPAT-β-番木瓜酶原是植物转化载体，其中番木瓜酶(caricain) 部分或全长eDNA的表达在与其内含子(UB-int)融合的玉米遍在蛋白 启动子(Ub-pro)和根癌土壤杆菌胭脂氨酸合酶基因的终止子的控制 下。另外，该载体包含“PAT盒”，对转化的细胞赋予对除草剂Basta 的抗性。图1-6给出了玉米转化载体pFPAT-番木瓜酶，pFPAT-β- 番木瓜酶，pFPAT-番木瓜酶原和pFPAT-β-番木瓜酶原的构建的示意 图。

从pIG-PAT剪切“PAT盒”作为AscⅠ片段并且使用克列诺聚合酶 补平。然后通过将“PAT盒”插入经SmaⅠ和HindⅢ消化(去除两个 FseⅠ位点中的一个)并且使用克列诺聚合酶补平的pFSE2载体中产生 基因玉米转化载体pFSE-PAT。可以使用单一的FseⅠ位点插入效应子 盒。

从编码自Nicotiana plumbaginifolia分离的ATP酶基因的β- 亚基的cDNA克隆获得植物线粒体导向序列(Chaumont等，1994)。通 过首先用NcoⅠ消化cDNA克隆，使用克列诺聚合酶补平反应，接着 使用BamHⅠ消化获得该导向序列。然后该序列连接到用KpnⅠ消化的 pFUN中，使用T4DNA聚合酶平端并且接着用BamHⅠ消化，产生PFUN- β(图2)。

通过对pET-WT-番木瓜酶进行PCR获得成熟番木瓜酶-编码片 段，使用正向寡核苷酸，MatCaric(5’GTTTATTAATGAAGATGGAT CCATGCTGCCCGAGAAT3’)，经修饰引入BamHⅠ位点和在该成熟序列的5’ 端的最佳翻译起始，和逆寡核苷酸MatCaric- R(5’GTTAGCAGCCGGATCCTCAATTTTTA3’)。然后使用BamHⅠ消化该PCR 片段并且连接到pFUN中，并且也用BamHⅠ消化PFUN-β载体，分别 产生PFUN-番木瓜酶(图3)和PFUN-β-番木瓜酶(图4)。

通过用NdeⅠ消化pET-WT-番木瓜酶，使用克列诺聚合酶补平反 应，接着使用BamHⅠ消化，获得编码番木瓜酶原的片段。然后该DNA 片段连接到用KpnⅠ消化的pFUN载体中，使用T4DNA聚合酶平端并且 再次用BamHⅠ消化，产生PFUN-番木瓜酶原(图5)。

另外，通过用NdeⅠ和BamHⅠ同时消化pET-WT-番木瓜酶，接 着使用克列诺聚合酶补平反应，获得编码番木瓜酶原的片段。然后该 DNA片段连接到用BamHⅠ消化的pFUN-β载体中，产生PFUN-β-番 木瓜酶原(图6)。

从pFPAT-番木瓜酶，pFPAT-β-番木瓜酶，pFPAT-番木瓜酶原 和pFPAT-β-番木瓜酶原剪切包含玉米多遍在蛋白质启动子(UBI)驱 动的番木瓜酶原或成熟番木瓜酶DNA及其内含子及后面的nos3’终止 子的FseⅠ盒。然后将该FseⅠ盒克隆到pFSE-PAT的FseⅠ位点分别产 生植物转化载体pFPAT-番木瓜酶，pFPAT-β-番木瓜酶，pFPAT-番 木瓜酶原和pFPAT-β-番木瓜酶原(图7)。

BMS玉米细胞的转化

将pFPAT-番木瓜酶，pFPAT-β-番木瓜酶，pFPAT-番木瓜酶原 和pFPAT-β-番木瓜酶原转化到玉米BMS细胞中。通过用单独包含PAT 选择盒的pFSE-PAT和pJITFSEnx共转化获得双控。载体pJITFSEnx 由GUS报道基因驱动的双倍增强的CAMV35S启动子组成并且不包括任 何PAT选择盒。该载体的组合用作负对照，因为其可能不抑制愈伤组 织形成。因为单独用pJITFSEnx转化细胞在bialophos上不再生，其 也可以用作共转化对照。使用BMS颈须转化实现的共转化频度对于下 面的试验(实施例2)是重要的并且通过计数也表达GUS(双转化)的再 生愈伤组织的比例来估计。

通过包含PAT选择盒的pBarnase，接着是CAMV35S启动子驱动 的潜在的细胞毒性核糖核酸酶基因芽孢杆菌RNA酶提供正对照。该构 建体预计大大减少转基因愈伤组织的成功建立。

所有转化实验重复三次进行并且将结果集合起来。

使用如下碳化硅纤维-介导的转化技术将该转化载体引入培养的 BMS细胞中：

碳化硅须晶的制备

无水须晶总是在通风橱中操作，以防止吸入和可能的肺损伤。这 些须晶可能是致癌的因为它们与石棉具有类似的性质。由美国 Advanced Composite Material Corporation Greer,South Carolina 提供Silar SC-9须晶。进一步如下制备无菌须晶悬浮液。大约50mg 须晶沉积到预先称重的1.5mlEppendorf试管中，其盖上盖并且再次 称重以确定须晶的重量。试管的盖子用针头穿孔并且盖上两层铝箔。 将该试管高压灭菌(121℃,15psi,20分钟)并且干燥。对每一个实 验制备新制备的须晶悬浮液，因为据报道当使用新制备的悬浮液时 DNA转化的水平比较早制备的悬浮液的DNA转化水平高。使用无菌去 离子水制备5％(重量/体积比)须晶悬浮液。将其涡流几秒钟以在使用 前立即悬浮这些须晶。

DNA转化到细胞中

所有程序在无菌条件下在空气层流通风橱中进行。使用下面的方 法将DNA转化到细胞中。本说明书中指出了对该方法的具体改进。

使用减短的Gilson吸移管尖移取细胞和须晶悬浮液。向无菌 Eppendorf试管中量取100微升新鲜的BMS培养基。向其中加入40 微升5％(w/v)须晶悬浮液和10微升(1mg/ml)质粒DNA，使用台式涡流 装置(Vortex Genie2Scientific Industries,Inc)以最大速度将其 涡流60秒钟。涡流后立即加入500微升细胞悬浮液即250微升压紧 细胞。然后盖上Eppendorf试管并且在竖立位置以最大速度将其涡流 60秒钟。使用相同的方法转化其它细胞系。

结论

如图8所示，所有蛋白酶构建物导致含有bialophos的培养基上 再生的愈伤组织的数量的减少，表明CPs可能对于细胞生长是有害 的。将CP前体导向线粒体的pFPAT-β-番木瓜酶原在实验的条件下具 有和芽孢杆菌RNA酶一样的潜力并且完全防止玉米愈伤组织生成。类 似地，将pFPAT-番木瓜酶原，pFPAT-番木瓜酶和pFPAT-β-番木 瓜酶整合到细胞基因组中导致产生的愈伤组织的数目减少，转化6星 期后，总计分别是对照的9.1％,27.3％和45.5％。

前体酶构建体比成熟酶更高的活性令人感兴趣，因为前体蛋白为 了被激活一定要失去它们的前肽。但是，对于实施例具体选择番木瓜 酶，因为其前肽非常不稳定并且认为其主要部分在自身催化反应中裂 解，即使在中性pH下也是如此(GoodenoughP W，私人通讯)。该成熟 酶构建体的较低活性可能引起折叠问题，因为认为氨基-末端前肽作 为可能使成熟酶采取正确构象的支架起作用(Taylor等，1995)。

尽管那些结果是初步的，但是它们已经经对小麦细胞悬浮液系统 进行的类似实验证实，该实验至今还不能公开。所有实验都重复进 行。

实施例2-玉米愈伤组织中半胱氨酸蛋白酶前肽的超量表达证明 它们抑制相应的成熟酶的潜力

目的

该项试验的目的是要证明培养的BMS玉米细胞中所述蛋白酶及其 相关前肽的同时表达导致与单独的该蛋白酶的表达相比提高的细胞 生存力，这一点通过转化后转基因愈伤组织的建立来测定，从而表明 植物中所述前肽的表达抑制成熟酶。

玉米转化载体pFUN-前肽和pFUN-β-前肽的构建

通过使用在新分子的两端引入BamHⅠ位点的修饰的引物通过PCR 对pET-WT-番木瓜酶原扩增编码所述前肽区的番木瓜酶cDNA的5’-端 区。用BamHⅠ消化该PCR片段并且亚克隆到也用BamHⅠ消化过的pFUN 和pFUN-β两个载体中(在多遍在蛋白内含子和nos3’终止子之间)， 分别产生pFUN-前肽和pFUN-β-前肽。

BMS玉米细胞的转化

将pFPAT-番木瓜酶和pFPAT-番木瓜酶原DNA载体分别与递增量 的pFUN-前肽DNA载体共转化到培养的BMS细胞中。类似地，将 pFPAT-β-番木瓜酶和pFPAT-β-番木瓜酶原DNA载体分别与递增量 的pFUN-β-前肽DNA载体共转化到培养的BMS细胞中。所有转化都 采用实施例1中描述的碳化硅纤维-介导的转化技术。该项实验也包 括实施例1中描述的正对照，负对照和共转化对照。

不超出本发明范围，本发明的其它修饰对于本领域技术人员来说 是显而易见的。

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Taylor M A J,Baker K C,Briggs G S,Con nerton I F, Cummings N J,Pratt K A,Revell D F,Freedman R B,Goodenough P W：来自木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶Ⅳ的重组前区是成熟木瓜酶的选 择性高亲和性抑制剂(Recombinant pro-regions from papain and papaya protease W are selective high affinity inhibitors of the mature papaya enzymes)。

蛋白质工程(Protein Engineering)8(1):59-62(1995)。

Terras R G,Torrekens S,Van Leuven F,Osborn R W, Vanderleyden J,Cammue B P A,Broekaert W F：来自Brassicaceae 物种的碱性富半胱氨酸植物抗真菌蛋白质的新家族(A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species)。

FEBS Lett 316(3):233-240(1993)。

Thomas M P,Topham C M,Kowlessur D,MellorG W,Thomas E W,Whitford D,Brocklehurst K：通过比较模型技术推导木瓜 凝乳蛋白酶M后洗脱的木瓜凝乳蛋白酶的结构和通过催化和时间依赖 性抑制剂反应的pH-依赖性动力学确定活性中心特征：Cys-25-His- 159离子对不足以在木瓜凝乳蛋白酶M和木瓜蛋白酶两者中胜任催化 作用(Structure of chymopapain M the late-eluted chymopapain deduced by comparative modelling techniques and active-centre characteristics determined by pH-dependent kinetics of catalysis and reactions with time-dependent inhibitors:The Cys-25-His-I 59 ion-pair is insufficient for eatalytic competence in both chymopapain M and papain)。

生物化学杂志(Biochemical Journal)300(3):805-820 (1994)。

Valpuesta V,Lange N E,Guerrero C,Reid M S：半胱氨 酸蛋白酶的增量调节伴随daylily(Hemerocallis)花的乙烯不应答 衰老(Up-regulation of a cysteine protease accompanies the ethylene-insensitive senescence of daylily(Hemerocallis) flowers)。

植物分子生物学(Plant Mol Biol)28(3):575-582(1995)。

Vernet T,Berti P J,De Montigny C,Musil R,Tessier D C,Men ard R,Magny M-C,Storer A C,Thomas D Y：木瓜 蛋白酶前体的处理：前区中的离子状态的保守氨基酸基元参与分子内 过程的调控(Processing of the papain precursor:the ionization state of a conserved amino acid motif within the Pro region oarticipates in the regulation of intramolecular processing)。

生物化学杂志(J Biol Chem)270(18):10838-10846(1995)。

Volkel H,Kurz U,Linder J,Klumpp S,Gnau V,Jung G and Schultz J E：组织蛋白酶L是Parameczum tefraurelia分子 内蛋白酶。其表达的前肽的纯化，测序和特异性抑制(Cathepsin L is an mtracellular protease in Parameczum tefraurelia. Purification,cloning,sequencing and specific inhibition of its expressed propeptide)。

欧洲生物化学杂志(Eur j Biochem)238:198-206(1996)。

Watanabe H,Abe K,Emori Y,Hosoyama H,Arai S：稻种 (oryzains)的多半胱氨酸蛋白酶的分子克隆和赤霉素诱导的表达 (Molecular cloning and gibberellin induced expression of multiple cysteine proteases of rice seeds(oryzains))。

生物化学杂志(J Biol Chem)266(25)16897-16902(1991)。

Wiederanders B,Broemme D,Kirschke H,Von Figura K, Schmidt B,Peters C：半胱氨酸蛋白酶克隆的系统发育保守和编码 人组织蛋白酶的cDNA的表达(Phylogenetic conservation of cysteine proteases cloning and expression of a cDNA coding for human cathepsins)。

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Yamauchi D,Akasofu H,Minamikawa T：来自Vigna mungo的 半胱氨酸内肽酶：基因结构和表达(Cysteine endopeptidase from Vigna mungo:gene structure and expression)。植物细胞生理学 (Plant Cell Physiol.)33(6):789-797(1992)。