发明领域

本发明涉及源自哺乳动物的可溶性LAIT/蛋白(CD14)及其相关蛋 白，它可以直接诱导抗生性多肽，尤其是防卫素(defensins)在哺乳 动物细胞中的，尤其是上皮细胞中的表达。本发明还涉及鉴定对于CD14 直接激活B细胞所必需的CD14部分。

抗生肽以及内毒素对抗生肽的诱导

抗生肽在自然界中广泛分布，并形成广泛的宿主防御机制 (Lehrer,R.I.et al.1993,Ann.Rev.Immunol.11:105；Boman, H.G.1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz, and M.E.Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr. Opin.Immunol,4:3)。抗生肽作为先天免疫系统的因子的优势在于它 们能无特异性、无记忆地发挥作用。它们的抗菌和抗病毒活性允许它 们在感染后短时间内，在后天免疫系统动员之前，延迟或避免微生物 的生长(Lehrer,R.I.et al.1993,Ann.Rev.Immunol.11:105； Boman,H.G.1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T. Ganz,and M.E.Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992. Curr.Opin.Immunol,4:3)。防卫素是抗生肽中最大的家族，由29 至35个氨基酸残基组成，

并在人类噬中性细胞中占细胞总蛋白的5％以上(Boman,H.G. 1995,Ann Rev.Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz,and M.E. Selsted,1991,Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr.Opin.Immunol, 4:3)在哺乳动物中已知防卫素是由肺巨噬细胞产生的(Lehrer,R.I.et al.1993,Ann.Rev.Immunol.11:105；Boman,H.G.1995,Ann Rev. Immunol,13:61；Lehrer,R.I.,T.Ganz,and M.E.Selsted,1991, Cell 64:229；Zasloff,M,1992.Curr.Opin.Immunol,4:3)，并且 最近在牛气管(Diamond,G.J.P.Ru8ssell,and C.L.Bevins.1996. PNAS 93:5156)和舌头(Schonwetter,B.S.,Stolzenberg,E.D.and M.A.Zasloff,1995,Science 267:1645)的上皮细胞中防卫素的产 生有所描述。

有人证明在原代气管上皮细胞中脂多糖形式的内毒素能诱导编码抗 生肽的信使RNA mRNA的表达提高十倍(Diamond,G.J.Russell,and C. L.Bevins 1996,PNAS93:5156)。这种被命名为气管抗生肽的多肽是属 于β-防卫素家族的。TAP从呼吸粘膜的上皮细胞诱导的机制是通过在上 皮细胞中表达的膜CD14(mCD14)。有人观察到当存在对CD14特异的单 克隆抗体时导致TAP表达的激活过程受到抑制，这与上皮细胞mCD14的 功能相一致(Diamond,G.J.Russell,and C.L.Bevins 1996, PNAS93:5156)。

有一段时间认为mCD14的表达是单核巨噬细胞的独占性标志 (Zeigler-Heitbrock,H.W.L.and R.J.Ulevitch.1993.Immunology Today 14:121)，但是现在已知它还在源自许多组织的上皮细胞中表达 (Feams,C.etal.1995,J.Exp.Med.181:857)。还发现其它组织 的上皮内层通过局部表达防卫素对内毒素或炎症产生应答。尤其是，有 人表明舌头的鳞状上皮细胞内层对感染或炎症的应答为产生β-防卫素 舌抗生肽(Schonwetter,B.S.,Stolzenberg,E.D.and M.A Zasloff, 1995.Science 267:1645)。在此研究中表明在舌头上天然损伤周围的 上皮细胞中大量存在编码舌抗生肽信使RNA(mRNA)。显然在该篇文献中 没有报道mCD14的参与。

以上描述的结果提供了一种免疫应答模型，在该模型中先天免疫应 答机制参与到感染或炎症的局部区域中，以便为宿主的最初防御作出贡 献。这样，应答于革兰氏阴性菌LPS而局部产生的抗生蛋白和抗生肽可 能在后天性免疫应答的攻击之前参与防止细菌的建群或随后的感染。下 文通过提供背景知识的方式给出了目前对单核细胞、巨噬细胞、上皮细 胞和内皮细胞中内毒素介导的应答机制的理解概要。

CD14是单核细胞中LPS:LBP复合物的膜受体

LPS形式的内毒素在体内和体外通过单核细胞/巨噬细胞诱导炎症细 胞因子(Beutler,B.et.al.Science 232:977；Michie,H.R.et al. 1988,New Engl.J.Med 318:1481；Tacey,K.J.1987,Nature 330:662； Waage,A.,Halstensen,A.and T.Espevik.1987 Lancet 1:355)。 这些源自单核细胞的细胞因子，包括TNFI,IL-1和IL-6是与脓毒性 休克综合症相关的，最终导致多发性器官衰竭。最近的工作描述了CD14 作为单核细胞LPS受体的特征，这转而导致了对LPS激活单核细胞/巨 噬细胞的机制的最初描述。

在目前的范例中涉及了组成型表达的质膜蛋白，脂多糖结合蛋白 (LBP)的参与，该蛋白和LPS形成高亲和性的复合物(Schumann,R. R.et al.1990 Science 249；1429；Wright,S.D.et al.1990 Science 249:L1431；Wright,S.D.et.al.1989.J.Exp.Med.170:1231) LBP是由肝脏产生的质膜糖蛋白，在健康成人的细胞中以5-10Tg/ml 的量组成型地存在着，并且在急性期应答后其浓度升高到20倍 (Schumann,R.R.et al.1990,Science 249:1429；Tobias,P.S. et.al.1992,Cell,Mol.Biol,7:239；Tobias,P.S.,Mathison, J.C.and R.J.Ulevistch 1988,J.Biol.Chem.263:13479；Tobias, P.S.,Soldau,K.and R.J.Ulevitch 1986,J Exp.Med 164:777； Wright,S.D.et al.1990.Science 249；1431；Wright S.D.et al,1989,J.Exp.Med,170:1231)。和LBP结合时，LPS在巨噬细 胞和单核细胞中刺激细胞因子产生的能力得以增强(Mathison,J.C., Tobias,P.S.and R.J.Ulevitch 1991,Pathobiology 59:185； Schumann,R.R.et al.1990 Science 249:1429；Wright,S.D. et al.1990.Science 249:1431；Wright,S.D.et al.1989,J. Exp.Med 170:1231)。

通过糖基磷脂酰肌醇结合的膜CD14(mCD14)(Zeigler- Heitbrock,H.W.L.and R.J.Ulevitch,1993,Immunology Today 14:121)的功能是作为LPS-LBP复合物的受体(Schumann,R.R.et al.1990,Science 249；1429；Wright,S.D.et al.1990.Science 249:1431)。CD14在单核细胞中和巨噬细胞中高水平地表达，在噬中 性细胞中较弱地表达(Ball,E.D.et al.1982.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 79:5374；Buckle,A.M.Jayaram,and N.Hogg 1990.Clin. Exp.Immunol.81:339；Ferrero,E.et al.1990.J.Immumnol. 145:331；Goyert,S.et al.1988,Science 239:497；Haziot,A.et al.1988.J.Immunol,141:547)。鼠前B细胞系70Z/3(Piage,C. J.et al.1978.J.Immunol.121:641)的mCD14的表达水平为免 疫荧光方法所不能检测到，并且通过northern印迹杂交法和RT-PGR 检测表明编码CD14的信使RNA是阴性的(Filipp,D.and M,Julius 未发表的观察；Lee,J.D.et al.1992.J.Exp.Med.175:1697) 这种细胞系已为mCD14作为LPS-LBP复合物受体的角色提供令人信服 的证据。尤其是，70Z/3细胞对LPS的应答是表达膜免疫球蛋白(mlg) (Paige,C.J.et al.1978,J.Immunol.121:641)。在mCD14-70Z/3 细胞中诱导mIg表达所需要的LPS的浓度比刺激mCD-14单核细胞产 生细胞因子所需要的浓度的数量级要大(Lee,J.D.et al.1992.J. Exp.Med.175:1697)。当用编码人CD14的cDNA转染70Z/3细胞时 表明诱导mCD+细胞克隆表达mIg所需的LPS的浓度比诱导野生型的 mCD-70Z/3亲本细胞所需要的要低10,000倍(Lee,J.D et al 1992, J.Exp.Med.175:1697)。

目前，这些结果为体内LPS介导的mCD14-白细胞激活的模型提供 了实验证据。暴露于LPS时，形成LPS-LBP复合物，这些复合物通过 和mCD14相互作用激活单核细胞/巨噬细胞。

在内毒素介导的内皮细胞和上皮细胞激活中的可溶性CD14

和参与LPS介导的mCD14+白细胞激活的可能机制相反，对参与LPS 介导的内皮细胞和上皮细胞激活机制的了解较少。直到最近内皮细胞和 上皮细胞被认为是mCD14+。尽管在这些细胞中检测不到mCD14的表达， LPS介导的激活被证明是血清依赖的，并且为CD14的特异抗体所抑制。 (Patrick,D.et al.1992,J inf.Dis 165:865；Pugin,J et al.1993. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2744；Arditi,M.et al.1993,Infect, Immun.61:3149)。这意味着CD14在内毒素介导的内皮细胞和上皮细胞 激活中起某些作用，尽管这些作用未知。

已经证明可溶的CD14(sCD14)缺少糖基磷脂酰肌醇锚着物，并存 在于健康成人的血清中(Bazil,V.et a.1986,Eur.J.Immunol. 16:1583)，参与LPS介导的内皮细胞激活(Arditi,M.et a 1993,Infect. Immun.61:L3149；Pugin,J.et al.1993.Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:2744；Frey,E.A.,et al,1992.J.Exp.Med.176；1665；Read, M.A.et al.1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9887；Haziot, A.et al.1993.J.Immunol.151:1500)和上皮细胞激活(Pugin,J. et al.1993,Proc.Natl.Acad Sci.UsA 90:2744)。激活过程的血 清依赖性被证明是由于sCD14的存在，并且对血清的需要可以为 sCD14所取代。在一些研究的LPS介导的内皮细胞激活中LBP不起作用， 这意味着sCD14自身是内皮细胞对内毒素应答的激动剂(Arditi,M.et al.1993,Infect.Immun,61:3149；Frey,E.A.,et al.1992,J. Exp Med.176:1665；Read,M.A.et al.1993,Proc.Natl.Acad Sci USA 90:9887)。在其它的研究中发现了血清在内皮细胞和上皮细胞的LPS 应答中的双重功能。具体而言，在内毒素介导的内皮细胞激活中sCD14 和LBP都是需要的(Pugin,J.et al.1993,Proc.Natl Acad.Sci. USA 90:2744；Haziot,A.et al.1993,J Immunol.151:1500)，这 在存在的内毒素浓度很低时尤其显著(Haziot,A.et al.1993.J. Immunol.151:1500)。

以上的实验结果导致了在mCD14-细胞激活中sCD-LPS复合物起作 用的假设。在高LPS浓度时这些复合物被认为是通过LPS和sCD14的 直接相互作用而产生的。在低LPS浓度时LBP被认为是首先与LPS相 互作用，该相互作用通过目前未知的方式促进了sCD14-LPS复合物的 产生。

在支持内皮细胞/水平细胞对LPS的应答的可能机制上以上结果彼 此之间可能不一致，但是它们有一个共同点，即该机制(这些机制)和 内毒素介导的mCD14-细胞所涉及的机制明显不同。两项研究都暗示着 sCD14作为激动剂发挥功能从而使得mCD14-细胞对内毒素的应答成为可 能，而不是mCD14-细胞上LPS-LBP的受体发挥作用的。然而，最近的 研究表明这可能不是事实，至少对于上皮细胞是如此。

内毒素介导的上皮细胞防卫素的诱导中的膜CD14

如上文所讨论，最近的研究表明内毒素在原代牛气管上皮细胞中诱 导了防卫素的表达(Diamond,G.J.P.Russsell,and C.L.Bevins, 1996 PNAS 93:5156)并且该表达涉及mCD14。未刺激的上皮细胞被证 明是mCD14-，但是在LPS介导的激活之后它们被诱导为mCD14+ (Diamond,G.J.P.Russell and C.L.Bevins,1996.PNAS 93:5156)。 在原代气管上皮细胞中mCD14的诱导被表明是与上皮细胞中对CD14特 异的信息的诱导相关的，这意味着其来源可能是内源性的。进而，LPS 介导的防卫素的诱导受到CD14的特异mAb的抑制(Diamond,G.J.P. Russell,and C.L.Bevins 1996 PNAS 93:5156)。

因此这表明LPS介导的上皮细胞激活的潜在机制与在mCD14-单核 细胞和巨噬细胞中观察到的类似。这两种细胞类型的LPS激活途径彼此 之间的区别仅仅是两种类型的靶细胞mCD14表达基线水平的不同。涉及 内皮细胞的类似研究尚无报道。

缺乏血清/LBP时可溶性CD14直接激活单核细胞

目前为止所描述的范例是LPS形式的内毒素通过它和细胞中mCD14 的相互作用介导了单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞的激活。反映了LBP 参与该过程的血清依赖性在除了一种情况外的所有情况中都得以证 明。

如上文所描述，在内毒素介导的内皮细胞的激活/损伤中已经涉 及了sGD14。它的功能被假设为增强LPS和细胞的相互作用(Pugin, J.et al.1993,Proc.Natl.A cad Sci.USA 90:2744)。随后的研 究表明分离自肾病病人尿液的sCD14能直接刺激人单核细胞产生炎症 细胞因子TNFI和IL-6(Sundan,A.et al.1994,Eur.J.Immunol. 24:1779)。

人单核细胞是mCD14-,LPS介导的这两种细胞因子的诱导是血清依 赖的(E spevik.T.等，1993,Eur.J.Immunol.23,255.Wright S.D 等J.Enp M ed.176:719)相反，出于这种观点，分离自尿的sCD14活 性证实是血清依赖的，不受LBP影响，亦不受LBP特异性抗体的影响 (Sandan,A.等1994,Eur.J.Immunol 24.177)而且，sCD14刺激人 单核细胞产生炎性细胞因子的能力显示出被CD14特异性mAb抑制 (Sandan,A.等Eur.J.Immund.24:1779)。

因此，sCD14似乎能和单核细胞上尚未鉴定的受体结构以不依赖于 血清的方式直接相互作用，并导致细胞因子的产生。这样内毒素和sCD14 能在单核细胞中介导类似的生物学应答。进而，同一种CD14特异mAb, 3C10(Van Voorhis,W.C.et a.,1983.J.Exp.Med.158:126)， 能同时抑制这两种方式的激活，这意味着涉及内毒素和sCD14的信号途 径至少有一部分是共有的，共有的部分可能是在受体结构水平上。CD14 特异的mAb 3C10识别CD14的N末端部分，这种识别依赖于CD14分子N 末端氨基酸7-14的存在(Juan,T.S.-C.etal.1995.J.Biol.Chem. 270:17237)。3C10抑制LPS介导的单核细胞激活的能力被认为是反映了 mCD14残基7-14是mCD14和LPS的相互作用位点(Todd.S.C.et al. 1995.J.Biol.Chem.270:17237)。与之相反，在没有LPS存在的情 况下，mAb3C10抑制sCD14对单核细胞的功能的基础仍然不清楚 (Sundan,A.et al.1994,Eur.J.Immunol.24:1779)。最简单的 解释认为在单核细胞上存在尚未描述的sCD14的受体结构，即干扰sCD14 和这样的结构之间的相互作用的mAb。

可溶性CD14以剂量依赖的方式体外抑制LPS诱导的单核细胞和嗜 中性粒细胞的激活

在1993年10月4日发表的国际专利申请No.WO93/19772中描述 了通过重组的人类可溶性CD14以剂量依赖的方式体外抑制LPS-诱导的 单核细胞和嗜中性粒细胞的激活，至少已发表文件的图1所示的数据是 这样表明的。该实验是在LPS-LBP复合物存在的情况下进行的，并且 和该复合物的结合相一致，加入CD14以降低复合物和单核细胞以及噬 中性粒细胞的膜结合CD14之间的相互作用程度。这一结果的有趣之处 在于已知sCD14自身能刺激单核细胞产生炎症细胞因子。

哺乳期相关的免疫营养(Lactation-Associated Immuno Trophic(LATI))蛋白和B细胞的激活

重组LAIT蛋白(牛CD14)的分离，生物学活性描述、分子克隆和 表达的描述参见联合申请的1996年11月18日归档的美国专利申请序 列号No.08/746,883和1997年11月18日归档的国际专利申请序列号 No.PCT/CA97/00880。

从牛和人类的初乳和乳汁中分离得到一种蛋白质，该蛋白质被命名 为哺乳期相关的免疫营养(LATI)蛋白。

使LAIT蛋白和其它细胞因子区分开的的生物学活性是它在成体动 物中支持B细胞的生长和分化，因此可能在B细胞激活的调节中起着独 特作用。在成体中诱导大多数体液反应需要在“辅助”T淋巴细胞、抗 原递呈细胞(APC)和B淋巴细胞之间的一系列细胞相互作用(Spent.J. J.1978.J Exp.Med.147:1159；Anderson.J.et al.1982.Proc. Natl.Aead.Sci.USA 77:1612；Julius,M.H.et al.1982.Proc. Natl.Acad.Sci.USA79:1989)。这些相互作用是强制性的(Sprent, J.J.1978.J.Exp.Med.147:1159；Andersson,J.et.al.1982.Proc. Natl.Acad.Sci.USA 77:1612；Julius,M.H.et.al.1982.Proc. Matl.Acad.Sci.USA 79:1989；Julius.M.H.et.al.1987.Immunol. Rev.95:914)，因此反映了特定的质膜相关分子作为先决信号的转导者 的功能。T细胞-B细胞接触的必要性反映了必需的分子相互作用，这 种相互作用是由B细胞质膜上表达的CD40，其同源的配基，gp39(或 CD40L)介导的，后者在T细胞的质膜上表达(Noelle,R.J.et.al. 1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6550；Armitage,R.J.et al. 1992,Nature 357:80)。CD40和CD40L之间的相互作用必然将诱导B 细胞生长、B细胞分化成免疫球蛋白分泌细胞，以及免疫球蛋白同种型 之间的转换(Foy,T.M.et al.1993,J.Exp.Med.178:1567)， 进而，由这些相互作用的细胞产生的一系列细胞因子在B淋巴细胞激活、 生长和分化的调节中处于中心地位(Andersson,J.et al.1982.Proc. Natl.Acad.Sci.USA 77:1612；Noelle.R.J.et.al.1983,Proc. Natl Acad.Sci.USA 80:6628；Hodgkin,P.D.1990,J.Immunol. 145:2025；Noelle,R.J.et al.1991,J.Immunol.146:1118；Parker, D.C.1980.Immunol.Rev.52:115；Howardm M.et al.1982,J.Exp. Med.155:914)这些淋巴细胞激活的可溶性介导剂在分离后并不起作用。 相反，它们彼此互相补充，各自将B淋巴细胞驱动向激活的下一阶段， 使它们可接受后续的和更进一步的激活信号(Julius,M.H.et al.1987. Immunol.Rev.95.:914)。

相反，LAIT蛋白在nM浓度的水平上是B细胞的直接分裂原，并且 作为B细胞生长的辅助激活剂，它与在pM的范国内的B细胞抗原受体 一起发挥功能。在后一情况下，这些源自抗原的信号将B细胞转化到一 种生理状态，在该状态下B细胞能接受T细胞的辅助。当考虑到处于抑 制状态的发育中的新生儿时，为新生儿持续提供直接支持B细胞生长和 分化的因子，与抗原联合施用是很重要的。

已经证明，与成体胸腺不同(Bill,J.et al.1989,J.Exp.Med. 169:1405；MacDonald,H.R.et al.1988,Nature 332:4020)，在 个体发生的早期，当胸腺有效产生T细胞时它不会有效除去那些表达潜 在自体反应受体的T淋巴细胞(Schneider,R.et al.1989.J.Exp.Med. 169:2149；Smith,H.et al.1989,Science 245；749；Ceredig,R. 1990Intl.Immunol.2:859；Ceredig,R.and C.Waltzinger,1990. Ihtl.Immunol.2:869)。同时，这些新生儿是健康的。初乳和早期乳 汁中含有了解得很清楚的T细胞功能抑制剂，尤其是TGFβ1和TGFβ2， 它们抑制T细胞的生长(Sporn,M.B.et al.1987,J.Cell.Biol. 105:1039；Massaqgue,J.1987,Cell 49:437；Wrann,M.et al.1987, EMBO J.6:1633；Stoeck,M.et al.1989.J.Immunol.143:3258)。 因此，在新生儿中，T细胞的功能似乎可能被这些细胞因子有效抑制以 允许一定的时间让胸腺功能成熟。考虑到源自母体的Ig是暂时的并且 同时其反映的特异性是母体所遇到的抗原，因此对于新生儿而言开始产 生自身保护性抗体显然是很重要的。估计LAIT蛋白的功能是T细胞的 代用品，在初次暴露于环境抗原的新生儿中它支持B细胞的生长和分化。 LAIT的这种作用因此提供了一种激活免疫系统的替代的，缩短的途径， 该途径是独立于T细胞功能的。

牛LAIT-蛋白片段的序列分析揭示了它和人类CD14具有很高的同 源性。CD14是后来利用可获得的单克隆抗体通过亲和层析从初乳中纯化 得到的，并且CD14和牛LAIT蛋白具有相同范围的活性。编码牛LAIT- 蛋白的基因克隆自牛cDNA文库，并且和人CD14在核酸水平上和在蛋白 水平上都具有很高的同源性。人和鼠重组CD14以及牛重组LAIT/CD14 的制备都是在昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统中进行的，并且每种蛋 白都含有来自初乳的牛LAIT蛋白的所有生物学活性，它们的比活和从 三种种属中分离得到的天然物质相比2倍以内。

在本发明的上下文中“抗生蛋白”或“抗生多肽”具有抗生特性： (ⅰ)不含半胱氨酸的，线性的，具有或不具有铰链的，大部分是螺旋 的肽，(cecropins)(ⅱ)高比例某些残基如脯氨酸和精氨酸，不 含半胱氨酸的线性肽；(ⅲ)具有一个二硫键的抗菌肽；(ⅳ)具有两 个或多个S-S键，主要或只有β-折叠片的肽，包括但不限于人防卫 素，HNP-1，兔防卫素NP-1，鼠防卫素NP-1，牛β-防卫素，TAP， 猪protegrin,PG-3和H-s螃蟹tachypiesin；和(ⅴ)源自较大多 肽的具有其它已知功能的抗菌肽(Boman,H.G.Ann.Rev.Immunol. 13:61)

“防卫素”是一组抗生多肽(Edwards,S.W Biochem istry and Physio logy of the Neutrophil,1994 Cam bridge University Press pp 67-70)。

“脓毒症”是指在病人被微生物侵入时在病人自身中表现出的如下 状况：温度高于38℃或低于36℃；心率高于90次每分钟；呼吸频率大 于20次每分钟或PaCO2小于32mmHg；白细胞计数大于12,00mm-3或 小于4000mm-3，或者不成熟形式大于10％；器官功能紊乱，低灌注或 低血压。低灌注或灌注异常包括但不限于乳酸酸中毒，少尿症或精神状 态急剧改变(1992,Chestl01:1644)。

在上下文中除非特定地注明，可以是牛，人或鼠的重组的 或分离自天然来源的CD14蛋白之任一种，其序列分别相应于SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

本发明提供了一种减轻脓毒症的方法。根据本发明的第一方面，有 一个步骤直接将需要治疗的哺乳动物的上皮细胞暴露于有效剂量的复合 物，该复合物含有(由这些物质组成或包含)可溶性CD14，或CD14的 刺激上皮细胞表达防卫素的多肽片段，或上述CD14或其刺激上述表达 的片段的保守替代的变体。

本发明还包括通过施用一种复合物在需要治疗的哺乳动物中增强 防卫素表达的方法，该复合物含有可溶性的CD14或CD14的增强上述 表达的多肽部分，或上述CD14或其刺激上述表达的片段的保守替代的 变体。

施用步骤包括，优选地包括，直接将上述哺乳动物的哺乳动物的上 皮细胞暴露于上述复合物。

本发明包括刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方法包 括对其施用有效剂量的一种复合物，该复合物包含可溶性CD14或CD14 刺激上述表达的一个多肽片段，或者上述CD14或其刺激该表达的片段 的保守替代变体。

根据一些方面，防卫素的表达在哺乳动物的舌头上进行。防卫素的 表达可以在肠道，尤其是，哺乳动物的小肠进行。

根据本发明的整体特征，防卫素在上皮细胞中的的表达是诱导的。

上述CD14可以具有选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或它们的保守替代变体。

在另一方面，本发明是减轻脓毒症的方法，包括对需要治疗的哺 乳动物施用有效剂量的可溶蛋白以直接将该哺乳动物的上皮细胞暴露 于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的氨基酸序列 相比至少63％是保守的，并且具有在上皮细胞中诱导防卫素表达的能 力。

替代地，上述蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的氨基酸 序列相比具有至少约68％或约71％或约73％或约78％或约83％或约93 ％的保守性。

本发明包括一种在哺乳动物中预防性地治疗脂多糖诱导的宿主炎症 反应的方法，该方法包括对哺乳动物施用有效治疗剂量的有效剂量的一 种蛋白以直接使该哺乳动物的上皮细胞暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸 序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的 氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有增强牛上皮细胞中一种或多种 防卫素的表达的能力。

本发明包括增强防卫素在需要治疗的哺乳动物中表达的方法，该方 法通过在哺乳动物中施用一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于 标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列 至少63％是保守的，并且具有增强防卫素在哺乳动物上皮细胞中表达的 能力。

本发明包括一种刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法，该方 法包括将上述细胞暴露于有效剂量的一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸 序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的 氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有刺激上皮细胞表达一种或多种 防卫素的能力。

本发明包括一种刺激防卫素沿着哺乳动物的胃肠道表达的方法， 该方法包括将上述胃肠道暴露于一种可溶性蛋白，该蛋白的氨基酸序 列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的 氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有刺激牛上皮细胞表达防卫素 的能力。

本发明包括一种刺激防卫素沿着哺乳动物的呼吸道和/或舌头，或 小肠道表达的方法，该方法包括将舌头暴露于有效剂量的一种可溶性蛋 白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5 或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少63％是保守的，并且具有刺激上皮 细胞表达防卫素的能力。

本发明包括一种诱导需要治疗的哺乳动物的上皮细胞表达防卫素 的方法，该方法包括施用有效剂量的一种蛋白，该蛋白的氨基酸序列 相对于标识为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨 基酸序列至少63％是保守的，并且具有诱导上皮细胞表达防卫素的能 力。

CD14或多肽部分或变体可以通过重组方法或化学方法得到。

在另一方面，本发明是一种制备CD14浓缩物的方法。该方法包括 提供乳腺分泌物的含有蛋白的储存溶液，从上述溶液中分离含有内源 CD14的浓缩物；确定浓缩物中CD14的浓度。

上述乳腺分泌物可以是奶、全奶或全奶的含蛋白部分，或者其可以 是初乳或初乳的含蛋白部分。

优选地，上述分泌物预先进行了处理，该处理足够温和，以保持CD14 诱导或刺激防卫素的产生和/或刺激B细胞的活性。

乳腺分泌物可以是人的或牛的。在CD14是从哺乳动物得到的情况 下，在CD14是内源的情况下(即在未进行分子遗传学操作的哺乳动物 中)，上述CD14优选地为牛的。

当溶液是液态溶液时，分离步骤可以包括从溶液中盐析蛋白。

CD14浓度的确定包括将从浓缩物得到的样品暴露于对CD14特异的 一抗以形成抗体CD14复合物，然后将复合物暴露于对第一抗体特异的 第二抗体，其中第二抗体包括报告分子。

在另一方面，本发明是获得CD14的方法，包括提供含有乳腺分泌 物蛋白的储存液，从该储存液中沉淀出含有CD14的蛋白组分并将蛋白 组分和上清分离。ELISA试验特别方便用于该实验。

另一方面，本发明是获得CD14的一种方法，包括提供含有乳腺分 泌物蛋白的贮存液，从贮存液中沉淀出含有CD14的蛋白级分，并从上 清液中分离蛋白级分。

沉淀步骤包括盐析出含CD14的蛋白组分。优选地，升高溶液的盐 浓度，以使离子强度至少达到硫酸铵饱和水溶液和一定体积的上述乳腺 分泌物(天然来源)混合时的离子强度一样高，其中上述硫酸铵溶液的 体积等于混合后溶液总体积的65％。

该方法经常包括在分离步骤中得到的CD14的量的测定。

同样，上述乳腺分泌物可以是初乳和/或乳汁，并且可以是牛的或 人的，或来自乳腺分泌物中存在CD14的其它哺乳动物。

本发明包括获得CD14的另一种方法，它包括提供含有乳腺分泌物 蛋白的储存液；从上述储存液中分离出含有蛋白质的组分，当硫酸铵饱 和水溶液和一定体积的上述乳腺分泌物混合时上述蛋白在乳腺分泌物中 不溶，硫酸铵溶液的体积等于混合溶液总体积的65％。优选地，该方法 包括测定分离步骤得到的CD14的量的步骤。

根据本发明的方法得到的内源CD14蛋白处于适当的可溶形式时可 被直接用于激活B细胞。类似地，它们可被用于生产用于这种用途的药 物。

根据另一方面，本发明是一种检测含有乳腺分泌物蛋白的组合物中 是否存在CD14的方法。该方法包括将该组合物暴露于对CD14特异的抗 体；根据在暴露步骤中是否形成CD14-抗体复合物判定样品中是否存在 分泌物的内源CD14。

上述分泌物可以进行也可以不进行预先处理，但如果进行预先处 理，那么预处理步骤足够温和以允许其保持CD14诱导或刺激防卫素的 产生和/或刺激B细胞的活力。

同样，优选地，该方法包括确定样品中CD14的浓度。

在另一方面，本发明是在哺乳动物中防止、减轻或治疗脓毒症的方 法，包括对哺乳动物施用从哺乳动物乳腺分泌物中获得的有效剂量的 CD14。

优选地，CD14是根据此处描述的方法之一从乳腺分泌物获得的。

CD14可以是包含在液体中，该液体可以包含富含CD14的乳汁的组 分。CD14可以包含于可食用的产品中，如食物条(例如，巧克力条或蛋 白条)。

在另一方面，本发明包括在含有乳腺分泌物蛋白的组合物中确定内 源CD14的量的方法，即，在CD14产生的意义上未进行分子遗传学操作 的动物中。该方法包括提供组合物；将该组合物的样品暴露于对CD14 特异的抗体并根据暴露步骤中CD14-抗体复合物形成的量确定样品中分 泌物内源CD14的量。

本发明包括确定源自乳腺分泌物的产物是否适用于在哺乳动物中诱 导或刺激防卫素的产生的方法，该方法包括这些步骤：

提供该产物的样品；并

确定样品中存在的CD14的量。

因此在确定产品的量时本发明的这一方面可被用作预备步骤，当上 述产品将被加入到药物或食品等等中，或者将根据本发明的方法被使 用，或者将被其它已知可溶性CD14有用的方法使用。

因此，如果分泌物已经预先进行处理，并且处理步骤足够温和以允 许保留CD14的诱导或刺激上述防卫素的产生的活性，那将是优选的。

类似地，本发明包括确定源自乳腺分泌物的产物是否适用于哺乳动 物刺激B细胞的生长的方法，该方法包括这些步骤：

提供产物的样品

确定样品中存在的内源CD14的量。

在一个优选的方面，抗体被用于确定步骤，更优选地，该抗体是mAb 3C10和或识别的氨基酸序列和3C10相同的mAb。

本发明包括使用此处描述的复合物制备用于减轻脓毒症的药物，以 及用于增强哺乳动物中防卫素的表达的药物等等。

本发明的另一方面包括在需要治疗的哺乳动物中增强防卫素的表达 的方法，该方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的重组多肽 CD14，该CD14由非天然存在的重组DNA分子编码，该DNA分子含有选 自以下一组的第一DNA序列：

(a)根据SEQ ID NO:2编码CD14的cDNA序列

(b)和(a)的非编码链特异性地杂交的cDNA序列，并且它编码 表达的多肽也能为特异性的识别人类CD14的抗体所特异性地识别；以 及

(c)编码的多肽和(a)或(b)的DNA序列所编码的多肽相同的 DNA序列。

其中(b)或(c)的多肽增强上述表达。

本发明的另一方面为刺激上皮细胞表达一种或多种防卫素的方法， 该方法包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的重组多肽CD14，该 CD14由非天然存在的重组DNA分子编码，该DNA分子含有选自以下一组 的第一DNA序列：

(a)根据SEQ ID NO:2编码CD14的cDNA序列

(b)和(a)的非编码链特异性地杂交的cDNA序列，并且它编码 表达的多肽也能为特异性的识别人类CD14的抗体所特异性地识别；以 及

(c)编码的多肽和(a)或(b)的DNA序列所编码的多肽相同的 DNA序列。

其中(b)或(c)的多肽增强上述表达。

优选地，特异性杂交是在严紧的条件下进行的。

“严紧杂交条件”的意思为本领域技术熟练人员所指的常用意思。 促使核酸杂交的适当条件包括，例如，技术熟练人员所知的6×氯化 钠/柠檬酸钠(SSC),45℃。以下例子来自Current Protocol in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1989),6.3.1-6.3.6：配 制50ml适当的第一杂交溶液，将24ml甲酰胺，12ml去离子水，10ml 50％硫酸右旋糖苷，0.5ml 10％SDS混合。适当的第二杂交溶液可以是 1％结晶BSA(组分V),1mM EDTA,0.5M Na2HPO4 pH7.2,7％SDS。 洗涤步骤的盐浓度可选自从严紧性的洗涤，约为2×SSS,50℃，到高 严紧性的洗涤，0.2×SSC,50℃。这两种洗涤溶液都可以含有0.1％SDS。 此外，洗涤步骤的温度可以从室温的低严紧性条件，约22℃，升高到 高严紧性条件，约65℃。引用的参考文献给出更详细的细节，但是， 适当的洗涤严紧性依赖于同源性的程度和探针的长度。如果同源性是 100％，可以使用高温(65℃到75℃)。如果同源性低，必须使用较低 的洗涤温度。然而，如果探针很短，(＜100b0)，尽管同源性是100％ 也必须使用低温。通常来说，洗涤在低温开始(37℃到40℃)，以3- 5℃的间隔逐步升高，直至背景足够低，不至于在放射自显影中成为主 要影响因素。

优选地，这样的多肽也能为特异性地识别人CD14的抗体，如mAb 3C10，所识别。

本发明的方法包括根据具体情况将气管上皮的局部，哺乳动物的外 表皮，尤其是伤口，直接暴露于上述多肽或蛋白。

本发明的方法还包括用于对人皮肤伤口直接局部施用以减轻感染， 尤其是细菌感染，的药膏的制备，该方法包括在药膏中掺入一定有效剂 量的浓缩物或本发明的其它具有CD14防卫素诱导活性的复合物。

类似地，加入了牛奶产物的组分的婴儿制剂，牛奶或其它液体也是 本发明的一部分，其中上述组分含有的CD14的浓度比天然存在的未分 离的牛奶产品的浓度高，其中牛奶产品未经能使CD14变性以至于CD14 丧失其合乎需要活性的过程的处理。

本发明的组合物可被用于需要抵抗微生物病原体的哺乳动物，其中 病原体选自病毒、细菌、真菌和酵母，尤其是当哺乳动物为患有免疫缺 陷的人类时。

诱导的防卫素包括RtNP1,RtNP2,RtNP3,RtNP4,HNP1,HNP2, HNP3,HNP3，以及它们的任何组合方式，或HNP1,HNP2和HNP3以及 它们的任何组合方式。

优选地，本发明的蛋白或多肽根据具体情况以250μg至2500μg每 千克哺乳动物的体重每天的剂量施用，或者以300μg至3000μg每千克 哺乳动物的体重每天的剂量施用。

在另一方面，本发明是用可溶性多肽直接激活B细胞的方法，上述 多肽的氨基酸序列选自leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser；leu- leu-leu-leu-leu-leu-pro-leu；和leu-leu-leu-leu-leu-leu- val-his，并且能被单克隆抗体3C10所识别和能激活B细胞。

在这样的方法中，优选地，氨基酸组成的序列选自SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或者它们能激活B细胞的保守替代 变体，或其能激活B细胞的片段或片段的能激活B细胞的保守替代变 体。

本发明包括在基因组中引入一种核酸序列的转基因哺乳动物，该核 酸序列编码具有标识为SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7 的氨基酸序列的多肽，或编码上述多肽的能直接激活B细胞的片段；或 上述多肽能直接激活B细胞的变体；或上述多肽的保守替代变体；或上 述片段或其变体的能直接激活B细胞的缀合物，其中上述核酸序列是在 哺乳动物内源CD14启动子的控制之下，并且该核酸序列是在哺乳动物 的天然存在的核酸序列之外的。

供选地，该核酸序列编码氨基酸序列被标识为SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，或上述多肽的能直接激活B细胞的片 段，或该多肽的保守替代变体，更为优选地，编码氨基酸序列被标识为 SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，或上述多肽的 保守替代变体，或进而更为优选地，编码氨基酸序列被标识为SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，最为优选地，核酸序列具 有被标识为SEQ NO NO:1或SEQ ID NO:2的序列。

优选地，转基因小鼠的基因组中引入了编码一种蛋白的核酸序列， 该蛋白能通过一种可溶性多肽直接激活B细胞，该多肽的序列选自leu- leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser；leu-leu-leu-leu-leu-leu- pro-leu；和leu-leu-leu-leu-leu-leu-val-his，并且能被单 克隆抗体3C10所识别和能激活B细胞。

替代地，可在转基因小鼠的基因组中引入编码本发明的其它蛋白的 核酸序列。该核酸序列可以是外源序列。

在另一方面本发明是在基因组中引入了被标识为SEQ ID NO:8的 核酸序列的转基因哺乳动物，其中核酸序列是哺乳动物的天然DNA的核 酸序列之外的。SEQ ID NO:8包括编码序列(参见SEQ ID NO:1)和 非编码部分，在产生只含有编码碱基的mRNA时非编码部分被切除。优 选地，核酸序列通过重组技术被引入到哺乳动物或哺乳动物的祖代。优 选地，该哺乳动物是牛。

附图简述

图1A示明CD14的特异抗体3C10和MEM-18对天然人类LAIT(Hu- LAIT,nhCD14)介导的B细胞激活的差异抑制(ToddS,-C,Juan.et al. 1995,J.Biol.Chem.270:5219)。往96孔平底培养板(Costar)的0.2ml 无血清培养基中分别加入注明浓度的mAbs3C10(——),MEM-18(---) 或它们的同型非特异性抗体12CA5(IgG2b)(-)(J.Field,et al. 1988,Mol.Cell.Biol.8:2159)和W 325(IgG1)(-----)(A.F. Williams 1977,Cell 12:663)，培养基中分别含有1Tg/ml天然(n) Hu-LAIT(■)或5Tg/mILPS(●)。37℃温育5小时后往每个培养孔 孔中加入按照先前描述的方法(Ratcliffe,M.J.et al.1983.J. Immunol.131:581)分离得到的1.5×105高浮力密度小鼠脾脏B细胞。 培养40小时后用1TCi3H-TdR脉冲标记，6小时候在滤垫上收集细胞， 胸腺嘧啶的吸收用闪烁分光法测量。结果用没有任何mAb时两种刺激中 分别引起的应答的百分比表示。没有刺激时的背景应答大约在0.7到1.7 ×103cpm；没有mAb时对5Tg/ml LPS和1Tg/ml nHu-LATI的应答分别为 77.8×103cpm和82.3×103cpm。偏差条表示三次培养平均值的一个标 准偏差。

图1B示明CD14特异抗体3C10对重组(r)Hu-和rBo-LAIT介导的 B细胞激活的抑制。往96孔平底培养板(Costar)的0.2ml无血清培养 基中分别加入注明浓度的mAbs 3C10或IgG2b同型非特异性抗体，mAb OX40(Paterson,D.J.et al.1987,Mol.Immunol.24:12)培养基 中分别含有15Tg/ml可溶性重组人类CD14(rHu-LAIT)(●),2Tg/ml 可溶性重组牛CD14(rBo-LAIT)(↑)或5Tg/ml LPS(Σ)。37℃温育5 小时后往每个培养孔中加入按照先前描述的方法(Ratcliffe,M.J.et al.1983.J.Immunol.131:581)分离得到的1.5×105高浮力密度 小鼠脾脏B细胞。培养40小时后用1TCi3H-TdR脉冲标记，6小时候 在滤垫上收集细胞，胸腺嘧啶的吸收用闪烁分光法测量。结果用没有任 何mAb时三种刺激中分别引起的应答的百分比表示。没有刺激时的背景 应答大约在0.7到1.7×103cpm；没有mAb3C10时对5Tg/mlLPS,15Tg/ml rHu-LATI和2Tg/ml rBo-LAIT的应答分别为77.8×103cpm,10.9×103 cpm和82.3×103cpm。重复培养之间的标准偏差＜10％。在所有的测试 浓度，OX40介导的抑制都小于15％。

图2A和图2B示明在鼠前B细胞系，70Z/3，中LPS和rBo-LAIT诱 导膜IgP(mIgP)表达的比较分析。在平底96孔培养板(Costar)0.1ml 无血清培养基中加入8×10470Z/3细胞，并在无刺激，或者注明浓度的 rBO-LAIT(↑)，源自S.typh in urium(Sigma)的LPS(·)，或源自E.coli 突变体D31m4的LPS粗制品(●)存在的条件下培养20小时(Kirkland, T.N.,Qureshi,N.and K.Takayam a 1991.Inf.and Imm.59:131)。 收集细胞并荧光素交联的对小鼠IgP特异的mAb187.1(F187.1)标记。 mIgP+的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。上方图 2A的三个频率分布图示明在无刺激(左)，3Tg/ml S.typh in urium LPS (中)和0.1Tg/ml rBo-LAIT(右)存在的情况下37℃培养20小时后 mIgP-70Z/3细胞的比率。图2B显示注明浓度的三种刺激所诱导的 mIgP+70Z/3细胞的百分比。

图3A示明mAb3C10对rBo-LAIT介导的mIgP+70Z/3细胞的诱导。 在0.1ml无刺激物(■)，或者含有3Tg/ml源自S.typhinurium(Sigma) 的LPS(·)或0.1Tg/ml rBO-LAIT(●)无血清培养基中加入注明浓 度的3C10，将混合物加入到平底96孔培养板(Costar)并在37℃培养 2小时。在此预温育阶段后往每个培养孔中加入8×10470Z/3细胞，然 后在37℃培养20小时，此后收集细胞并用F187.1标记。mIgP+的细胞 的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。示明的是对照应答 ％，即，分别在rBo-LAIT和LPS诱导时在所示浓度的mAb 3C10存在时 观察到的mIgP+70Z/3细胞比率除以无mAb 3C10时观察到的mIgP+70Z/3 细胞比率。当mAb 3C10用于两种刺激之一时，在其任一浓度下同一种 型非特异性mAb OX40不介导大于15％抑制。

图3B显示CD14特异性mAb对rHu-LAIT介导的mIgP+70Z/3细胞 的诱导的抑制。在含有0.75Tg/ml nHu-LAIT的0.1ml无血清培养基中 加入注明浓度的mAb 3C10(●),MEM-18(■)或它们相应的同型非特异 mAb,12cA5(·)和W3/25(↑)。37℃温育2小时后往每个培养孔加入8 ×104 70Z/3细胞，然后在37℃温育20小时，随后收集细胞并用F187.1 标记。mIgP+的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。 示明的是对照应答％，即，在所示浓度的mAb 3C10存在时观察到的 mIgP+70Z/3细胞比率除以无mAb 3C10并存在0.75Tg/ml nHu-LAIT时 观察到的mIgP+70Z/3细胞比率。

图4A到图4C示明nBo-LAIT或者源自Rhodopseudomonas shpaeroides(球状红色假单胞菌)(RSDPLA)的LPS，二磷酰基磷脂A 在70Z/3细胞中对mIgP+的诱导效应。在96孔板(Costar)的0.1ml含 10Tg/ml RSDPLA的无血清培养基中37℃培养8×104 70Z/3细胞2小时。 在此预温育阶段后往加入注明浓度的ReLPS(↑，图4A)，或天然Bo- LAIT(·，图4B)，然后在37℃培养20小时，此后收集细胞并用F187.1 标记。mIgP+的细胞的比例用B-D FACSan5通过流式细胞的方法检测。 进行两组实验作为对照以比较每种此举得到的结果。往用RSDPLA进行 过类似的预处理的细胞中加入注明浓度的RSDPLA(▲)。往进行过类似 的预处理但不含RSDPLA的细胞中加入注明浓度的ReLPS(■，图4A)。 往进行过类似的预处理但不含RSDPLA的细胞中加入nBo-LAIT(●，图 4B)。在图4C中平行测定的96孔平底板的0.1ml培养基中接种8×104 70Z/3细胞并在37℃温育2小时。在此预温育阶段后往往培养物中加入 无刺激物(▲),5Tg/ml LPS(●)，或0.3Tg/ml nBo-LAIT(■)如图 4C所示20小时后后收集一个培养板的细胞并用藻红蛋白交联的羊抗鼠 IgP特异抗体(Southern Biotechnology)标记。mIgP+细胞的比率用 B-D FACSan5检测。示明的是对照应答％，即，在所示浓度的RSDPLA 存在时观察到的mIgP+细胞比率除以无RSDPLA但存在所示刺激物时观察 到的mIgP+细胞比率(左手纵坐标)。加入刺激物14小时后，第二块板 用1TCi的3H-TdR脉冲标记，6小时后用滤纸垫收集细胞，胸腺嘧啶的 吸收用液体闪烁分光法测定(右手纵坐标)。

图5A是nHu-LAIT/CD14的简图。画出的两个区域是mAb 3C10所识 别的表位(氨基酸7到14)和MEM18识别的表位(氨基酸57道65)。 图5B是RSDPLA抑制Hu-LAIT介导的70Z/3分化的可能机制的示意图。 RSDPLA可能与Hu-LAIT蛋白的LPS结合位点相互作用，或者RSDPLA可 能与70Z/3细胞上假设的LAIT受体相互作用。LPS和LAIT介导的细 胞激活的一些因素可能是共有的。图中还示出了MEM-18，根据一种可 能的作用方式它可能阻断nHu-LAIT和RSDPLA的相互作用。图5C示明 了在RSDPLA存在的条件下各种浓度的mAb MEM18对nHu-LAIT诱导 mIgP+70Z/3细胞的抑制作用。8×104 70Z/3细胞在0.1ml含30Tg/ml RSDPLA的无血清培养基中37℃培养2小时。往上述培养物中加入已经 与注明浓度的mAb MEM-18预温育2小时的0.75Tg/ml的nHu-LAIT。37 ℃进一步培养20小时后收集细胞并用藻红蛋白交联的羊抗鼠IgP特异 抗体(Southern Biotechnology)标记。mIgP+细胞的比率用B-D FACSan5 检测。示明的是对照应答％，即，在所示浓度的RSDPLA存在时观察到 的mIgP+细胞比率除以无RSDPLA但存在0.75Tg/ml nHu-LAIT时观察到 的mIgP+细胞比率(90％)

图6A示明在分娩后图中所注明的时间从9个受试者取得的成对乳 汁和血清样品的nHu-LAIT/sCD14的定量。sCD14的定量用的是可由商 业途径获得的ELISA试剂盒(IBL,Hamburg)。得到的结果用sCD14/乳 汁(空心)和血清(实心)中总蛋白的比率来表示。每种形状的符号代 表不同的受试者。总蛋白用比色检测系统测定(BioRad)。

图6B示明热变性nBo-LAIT的B细胞生长促进活性。按照先前描述 的方法(Ratcliffe,M.J.H.and Julius,M.H.1983,J.Immunol 131:581)从常规小鼠C57B1/6制备了1.5×105高浮力密度小鼠脾脏B 细胞，并且在所示浓度的刺激物存在的条件下在0.2ml无血清培养基中 培养。所示浓度的nBo-LAIT是通过稀释10×溶液得到的，上述10×溶 液已经在Perkin Elmer GeneAmp PCR系统9600上99.9℃处理10分 钟，或者未经处理。处理后样品在冰上冷却5分钟，然后加入到含B细 胞的培养物中。40小时时培养物用1TCi3H-TdR脉冲标记，6小时后收 集，胸腺嘧啶的吸收用液体闪烁分光法测定。

图7A到图7C示明联合使用连续盐析和排阻层析部分纯化的具有生 物学活性的nBo-LAIT/CD14。按照文中所描述制备牛奶乳清和进行盐析。 图7A中所示的是澄清乳清(CM)，亲和层析纯化的nBo-LAIT(nBo)以 及各种进行测试的(NH4)2SO4级分的特异性免疫印迹。免疫印迹按照下文 图7D的描述进行。图7B是用10％的SDS-PAGE和随后的银染图7A中 描述的各个级分的蛋白。nBo-LAIT比率最高的62％(NH4)2SO4级分用TN 缓冲液(10mM Tris pH8.0,150mM NaCl)平衡的Superdexcl-75排阻 层析FPLC柱(Parmacia)进行分子筛分离。用TN缓冲液洗脱蛋白，流 速0.4ml/min，在40分钟内收集体积为0.2ml的级分，用OD280nm检测 器监测蛋白的洗脱图。利用图7D中描述的免疫印迹就nBo-LAIT/CD14 检测每个级分。免疫印迹表明这一分离方法中级分47到49含有最高浓 度的nBo-LAIT/sCD14。图7C示明亲和纯化的nBo-LAIT/sCD14(nBo- LAIT)在前B细胞系70Z/3中诱导mIgP表达的比较分析。用作分子筛 层析的起始材料的62％(NH4)2SO4级分(·)；根据免疫印迹测量含有峰尖 含量的nBo-LAIT/sCD14的分离自Superdex-75的级分47(■)48(▲) 和49(●)。在存在注明浓度的各种刺激物存在的情况下，在96孔细胞 培养板(Costar)的0.1ml无血清培养基中培养8×10470Z/3细胞20 小时。收集细胞并用藻红蛋白交联的羊抗鼠IgP特异抗体(Southern Biotechnology)标记。mIgP+细胞的比率用B-D FACSan5通过流式细 胞法检测。

图7D示明纯化自牛初乳和牛奶的nBO-LAIT的B细胞刺激活性的比 较。如图7A中所描述，通过提高(NH4)2SO4浓度对澄清的初乳乳清和牛 奶乳清进行连续盐析。62％(NH4)2SO4级分溶解和脱盐后用交联到 Sephadex 4B上的mAb 3C10亲和层析sCD14。见初乳(·)和牛奶(●) 亲和层析得到材料以所注明的浓度加入到含有1.5×105按照先前描述的 方法分离得到的高浮力密度脾脏B细胞的0.2ml无血清培养基中。在40 小时用1TCi3H-TdR脉冲标记培养物，6小时后用滤垫收集细胞，胸腺嘧 啶的吸收用闪烁分光法测量。图7D中的插图代表牛奶(M)和初乳(C) 的牛sCD14。用10％SDS-PAGE分辨250ng蛋白然后将蛋白转移到PVDF 膜上。接着用5％脱脂牛奶封闭1小时，蛋白用兔抗牛CDl4多克隆抗体 以及马辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgG(BioRad)显示。信号用ECI检 测(Amersham)。

图8A示明用于检测对牛气管抗生多肽(TAP)特异的mRNA的寡聚 核苷酸探针的序列。图8B示明用于检测对对牛微管蛋白特异的mRNA的 寡聚核苷酸探针的序列，用作负载对照。

图9A示明利用LPS，源自牛(nBo-LAIT)和人(nHu-LAIT)的天 然LAIT，以及利用源自哺乳动物表达系统(rBo-C127)或杆状病毒表 达系统(rBo-Sf9)的重组LAIT蛋白在原代气管上皮细胞中诱导气管抗 生多肽(TAP)mRNA的表达。牛气管上皮细胞原代培养物的制备按照先 前发表的方法进行(Diamond,G.et al.1996,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:5156)。在1ml含有注明浓度的各种刺激物的无血清培养基中培 养5×105气管上皮细胞。37℃培养16小时后用Trizol方法(Gibco) 从各种培养物中分离总RNA，并且将20TgRNA上样到1.2％甲醛/琼脂糖 凝胶上。然后用真空印迹仪(Vaccum blotter,Pharmacia),10×SSC 将分离后的RNA转移到尼龙膜上(GeneScreen,Dupont)，并根据制造 商的建议进行紫外交联。1∶1混合5’-端标记的TAP寡聚探针(参见图8A 和图8B)并且与在50％(体积/体积)甲酰胺/6×标准柠檬酸盐溶液(SSC) /5×Denharts/0.5％SDS/10％(wt/vol)硫酸右旋葡萄糖苷/100g/ml 鲑鱼精DNA在42℃中固定的RNA杂交16到20小时然后用2×SSC, 0.1％SDS 65℃洗涤30min。通过测量每条泳道的牛微管蛋白的量使上样 归一化。用高严紧性洗涤条件进行与牛微管蛋白特异性寡聚探针杂交， 上述高严紧性条件为0.1×SSC,1％SDS,65℃2小时。利用Posphorlmage (Molecular Dynamics)通过测量上样的对照探针的信号强度得到的相 对RNA含量使得TAP的信号强度归一化。

图9B示明在原代气管上皮细胞中LPS和nBo-LAIT/sCD14诱导气管 抗生多肽(TAP)mRNA表达的时间过程。原代气管上皮细胞的制备根据 图9A。所有的平行培养物都含有1Tg/ml LPS或1Tg/ml nBo-LAIT/sCD14。 在注明的时间点分离总RNA，在琼脂糖凝胶上分辨，并首先用TAP特异 性寡聚探针探测，然后用微管蛋白特异性寡聚探针探测，如图9A所描 述。TAP信号强度归一化为利用Posphorlmage(Molecular Dynamics) 测量上样的对照探针的信号强度得到的相对RNA含量。

优选实施方案的描述

下文所描述的实验显示了在无血清的培养基中，在重组形式的牛 和人LAIT蛋白/sCD14的诱导下，分离自小鼠脾脏的高浮力密度B细 胞进入并且通过细胞循环。在实验中还表明对人CD14的N末端残基7 -14特异的mAb 3C10，而不是对残基57-65特异的mAb MEM-18， 能特异性地抑制重组和天然的牛和人LAIT蛋白/sCD14对B细胞的生 长促进活性。

还证实了在不含血清的合成培养基中，重组牛和人LAIT-蛋白 /sCD14体外诱导mCD14-,mIg-鼠pre-B细胞系70Z/3向mIg+状态的 分化。

还表明该过程被mAb 3C10，而不是mAb MEM-18抑制。

实验还表明LPS和重组牛LAIT-蛋白/sCD14诱导的鼠前-B细胞 系70Z/3向mIg+的转化受到源自Rhodopseudomonas sphaeroides(RSDPLA)的二磷酰基脂A的抑制。

实验还表明人类受试者的初乳中含有的天然人类LAIT蛋白/sCD14 的浓度比起分娩后同一时间同一受试者的血清样品含有的浓度要高100 到400倍。初乳和乳汁中人LAIT蛋白/sCD14纤对血清的浓度升高能持 续到分娩后400天。

实验表明直到分娩后200天，从乳汁中观察到的天然牛LAIT蛋白 /sCD14的活性和在牛初乳中观察到的活性是可比的。实验表明源自牛乳 汁的LAIT/sCD14蛋白能诱导源自小鼠的高浮力密度脾脏B细胞进入和 进行细胞循环，在不含血清的合成培养基的体外实验中，其比活和在源 自初乳的天然LAIT蛋白/sCD14是可比的。

实验表明亲和纯化的nBo-LAIT的B细胞生长促进活性在99℃沸腾 10分钟后显著降低。

实验表明按照下文详细描述的方法用(NH4)2SO4从澄清牛乳清中连续 盐析蛋白能在62％(NH4)2SO4级分中富集天然牛LAIT蛋白/sCD14。这种 从牛乳清得到的62％(NH4)2SO4级分能在体外刺激mCD14-,mIg-鼠前B细 胞系70Z/3向mIg+转化。

牛乳清62％(NH4)2SO4级分蛋白的分子筛层析能得到的富含生物活 性天然牛LAIT蛋白/sCD14的级分。这些富含级分在体外刺激mCD14-, mIg-鼠前B细胞系70Z/3向mIg+转化的特异性活性比牛乳汁62％ (NH4)2SO4级分的活性要高到约100倍。

实验表明LPS，天然形式的牛和人LAIT蛋白/sCD14以及在哺乳动 物和杆状病毒表达系统中产生的重组形式的牛LAIT蛋白/sCD14分别都 能在原代气管上皮细胞中诱导气管抗生多肽(TAP)的表达。

实验

LAIT蛋白/sCD14介导的B细胞激活受到MAb 3C10的抑制

CD14特异性抗体，3C10和MEM18抑制LPS-LBP复合物介导的单 核细胞激活以及抑制它们随后产生炎症细胞因子。进而，mAb 3C10能 抑制sCD14介导的单核细胞激活。后一结果与单核细胞上存在sCD14 受体是一致的，并且sCD14和这些假设的受体的相互作用位点和单核 细胞上mCD14和LPS-LBP复合物相互作用的位点相同或非常相近。由 于单核细胞上mCD14-,3C10介导的对sCD14功能的抑制可能是由于它 与sCD14的相互作用，或者在目的单核细胞上表达mCD14，或者两者 都有。

图1A中的结果表明了CD14特异性mAb抑制天然人LAIT蛋白/sCD14 介导的B细胞激活的能力的差异。mAb 3C10，而不是mAb MEM-18，也不 是它们相应的同型对照mAb，能抑制LAIT蛋白诱导的B细胞生长，而没 有mAb能抑制LPS诱导的B细胞生长。图1B中的结果表明CD14特异mAb 能抑制rBo-LAIT/sCD14和rHu-LAIT/sCD14介导的鼠B细胞的生长，而 不影响LPS诱导的B细胞生长。

由于B细胞的mCD14的表达还不确定，这些结果并不能区分mAb 3C10 对sCD14介导的B细胞激活的抑制的潜在机制。进而，此实验中用作靶 细胞的高浮力密度鼠B细胞的纯度大约在88％到95％之间，污染的细 胞是mCD14+。特别是，已经证明这些B细胞群含有编码CD14的mRNA(PCT 申请No.PCT/C97/00880)。为澄清LAIT/sCD14介导B细胞激活的机制， 进行了两个实验。

通过荧光激活细胞分类，使基于其mIgP表达而分离的B细胞纯 度大于90％。Morthern印迹分析表明，这群B细胞对于限制性CD14 特异的mRNA是阴性的。随后证明，这一“CD14”B细胞群对于源自初 乳的天然Bo-LAIT/sCD14的应答和未经此技术纯化的一样强(PCT申 请N o.PCT/CA97/00880)。用于确定mCD14是否参与LAIT蛋白介导的 B细胞激活的方法需要测定其诱导CD14-前B细胞系，70Z/3分化的能 力。

LAIT/sCD14诱导的mCD14-前B细胞系的分化

免疫荧光方法不能检测出膜免疫球蛋白阴性(mIg-)的鼠前B细胞 系70Z/3(Paige,C.J.et al.1978.J.Immunol..121:641)，的mCD14 表达，并且Northen杂交和PR-PCR分析都表明其编码CD14的mRNA为 阴性(Filipp,D.andM.Julius未发表的数据；Lee.J.D.et al.J. Exp.Med.175:1697)。用LPS或IFN-K刺激时70Z/被诱导到mIgP+ 状态(Paige,C.J.et.al 1978.J.Immunol.121:641)。图2中 的结果表明rBo-LAIT/sCD14诱导70Z/3向mIgP+的分化和LPS一样有 效。该结果表明在70Z/3细胞上有rBo-LAIT的受体，进而，该受体不 是mCD14。该方法因此提供了一种检测mAb 3C10介导的LAIT/sCD14生 物活性抑制的mCD14依赖性的手段。

LAIT/sCD14诱导的70Z/3分化受到mAb 3C10的抑制

图3A中的结果表明3C10抑制LAIT/sCD14诱导的mIgP在70Z/3上 的表达。LPS介导的mIgP诱导不受mAb 3C10的抑制，表明该抑制是对 LAIT/sCD14特异的，进而表明了mAb 3C10介导的抑制的潜在机制并不 需要其与70Z/3的直接相互作用。

图3B中的结果表明不是所有的CD14特异抗体都抑制LAIT蛋白 /sCD14介导的70Z/3向mIgP+状态的分化。特别是，mAb 3C10，而不是 同样对CD14特异的mAb MEM-18，也不是它们相应的同型对照抗体，能 抑制重组人LAIT蛋白/sCD14介导的70Z/3向mIgP+状态的分化。这些 结果表明mAb3C10和LAIT/sCD14相互作用并掩盖LAIT/sCD14和70Z/3 细胞上表达的假设的LAIT/sCD14受体相互作用的决定簇。

内毒素和LAIT蛋白/sCD14共有信号途径

如在背景部分所讨论，许多模型被提出以解释LPS诱导单核细胞激 活以及它们随后产生炎症前细胞因子的机制。作为内毒素可能受体的 mCD14在假设的机制中处于中心地位。虽然mCD14的表达降低了诱导细 胞激活所需要的LPS浓度的数量级，但它并不能决定LPS介导的激活。 特别是，诱导mCD14-70Z/3细胞表达mIgP所需要的LPS浓度比刺激 mCD14-单核细胞表达细胞因子所需要的浓度要高很多(Lee,J.D.et al. 1992.J.Exp.Med.175,1697)。进而，当用编码人mCD14的cDNA 转染70Z/3细胞时诱导mCD14-克隆表达mIg所需要的LPS的浓度比诱 导野生型mCD14-的亲本70Z/3细胞系所需要的浓度低10,000倍。进而， 在这些情况下LPS刺激的效率是血清依赖性的，这反应了LBP的参与 (Lee,J.D.et al.1992.J.Exp.Med.175,1697)。因此，在强 调mCD14在介导细胞和LPS-LBP复合物相互作用的中心位置的同时这 些结果还表明LPS的激活存在独立于mCD14的途径，该途径是独立于血 清的，因此也是独立于LBP的。

接着的问题是LPS激活70Z/3的mCD14独立途径是否和 LAIT/sCD14对70Z/3的激活途径有共同的信号元素。图4的结果表明 这种情况是可能的。先前已经证明源自LPS的二磷酰基脂A能抑制LPS 对70Z/3的激活(Kirkland,T.N.Quershi,N.and Takayama,K.1991. Infection and Immunity 59:131)。尤其是，70Z/3与含有二磷酰基 脂A(RSDPLA)的培养基预保温能随后抑制LPS诱导的mIg表达。图4A 还表明在测试的浓度范围内即0.1至30Tg/ml RSDPLA自身不会诱导 70Z/3表达IgP。图4B表明70Z/3与含有10Tg/m RSDPLA的培养基的 预温育不仅抑制nBo-LAIT诱导的IgP表达并远远高于LPS作为刺激 物时的效力，在所有测试的nBo-LAIT的浓度范围内至少能使nBo- LAIT介导的诱导被抑制10倍。图4C表明虽然RSDPLA抑制LPS和nBo -LAIT/sCD14诱导70Z/3表达mIgP，在任何测试的浓度，即0.03Tg/ml 到10Tg/ml，它都不抑制70Z/3的生长。

RSDPLA对LPS介导的激活的抑制是同构体的抑制，因为前者是源自 LPS，并且RSDPLA的抑制被认为是由于它和70Z/3所表达的生理学上的 脂A受体的竞争结合。RSDPLA抑制LAIT/sCD14介导的激活的能力意味 着LAIT/sCD14和LPS共有相同的受体元件，以及/或是由于RSPDLA和 先前描述的CD14上的LPS相互作用序列，残基57-64(Juan,T.S.-C. et al.1995.J.Biol.Chem.270:5219)，相互作用，尽管LPS独立 于LAIT/sCD14的功能，在这些实验中上述相互作用反过来抑制了 LAIT/sCD14的活性。

RSDPLA通过直接和LAIT蛋白/sCD14的结合抑制LAIT蛋白/sCD14 的功能的可能性的评估见图5。图5A示明了LAIT蛋白/sCD14的示意 图并且突出了作为mAb 3C10和MEM18的结合位点的两个区域。MEM- 18能阻止CD14和LPS的结合，因此残基57-65被认为是CD14上的 LPS结合位点。图5B阐明了RSDPLA介导对LAIT蛋白/sCD14功能的 抑制的两种可能的潜在机制。RSDPLA或者直接和LPS以及LAIT蛋白 /sCD14共有的受体元件相互作用，或者可能直接结合LAIT蛋白 /sCD14。如果后者成立，那么用mAb MEM-18(图5B)阻止RSDPLA和 LAIT蛋白/sCD14的相互作用将干扰RSDPLA对LAIT蛋白/sCD14功能 的抑制。如图5C所示，天然人类LAIT蛋白/sCD14与mAb MEM-18的 预保温并未改变RSDPLA抑制LAIT蛋白/sCD14诱导70Z/3表达mIgP 的能力。

在此已证明是mAb 3C10，而不是mAb MEM18，能够抑制LAIT/sCD14 对成熟的鼠B细胞(图1A)以及对鼠前B细胞系70Z/3(图3A和图3B) 的功能。如先前所描述，mAb 3C10识别CD14上的序列，残基7至14， 该序列对于LPS介导的信号是必需的，但不是LPS结合所必需的(Juan. T.S.-C.et al.1995.J.Biol.Chem.270:17237)。由于mAb 3C10 抑制不依赖于LPS的LAIT/sCD14信号，这意味着LAIT/sCD14上的残基 7-14参与了该配基与假设的膜受体结构之间的相互作用。进而，已经 证明对CD14上参与LPS结合的序列特异的，并且能阻止LPS-CD14相 互作用的mAb MEM18对于RSDPLA介导的对LAIT蛋白/sCD14激活的抑 制没有影响。因此，尽管尚未明确证明，我们更倾向于RSDPLA通过竞 争共有的受体元件抑制LAIT/sCD14的信号的解释。

LAIT/sCD14在人初乳和乳汁中富集

考虑到可溶性Hu-LAIT对于新生婴儿可能具有重要作用，检测了分 娩后人类女性的Hu-LAIT表达方式。在分娩后不同时间从9个人类受试 者取得了初乳和乳汁样品。由于已知健康人受试者的血清中含有大约1 -5Tg/ml的sCD14，从上述的9个受试者取得了血清样品以确定是否血 清中含有的sCD浓度和乳腺分泌物中观察到的平行。用商业上可购得的 ELISA试剂盒进行CD14定量，总蛋白的测定用的是可由商业途径获得的 比色检测系统。图6A中出示的结果是每对乳汁和血清样品的Tg CD14/mg 总蛋白。如图中所示，人乳汁含有的sCD14比同一个人的血清的要高100 -400倍。还表明sCD14在乳汁中相对于血清的富集一直持续到分娩后 400天。

亲和纯化的nBo-LAIT的热不稳定性

必须小心避免可能降低CD14或感兴趣的多肽变体的合乎需要的活 性的条件。图6B示明了将亲和纯化的nBo-LAIT在99℃沸腾10分钟的 影响。B细胞吸收的胸腺嘧啶大大降低，这表明它的B细胞刺激活性如 果不是完全丧失也是极大降低。

从乳汁中部分纯化具有生物活性的牛LAIT-蛋白/sCD14；源自初乳 和乳汁的牛LAIT-蛋白/sCD14具有可比的生物学活性

以前不知道可溶性CD14存在于母牛的乳汁中。在本文的上下文中， 术语“乳汁分泌物”包括初乳和乳汁。“初乳”是从后代的出生开始并 持续到固定的一段时间的乳腺分泌物，上述固定的时间通常不超过24 小时。“乳汁”是初乳之后的乳腺分泌物。本领域中的技术熟练人员很 容易分辨初乳和乳汁。初乳通常是在分娩后头几个小时到开始吸奶之前 得到的。在此描述的实验，以及牛初乳被用作bo-LAIT来源的PCT/CA 97/00880中初乳是在分娩后1个小时并在吸奶之前得到的。

先前用于从牛初乳中分离LAIT的方法(PCT/CA 97/00880)在此用 于从乳汁中得到LAIT。未进行巴氏消毒的全牛奶来自研究农场。通过检 测在液体培养基和血平板(blood auger plate)中的生长以确定培养 基是无菌的。只有无菌的材料才被用于此处描述的实验。

制备澄清乳清时首先将初乳在4420g离心30分钟以除去细胞和细 胞残渣。然后这一步离心的上清在250,000g离心2小时。弃除浮着的 脂类和沉淀的酪蛋白，澄清的初乳乳清进行进一步分离。

乳清中蛋白的盐析是通过添加饱和硫酸铵溶液，使蛋白在(NH4)2SO4中连续沉淀而完成的。所使用的逐步升高的盐浓度是42％、50％、62％、 65％(v/v)的硫酸铵(AS)。因此，42％沉淀材料的上清中AS浓度被 升高到50％；50％沉淀的材料被取出，剩下的上清中AS的浓度被升高 到62％；如此类推。每一次AS沉淀的沉淀物溶于含有0.15M NaCl和 1mM AEBSF的10mM Tris-HCl pH8.0,(TNAEBSF)中。这些级分被除盐， 用10DG柱子将缓冲液置换成TNAEBSF，并检测生物活性。

用(NH4)2SO4从牛乳清中连续盐析蛋白使得天然牛LAIT蛋白/sCD14 富集于62％(NH4)2SO4级分(比较图7A和图7B)。源自牛乳清和初乳 乳清的62％(NH4)2SO4级分的蛋白浓度分别为8-15mg/ml和47- 65mg/ml。源自乳汁和初乳的62％(NH4)2SO4级分中LAIT蛋白/sCD14 的浓度分别为1-5Tg/ml和5-12Tg/ml。因此，从这两种来源的LAIT 蛋白/sCD14的产量是可比的，在0.15-0.26Tg/mg蛋白之间。

然后对62％级分中的活性进行富集。五十五毫克的62％AS富集 级分被上样到阴离子交换柱上，然后用10mMBis-Tris丙烷中的50mM 到400mM NaCl盐梯度，以及同时进行的7.5-9.5的pH梯度分离上述 材料。图7C是源自乳汁的牛LAIT蛋白/sCD14的部分纯化级分与同样 来源的亲和纯化材料诱导70Z/3表达IgP的对比分析。如图所示，62 ％(NH4)2SO4级分的比活大约比亲和纯化的源自乳汁的牛LAIT蛋白 /sCD14低10,000倍。图7C还显示了62％(NH4)2SO4级分在Superdex 75分子筛树脂上进一步分离后得到的含有LAIT蛋白/sCD14主要活性 (根据免疫印迹分析)的级分的生物学活性。级分47-49的比活比62 ％(NH4)2SO4级分要高100倍，这和LAIT蛋白/sCD14浓度的相应提 高是一致的。

图7D中所示的是源自乳汁和初乳的牛LAIT蛋白/sCD14介导的B 细胞生长的比较分析。如图所示，源自乳汁的材料的比活和源自初乳的 一样高。图7D中的插入图示明免疫亲和纯化的乳汁和初乳LAIT蛋白 /sCD14。

因此本实验表明LAIT蛋白/sCD14天然存在于牛奶中，并且可能浓 缩和纯化乳汁蛋白并保持B细胞激活活性。

LAIT/sCD14在原代牛气管上皮细胞中诱导TAP特异mRNA

如上文所述，LPS和LAIT/sCD14共有相同的受体元件的可能性导 致了它们可能具有相同的生物学活性。在此研究了LAIT/sCD14在防卫 素的诱导中起一定作用的可能性。最近牛特有的防卫素分子已有描述 (Diamond,G.J.P.Russell,and C.L.Bevins.1996.PNAS 93:5156； Schonwetter,B.S.Stolzenberg,E.D.and M.A.Zasloff.1995. Science 267:1645)。因此制备了牛TAP的寡聚核苷酸探针以评估LPS 和LAIT/sCD14体外诱导这种抗生多肽的信使的相对能力。

图8A示明了用于在原代牛气管上皮细胞中探测牛气管抗生肽(TAP) 的寡聚核苷酸探针的序列。TAP是38氨基酸的多肽，它的表达似乎局限 于牛呼吸道的柱状上皮细胞(Diamond,G.et al.1996.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 93:5156)。

原代牛气管上皮细胞的制备根据先前描述的方法进行(Diamond,G. et al.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5156)。准备24孔的 培养板，每个孔含有1ml无血清培养基以及约5×105上皮细胞，用注明 浓度的(图9A)LPS、天然形式的人和牛LAIT蛋白/sCD14，或用哺乳 动物表达系统(C127)或杆状病毒表达系统(Sfq)制备的重组形式的 Bo-LAIT/sCD14刺激16小时。源自乳汁的牛LAIT被用于这些实验。如 图9A所示，1Tg/ml天然或重组LAIT/sCD14诱导出的TAP特异mRNA的 水平和1Tg/mlLPS的可比，并且比未刺激的细胞中观察到的信号升高15 -20倍。图9A还示明了从牛微管蛋白特异mRNA得到的信号，这表示上 样到每个泳道的RNA的量是可比的，并且被用于使TAP mRNA信号的归 一化。

图9B中所显示的是1Tg/ml LPS或天然牛LAIT蛋白/sCD14在原代 牛气管上皮细胞中诱导TAP mRNA的时间过程的比较研究。上皮细胞的 培养按照图9A中所描述，在注明的时间点测量TAP特异mRNA的表达。 如图所示，根据微管蛋白mRNA的水平进行归一化之后两种刺激物诱导 TAP mRNA的表达的峰值都在16小时(图9B)。

因此本发明提供了从乳腺分泌物中制备CD14浓缩物的方法。上述 分泌物可以是初乳或乳汁，或两者。上述分泌物可以来自牛或人或其他 种属。由于牛CD14天然存在于牛乳汁中，因此生产内源牛CD14浓缩物 的工业方法似乎是很有前途的。在一些情况下在遗传上改变一些生物体 以生产CD14是优选的。这在下文描述。

由于对牛奶的热处理可能减低或破坏CD14的有益特性(防卫素诱 导活性，和/或B细胞刺激活性)，避免对牛奶进行这样的预处理以得到 CD14是必要的或合乎需要的。一种“浓缩”CD14的方法是上文所描述 的盐析方法。但对于本领域的技术熟练人员而言这并不是唯一的方法。 例如，可以使用离子交换层析，分子筛层析。此处所描述的方法可以进 行改善和优化以用于商业生产CD14浓缩物或分离物。并且可以根据本 领域中技术熟练人员所已知的方法除去乳汁或初乳中不合乎需要的其它 组分。这些方法的例子在本文中有所描述，其中乳汁进行离心并且除去 漂浮的脂类，将含蛋白的液体(乳清)从离心时形成的酪蛋白溶液上倒 出。

“分离”的CD14是指从至少一种污染物分开的，经过鉴定的CD14 蛋白，该污染物通常在天然状态下与CD14在一起，例如在动物或人 的CD14源中。在CD14被用作药物的优选实施例中CD14将被从其初 始状态的蛋白中被分离至药用上可接受的纯度水平。在优选的实施例 中，CD14蛋白将被纯化至大于蛋白重量的95％，最为优选地，大于 蛋白重量的99％，蛋白重量的确定用的是Lowry法。这些是优选的 纯化程度。

CD14“浓缩物”是指从天然来源得到的CD14蛋白，该蛋白已经经 过处理使得呈现于浓缩物中的的浓度大于从天然来源得到的浓度。

“可溶性”CD14的意思为例如不通过糖基磷脂酰肌醇锚着物与膜结 合的CD14。

涉及处理时，在浓缩的CD14中保留合乎需要的CD14活性是很重要 的。因此，例如，在生产用于激活B细胞的CD14时含有CD14的溶液不 得在99□C加热10分钟以上，已知这些条件严重地降低CD14的这种活 力。参见图6B，图6B证明在这些条件下亲和纯化的n-bo-LAIT的活性 基本上丧失。

使用此处描述的技术，技术熟练的人员很容易确定对所需要的活 性有害的或相对来说较不利的条件。例如，可以对含有CD14的溶液 进行不同时间(例如，1分钟，2分钟，……10分钟)的各种温度(例 如，40□C,50□C,60□C,70□C等等)处理，然后根据此处所公布 的方法确定处理对B细胞刺激活性的影响。类似地，通过类似的方案 很容易确定这些的条件对在上皮细胞中诱导防卫素的影响。其他条件 的影响，例如盐的影响，或其它可能用来处理乳汁的化学物质的影响， 也很容易确定。应当谨慎避免CD14暴露于已被证实不利于其所需活 性的条件。

当CD14经过浓缩时可根据常规方法确定CD14的量或浓度。一种受 欢迎的方法是基于化学发光的ELISA检测。对于检测人CD14可以使用 可由商业途径获得的试剂盒(IBL,Hamburg,Germany)。

对于牛或其它种属CD14的检测，技术熟练人员可以很容易建立一 座ELISA方法，以下是例子。按照PCT申请No.PCT/CA 97/00880中所 描述的方法制备重组CD14。重组材料被用于产生标准曲线。在兔中产生 抗重组分子的多克隆抗体并分离IgG成分。然后将IgG固定到ELISA板 上并洗涤以除去过量的(未结合的)免疫球蛋白。加入BSA(牛血清白 蛋白)以“封闭”ELISA板上未反应的位点。在很广的浓度范围内滴定 重组蛋白的浓度，例如，从100μg到1ng每毫升，浓度每次增加10倍。 洗板。通过和酶交联标记抗体，例如，马辣根过氧化物酶，将酶联抗体 暴露于滴定板，保温，洗去过量抗体。通过加入酶底物、显色并在ELISA 读板机上读数而显示结合的外抗体。

曲线的线性部分(吸收对蛋白浓度)被用作标准曲线，因为这通常 是合适的灵敏度范围。结合的抗体的量(如光密度所示)相应于该蛋白 的一个已知浓度。为了确定该蛋白在未知样品中的浓度，顺序稀释的未 知样品被加入到一块新ELISA板以得到吸收值适当的点(处于标准曲线 的范围内)并计算该蛋白在原来未知样品中的浓度。

通常可以为任何种属的CD14的建立这样的检测方法，只要能得到 该CD14的多克隆抗体。

当说一种抗体对具有特定氨基酸序列的多肽(或其它抗原)“具有 特异性”时的意思为，或者说技术熟练人员将如此理解，该抗体和多 肽将以高度选择性的方式结合，并且该多肽不会与其它抗原所引起的 抗体结合。在这种情况下可以对等地说该多肽被该抗体特异性地识 别”。

一旦确定了一种给定CD14浓缩物的浓度，如果它没有其他不合乎 要求的成分的话，它就可以以合乎需要的量用于加入到药物，食用品等 等中。因此，例如，在将含有10(500)TgCD14的食物条中可以加入0.1(5)g 含有100Tg/gCD14的浓缩物。

将液体浓缩物转化为固体形式也许是合乎需要的，例如通过将该液 体进行蒸发、冻干或通过其它技术。

如果CD14处于液体中，例如婴儿制剂中，那么有时包括一种或两 种防腐剂以保持CD14的活性也许是合乎需要的。

本发明有一些惊人地简单但却非常有用的方面。例如，本发明的一 个方面是检测含有乳腺分泌物蛋白的组合物中CD14存在的检测方法。 这样的方法尽管应用起来很直接，但是在没有关于在乳腺分泌物，尤其 是牛乳汁中，天然存在CD14的知识之前是不可能的。根据该方法，上 述组合物被暴露于对CD14特异的抗体然后根据在暴露步骤是否形成 CD14抗体来确定在样品中是否存在分泌物的内源CD14，举个例子，ELISA 检测。

本发明还提供了确定含有乳腺分泌物，尤其是牛乳汁，的组合物中 的内源CD14的方法。提供该组合物。将样品暴露于对CD14特异的抗体 并根据暴露步骤形成的CD14-抗体复合物的量确定样品中分泌物内源 CD14的量。同上，可以使用适当的ELISA检测。

根据这些方法人或牛的初乳或乳汁可用作CD14的来源。

在另一方面，本发明是确定源自乳腺分泌物的产品是否适用于所希 望的用途，例如，用于在哺乳动物中诱导或刺激防卫素的产生(或B细 胞的激活)，的方法。该方法包括提供产品的样品并确定样品中存在的 CD14的量。已知了样品中CD14的量后技术熟练人员可以再一次根据所 希望的活力将适当量的该产品加入到待使用的组合物中。例如，人可溶 性CD14(重组)的一种用途在美国专利No.5,804,189中有所描述，确 定达到可比效果所需要的牛CD14的量在本领域的技术熟练人员的能力 范围内。

根据本发明的一些方面，具有类似CD14活性的蛋白(例如，B细胞 刺激活性，或防卫素诱导活性)可以是天然存在的，如在乳腺分泌物中， 或是根据化学或重组技术制备的。“重组”的蛋白或多肽是指它通过利 用分子遗传学技术表达分离的核酸序列产生的，这将为本领域中的技术 熟练人员所理解。

在此说明书中，同源性是根据常规方法计算的，计算时需要将两个 待比较的序列进行序列对比以达到最大的配对，然后计算配对的百分 比。在一个优选的方面中本发明是减轻脓毒症症状的方法，包括对需要 治疗的哺乳动物施用有效剂量的可溶性蛋白以使得该哺乳动物的上皮细 胞直接暴露于该蛋白，该蛋白的氨基酸序列和标识为SEQ ID NO:5的 氨基酸序列相比至少有63％的保守性，并且具有在上皮细胞中诱导防卫 素的表达的能力。换句话说，所讨论的序列和SEQ ID NO:5至少有63 ％的同源性。

这些多肽的基本上等价的物质包括其天然序列的一个或多个残基被 缺失、取代，或被插入不同的氨基酸或酸后的产物。

有可能此处所描述的多肽序列而至少保留一部分合乎需要的活性。 优选的变化包括保守替代，即，一个残基被同一大类的另一个氨基酸替 代后的产物。众所周知，天然存在的氨基酸可以被划分为酸性、碱性、 中性和极性，或中性和非极性。当然，应当理解可以进行许多可能的氨 基酸置换而同时“保留”负责此处所描述的多肽的主要刺激效应(bone stimulatory effects)的结构，而不必受到此处的限制。因此预期， 例如，非极性脂肪族中性氨基酸，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸，缬氨酸和 异亮氨酸之间的相互置换是可能的。类似地，极性脂肪族中性氨基酸， 丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺之间的置 换也是可能的。带电荷的酸性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸也可能进行替 代，类似地，也可进行带电荷的碱性氨基酸，赖氨酸和精氨酸之间的替 代。芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸，组氨酸，色氨酸和酪氨酸之间的替 代也是可能的。这些替代和互换，如美国专利No.5,487,983中所进行 的举例说明中所示，对于本领域中的技术熟练人员是众所周知的。可以 利用本领域中众所周知的计算机程序，例如DNASTAR软件，指导确定哪 些氨基酸残基可以被替代、插入或缺失而不至于丧失生物学或免疫学活 性。

“序列同一性或同源性”因而指两个多肽分子或两个核酸分子之 间的序列一致性。当两个比较的多肽序列上的一个位点均被同一氨基 酸占据时(例如，两个多肽的每一个上的该位点均是丙氨酸残基)，那 么在该位点上，该分子是同源的或序列是同一的。两个分子之间同源 性百分数或两个序列间的序列同一性是这样一个函数：两个序列共有 的匹配位点的数目除以比较的位点的数目×100％。例如，如果两个序 列的10个位点中的6个是同一的，那么这两个序列是60％同源性的 或具有60％序列同一性。例如，多肽序列METL IA和MPTW IF具有50％ 同源性或序列同一性。一般地，当两个序列被对齐以给出最大同源性 时进行比较。

序列的比较以及两个序列间的同源性百分比的确定可通过一种数 学运算法则来完成。在本说明书中序列对比是根据Clustal方法进行 的。

当相似性不一定是进化上相关时建议使用Clustal运算法则(此处 通过DNASTAR Inc.1228South Park Street,Madison,Wisconsin,USA, 1994的软件应用)进行序列对比。该运算法则由Higgins,D.G.et al. 1989.CABIOS 5:151描述。同一软件程序提供了根据Jotun Hein方法 进行的序列对比，Jotun Hein方法被建议用于具有清晰的进化关系的高 的进化的家族的序列对比。该运行法则的描述见Hein,J.1990,Methods in Enzym ology 183:626。使用程序的默认设置(标准参数)。基于进化 取代模式、电荷、结构和化学相似性进行氨基酸残基的加权(weighting) 时选择的可接受突变百分比(percent acceptable mutation,PAM)设 置为250。对于序列对比，所使用的序列对比参数为K-tuple=1,Gap penalty=3,Window=5,Diagonals Saved=5。

在一个优选的实施例中本发明是减轻脓毒症症状的方法，它包括对 需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的可溶性蛋白以直接将该哺乳动物的 上皮细胞暴露于上述蛋白，该蛋白的氨基酸序列相对于标识为SEQ ID NO:5的氨基酸序列的保守性至少为63％，并且具有诱导上皮细胞表达 防卫素的能力。换句话说，所讨论的序列和SEQ ID NO:5的同源性至 少为63％。

因此本发明还提供了含有有效剂量的本发明的复合物的组合物，以 及它的无毒加成盐，胺和酯，它们可能单独就能提供上文描述的治疗效 果。这样的组合物可以和生理上可耐受的液体、凝胶或固体稀释剂、佐 剂以及赋形剂一起提供。

在涉及CD14蛋白的情况下可以以250Tg至300Tg多肽每千克体重 的剂量喂养哺乳动物，例如，根据平均每天消耗的食物对哺乳动物每天 喂养18至36ml液体。应当理解非常小的动物消耗的剂量随时间而增加。 施用的剂量的根据是成体乳汁中测量得到的sCD14浓度为10至 20Tg/ml，并且考虑到出生后头六个月内人类婴儿摄入的乳汁量每天增 加0.11至11，同时假设人和大鼠的体重比为28。在实践中，特别是涉 及人类受试者时，每天的剂量可以是250Tg至2500Tg或更多一些每千 克体重每天。更为优选地，剂量可以是300Tg至1mg每千克体重每天左 右。根据施用途径、方便性、以及治疗的有效性随施用的频率以及每次 施用剂量的变化，优选的施用频率可以是大于或小于每天一次。施用的 剂量也依赖于受试者以及施用所要达到的效果。任何一种或多种复合物 的剂量决定于许多因素，包括所使用的特定复合物或几种复合物的组 合，施用的方式，以及待治疗的哺乳动物。特定复合物或几种复合物的 组合的剂量可根据传统的考虑因素而决定：例如，复合物与已知制剂的 常规的活性差异比较，即，通过适当的药理学方法。

药用制剂包括任何被制备成可注射溶液的复合物，包括在使用前制 备成可注射溶液的的复合物。可注射的复合物可以是溶液或悬浮液；也 可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体的固体形式。制备物也可以 被乳化。活性蛋白经常与稀释剂和赋形剂混合，上述稀释剂与赋形剂是 生理上可耐受的并且与上述多肽相容的。适当的稀释剂与赋形剂为，例 如，水，盐水，右旋糖，甘油等等，以及它们的组合。此外，如果需要 的话该组合物可以含有小量的辅助物质如润湿剂或乳化剂，稳定剂和pH 缓冲剂等等。

药用制剂包括使用上述复合物与传统赋形剂混合，赋形剂即不会与 上述复合物产生有害反应并且可能会增强上述复合物的储存和操作稳定 性的，药用上可接受的有机或无机载体。制备步骤可以包括药用制剂的 灭菌。该复合物可以和不会与其发生有害反应的辅助性物质如润滑剂、 防腐剂、稳定剂、影响渗透压的盐等等混合。

该组合物通常通过注射，例如，皮下注射或皮内注射经过肠道外途 径施用。适用于其它施用方式的制剂包括栓剂、鼻内气溶胶和一些情况 下的口服制剂。对于栓剂通常包括结合剂和赋形剂，包括，例如，聚烷 基二醇或甘油三酸酯：这样的栓剂可以从含有0.5％至10％范围内的活性 成分，优选地含有1％至2％活性成分的混合物形成。口服制剂包括这 些通常使用的赋形剂，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、 糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物的形式为溶液、悬浮液、药 丸胶囊、持续释放制剂(sustained release formulation)或粉剂， 并且含有10％-95％的活性成分，优选地25％-75％的活性成分。如 果恰当的话口服制剂可以包括设计用来保护蛋白直至蛋白到达既定作用 位点的制剂。

蛋白复合物可以被配制成中性的或盐形式的组合物。药用上可接受 的无毒盐包括酸加成盐(和游离氨基基团形成)以及和无机酸，例如， 高氯酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成的盐。 和自由羧基形成的盐可以自无机碱如，例如，钠、钾、铵、钙或氢氧化 铁，或来自有机碱如异丙胺、三甲基胺、2-甲基氨基乙醇、组胺、普 鲁卡因等等衍生。

本发明的复合物可以可以自身形成均一多聚物。该复合物还可以被 交联到生物兼容的多聚复合物，如，BIOPOLTM(WR Grace&Co.Conn) 上。

本领域中配制制剂的方法见，例如，“Remington’s Pahrmaceutical Sciences”。

在通常的保健方案(health promoting regimen)中优选的施用途 径可能是口服。CD14存在于液体中以便在吞咽CD14液体时时GI道暴露 于CD14。它还可以包含在耐嚼的或柔韧性好的物质中以保护CD14不会 被降解，但在咀嚼时它又很容易将CD14释放出来，以便随后暴露于GI 道。

本发明的组合物可以包含在任何适当的药用上可接受的载体中，例 如，液体载体如丙二醇、丙二醇氯仿等等，外用到伤口部位。在这些组 合物中活性物质的可能浓度至少为0.01％的重量比，更可能为重量比0.1％ 至0.5％，更可能为重量比0.05％至0.2％，但是任何治疗上有效的剂量 都可以使用。

本发明的组合物也可通过任意多的其它途径配制，这依赖于需要的 是水溶液、膏霜还是药膏，以及它是否被用于，或者说它使用的位点是 否为皮肤的或眼睛的表面。

配制成膏霜的组合物可以含有膏霜稳定剂如呫吨胶、乳化剂，优选 地为非离子型乳化剂，至少一种液体和一种固体疏水材料，上述液体和 固体疏水材料选自液体和固体脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、药用级的蜡 以及碳氢复合物，后者在液体和半液体之间变动，如凡士林或者在液体 和固体之间变动等等；上述组合物还含有防腐剂，抗氧化剂和水。

通过减轻皮肤感染而促进治疗伤口的方法包括将本发明的促进上皮 细胞产生防卫素的组合物直接施用或与伤口接触。允许组合物和伤口保 持接触一段时间，该段时间的长度足以使上述组合物帮助减轻感染。这 样的方法包括将本发明的组合物加入到膏霜制剂或者将本发明的组合物 的溶液浸泡到纱布中，然后将膏霜或浸泡过的纱布用于处理伤口，例如， 烧伤、供体部位伤口(donor site wound)、溃疡或人任何形式的皮肤 伤口。此外，缝合处或缝合线可以被涂覆或浸泡一层本发明的组合物并 用与缝合开口道伤口。

可以用本发明的组合物治疗的伤口的类型包括任何由于医疗或意外 原因引起的导致上皮损伤的伤口，如asophthalmic伤口，如由于角膜 溃疡而产生的伤口，皮肤伤，如烧伤、皮肤移植的供体部位伤口和溃疡。 进而，皮肤被损伤的皮肤病可以用本发明的组合物治疗。脚和腿的溃疡 也可以用本发明的组合物治疗。

通过气溶胶施用本发明的组合物尤其适合于将气管和肺暴露于 CD14。

在任何情况下，通常都应理解在摄入或吸入等等时将细菌(或病毒， 真菌等等)暴露于一种或多种防卫素的有利之处。在受试者不一定能进 行完全的或正常的免疫应答时尤为如此。在能产生LPS的革兰氏阴性菌 的情况下在被认为是脓毒症休克高危人群的GI道或气管中存在一种或 多种防卫素是特别有利的。

在另一方面，本发明包括了基因被改变以在其乳汁中增强CD14的 产生的转基因哺乳动物。尽管产生转基因小鼠的技术已经使用了二十 年，将外源基因引入到家畜基因组，包括山羊、绵羊、奶牛和猪基因组 的可能性直到最近才被证实。尽管技术上更为困难，将编码具有制药学 重要意义分子的克隆基因转入到家畜中的优点在于使得重组蛋白的大量 生产成为可能。这转而将大大降低生产费用。在这一方面，转基因家畜 可以被认为是在乳汁、血液或尿液中具有制药用途的蛋白的“生物反应 器”。

在过去的几年里在血液和组织中表达蛋白已经大大地扩大了转基因 动物在医学上的应用。例如，用于人类移植的“隐形动物器官(stealth animal organs)”最近得到了很大的重视。重要的是在乳汁中表达转基 因蛋白的能力上最近取得了重大进展。目前为在进行的研究集中于在动 物的乳腺中直接表达蛋白以及提高它们的产量。

产生转基因动物的技术根据的是已经很好地确立的原理(Marki,U. and Harri,A.1996.Int.J.Exp.Path.77:247)。感兴趣的基因 与启动子结合，上述启动子指导和调节该基因在转基因动物的特定组织 /细胞中表达。表达构建体(DNA)被注射到受精卵的的前体核中，注射 后的卵被植入到激素同步化的代孕母亲中。控制这种通过人工授精得到 的动物以使注射的DNA构建体整合。检测上述基因在这些原初动物的后 代中的表达及其产物，以及该基因的遗传方式以确认该基因的生殖细胞 传递，即，转基因被整合入了该动物的生殖细胞系中。

在一个优选的方面本发明是转基因的牛科哺乳动物动物，其中CD14 (或其直接激活B细胞的类似物，或直接在上皮细胞中诱导防卫素表达 的类似物)是通过重组DNA技术引入到上述哺乳动物中并处于内源性 CD14启动子的控制之下。

在另一个优选的方面该转基因哺乳动物是牛，该牛的基因组被引入 了额外的基因组序列的拷贝(外显子和内含子，即，SEQ ID NO:8)， 从上述这些拷贝可得到编码内源性牛CD14的mRNA。

在目前为止测试的三个种属：人、牛、和小鼠中可溶性CD14是初 乳和乳汁的天然组分。尽管可溶性CD14出现在这些分泌物中的潜在分 子机制还不清楚，内源性CD14启动子可能在这一方面起重要作用。因 此，使用内源性CD14启动子序列驱动“转基因”CD14的表达，以及使 用一种组织特异性启动子，该启动子选择性地激活转基因CD14在乳腺 组织中的表达。

使用基因组序列，而不是cDNA序列，制备转基因动物已经被证明 能使转基因的表达更有效(Janne,J.et al.1994.Int.J.Biochem. 26:859)。因此可以把编码CD14的牛和/或人基因组DNA和牛内源性CD14 启动子一起克隆。替代地，绵羊的θ-乳球蛋白启动子(Wright,G.et al. 1991.Biotechnology 9:830)指导和调节基因主要在乳腺中表达。带 有该基因构建物的载体可以被添加有效的转录终止子以及基质附着区域 (matrix attached region)和特定的染色体序列以增强该转基因的表 达并且将其与染色体环境中的下调效应隔绝开。该构建体被注射到源自 任何合乎需要的种属的卵子的前体核中，并将卵子植入到该种属的激素 同步化的受体中。

本申请中任何提及的引用都在此全文引入作为参考。1999年5月27 日归档的美国临时专利申请第60/086,884号的说明书和权利要求也在 此引入作为参考，根据这些本申请要求优先权和目前悬而未决的(本申 请的归档日期)美国专利申请序列号第08/746,883,1996年11月18 日归档。

此处所讨论的多肽和蛋白序列标识如下：

SEQ ID NO:1编码牛CD14的核酸序列。

SEQ ID NO:2编码人CD14的核酸序列。

SEQ ID NO:3编码鼠CD14的核酸序列。

SEQ ID NO:4牛CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5人CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6鼠CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7兔CD14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8牛CD14的基因组核酸序列序列。

在SEQ ID NO:8中碱基1到83是5’-非翻译区。84到86是ATG 起始密码子。87到163是内含子，碱基164到1282是编码序列，碱基 1283到-1405是3’-非翻译区。

兔CD14的氨基酸序列是先前已知的(Ikeda.A.et al.1997.J.Vet. Med.Sci.59:715)。

人和牛之间的同源性被发现是70.8％，人和小鼠之间的同源性被发 现是63.4％，人和兔之间的同源性被发现是71.8％，牛和鼠之间的同源 性被发现是58.7％。

                      序列表 <110>    GEMMA生物技术公司；JULIUS,Michael H.；FILIPP,Dominik <120>    用LAIT/sCD14-蛋白诱导抗生蛋白或抗生多肽 <130>    47841/00048 <140>    PCT/CA99/00482 <141>    1999-05-27 <150>    US 60/086,884 <151>    1998-05-27 <160>    8 <170>    Wordperfec 6.1 <210>    1 <211>    1122 <212>    DNA <213>    牛 <400>    1 atggtgtgcg tgccctacct gctgctgctg ctgctgccgt cactgctgcg tgtgtctgcg          60 gacacaacag aaccctgcga gctggacgac gacgatttcc gttgtgtctg caacttcacg         120 gatccgaagc ctgactggtc tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtcga ggtggagatc         180 agtgccggcg gccgcagcct ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaa cccgaagcag         240 tatgctgaca caatcaaggc tctgcgcgtt cggcgactca agctgggcgc tgcacaggtt         300 cctgctcagc ttctggtcgc cgttctgcgc gcgctcgggt actctcgtct caaggaactg         360 acgcttgagg acctggaggt aaccggccca acgcccccga cgcctctgga agccgctggg         420 cctgcgctca ccaccctcag tctgcgtaac gtatcgtgga caacaggagg tgcctggctc         480 ggcgaactgc agcagtggct caagcctggg ctcagggtgc tgaacattgc ccaagcacac         540 tcgcttgcct ttccgtgcgc agggctctcc accttcgagg cgctcaccac cctagacctg         600 tctgacaatc ccagtctcgg cgacacgggg ctgatggcag ctctctgtcc gaacaagttc         660 ccggccctcc aatatctagc gctacgcaac gcggggatgg agacgccgag cggcgtgtgc         720 gcggcgctgg cggcagcgag ggtgcagccc caaagcctgg acctcagcca caactcgctg         780 cgcgtcaccg ccccgggtgc tacccgatgt gtctggccca gtgcactaag gtctctcaat         840 ttgtcgttcg ctgggctgga gcaagtgcct aagggactgc cccctaagct cagcgtgctt         900 gatctcagct gcaacaagct aagcagggag ccgcggcgag acgagctgcc cgaggtaaat         960 gacctgactc tggacggaaa tccctttctg gaccctggag ccctccagca ccaaaatgac        1020 ccgatgatct ccggcgtggt cccagcctgt gcgcgttctg ccttgaccat gggggtgtca        1080 ggagccctgg cgctgcttca aggagcccga ggcttcgcgt aa                           1122 <210>    2 <211>    1128 <212>    DNA <213>    人 <400>    2 atggagcgcg cgtcctgctt gttgctgctg ctgctgccgc tggtgcacgt ctctgcgacc         60 acgccagaac cttgtgagct ggacgatgaa gatttccgct gcgtctgcaa cttctccgaa        120 cctcagcccg actggtccga agccttccag tgtgtgtctg cagtagaggt ggagatccat        180 gccggcggtc tcaacctaga gccgtttcta aagcgcgtcg atgcggacgc cgacccgcgg        240 cagtatgctg acacggtcaa ggctctccgc gtgcggcggc tcacagtggg agccgcacag        300 gttcctgctc agctactggt aggcgccctg cgtgtgctag cgtactcccg cctcaaggaa        360 ctgacgctcg aggacctaaa gataaccggc accatgcctc cgctgcctct ggaagccaca        420 ggacttgcac tttccagctt gcgcctacgc aacgtgtcgt gggcgacagg gcgttcttgg        480 ctcgccgagc tgcagcagtg gctcaagcca ggcctcaagg tactgagcat tgcccaagca        540 cactcgcctg ccttttcctg cgaacaggtt cgcgccttcc cggcccttac cagcctagac        600 ctgtctgaca atcctggact gggcgaacgc ggactgatgg cggctctctg tccccacaag        660 ttcccggcca tccagaatct agcgctgcgc aacacaggaa tggagacgcc cacaggcgtg        720 tgcgccgcac tggcggcggc aggtgtgcag ccccacagcc tagacctcag ccacaactcg        780 ctgcgcgcca ccgtaaaccc tagcgctccg agatgcatgt ggtccagcgc cctgaactcc        840 ctcaatctgt cgttcgctgg gctggaacag gtgcctaaag gactgccagc caagctcaga        900 gtgctcgatc tcagctgcaa cagactgaac agggcgccgc agcctgacga gctgcccgag        960 gtggataacc tgacactgga cgggaatccc ttcctggtcc ctggaactgc cctcccccac       1020 gagggctcaa tgaactccgg cgtggtccca gcctgtgcac gttcgaccct gtcggtgggg       1080 gtgtcgggaa ccctggtgct gctccaaggg gcccggggct ttgcctaa                    1128 <210>    3 <211>    1101 <212>    DNA <213>    鼠 <400>    3 ATGGAGCGTG TGCTTGGCTT GTTGCTGTTG CTTCTGGTGC ACGCCTCTCC CGCCCCACCA            60 GAGCCCTGCG AGCTAGACGA GGAAAGTTGT TCCTGCAACT TCTCAGATCC GAAGCCAGAT           120 TGGTCCAGCG CTTTCAATTG TTTGGGGGCG GCAGATGTGG AATTGTACGG CGGCGGCCGC           180 AGCCTGGAAT ACCTTCTAAA GCGTGTGGAC ACGGAAGCAG ATCTGGGGCA GTTCACTGAT           240 ATTATCAAGT CTCTGTCCTT AAAGCGGCTT ACGGTGCGGG CCGCGCGGAT TCCTAGTCGG           300 ATTCTATTCG GAGCCCTGCG TGTGCTCGGG ATTTCCGGCC TCCAGGAACT GACTCTTGAA           360 AATCTCGAGG TAACCGGCAC CGCGCCGCCA CCGCTTCTGG AAGCCACCGG ACCCGATCTC          420 AACATCTTGA ACCTCCGCAA CGTGTCGTGG GCAACAAGGG ATGCCTGGCT CGCAGAACTG          480 CAGCAGTGGC TAAAGCCTGG ACTCAAGGTA CTGAGTATTG CCCAAGCACA CTCACTCAAC          540 TTTTCCTGCG AACAGGTCCG CGTCTTCCCT GCCCTCTCCA CCTTAGACCT GTCTGACAAT          600 CCTGAATTGG GCGAGAGAGG ACTGATCTCA GCCCTCTGTC CCCTCAAGTT CCCGACCCTC          660 CAAGTTTTAG CGCTGCGTAA CGCGGGGATG GAGACGCCCA GCGGCGTGTG CTCTGCGCTG          720 GCCGCAGCAA GGGTACAGCT GCAAGGACTA GACCTTAGTC ACAATTCACT GCGGGATGCT          780 GCAGGCGCTC CGAGTTGTGA CTGGCCCAGT CAGCTAAACT CGCTCAATCT GTCTTTCACT          840 GGGCTGAAGC AGGTACCTAA AGGGCTGCCA GCCAAGCTCA GCGTGCTGGA TCTCAGTTAC          900 AACAGGCTGG ATAGGAACCC TAGCCCAGAT GAGCTGCCCC AAGTGGGGAA CCTGTCACTT          960 AAAGGAAATC CCTTTTTGGA CTCTGAATCC CACTCGGAGA AGTTTAACTC TGGCGTAGTC         1020 ACCGCCGGAG CTCCATCATC CCAAGCAGTG GCCTTGTCAG GAACTCTGGC TTTGCTCCTA         1080 GGAGATCGCC TCTTTGTTTA A                                                   1101 <210>    4 <211>    3738 <212>    PRT <213>    牛 <400>    4 Met Val Cys Val Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu 1               5                   10                  15 Arg Val Ser Ala Asp Thr Thr Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Asp Asp

        20                  25                  30 Phe Arg Cys Val Cys Asn Phe Thr Asp Pro Lys Pro Asp Trp Ser Ser

    35                  40                  45 Ala Val Gln Cys Met Val Ala Val Glu Val Glu Ile Ser Ala Gly Gly

50                  55                  60 Arg Ser Leu Glu Gln Phe Leu Lys Gly Ala Asp Thr Asn Pro Lys Gln 65                  70                  75                  80 Tyr Ala Asp Thr Ile Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Lys Leu Gly

            85                  90                  95 Ala Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Ala Val Leu Arg Ala Leu

        100                 105                 110 Gly Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Glu Val Thr

    115                 120                 125 Gly Pro Thr Pro Pro Thr Pro Leu Glu Ala Ala Gly Pro Ala Leu Thr

130                 135                 140 Thr Leu Ser Leu Arg Asn Val Ser Trp Thr Thr Gly Gly Ala Trp Leu 145                 150                 155                 160 Gly Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Arg Val Leu Asn Ile

            165                 170                 175 Ala Gln Ala His Ser Leu Ala Phe Pro Cys Ala Gly Leu Ser Thr Phe

        180                 185                 190 Glu Ala Leu Thr Thr Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Ser Leu Gly Asp

    195                 200                 205 Thr Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro Asn Lys Phe Pro Ala Leu Gln

210                 215                 220 Tyr Leu Ala Leu Arg Asn Ala Gly Met Glu Thr Pro Ser Gly Val Cys 225                 230                 235                 240 Ala Ala Leu Ala Ala Ala Arg Val Gln Pro Gln Ser Leu Asp Leu Ser

            245                 250                 255 His Asn Ser Leu Arg Val Thr Ala Pro Gly Ala Thr Arg Cys Val Trp

        260                 265                 270 Pro Ser Ala Leu Arg Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln

    275                 280                 285 Val Pro Lys Gly Leu Pro Pro Lys Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Cys

290                 295                 300 Asn Lys Leu Ser Arg Glu Pro Arg Arg Asp Glu Leu Pro Glu Val Asn 305                 310                 315                 320 Asp Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Asp Pro Gly Ala Leu Gln

            325                 330                 335 His Gln Asn Asp Pro Met Ile Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg

        340                 345                 350 Ser Ala Leu Thr Met Gly Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Leu Gln Gly

    355                 360                 365 Ala Arg Gly Phe Ala

370 <210>        5 <211>        375 <212>        PRT <213>        人 <400>        5 Met Glu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val His 1               5                   10                  15 Val Ser Ala Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe

        20                  25                  30 Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala

    35                  40                  45 Phe Gln Cys Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu

50                  55                  60 Asn Leu Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg 65                  70                  75                  80 Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val

            85                  90                  95 Gly Ala Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val

        100                 105                 110 Leu Ala Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile

    115                 120                 125 Thr Gly Thr Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu

130                 135                 140 Ser Ser Leu Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp 145                 150                 155                 160 Leu Ala Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser

            165                 170                 175 Ile Ala Gln Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Tyr Glu Gln Val Arg Ala

        180                 185                 190 Phe Pro Ala Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly

    195                 200                 205 Glu Arg Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile

210                 215                 220 Gln Asn Leu Ala Leu Arg Asn Thr Gly Met Glu Thr Pro Thr Gly Val 225                 230                 235                 240 Cys Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu

            245                 250                 255 Ser His Asn Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys

        260                 265                 270 Met Trp Ser Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu

    275                 280                 285 Glu Gln Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu

290                 295                 300  Ser Cys Asn Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu 305                 310                 315                 320 Val Asp Asn Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr

            325                 330                 335 Ala Leu Pro His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys

        340                 345                 350 Ala Arg Ser Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu

    355                 360                 365 Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ala

370                 375 <210>        6 <211>        366 <212>        PRT <213>        鼠 <400>        6 Met Glu Arg Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val His Ala Ser 1               5                   10                  15 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Glu Glu Ser Cys Ser Cys

        20                  25                  30 Asn Phe Ser Asp Pro Lys Pro Asp Trp Ser Ser Ala Phe Asn Cys Leu

    35                  40                  45 Gly Ala Ala Asp Val Glu Leu Tyr Gly Gly Gly Arg Ser Leu Glu Tyr

50                  55                  60 Leu Leu Lys Arg Val Asp Thr Glu Ala Asp Leu Gly Gln Phe Thr Asp 65                  70                  75                  80 Ile Ile Lys Ser Leu Ser Leu Lys Arg Leu Thr Val Arg Ala Ala Arg

            85                  90                  95 Ile Pro Ser Arg Ile Leu Phe Gly Ala Leu Arg Val Leu Gly Ile Ser

        100                 105                 110 Gly Leu Gln Glu Leu Thr Leu Glu Asn Leu Glu Val Thr Gly Thr Ala

    115                 120                 125 Pro Pro Pro Leu Leu Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Asn Ile Leu Asn

130                 135                 140 Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Arg Asp Ala Trp Leu Ala Glu Leu 145                 150                 155                 160 Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln Ala

            165                 170                 175 His Ser Leu Asn Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Val Phe Pro Ala Leu

        180                 185                 190 Ser Thr Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Glu Leu Gly Glu Arg Gly Leu

    195                 200                 205 Ile Ser Ala Leu Cys Pro Leu Lys Phe Pro Thr Leu Gln Val Leu Ala

210                 215                 220 Leu Arg Asn Ala Gly Met Glu Thr Pro Ser Gly Val Cys Ser Ala Leu 225                 230                 235                 240 Ala Ala Ala Arg Val Gln Leu Gln Gly Leu Asp Leu Ser His Asn Ser

            245                 250                 255 Leu Arg Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ser Cys Asp Trp Pro Ser Gln Leu

        260                 265                 270 Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Thr Gly Leu Lys Gln Val Pro Lys Gly

    275                 280                 285 Leu Pro Ala Lys Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Asp

290                 295                 300 Arg Asn Pro Ser Pro Asp Glu Leu Pro Gln Val Gly Asn Leu Ser Leu 305                 310                 315                 320 Lys Gly Asn Pro Phe Leu Asp Ser Glu Ser His Ser Glu Lys Phe Asn

            325                 330                 335 Ser Gly Val Val Thr Ala Gly Ala Pro Ser Ser Gln Ala Val Ala Leu

        340                 345                 350 Ser Gly Thr Leu Ala Leu Leu Leu Gly Asp Arg Leu Phe Val

    355                 360                 365 <210>        7 <211>        377 <212>        PRT <213>        兔 <400>        7 Met Glu Pro Val Pro Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Xaa Leu Leu  1               5                  10                  15 Arg Ala Ser Thr Asp Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Asp Asp

        20                  25                  30 Ile Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Asp Pro Gln Pro Asp Trp Ser Ser

    35                  40                  45 Ala Leu Gln Cys Met Pro Ala Val Gln Val Glu Met Trp Gly Gly Gly

50                  55                  60 His Ser Leu Glu Gln Phe Leu Arg Gln Ala Asp Leu Tyr Thr Asp Gln 65                  70                  75                  80 Arg Arg Tyr Ala Asp Val Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr

            85                  90                  95 Val Gly Ala Val Gln Val Pro Ala Pro Leu Leu Leu Gly Val Leu Arg

        100                 105                 110 Val Leu Gly Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu Glu Asp Ile Glu

    115                 120                 125 Val Thr Gly Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu Glu Ala Thr Gly Pro

130                 135                 140 Ala Leu Ser Thr Leu Ser Leu Arg Asn Val Ser Trp Pro Lys Gly Gly 145                 150                 155                 160 Ala Trp Leu Ser Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Gln Val

            165                 170                 175 Leu Asn Ile Ala Gln Ala His Thr Leu Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val

        180                 185                 190 Arg Thr Phe Ser Ala Leu Thr Thr Leu Asp Leu Ser Glu Asn Pro Gly

    195                 200                 205 Leu Gly Glu Arg Gly Leu Val Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Glu Pro

210                 215                 220 Ala Leu Gln Asp Leu Ala Leu Arg Asn Ala Gly Met Lys Ile Leu Gln 225                 230                 235                 240 Gly Val Cys Ala Ala Leu Ala Glu Ala Gly Val Gln Pro His His Leu

            245                 250                 255 Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Arg Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Asp Thr Gln

        260                 265                 270 Arg Cys Ile Trp Pro Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Thr

    275                 280                 285 Gly Leu Gln Gln Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Asn Val Leu

290                 295                 300 Asp Leu Ser Cys Asn Lys Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Gly Glu Leu 305                 310                 315                 320 Pro Lys Val Val Asn Leu Ser Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro

            325                 330                 335 Gly Ala Ser Lys Leu Gln Glu Asp Leu Thr Asn Ser Gly Val Phe Pro

        340                 345                 350 Ala Cys Pro Pro Ser Pro Leu Ala Met Gly Met Ser Gly Thr Leu Ala

    355                 360                 365 Leu Leu Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ile

370                 375 <210>        8 <211>        1405 <212>        DNA <213>        牛 <400>        8 gcgtgacgca ctgtaaagga aagaatccac agtccagccc gacaaccaga gagagaggca        60 caggctctga gaatctactg actatgttct tggggccgaa gcgtgggcta tttggggact        120 taggaacagg cttgggccgc cctgacctcc gctgtcgggc caggtgtgcg tgccctacct        180 gctgctgctg ctgctgccgt cactgctgcg tgtgtctgcg gacacaacag aaccctgcga        240 gctggacgac cacgatttcc gttgtgtctg caacttcacg gatccgaagc ctgactggtc        300 tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtcga ggtggagatc agtgccggcg gccgcagcct        360 ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaa cccgaagcag tatgctgaca caatcaaggc        420 tctgcgcgtt cggcgactca agctgggcgc tgcacaggtt cctgctcagc ttctggtcgc        480 cgttctgcgc gcgctcgggt actctcgtct caaggaactg acgcttgagg acctggaggt        540 aaccggccca acgcccccga cgcctctgga agccgctggg cctgcgctca ccaccctcag        600 tctgcgtaac gtatcgtgga caacaggagg tgcctggctc ggcgaactgc agcagtgcct        660 caagcctggg ctcagggtgc tgaacattgc ccaagcacac tcgcttgcct ttccgtgcgc        720 agggctctcc accttcgagg cgctcaccac cctagacctg tctgacaatc ccagtctcgg        780 cgacagcggg ctgatggcag ctctctgtcc gaacaagttc ccggccctcc aatatctagc        840 gctacgcaac gcggggatgg agacgccgag cggcgtgtgc gcggcgctgg cggcagcgag        900 ggtgcagccc caaagcctgg acctcagcca caactcgctg cgcgtcaccg ccccgggtgc        960 tacccgatgt gtctggccca gtgcactaag gtctctcaat ttgtcgttcg ctgggctgga       1020 gcaagtgcct aagggactgc cccctaagct cagcgtgctt gatctcagct gcaacaagct       1080 aagcagggag ccgcggcgag acgagctgcc cgaggtaaat gacctgactc tggacggaaa       1140 tccctttctg gaccctggag ccctccagca ccaaaatgac ccgatgatct ccggcgtggt       1200 cccagcctgt gcgcgttctg ccttgaccat gggggtgtca ggagccctgg cgctgcttca       1260 aggagcccga ggcttcgcgt aaggccaggg gaagagaggg aagaggaatg aattggctca       1320 gattgccctg gctccgggag accctcgcca ggacatctca accaaccagc cttctgcccc       1380 atccttatta aaatcttaaa cagca                                             1405