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哺乳动物细胞中可溶性病毒融合糖蛋白的表达

阅读:1128发布:2020-05-31

专利汇可以提供哺乳动物细胞中可溶性病毒融合糖蛋白的表达专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且该技术部分涉及重组病毒融合糖蛋白的产生(即,表达)以及编码此类病毒融合糖蛋白的核酸。在一些 实施例 中,表达了人 呼吸道 合胞病毒融合蛋白(RSV-F)以及人副流感病毒3融合蛋白(hPIV3-F)。,下面是哺乳动物细胞中可溶性病毒融合糖蛋白的表达专利的具体信息内容。

1.一种分离的核酸,该核酸包括具有约51%或更大GC含量的、编码一种可溶性病毒融合蛋白的一个核苷酸序列,该融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有90%或更大一致性的一个基酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有
95%或更大一致性的氨基酸序列的一个蛋白。
3.如权利要求1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的一个蛋白。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的核酸,其中该可溶性病毒融合蛋白缺乏一个功能膜相关区域。
5.如权利要求4所述的分离的核酸,其中该可溶性病毒融合蛋白缺乏对应SEQ ID NO:2的525至574位氨基酸的C端跨膜区域氨基酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白包括一个标签。
7.如权利要求1至5中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白不包括标签。
8.如权利要求1至7中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量是76%或更大。
9.如权利要求8所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:6。
10.如权利要求1至9中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC含量是约
58%或更大。
11.如权利要求10所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量约100%。
12.如权利要求10或11所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:5。
13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有65%或更大的一致性。
14.如权利要求13所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有73%或更大的一致性。
15.如权利要求14所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有77%或更大的一致性。
16.如权利要求1至15中任一项所述的分离的核酸,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的一个顺式调节元件。
17.如权利要求16所述的分离的核酸,其中该顺式调节元件包括一个转录后加工元件。
18.如权利要求17所述的分离的核酸,其中该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病毒。
19.如权利要求1至18中任一项所述的分离的核酸,其位于一个表达载体中。
20.一种细胞,包括权利要求19所述的分离的核酸。
21.一种细胞,包括整合到细胞DNA内的权利要求1至15中任一项所述的核苷酸序列。
22.如权利要求20或21所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少2微克该蛋白。
23.如权利要求22所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少6微克该蛋白。
24.如权利要求23所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少200微克该蛋白。
25.如权利要求24所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少500微克该蛋白。
26.如权利要求25所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少1毫克该蛋白。
27.如权利要求26所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少1.3毫克该蛋白。
28.如权利要求27所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少1.6毫克该蛋白。
29.如权利要求20至28中任一项所述的细胞,其分泌该可溶性病毒融合蛋白。
30.如权利要求20至29中任一项所述的细胞,其是一种哺乳动物细胞。
31.如权利要求30所述的细胞,其中该细胞是一种非粘附细胞。
32.如权利要求30或31所述的细胞,其中该细胞是一种CHO细胞或CHO衍生的细胞。
33.如权利要求32所述的细胞,其中该细胞是一种CAT-S细胞。
34.如权利要求32所述的细胞,其中该细胞是一种CHO-S细胞。
35.如权利要求30所述的细胞,其中该细胞是一种Vero细胞。
36.如权利要求30所述的细胞,其中该细胞是一种MRC-5细胞。
37.如权利要求30所述的细胞,其中该细胞是一种BSR-T7细胞。
38.如权利要求20至37中任一项所述的细胞,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
39.如权利要求20至38中任一项所述的细胞,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的、权利要求16至18中任一项所述的顺式调节元件。
40.用于表达可溶性病毒融合蛋白的方法,包括:将包括权利要求1至15中任一项所述的核苷酸序列的多个细胞与在其下蛋白产生的条件相接触
41.如权利要求40所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的一个表达载体中。
42.如权利要求40所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的细胞DNA中。
43.如权利要求40至42中任一项所述的方法,其中该细胞是哺乳动物细胞。
44.如权利要求43所述的方法,其中该细胞是非粘附细胞。
45.如权利要求44所述的方法,其中该细胞是CHO细胞或CHO衍生的细胞。
46.如权利要求45所述的方法,其中该细胞是CAT-S细胞。
47.如权利要求45所述的方法,其中该细胞是CHO-S细胞。
48.如权利要求43所述的方法,其中该细胞是Vero细胞。
49.如权利要求43所述的方法,其中该细胞是MRC-5细胞。
50.如权利要求43所述的方法,其中该细胞是BSR-T7细胞。
51.如权利要求40至50中任一项所述的方法,其中每毫升细胞产生至少2微克该蛋白。
52.如权利要求51所述的方法,其中每毫升细胞产生至少6微克该蛋白。
53.如权利要求52所述的方法,其中每毫升细胞产生至少200微克该蛋白。
54.如权利要求53所述的方法,其中每毫升细胞产生至少500微克该蛋白。
55.如权利要求54所述的方法,其中每毫升细胞产生至少1毫克该蛋白。
56.如权利要求55所述的方法,其中每毫升细胞产生至少1.3毫克该蛋白。
57.如权利要求56所述的方法,其中每毫升细胞产生至少1.6毫克该蛋白。
58.如权利要求40至57中任一项所述的方法,其中该细胞分泌该蛋白。
59.如权利要求40至57中任一项所述的方法,其中该蛋白产生持续7天或更多天。
60.如权利要求40至59中任一项所述的方法,其中该细胞培养在无动物产品培养条件下。
61.如权利要求40至60中任一项所述的方法,进一步包括确定这些细胞产生的蛋白的量。
62.如权利要求40至61中任一项所述的方法,进一步包括分离该蛋白。
63.如权利要求40至62中任一项所述的方法,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
64.如权利要求40至63中任一项所述的方法,其中该细胞进一步包括与权利要求1至
15中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、权利要求16至18中任一项所述的顺式调节元件。
65.如权利要求40至64中任一项所述的方法,包括向该细胞核中导入权利要求1至
15中任一项所述的核苷酸序列。
66.如权利要求65所述的方法,包括向该细胞核中导入与权利要求1至15中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、权利要求16至18中任一项所述的顺式调节元件。
67.如权利要求65或66所述的方法,其中向该细胞核中的导入通过核转染进行。
68.一种分离的核酸,该核酸包括一个核苷酸序列,该核苷酸序列(i)具有约51%或更大的GC含量,(ii)与SEQ ID NO:1具有73%或更大得一致性,并且(iii)编码包括与SEQ ID NO:2具有90%或更大一致性的一个氨基酸序列的一种病毒融合蛋白。
69.如权利要求68所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有95%或更大一致性的氨基酸序列的一个蛋白。
70.如权利要求68所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个蛋白。
71.如权利要求68至70中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白包括一个标签。
72.如权利要求68至70中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白不包括标签。
73.如权利要求68至72中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量是
76%或更大。
74.如权利要求68至73中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC含量是约58%或更大。
75.如权利要求74所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量约100%。
76.如权利要求74或75所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:17。
77.如权利要求76所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有77%或更大的一致性。
78.如权利要求68至77中任一项所述的分离的核酸,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的一个顺式调节元件。
79.如权利要求78所述的分离的核酸,其中该顺式调节元件包括一个转录后加工元件。
80.如权利要求79所述的分离的核酸,其中该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病毒。
81.如权利要求68至80中任一项所述的分离的核酸,其位于一个表达载体中。
82.一种细胞,包括权利要求81所述的分离的核酸。
83.一种细胞,包括整合到细胞DNA内的权利要求68至77中任一项所述的核苷酸序列。
84.如权利要求82或83所述的细胞,其中该蛋白被保留在该细胞膜中。
85.如权利要求82或83所述的细胞,其分泌该病毒融合蛋白。
86.如权利要求82至85中任一项所述的细胞,其是一种哺乳动物细胞。
87.如权利要求86所述的细胞,其中该细胞是一种非粘附细胞。
88.如权利要求86或87所述的细胞,其中该细胞是一种CHO细胞或CHO衍生的细胞。
89.如权利要求88所述的细胞,其中该细胞是一种CAT-S细胞。
90.如权利要求88所述的细胞,其中该细胞是一种CHO-S细胞。
91.如权利要求86所述的细胞,其中该细胞是一种Vero细胞。
92.如权利要求86所述的细胞,其中该细胞是一种MRC-5细胞。
93.如权利要求86所述的细胞,其中该细胞是一种BSR-T7细胞。
94.如权利要求82至93中任一项所述的细胞,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
95.如权利要求82至94中任一项所述的细胞,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的、权利要求78至80中任一项所述的顺式调节元件。
96.用于表达病毒融合蛋白的方法,包括:将包括权利要求68至77中任一项所述的核苷酸序列的多个细胞与在其下蛋白产生的条件相接触。
97.如权利要求96所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的一个表达载体中。
98.如权利要求96所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的细胞DNA中。
99.如权利要求96至98中任一项所述的方法,其中该细胞是哺乳动物细胞。
100.如权利要求99所述的方法,其中该细胞是非粘附细胞。
101.如权利要求100所述的方法,其中该细胞是CHO细胞或CHO衍生的细胞。
102.如权利要求101所述的方法,其中该细胞是CAT-S细胞。
103.如权利要求101所述的方法,其中该细胞是CHO-S细胞。
104.如权利要求99所述的方法,其中该细胞是Vero细胞。
105.如权利要求99所述的方法,其中该细胞是MRC-5细胞。
106.如权利要求99所述的方法,其中该细胞是BSR-T7细胞。
107.如权利要求96至106中任一项所述的方法,其中该蛋白被保留在该细胞膜中。
108.如权利要求96至106中任一项所述的方法,其中该细胞分泌该蛋白。
109.如权利要求96至108中任一项所述的方法,其中该蛋白产生持续7天或更多天。
110.如权利要求96至109中任一项所述的方法,其中该细胞培养在无动物产品培养条件下。
111.如权利要求96至110中任一项所述的方法,进一步包括确定这些细胞产生的蛋白的量。
112.如权利要求96至111中任一项所述的方法,进一步包括分离该蛋白。
113.如权利要求96至112中任一项所述的方法,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
114.如权利要求96至113中任一项所述的方法,其中该细胞进一步包括与权利要求
68至77中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、权利要求78至80中任一项所述的顺式调节元件。
115.如权利要求96至114中任一项所述的方法,包括向该细胞核中导入权利要求68至77中任一项所述的核苷酸序列。
116.如权利要求115所述的方法,包括向该细胞核中导入与权利要求68至77中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、权利要求78至80中任一项所述的顺式调节元件。
117.如权利要求115或116所述的方法,其中向该细胞核中的导入通过核转染进行。
118.一种核酸,该核酸包括具有约51%或更大GC含量的、编码一种病毒融合蛋白的一个核苷酸序列,该融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有90%或更大一致性的一个氨基酸序列。
119.如权利要求118所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括与SEQID NO:12具有95%或更大一致性的氨基酸序列的一个蛋白。
120.如权利要求118所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的一个蛋白。
121.如权利要求118至120中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白包括一个标签。
122.如权利要求118至120中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白不包括标签。
123.如权利要求118至122中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC含量是约60%或更大。
124.如权利要求123所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量约100%。
125.如权利要求123或124所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:11。
126.如权利要求125所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有65%或更大的一致性。
127.如权利要求125所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有75%或更大的一致性。
128.如权利要求118至127中任一项所述的分离的核酸,其中该病毒融合蛋白缺乏功能膜相关区域。
129.如权利要求128所述的分离的核酸,其中该病毒融合蛋白缺乏对应SEQ ID NO:9的489至539位氨基酸的C端跨膜区域氨基酸。
130.如权利要求118至129中任一项所述的分离的核酸,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的一个顺式调节元件。
131.如权利要求130所述的分离的核酸,其中该顺式调节元件包括一个转录后加工元件。
132.如权利要求131所述的分离的核酸,其中该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病毒。
133.如权利要求118至132中任一项所述的分离的核酸,其位于一个表达载体中。
134.一种细胞,包括权利要求133所述的分离的核酸。
135.一种细胞,包括整合到细胞DNA内的权利要求118至129中任一项所述的核苷酸序列。
136.如权利要求134至135中任一项所述的细胞,其中该病毒融合蛋白被保留在该细胞中。
137.如权利要求134至135中任一项所述的细胞,其分泌该病毒融合蛋白。
138.如权利要求134至137中任一项所述的细胞,其是一种哺乳动物细胞。
139.如权利要求138所述的细胞,其中该细胞是一种非粘附细胞。
140.如权利要求138或139所述的细胞,其中该细胞是一种CHO细胞或CHO衍生的细胞。
141.如权利要求140所述的细胞,其中该细胞是一种CAT-S细胞。
142.如权利要求140所述的细胞,其中该细胞是一种CHO-S细胞。
143.如权利要求138所述的细胞,其中该细胞是一种Vero细胞。
144.如权利要求138所述的细胞,其中该细胞是一种MRC-5细胞。
145.如权利要求138所述的细胞,其中该细胞是一种BSR-T7细胞。
146.如权利要求134至145中任一项所述的细胞,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
147.如权利要求134至146中任一项所述的细胞,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的、权利要求130至132中任一项所述的顺式调节元件。
148.用于表达病毒融合蛋白的方法,包括:将包括权利要求118至129中任一项所述的核苷酸序列的多个细胞与在其下蛋白产生的条件相接触。
149.如权利要求148所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的一个表达载体中。
150.如权利要求148所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的细胞DNA中。
151.如权利要求148至150中任一项所述的方法,其中该细胞是哺乳动物细胞。
152.如权利要求151所述的方法,其中该细胞是非粘附细胞。
153.如权利要求152所述的方法,其中该细胞是CHO细胞或CHO衍生的细胞。
154.如权利要求153所述的方法,其中该细胞是CAT-S细胞。
155.如权利要求153所述的方法,其中该细胞是CHO-S细胞。
156.如权利要求151所述的方法,其中该细胞是Vero细胞。
157.如权利要求151所述的方法,其中该细胞是MRC-5细胞。
158.如权利要求151所述的方法,其中该细胞是BSR-T7细胞。
159.如权利要求148至158中任一项所述的方法,其中该蛋白被保留在该细胞中。
160.如权利要求148至158中任一项所述的方法,其中该细胞分泌该蛋白。
161.如权利要求148至160中任一项所述的方法,其中该蛋白产生持续7天或更多天。
162.如权利要求148至161中任一项所述的方法,其中该细胞培养在无动物产品培养条件下。
163.如权利要求148至162中任一项所述的方法,进一步包括确定这些细胞产生的蛋白的量。
164.如权利要求148至163中任一项所述的方法,进一步包括分离该蛋白。
165.如权利要求148至164中任一项所述的方法,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
166.如权利要求148至165中任一项所述的方法,其中该细胞进一步包括与权利要求
118至129中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、权利要求130至132中任一项所述的顺式调节元件。
167.如权利要求148至166中任一项所述的方法,包括向该细胞核中导入权利要求
118至129中任一项所述的核苷酸序列。
168.如权利要求167所述的方法,包括向该细胞核中导入与权利要求118至129中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、权利要求130至132中任一项所述的顺式调节元件。
169.如权利要求167或168所述的方法,其中向该细胞核中的导入通过核转染进行。

说明书全文

哺乳动物细胞中可溶性病毒融合糖蛋白的表达

[0002] 本申请要求2011年1月28日提交的在先美国临时专利申请号61/437,531的权益,将其通过引用以其全文结合在此。
[0003] 领域
[0004] 技术涉及重组病毒融合糖蛋白的产生(即,表达)以及编码此类病毒融合糖蛋白的核酸。在一些实施例中,提供了用于生产重组人呼吸道合胞病毒融合蛋白(RSV-F)以及人副流感病毒3融合蛋白(hPIV3-F),以及编码此类蛋白的核酸的方法。
[0005] 背景
[0006] 在病毒感染过程中,病毒融合糖蛋白介导病毒进入宿主细胞。病毒融合蛋白投射自病毒包膜表面(如三聚体),并且通过诱导病毒包膜与细胞膜之间的融合介导细胞进入。
存在两类病毒融合蛋白:I型和II型。I型病毒融合蛋白包括但不局限于,副黏病毒、反转
录病毒、冠状病毒、正黏液病毒、以及线状病毒的融合蛋白。II型病毒融合蛋白包括但不局限于,甲病毒以及黄病毒的融合蛋白。I型和II型病毒融合蛋白两者在融合时排列为三聚
体。I型病毒融合蛋白被合成为单体并且在共翻译插入内质网膜中、糖基化并折叠之后,成为三体。三聚(trimerization)之后,I型病毒性融合前体(F0)蛋白被切割并且由宿主蛋白酶激活。例如,在副黏病毒中,激活的I型病毒融合蛋白包括膜-锚定亚基以及膜-远端
亚基,各自地称为F1和F2。该膜-锚定亚基包含一个跨膜结构域以及一个新疏基端,
称作融合肽。
[0007] 副黏病毒融合蛋白可以包括来自例如像呼吸道合胞病毒(RSV)以及人副流感病毒(hPIV)的病毒的融合蛋白。RSV感染产生了严重的下呼吸道疾病,特别是在早产儿中。用帕利珠单抗,一种中和RSV的单克隆抗体进行预防(prophylaxis)可以防止(prevent)早产儿中由RSV引起的下呼吸道感染,然而没有批准用于RSV的疫苗。hPIV也是幼儿中下呼吸道感染的常见原因。hPIV存在四种血清型,包括hPIV-1(哮吼以及其他上和下呼吸道疾病
的最常见原因);hPIV-2(哮吼以及其他上和下呼吸道疾病的原因);hPIV-3(与细支气管炎以及炎有关);以及hPIV-4。类似于RSV,没有批准用于hPIV的疫苗。
[0008] 概述
[0009] 在一些实施例中,提供了一种分离的核酸,该核酸包括具有约51%或更大GC含量的、编码可溶性病毒融合蛋白的一个核苷酸序列,该融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有90%
或更大一致性的一个氨基酸序列。
[0010] 在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有91%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有
92%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与
SEQ ID NO:7具有93%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷
酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有94%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些
实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有95%或更大一致性的一个氨基酸序
列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有96%或更大一致
性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具
有97%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括
与SEQ ID NO:7具有98%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核
苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有99%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一
些实施例中,该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:7的一个氨基酸序列的蛋白。
[0011] 在一些实施例中,该可溶性病毒融合蛋白缺乏功能膜相关区域。有时,该可溶性病毒融合蛋白缺乏对应SEQ ID NO:2的525至574个氨基酸的C端跨膜区域氨基酸。
[0012] 在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约45%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约46%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约47%或更
大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约48%或更大。在一些实施例中,该核苷酸
序列的GC含量约49%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约50%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约51%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC含量约52%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约53%或更大。在一
些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约54%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC
含量约55%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约56%或更大。在一些实施
例中,该核苷酸序列的GC含量约57%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约
58%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约59%或更大。在一些实施例中,该
核苷酸序列的GC含量约60%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约61%或
更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约62%或更大。在一些实施例中,该核苷
酸序列的GC含量约63%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约64%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约65%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC含量约70%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约75%或更大。在一
些实施例中,该GC含量约80%或更大。在一些实施例中,该GC含量约85%或更大。在一些
实施例中,该GC含量约90%或更大。在一些实施例中,该GC含量约95%或更大。在一些实
施例中,该GC含量约99%或更大。
[0013] 在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约70%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约75%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约76%或
更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约77%或更大。在一些实施例中,该核苷
酸序列的GC3含量约78%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约79%或更
大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约80%或更大。在一些实施例中,该核苷酸
序列的GC3含量约85%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约90%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约95%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC3含量约96%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约97%或更大。在
一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约98%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的
GC3含量约99%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约100%。某些实施例
针对包括核苷酸序列SEQ ID NO:6的核酸。某些实施例针对包括核苷酸序列SEQ ID NO:5
的核酸。
[0014] 在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有60%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有61%或更大的一致性。在一些实施例中,该
核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有62%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:3具有63%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具
有64%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有65%或更大的
一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有66%或更大的一致性。在一
些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有67%或更大的一致性。在一些实施例中,该
核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有68%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:3具有69%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具
有70%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有71%或更大的
一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有72%或更大的一致性。在一
些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有73%或更大的一致性。在一些实施例中,该
核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有74%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:3具有75%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具
有76%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有77%或更大
的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有78%或更大的一致性。在
一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有79%或更大的一致性。在一些实施例中,
该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有80%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列
与SEQ ID NO:3具有85%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3
具有90%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有95%或更
大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有99%或更大的一致性。
[0015] 在一些实施例中,该核酸进一步包括与该核苷酸序列功能相关的顺式调节元件。有时,该顺式调节元件包括转录后加工元件。有时,该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎
毒。在一些实施例中,该核酸位于表达载体中。在一些情况下,该核酸编码包括标签的一种蛋白。
[0016] 在一些实施例中,该核酸是密码子优化的并且包括一个核苷酸序列,该核苷酸序列(i)具有约46%或更大的GC含量,并且(ii)编码与SEQ ID NO:7具有约90%或更大一
致性的一种可溶性病毒融合蛋白。
[0017] 在一些实施例中,该核酸具有核苷酸序列SEQ ID NO:4。
[0018] 在某些实施例中,还提供了一种分离的核酸,该核酸包括一个核苷酸序列,该核苷酸序列(i)具有约51%或更大的GC含量,(ii)与SEQ ID NO:1具有73%或更大得一致性,并且(iii)编码包括与SEQ ID NO:2具有90%或更大一致性的一个氨基酸序列的一种病毒
融合蛋白。
[0019] 在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有91%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有
92%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与
SEQ ID NO:2具有93%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷
酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有94%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些
实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有95%或更大一致性的一个氨基酸序
列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有96%或更大一致
性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具
有97%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括
与SEQ ID NO:2具有98%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核
苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有99%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一
些实施例中,该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:2的一个氨基酸序列的蛋白。
[0020] 在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约45%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约46%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约47%或更
大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约48%或更大。在一些实施例中,该核苷酸
序列的GC含量约49%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约50%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约51%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC含量约52%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约53%或更大。在一
些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约54%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC
含量约55%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约56%或更大。在一些实施
例中,该核苷酸序列的GC含量约57%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约
58%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约59%或更大。在一些实施例中,该
核苷酸序列的GC含量约60%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约61%或
更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约62%或更大。在一些实施例中,该核苷
酸序列的GC含量约63%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约64%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约65%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC含量约70%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约75%或更大。在一
些实施例中,该GC含量约80%或更大。在一些实施例中,该GC含量约85%或更大。在一些
实施例中,该GC含量约90%或更大。在一些实施例中,该GC含量约95%或更大。在一些实
施例中,该GC含量约99%或更大。
[0021] 在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约70%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约75%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约76%或
更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约77%或更大。在一些实施例中,该核苷
酸序列的GC3含量约78%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约79%或更
大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约80%或更大。在一些实施例中,该核苷酸
序列的GC3含量约85%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约90%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约95%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC3含量约96%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约97%或更大。在
一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约98%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的
GC3含量约99%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约100%。某些实施例
针对包括核苷酸序列SEQ ID NO:17的核酸。
[0022] 在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有60%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有61%或更大的一致性。在一些实施例中,该
核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有62%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:1具有63%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具
有64%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有65%或更大的
一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有66%或更大的一致性。在一
些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有67%或更大的一致性。在一些实施例中,该
核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有68%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:1具有69%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具
有70%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有71%或更大的
一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有72%或更大的一致性。在一
些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有73%或更大的一致性。在一些实施例中,该
核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有74%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:1具有75%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具
有76%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有77%或更大
的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有78%或更大的一致性。在
一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有79%或更大的一致性。在一些实施例中,
该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有80%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列
与SEQ ID NO:1具有85%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1
具有90%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有95%或更
大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有99%或更大的一致性。
[0023] 在一些实施例中,该核酸进一步包括与该核苷酸序列功能相关的顺式调节元件。有时,该顺式调节元件包括转录后加工元件。有时,该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病
毒。在一些实施例中,该核酸位于表达载体中。在一些情况下,该核酸编码包括标签的一种蛋白。
[0024] 还提供了一种分离的核酸,该核酸包括具有约51%或更大GC含量的、编码一种病毒融合蛋白的一个核苷酸序列,该融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有90%或更大一致性的
一个氨基酸序列。
[0025] 在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有91%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有
92%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与
SEQ ID NO:12具有93%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷
酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有94%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一
些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有95%或更大一致性的一个氨基酸
序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有96%或更大一
致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12
具有97%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该核苷酸序列编码包
括与SEQ ID NO:12具有98%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在一些实施例中,该
核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有99%或更大一致性的一个氨基酸序列的蛋白。在
一些实施例中,该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:12的一个氨基酸序列的蛋白。
[0026] 在一些实施例中,该可溶性病毒融合蛋白缺乏功能膜相关区域。有时,该可溶性病毒融合蛋白缺乏对应SEQ ID NO:9的489至539位氨基酸的C端跨膜区域氨基酸。
[0027] 在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约45%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约46%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约47%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约48%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC含量约49%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约50%或更大。在一
些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约51%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC
含量约52%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约53%或更大。在一些实施
例中,该核苷酸序列的GC含量约54%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约
55%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约56%或更大。在一些实施例中,该
核苷酸序列的GC含量约57%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约58%或
更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约59%或更大。在一些实施例中,该核苷
酸序列的GC含量约60%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约65%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC含量约70%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC含量约75%或更大。在一些实施例中,该GC含量约80%或更大。在一些实施例中,该
GC含量约85%或更大。在一些实施例中,该GC含量约90%或更大。在一些实施例中,该GC
含量约95%或更大。在一些实施例中,该GC含量约99%或更大。
[0028] 在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约70%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约75%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约76%或
更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约77%或更大。在一些实施例中,该核苷
酸序列的GC3含量约78%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约79%或更
大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约80%或更大。在一些实施例中,该核苷酸
序列的GC3含量约85%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约90%或更大。
在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约95%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列
的GC3含量约96%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约97%或更大。在
一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约98%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的
GC3含量约99%或更大。在一些实施例中,该核苷酸序列的GC3含量约100%。某些实施例
针对包括核苷酸序列SEQ ID NO:11的核酸。
[0029] 在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有60%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有61%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有62%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:10具有63%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10
具有64%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有65%或更
大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有66%或更大的一致性。
在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有67%或更大的一致性。在一些实施例
中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有68%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸
序列与SEQ ID NO:10具有69%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID
NO:10具有70%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有71%
或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有72%或更大的一致
性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有73%或更大的一致性。在一些实
施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有74%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有75%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ
ID NO:10具有76%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有
77%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有78%或更大的
一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有79%或更大的一致性。在一
些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有80%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有85%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与
SEQ ID NO:10具有90%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10
具有95%或更大的一致性。在一些实施例中,该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有99%或更
大的一致性。
[0030] 在一些实施例中,该核酸进一步包括与该核苷酸序列功能相关的顺式调节元件。有时,该顺式调节元件包括转录后加工元件。有时,该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病
毒。在一些实施例中,该核酸位于表达载体中。在一些情况下,该核酸编码包括标签的一种蛋白。
[0031] 还提供了包括任何上述核酸的一种细胞,这些核酸包括任何对应实施例。有时细胞包括整合到细胞DNA上的核苷酸序列。有时细胞分泌可溶性病毒融合蛋白。有时病毒融
合蛋白被保留在细胞中。有时病毒融合蛋白被保留在细胞膜中。在一些情况下,细胞表达
每毫升细胞至少1微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少2微克蛋白。在一
些情况下,细胞表达每毫升细胞至少3微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少
4微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少5微克蛋白。在一些情况下,细胞表
达每毫升细胞至少6微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少7微克蛋白。在
一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少8微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少9微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少10微克蛋白。在一些情况下,细
胞表达每毫升细胞至少100微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少200微克
蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少300微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少400微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少500微克蛋白。在
一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少600微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少700微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少800微克蛋白。在一些情况
下,细胞表达每毫升细胞至少900微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少1毫
克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少约1.3毫克或更多蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少约1.6毫克或更多蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至
少2毫克蛋白。
[0032] 在一些情况下,细胞是哺乳动物细胞。有时,细胞是非粘附细胞。有时,细胞是CHO细胞或CHO-衍生的细胞。有时,细胞是CAT-S细胞。有时,细胞是CHO-S细胞。在一些情况下,细胞是非洲绿猴肾细胞株系(Vero)细胞。在一些情况下,细胞是MRC-5细胞。在一些情况下,细胞是BSR-T7细胞。
[0033] 在一些情况下,细胞在细胞核中合成编码病毒融合蛋白的核酸。
[0034] 在某些实施例中,还提供了用于表达可溶性病毒融合蛋白的方法,该方法包括将包括上文提供的任何核苷酸序列以及它们的对应实施例的多个细胞与在其下产生蛋白的
条件接触。在该方法的一些实施例中,核苷酸序列位于这些细胞内的表达载体中。有时该
核苷酸序列位于这些细胞的细胞DNA中。
[0035] 在该方法的一些实施例中,细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中,细胞是非粘附细胞。有时,细胞是CHO细胞或CHO-衍生的细胞。有时,细胞是CAT-S细胞。有时,细胞是CHO-S细胞。在一些情况下,细胞是Vero细胞。在一些情况下,细胞是MRC-5细胞。在一些
情况下,细胞是BSR-T7细胞。
[0036] 在该方法的一些实施例中,细胞分泌该蛋白。在该方法的一些实施例中,蛋白被保留在细胞中。在该方法的一些实施例中,蛋白被保留在细胞膜中。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少1微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少2微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少3微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少
4微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少5微克蛋白。在一些情况下,细胞表
达每毫升细胞至少6微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少7微克蛋白。在
一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少8微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少9微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少10微克蛋白。在一些情况下,细
胞表达每毫升细胞至少100微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少200微克
蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少300微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少400微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少500微克蛋白。在
一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少600微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少700微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少800微克蛋白。在一些情况
下,细胞表达每毫升细胞至少900微克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少1毫
克蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少约1.3毫克或更多蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至少约1.6毫克或更多蛋白。在一些情况下,细胞表达每毫升细胞至
少约2毫克或更多蛋白。
[0037] 在该方法的一些实施例中,持续5天或更多天产生蛋白。在该方法的一些实施例中,持续6天或更多天产生蛋白。在该方法的一些实施例中,持续7天或更多天产生蛋白。
在该方法的一些实施例中,持续8天或更多天产生蛋白。在该方法的一些实施例中,持续10天或更多天产生蛋白。
[0038] 在该方法的一些实施例中,将这些细胞在无动物产品的培养条件下培养。有时该方法进一步包括确定这些细胞产生的蛋白量。在一些情况下,该方法进一步包括分离蛋白。
[0039] 在该方法的一些实施例中,细胞在细胞核中合成编码病毒融合蛋白的核酸。有时核酸被导入到细胞核中。在某些实施例中,核酸通过核转染被导入到细胞核中。
[0040] 在以下说明书、实例、权利要求书以及附图中进一步描述了某些实施例。
[0041] 附图简要说明
[0042] 这些附图说明了本技术的实施例且并非限制性的。为了清楚和便于说明,这些附图不按比例作图,并且,在一些情况中,可能增大或扩大地示出不同方面以有助于具体实施例的理解。
[0043] 图1A说明了重组RSV-F蛋白表达盒的一个示意图。图1B提供了针对构建体FA2、FOPT以及FGC的RSV-F蛋白GC含量的比较。
[0044] 图2提供了pCLD550v4合成物MCS-SV40pA表达载体的一个图解。
[0045] 图3提供了具有克隆到FseI和SbfI限制酶切位点的可溶GC3构建体的pCLD550v4合成物MCS-SV40pA表达载体的一个图解。
[0046] 图4示出重组RSV-F蛋白表达通过增加GC丰度得以改进。在用pCMVscript RSV-F蛋白表达载体转染后36h,针对来自BSR-T7、MRC-5、以及Vero细胞系溶解产物的三份RSV-F蛋白呈现蛋白质印迹。针对每一种细胞类型对FA2(野生型)、Fopt(密码子优化的)、以及FGC(富含GC的)构建体进行试验。蛋白上样被标准化为β-肌动蛋白。
[0047] 图5示出跨转染野生型(F)、密码子优化的(Fopt)以及富含GC的(Fxgc)序列的细胞系的RSV-F的表达。将编码相同RSV-F蛋白的三个核苷酸译本(version)构建在pCMVscript表达载体中并且转染到BSRT7、MRC-5、以及Vero细胞中。虽然RSV-F的水平
(48kDa)在野生型序列转染的任何细胞中都未检测出,但对于该密码子优化序列,该蛋白在MRC-5与BSRT7细胞中各自地在低至中等水平表达。当转染富含GC的序列时,RSV-F蛋白
水平在所有细胞系中均最高。
[0048] 图6示出重组RSV-F蛋白表达通过增加GC丰度得以改进并且通过WPRE的存在得以增强。对来自经pEBNA RSV-F蛋白表达载体转染的293F细胞的溶解产物的RSV-F蛋白
呈现蛋白质印迹。将该溶解产物首先稀释至标准化用于基于β-肌动蛋白的蛋白上样。然
后进一步稀释这些标准化了的溶解产物,如在该印迹的顶部指出的,为了便于比较,在上样之前,将其中具有更高RSV-F蛋白(Fopt、Fopt-WPRE、FGC、以及FGC-WPRE)水平的溶解产物比具有更低RSV-F蛋白(FLong、FLong-WPRE、FA2、以及FA2-WPRE)水平的那些多稀释10倍。为了比较,以同样方式,对来自受感染的HEp-2细胞进行的蛋白质印迹包括在内。使用星号来标记在48kDa
处观察到的模糊条带。蛋白质印迹代表每一个实验的至少三个重复。
[0049] 图7A和图7B示出增加的GC丰度不改进来自重组b/hPIV3细胞质表达载体的重组RSV-F蛋白表达。图7A提供了b/hPIV3+RSV-F表达载体的一个示意图。图7B示出针对
来自经b/hPIV3-RSV-F重组病毒感染的Vero细胞(在0.1MOI感染且在感染48h后采集)溶
解产物的RSV-F蛋白的蛋白质印迹。蛋白上样被标准化为PIV3HN基因表达。蛋白质印迹
代表每一个实验的至少三个重复。
[0050] 图8A和图8B示出在重组RSV-F蛋白表达过程中发生的过早多聚腺苷酸化。图8A提供了每个RSV-F蛋白序列中发现的多聚腺苷酸化信号序列的概述。图8B示出在纯化自
经pEBNA RSV-F蛋白表达载体转染的293F细胞的RNA上进行的3’RACE RT-PCR的1%琼脂
糖凝胶分析。为了便于比较,在该PCR中使用2微升的野生型cDNA,而在该PCR中使用0.5
微升的Fopt以及FGC cDNA。负反转录(RT)步骤对照包括在凝胶的下半部分中。如表明的,全长转录物在长度上应当为约1,700个核苷酸。
[0051] 图9示出一旦转染,与增加的合胞体形成关联的增加的RSV-F蛋白表达。经pEBNARSV-F蛋白表达载体转染后24h的293Ad细胞的显微图像。包括编码绿色荧光蛋白(gfp)
的pEBNA载体以粗略估计转染率。图像代表每一个实验的至少三个重复。
[0052] 图10示出sRSV-F构建体的CAT-S试验。呈现CAT-S转染子上清液的蛋白质印迹。6
对于每一个细胞群体,将上清液标准化为每mL2x10 个活细胞。如所表明的,将蛋白用莫维珠单抗亦或山羊抗-RSV显现。将以下样品上样到各个编号的孔中:1.野生型;2.密码子优
化的;3.富含GC;4.HL2(中等GC3);5.GH5;6.gfp。
[0053] 图11示出sRSV-F构建体的CAT-S试验。呈现经莫维珠单抗(在1/10,000稀释度)以及抗-人HPR(在1/1000稀释度)、或山羊抗-RSV的、12%还原SDS-PAGE蛋白质印迹。对
6
于每一个细胞群体,将上清液标准化为每mL2x10 个活细胞。如所表明的,将蛋白用莫维珠单抗亦或山羊抗-RSV显现。将以下样品上样到各个编号的孔中:1.MAGIC MARK;2.SEEBLUE PLUS;3.野生型;4.密码子优化的;5.富含GC;6.HL2(中等GC3);7.GH5;8.gfp。呈现印迹的三种不同的曝光。
[0054] 图12示出sRSV-F构建体的CHO-S试验。呈现CHO-S转染子的蛋白质印迹。对于6
每一个细胞群体,将上清液标准化为每mL2x10 个活细胞。如所表明的,将蛋白用莫维珠单抗亦或山羊抗-RSV显现。将以下样品上样到各个编号的孔中:1.野生型;2.密码子优化
的;3.富含GC;4.HL2(中等GC3);5.GH5;6.gfp;7.sRSV-F克隆10(CAT-S产生的sRSV-F蛋白用作对照)。
[0055] 图13示出sRSV-F构建体的CHO-S试验。呈现CHO-S转染子的蛋白质印迹。将蛋白用莫维珠单抗显现。将以下样品上样到各个编号的孔中:1.MAGIC MARK;2.SEEBLUE PLUS2;
3.野生型;4.密码子优化的;5.富含GC;6.HL2(中等GC3);7.GH5;8.gfp;9.sRSV-F克隆
10(CAT-S产生的sRSV-F蛋白用作对照)。呈现该印迹在2分钟、5分钟以及10分钟时的
曝光。
[0056] 图14示出通过ELISA、来自CAT-S以及CHO-S细胞的sRSV-F产生水平。针对每一个转染子上清液,表明了sRSV-F蛋白的ELISA滴定。对于每一个细胞群体,将上清液标准
6
化为每mL2x10 个活细胞并且通过定量ELISA对sRSV-F定量进行分析。
[0057] 图15示出CAT-S(左)以及CHO-S(右)细胞中sRSV-F表达的FACS分析。针对每一个转染子呈现展示不同水平sRSV-F蛋白的细胞数目。
[0058] 图16A呈现CAT-S细胞中sRSV-F表达的FACS分析。针对每一个转染子提供平均荧光强度。用于CAT-S细胞的平均荧光强度的刻度是150至750。图16B呈现CHO-S细胞
中sRSV-F表达的FACS分析。针对每一个转染子提供平均荧光强度。用于CHO-S细胞的平
均荧光强度的刻度是0至300。
[0059] 图17呈CAT-S以及CHO-S细胞中sRSV-F表达的FACS分析。图16A和图16B中呈现的这些图表中的数据已经合并到图17中以提供针对每种细胞类型的荧光强度的并列
比较。
[0060] 图18示出通过定量ELISA确定CAT-S亲本克隆中的sRSV-F蛋白水平。使用定量的夹心ELISA,针对重组蛋白表达,筛选来自经sRSV-F核苷酸序列的可变形式转染的初始
96-孔板CAT-S克隆的培养基。初始筛选表明最高高水平sRSV-F由包含富含GC编码序列
的细胞产生,该水平比密码子优化的亦或野生型序列展示的好大于10倍。
[0061] 图19示出通过最高CAT-S(富含GC)亲本克隆的sRSV-F产生。使用定量的夹心ELISA,针对重组sRSV-F蛋白表达,筛选来自顶端四个CAT-S亲本克隆的初始摇瓶过度生长
培养的培养基。结果表明这些细胞可以产生高达90微克/mLsRSV-F的峰值产量,这比前面
达到的高至少六倍。
[0062] 图20示出最高CAT-S(富含GC)亲本克隆的抗-RSV-F蛋白质印迹分析。将来自顶端四个CAT-S亲本克隆的初始摇瓶过度生长培养的培养基在非还原和还原条件下经由
SDS-PAGE进行跑胶并用山羊抗-RSV多克隆抗体进行检测。sRSV-F水平在摇瓶培养过程急
剧增加并且该蛋白的高分子量聚集体在非还原条件下明显。
[0063] 图21示出hPIV3-F构建体的CAT-S试验。呈现CAT-S转染子溶解产物的蛋白质印迹。溶解产物产生自用来自相同转染混合物的细胞接种的三个独立孔。如所表明的,将
蛋白用多克隆抗-PIV3、抗-HIS、或抗-C-端HIS显现。
[0064] 图22呈现遗传码的一个表。该表修改自http地址www.mun.ca/biology/scarr/MGA2_03-20.html,通过引用结合在此。
[0065] 图23示出如通过定量ELISA确定的CAT-S亲本克隆中的sRSV-F蛋白水平。在按比例放大过程中,通过定量ELISA,筛选来自经sRSV-F核苷酸序列的可变形式转染的CAT-S
克隆的培养基。不选择用灰色突出显示的克隆用于进一步生长。迭代筛选表明最高水平
sRSV-F由包含富含GC编码序列的细胞产生,该水平通常比密码子优化的克隆展示的好大
于10倍。
[0066] 详细说明
[0067] 在此提供了重组表达的病毒融合蛋白,编码它们的核酸,包含此类核酸的核苷酸序列的细胞,以及用于从此类细胞生产融合蛋白的方法。表达的重组病毒融合蛋白可以用
于病毒融合蛋白的结构研究以及它们的膜融合活性的研究。由于病毒融合蛋白是某些病毒
表面上经常发现的糖蛋白并且因此容易进行免疫监视,因此这些蛋白可以用作针对中和抗
体的标靶。比起在病毒表面上发现的其他糖蛋白,病毒融合蛋白通常更不可变,并且病毒融合蛋白的表达对于对抗表达这些糖蛋白的某些病毒的疫苗的开发可以是有用的。前述应
用可以取决于具体病毒融合蛋白的适当表达水平,该水平通过在此描述的组合物和方法提
供。
[0068] 病毒融合糖蛋白
[0069] 在经由膜融合诱导的病毒感染过程中,病毒融合糖蛋白介导病毒进入宿主细胞。在此提供了重组表达的病毒融合蛋白。如在此使用,“病毒融合蛋白”是指任何病毒融合蛋白,包括但不局限于,天然病毒融合蛋白、重组病毒融合蛋白、合成产生的病毒融合蛋白,以及提取自细胞的病毒融合蛋白。如在此使用,“天然病毒融合蛋白”是指自然中存在的、由天然发生的病毒基因或病毒RNA编码的病毒融合蛋白。如在此使用,术语“重组病毒融合蛋白”是指衍生自工程化核苷酸序列的并且是体外和/或体内表达系统中产生的病毒融合蛋
白。与病毒融合蛋白可互换地使用的替代名称包括“病毒融合糖蛋白”以及“F蛋白”。病毒融合蛋白包括来自不同病毒和病毒株(包括但不局限于人类以及非人类的病毒株)的相
关蛋白。病毒融合蛋白可以通过氨基酸序列、蛋白结构、和/或功能相关。病毒融合蛋白包括指定为病毒融合蛋白的所有种类的成员,包括但不局限于,被指定为I型和II型病毒融
合蛋白的成员。
[0070] 病毒融合蛋白包括具有或不具有信号肽的前体(F0)蛋白,以及激活的和/或成熟的片段,包括F1和F2亚基。如在此使用,术语“成熟的”以及“激活的”是指已经通过宿主蛋白酶从前体蛋白转换为成熟融合蛋白的病毒融合蛋白。典型地,激活的病毒融合蛋白包括膜-锚定亚基以及膜-远端亚基,在某些类型的病毒中,它们各自地称为F1和F2。活性
的F1和F2亚基通常经由一个二硫键连接在一起。病毒融合蛋白可以是任何三级结构,例
如像单体、二聚体、三聚体或六聚体。
[0071] 重组病毒融合蛋白可以是任何长度并且可以包括任何修饰、融合、突变、置换、氨基酸改变、缺失、插入或添加,其条件是该病毒融合蛋白保留天然的、全长的、成熟的病毒融合蛋白对应物特有的至少一个功能和/或抗原特征。例如,重组病毒融合蛋白可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸修饰,其条件是该病毒融合蛋白保留天然的、全长的、成熟的病毒融合蛋白对应物特有的至少一个功能和/
或抗原特征。病毒融合蛋白的功能特征是,例如,诱导膜融合的能。该功能特征不需要
在与天然的、全长的、成熟的病毒融合蛋白对应物所展示的相同水平或活性。在一些实施
例中,重组病毒融合蛋白保留天然的、全长的、成熟的病毒融合蛋白对应物的至少约20%的功能特征活性(例如,该对应物的功能特征活性的约25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、
65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%)。
[0072] 重组病毒融合蛋白活性可以通过本领域中已知的任何用于融合蛋白功能的测定进行评估。例如,表达病毒融合蛋白的细胞可以经由显微镜检查法针对细胞与细胞之间的
融合和/或合胞体形成进行监控,例如像实例2中在此描述的细胞融合测定。用于膜融合
的其他测定包括,例如,涉及荧光/猝灭系统的测定或采用存在于分离囊泡中的协同荧光
组分的测定,此时膜融合引起可检测出的信号。此类测定是可商购的并且包括例如,使用
ANTS/DPX(英杰公司(Invitrogen))的荧光猝灭测定以及使用Tb3+/DPA(英杰公司)的荧光增强测定。
[0073] ANTS/DPX荧光猝灭测定可以用于通过病毒融合蛋白确定膜融合活性。该测定基于通过阳离子淬灭剂DPX的聚阴离子荧光团的ANTS的碰撞猝灭。将表达病毒融合蛋白的
分离囊泡群体中的其中之一或两者每一个装入ANTS或DPX。囊泡融合引起ANTS荧光的淬
灭。在此类测定中可以采用的其他荧光/淬灭剂对包括但不局限于,HPTS/DPX、芘四磺酸/
DPX、ANTS/铊(Tl+)、ANTS/铯(Cs+)、荧光黄(HPTS、H348)/铊(TI+)、荧光黄(HPTS、H348)/铯(Cs+)、芘四磺酸(P349)/铊(TI+)以及芘四磺酸(P349)/铯(Cs+)。
[0074] Tb3+/吡啶二羧酸(DPA)测定也可以用于通过病毒融合蛋白确定膜融合活性。在Tb3+/DPA测定中,表达病毒融合蛋白的分离囊泡群体装入TbCl3或DPA。囊泡融合导致
Tb3+/DPA螯合物的生成,该螯合物比游离Tb3+具有约10,000倍更高的荧光。
[0075] 例如,通过化学修饰或翻译后修饰,可以进一步修饰重组病毒融合蛋白。此类修饰包括但不局限于,聚乙二醇化白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、hasylation、氨基甲酰化、硫酸化、磷酸化、以及本领域中已知的其他多肽修饰。在此提供的病毒融合蛋白可以进一步通过初级氨基酸序列的稀释,通过一个或多个氨基酸的缺
失、添加、或置换进行修饰。例如,通过翻译后糖基化可以进一步修饰重组病毒融合蛋白。
重组病毒融合蛋白可以是完全糖基化、部分糖基化、去糖基化或非糖基化的。在一些实施
例中,重组病毒融合蛋白(例如,RSV-F融合蛋白、可溶RSV-F融合蛋白、可溶hPIV-3融合蛋白)可以具有类似于、基本上等同于、或等同于天然对应物蛋白(例如,Rixon(里克森)等人,
2002J.Gen.Virol.(《普通病毒学杂志》)83:61-66)的糖基化特性的糖基化特性。如在此使用,术语“糖基化特性”是指位于糖基化蛋白上的氨基酸以及在每一个位点的一个或多个糖基化部分的类型。如在此使用,“糖基化位点”是指水化物部分可以附接到其上的多肽中的一个氨基位置。典型地,糖基化蛋白包含可以附接到一个或多个碳水化物部分上的一
个或多个氨基酸残基,如天冬酰胺酸或丝氨酸。如在此使用,“天然糖基化位点”是指当该天然多肽在自然中产生时,在自然多肽中附接到碳水化物部分上一个氨基酸位置。如在此使
用,“完全糖基化的”重组病毒融合蛋白是该多肽中全部天然糖基化位点处都发生糖基化的多肽。如在此使用,与天然糖基化的病毒融合蛋白相比,“去糖基化的”重组病毒融合蛋白由于它具有更少的附接到该多肽上的碳水化物部分(例如,借助通过突变去除的更少数至高
达全部糖基化位点)具有减少的糖基化。去糖基化病毒融合蛋白还包括具有通过化学或酶
切去除或部分去除的一个或多个碳水化物部分的多肽。如在此使用,“非糖基化的”重组病毒融合蛋白是不具有糖基化的多肽(即,该蛋白中不包含附接到糖基化位点的碳水化物部
分)。非糖基化多肽可以由不糖基化该多肽的宿主(例如,原核生物宿主)通过全部糖基化位点的消除(例如,糖基化位点氨基酸的突变),或来自糖基化蛋白的糖基化部分的消除来产生。
[0076] 重组病毒融合糖蛋白可以包括本领域中已知的多个糖苷键中的任一个,包括但不局限于N-糖苷键(例如,GlcNAc-β-Asn,Glc-β-Asn,Rha-Asn以及Glc-β-Arg键);O-糖苷键(例如,连接至Ser,Thr,Tyr,Hyp[羟脯氨酸],以及Hyl[羟赖氨酸]的键;GalNAc-Ser/Thr,GalNAc-β-Ser/Thr,Gal-Ser/Thr,Man-Ser/Thr,Fuc-Ser/Thr,Glc-β-Ser,
Pse-Ser/Thr,DiActrideoxyhexose-Ser/Thr,FucNAc-β-Ser/Thr,Xyl-β-Ser,Glc-Thr,GlcNAc-Thr,Gal-β-Hyl,Gal-Hyp,Gal-β-Hyp,Ara-Hyp Ara-β-Hyp,GlcNAc-Hyp,
Glc-Tyr以及Glc-β-Tyr键);C-甘露糖基键(例如,通过C-C键连接至Trp的C-2上的甘
露糖基键);磷酸糖基键(例如,糖(例如,GlcNAc,Man,Xyl,以及Fuc)经由磷酸二酯键附接到蛋白上;GlcNAc-1-P-Ser,Man-1-P-Ser,Xyl-1-P-Ser,Fuc-β-1-P-Ser键);以及糖基磷脂酰肌醇化键(例如,Man连接至磷酸乙醇胺,其进而附接到蛋白的端羧基上)。使用本领域中已知的方法(例如,Spiro(斯皮罗),Glycobiology(《糖生物学》)12:43R-56R(2002))可以评估糖基化的程度。
[0077] 重组病毒融合蛋白包括来自表达融合蛋白的病毒或其病毒株的蛋白。I型病毒融合蛋白由以下病毒表达,这些病毒包括但不局限于,副黏病毒、反转录病毒、冠状病毒、正黏液病毒、以及线状病毒。II型病毒融合蛋白由以下病毒表达,这些病毒包括但不局限于,甲病毒以及黄病毒。I型病毒融合蛋白包括,例如,副黏病毒融合蛋白。副黏病毒是可以引起若干人类和动物疾病的反义单链RNA病毒。副黏病毒融合蛋白投射自病毒包膜表面如三聚
体,并且通过诱导病毒包膜与细胞膜之间的融合介导细胞进入,并且通常需要中性pH以用
于膜融合活性。副黏病毒家族的病毒包括但不局限于,新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疫病毒、犬瘟热病毒、海豹瘟热病毒、小反刍兽疫病毒(PPR)、仙台病毒、人副流感病毒1、2、3和4、感冒病毒、猿猴副流感病毒5、梅南高病毒、Tioman病毒、Tuhoko病毒1、2和3、人呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、禽肺病毒、人类偏肺病毒、枪头蛇病毒、纳里瓦病毒、树鼩副黏病毒、Salem病毒、J病毒、莫斯曼病毒以及Beilong病毒。
[0078] 重组病毒融合蛋白可以是,例如,呼吸道合胞病毒融合蛋白(RSV-F)。RSV-F蛋白可以是本领域中已知的任何RSV株或分离群,包括,例如,人的株例如A2,Long,ATCC
VR-26,19,6265,E49,E65,B65,RSB89-6256,RSB89-5857,RSB89-6190,以及RSB89-6614;
或牛的株例如ATue51908,375,以及A2Gelfi;或羊的株。RSV-F氨基酸序列可以是在此提
供的任何RSV-F氨基酸序列或具有高达10%的在此提供的RSV-F氨基酸序列变体的任何序
列(例如,该变体氨基酸序列可以与在此提供的氨基酸序列具有约90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%或99%的一致性,或相对于在此提供的氨基酸序列可以包括1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰)。例如,野生型RSV-F人类株A2的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中列出。
[0079] 重组病毒融合蛋白还可以包括,例如,hPIV3融合蛋白(hPIV3-F)。在此提供的hPIV3-F蛋白可以来自本领域中已知的任何hPIV3株或分离群,包括,例如像,株14702、
ZHYMgz01、LZ22、Texas/12084/1983、以及Wash/47885/57。HPIV3-F氨基酸序列可以是在
此提供的任何HPIV3-F氨基酸序列或具有高达10%的在此提供的HPIV3-F氨基酸序列变体
的任何序列(例如,该变体氨基酸序列可以与在此提供的氨基酸序列具有约90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性,或相对于在此提供的氨基酸序列可以包括1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰)。例如,野生型hPIV3-F株Texas/12084/1983的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中列出。
[0080] 可溶性病毒融合蛋白
[0081] 在此还提供了重组可溶性病毒融合蛋白。天然的、全长的病毒融合蛋白典型地包括膜相关区域,以及通常缺乏常位于该天然蛋白的C-端区域的功能膜相关区域的重组可
溶性病毒融合蛋白。重组可溶性病毒融合蛋白可以通过病毒融合蛋白的功能膜相关区域
的缺失、突变、或本领域中已知的任何破坏模式产生。例如,该膜相关区域的任何部分或全部可以被去除或修饰,其条件是该膜相关区域不是可检测地发挥功能的(例如,不再存在于该膜中的区域),以及(ii)某一百分率的膜相关区域残余物(例如,约50%或更少的残余物)被去除(例如,约50%或更多的去除)或经修饰(例如,约50%或更大的修饰)。被破坏的膜相关区域不再赋予蛋白与质膜的相关性的程度可以通过本领域中已知的、可以评估蛋白的
膜相关性的任何技术来确定。例如,可以进行该病毒融合蛋白以及已知的膜相关蛋白的共
免疫染色使保留在该膜中的蛋白显现。在此提供了可溶性病毒融合蛋白的实例并且包括而
不局限于可溶性RSV-F以及可溶性hPIV3-F。可溶性RSV-F可以通过,例如,对应于SEQ ID
NO:2的525-574位氨基酸的、RSV-F蛋白的50个氨基酸C端跨膜结构域的缺失产生。用于
可溶性RSV-F这个实例的氨基酸序列在SEQ ID NO:7中列出。可溶性hPIV3-F可以通过,
例如,对应于SEQ ID NO:9的489-539位氨基酸的、C端51个氨基酸的缺失产生。用于可
溶性hPIV3-F这个实例的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中列出。
[0082] 重组可溶性病毒融合蛋白可以在任何细胞组分中产生。例如,可溶性病毒融合蛋白可以在细胞质中产生。重组可溶性病毒融合蛋白还可以结合细胞分泌途径表达并且可以
在,例如,内质网、高尔基体、质膜以及细胞外介质中表达。因此,重组可溶性病毒融合蛋白可以从不同细胞的和细胞外组分(包括细胞质、胞内囊泡、和/或质膜)中分离出。重组可溶性病毒融合蛋白还可以分泌到细胞外介质中,并且一种分泌出的病毒融合蛋白可以随着细
胞中保留的蛋白残余部分完全分泌出或部分分泌出。
[0083] 核酸
[0084] 核酸可以来自任何来源或组合物,并且可以是,例如,脱核糖核酸(DNA)、互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)、核糖核酸(RNA)、抑制性RNA(RNAi)、短抑制性RNA(siRNA)、转运RNA(tRNA)或信使RNA(mRNA)。核酸可以处于任何合适形式,包括但不局限于,线型、环状、超螺旋、单链、双链,以及类似形式。应理解,术语“核酸”本身不是指或推断出多核苷酸链的一个特定长度,因此多核苷酸以及寡核苷酸也包括在该定义内。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧苷以及脱氧胸苷。对于RNA,尿嘧啶基是尿苷。
[0085] 核酸有时是质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、酵母人工染色体(例如,YAC)或者是在宿主细胞中能够复制或被复制的其他核酸。在一些实施例中,核酸来自单条染色体(例如,核酸样品可以来自获得自二倍体有机体的一个样品的一条染色体)。在某些实施例中,核酸可以来自一个文库或可以从来自感兴趣的有机体的酶消化的、剪切的或声处理的基因组DNA(例如,片段化的)获得。
[0086] 在一些实施例中,核酸可以是,例如约5至约500个核苷酸或碱基对的长度(例如,约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230250、300、350、400、450、或高达约500个核苷酸或碱基对的长度)。在某些实施例中,核酸可以是约5至约300个核苷酸或碱基对的大小,或
约5至约200个核苷酸或碱基对的大小。在某些实施例中,核酸可以是,大于约200个核苷
酸或碱基对的长度,并且有时是约300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、
1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、
6500、7000、7500、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、
18000、19000或20000个核苷酸或碱基对的长度)。如在此使用,关于核酸链长度的术语“核苷酸”是指单链的核酸链。如在此使用,关于核酸链长度的术语“碱基对”是指双链的核酸链。
[0087] 核酸可以包括DNA或RNA类似物或修饰(例如,包含类碱基、修饰的碱基、糖类似物和/或非天然的骨架以及类似物)。“修饰的碱基”意思是在1'位置处除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶外的核苷酸碱基或它们的等效物。在一些实施例中,核酸可以包括一种或多种类型的修饰的碱基,并且可以独立地导入核酸的碱基修饰的非限制性实例包括肌苷、
嘌呤、吡啶-4-、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如,5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如,核糖胸核苷)、
5-卤尿苷(例如,5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、以及其他。
[0088] 载体核酸
[0089] 核酸通常包含可翻译核苷酸序列,例如像,编码病毒融合蛋白(例如,可溶性病毒融合蛋白)的序列。该可翻译核苷酸序列通常位于起始密码子(在核糖核酸中是AUG并且在脱氧核糖核酸中是ATG)与终止密码子(例如,在核糖核酸中是UAA(赭石)、UAG(琥珀)或UGA(蛋白石)并且在脱氧核糖核酸中是TAA、TAG或TGA)之间,并且有时在此是指“开放读码框”(ORF)。载体核酸有时包括一个或多个ORF。ORF可以是任何合适来源,有时来自基因组DNA、mRNA、逆转录的RNA或互补DNA(cDNA)或包括前述一个或多个的核酸文库,并且来自任何有机体物种,例如像病毒、原核生物、酵母、真菌、人类、昆虫、线虫、牛、、犬、猫、大鼠或小鼠。
[0090] 可以将编码病毒融合蛋白的ORF插入或克隆到一个载体中,用于该载体的复制、该载体部分的转录(例如,ORF的转录)和/或细胞中蛋白的表达。载体通常包括,例如,促进克隆ORF或其他核酸元件、复制、转录、翻译以及选择中的一个或多个的元件。因此,载体核酸可以包括以下非限制性核苷酸元件中的一个或多个或全部:一个或多个启动子元件、
一个或多个5’非翻译区(5’UTR)、靶核苷酸序列可以插入其中的一个或多个区域(“插入元件”)、一个或多个ORF、一个或多个3’非翻译区(3’UTR)、以及一个选择元件。
[0091] 在一些实施例中,载体核酸包括允许ORF或其他元件插入的一个或多个元件。可以利用本领域中已知的任何便利克隆策略来将一个元件,例如,ORF合并到一个载体核酸
中。可以利用已知的方法将一个元件独立于插入元件地插入该载体中,例如(1)将该载体
在一个或多个现存的限制性内切酶位点进行切割并且结合感兴趣的元件以及(2)通过杂
交包括一个或多个合适的限制性内切酶位点的寡核苷酸引物向该载体添加限制性内切酶
位点并且通过聚合酶链式反应进行扩增(在此更详细描述)。其他克隆策略利用存在或插入到该载体核酸中的一个或多个插入位点,例如像用于PCR的寡核苷酸引物杂交位点,以及
下文描述的其他。
[0092] 在一些实施例中,该载体核酸包括一个或多个重组酶插入位点。重组酶插入位点是核酸分子上的一个识别序列,通过重组蛋白参与整合/重组反应。例如,用于Cre重组酶
的重组位点是loxP,这是由两条反向重复的13个碱基对(用作重组酶结合位点)侧翼8个
碱基对的核心序列构成的一个34个碱基对的序列(例如,Sauer,B.(萨奥尔),Curr.Opin.Biotech.(《生物技术新见》)5:521-527(1994),图1)。重组位点的其他实例包括attB、attP、attL、以及attR序列及其突变体、片段、变体和衍生物,重组位点通过重组蛋白λInt并且通过辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS以及切除酶(Xis)进行识别(例如,美国专利号
5,888,732;6,143,557;6,171,861;6,270,969;6,277,608;以及6,720,140;美国专利公开号2002-0007051-A1;Landy(兰迪),Curr.Opin.Biotech.(《生物技术新见》)3:699-707(1993),将全部参考文献通过引用结合在此)。重组酶克隆核酸的实例处于 系统
(英杰公司,加利福尼亚州)中,该系统包括用于体内或体外克隆希望的核酸分子的至少一个重组位点。在一些实施例中,该系统利用包含至少两个不同的位点特异性重组位点的载
体,通常基于噬菌体λ系统(例如,att1以及att2),并且突变自野生型(att0)位点。每个突变的位点具有针对它的相同类型的同源配偶体att位点(即,它的结合配偶体的重组位
点)的唯一特异性(例如,具有attP1的attB1或具有attR1的attL1)并且将与其他突变类
型的重组位点或与野生型att0位点进行交叉反应。不同的位点特异性允许定向克隆或希
望的分子的结合,由此提供克隆分子的希望的取向。使用 系统,通过置换受体质
粒分子(有时称作目的载体)上侧翼是att位点的可选择的标记(例如,ccdB)来克隆和亚克隆侧翼是重组位点的核酸片段。然后通过ccdB敏感的宿主株的转化以及针对受体分子上
的标记阳性选择来选择希望的克隆。用于阴性选择(例如,有毒基因的使用)的类似策略可以用于其他有机体,例如哺乳动物和昆虫中的胸苷激酶(TK)。
[0093] 在某些实施例中,该载体核酸包括一个或多个拓扑异构酶插入位点。拓扑异构酶插入位点是由位点特异性拓扑异构酶识别并结合的一个限定的核苷酸序列。例如,核苷
酸序列5'-(C/T)CCTT-3'是大多数痘病毒拓扑异构酶(包括牛痘病毒DNA拓扑异构酶I)
特异性结合的一个拓扑异构酶识别位点。结合到识别序列上之后,该拓扑异构酶在识别
位点的3'-最末端胸苷处酶切该链以产生包括5'-(C/T)CCTT-PO4-TOPO的一个核苷酸序
列,经由拓扑异构酶中酪氨酸将该拓扑异构酶共价结合到3'磷酸盐上的一种复合物(美
国专利号5,766,891;PCT/US95/16099;以及PCT/US98/12372)。相比之下,核苷酸序列
5'-GCAACTT-3'是用于类型IA大肠杆菌拓扑异构酶III的一个拓扑异构酶识别位点。将
要插入的元件通常与拓扑异构酶-反应的载体组合并且由此结合到该载体核酸中(例如,
http 地 址www.invitrogen.com/downloads/F-13512_Topo_Flyer.pdf;http地 址www.
invitrogen.com/content/sfs/brochures/710_021849%20_B_TOPOCloning_bro.pdf;TOPO TA 试剂盒以及Zero 克隆试剂盒产品信息)。
[0094] 载体核酸有时包含一个或多个复制起点(ORI)元件。在一些实施例中,载体包括两个或更多个ORI,其中一个在一种有机体(例如,细菌)中有效地发挥功能并且另一个在另一种有机体(例如,真核生物)中有效地发挥功能。在一些实施例中,一个ORI可以在细菌细胞中有效地发挥功能并且另一个ORI可以在哺乳动物细胞中有效地发挥功能。载体核酸有时还包括一个或多个转录调节位点。
[0095] 5’UTR可以包括与从其起源的核苷酸序列同源的一个或多个元件,并且有时包括一个或多个外源元件。5’UTR可以起源自任何合适的核酸,例如基因组DNA、质粒DNA、RNA或mRNA,例如,起源自任何合适的有机体(例如,病毒、细菌、酵母、真菌、植物、鸟、昆虫或哺乳动物)。技术员可以基于所利用的转录和/或翻译系统选择适当的、用于5’UTR的元件。
5’UTR有时包括以下元件中的一个或多个:翻译增强子序列、转录起始位点、转录因子结合位点、翻译调节位点、翻译起始位点、翻译因子结合位点、核糖体结合位点、复制子、增强子元件、内部核糖体进入位点(IRES)、以及沉默子元件。
[0096] 3’UTR可以包括与从其起源的核苷酸序列同源的一个或多个元件,并且有时包括一个或多个外源元件。3’UTR可以起源自任何合适的核酸,如基因组DNA、质粒DNA、RNA
或mRNA,例如,起源自任何合适的有机体(例如,病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)。技术员可以基于所利用的转录和/或翻译系统选择适当的、用于3’UTR的元件。3’UTR有时包括以下元件中的一个或多个:转录调节位点、转录起始位点、转录终止位点、转录因子结合位点、翻译调节位点、翻译终止位点、翻译起始位点、翻译因子结合位点、核糖体结合位点、复制子、增强子元件、沉默子元件以及多聚腺苷酸化尾巴。3’UTR经常包括多聚腺苷酸化尾巴并且有时不包括,并且如果存在多聚腺苷酸化尾巴,则可以从其上添加或删除一个
或多个腺苷部分(例如,可以添加或去掉约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个腺苷部分)。
[0097] 载体核酸可以包括可以与一个或多个ORF功能相关地放置的启动子元件。对于DNA合成和/或RNA合成,典型地需要启动子元件。启动子通常与RNA聚合酶相互作用。聚
合酶是使用先存的核酸模板催化核酸合成的一种酶。当该模板是DNA模板时,在蛋白合成
之前,转录RNA分子。具有合适的聚合酶活性的酶包括在具有选择载体以合成蛋白的选择
系统中有活性的任何聚合酶。聚合酶的非限制性实例包括RNA聚合酶II、SP6RNA聚合酶、
T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、RNA聚合酶III以及噬菌体衍生的RNA聚合酶。这些以及其他
聚合酶是已知的并且与它们相互作用的核酸序列是已知的。此类序列易于由技术员访问
例如像通过检索一个或多个公共或私有数据库,并且这些序列易于适应在此描述的载体核
酸。启动子的非限制性实例是诱导型启动子、抑制型启动子、不可诱导型启动子、组成型启动子、强启动子以及弱启动子,并且可从任何合适的有机体(例如,病毒、原核生物、酵母、真菌、哺乳动物)获得。启动子元件有时直接邻近ORF放置,并且有时与ORF间隔载体核酸中
的一个或多个核苷酸,其条件是该启动子可以功能地驱动从ORF的转录物RNA的产生。
[0098] 任何合适的启动子可以用于在此描述的核酸载体中,只要该启动子提供适合转染细胞系中高水平蛋白生产的转录物产生水平。适合与在此描述的核酸载体一起使用的启动
子的非限制性实例包括人CMV主要中早期基因(hCMV-MIE)启动子、SV40启动子、CaMV启动子、MMTV启动子、Pol I启动子、Pol II启动子、PolIII启动子、以及类似物。
[0099] 载体核酸通常包括一个或多个选择元件。通常使用已知的方法利用选择元件来确定载体核酸是否包括在细胞中。在一些实施例中,载体核酸包括两个或更多个选择元件,其中一个在一种有机体(例如,原核生物)的细胞中有效地发挥功能并且另一个在另一种有机体(例如,哺乳动物)的细胞中有效地发挥功能。选择元件的实例包括但不局限于(1)编码提供对另外的有毒化合物的抗性的产物(例如,抗生素)的核酸区段;(2)编码受体细胞中另外缺乏的产物(例如,基本产物、tRNA基因、营养缺陷型标记)的核酸区段;(3)编码抑制基因产物活性的产物的核酸区段;(4)编码可以容易识别的产物(例如,表型标记如抗生素(例如,β-内酰胺酶),β-半乳糖苷酶,绿色荧光蛋白(GFP),黄色荧光蛋白(YFP),红色荧光蛋白(RFP),蓝绿色荧光蛋白(CFP),以及细胞表面蛋白)的核酸区段;(5)结合另外对细胞存活和/或功能有害的产物的核酸区段;(6)另外抑制上述编号1-5中描述的任何核酸
区段(反义寡核苷酸)活性的核酸区段;(7)结合修饰底物(例如,限制性内切酶)的产物的核酸区段;(8)可以用于分离或识别希望的分子(例如,特异性蛋白结合位点)的核酸区段;
(9)编码可以另外是无功能的特异性核苷酸序列(例如,用于分子亚群的PCR扩增)的核酸
区段;(10)当不存在时,直接或间接赋予对具体化合物的抗性或敏感性的核酸区段;(11)
在受体细胞中编码有毒(例如,白喉毒素)亦或或转化相对无毒化合物为有毒化合物(例如,单纯疱疹-胸腺激酶、胞嘧啶脱氨酶)的产物的核酸区段;(12)抑制包含它们的核酸分子的复制、分配或遗传力的核酸区段;和/或(13)编码有条件复制功能,例如,在某些宿主或宿主细胞株中或在某些环境条件(例如,温度、营养条件、以及类似条件)下复制的核酸区段。
[0100] 位于ORF末端的终止密码子有时被修饰为另一种终止密码子,如上文描述的琥珀终止密码子。在一些实施例中,有时通过现有密码子的插入或突变将终止密码子导入ORF
内。包括经修饰的末端终止密码子和/或内部终止密码子的ORF通常在一个包括识别该终
止密码子的抑制子tRNA的系统中进行翻译。包括终止密码子的ORF有时在一个包括在靶
蛋白或靶肽翻译过程中结合非天然氨基酸的抑制子tRNA的系统中进行翻译。用于将非天
然氨基酸结合到靶蛋白或肽上的方法是已知的,该方法包括,例如,利用异源tRNA/合成酶对的方法,其中该tRNA识别琥珀终止密码子并且载有非天然氨基酸(例如http地址www.
iupac.org/news/prize/2003/wang.pdf)。非天然氨基酸包括但不局限于D-同分异构体
氨基酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、正亮氨酸、pyrylalanine、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸以及苯基甘氨酸、α以及α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、天然氨基酸的卤化物衍生物如三氟酪氨酸、p-Cl-苯丙氨酸、p-Br-苯丙氨酸、p-I-苯丙氨酸、L-烯丙基-甘氨酸、β-丙
氨酸、L-α-氨基丁酸、L-γ-氨基丁酸、L-α-氨基异丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-蛋氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸、p-硝基-L-苯丙氨酸、L-羟基脯氨酸、L-硫代脯氨酸、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe、五甲基-Phe、L-Phe(4-氨基)、L-Tyr(甲基)、L-Phe(4-异丙基)、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)、L-二氨基丙酸、L-Phe(4-苄基)、2,4-二氨基丁酸、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基丁酸(α-Abu)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜胺酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、具有重原子或重同位素(例如,Au、氘、15N;对于合成适用于X-射线晶体结构分析或核磁共振分析的蛋白有用)的衍生的氨基酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、氟氨基酸、设计者(designer)氨基酸例如β-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸、萘基丙氨酸、以及类似氨基酸。
[0101] 标签
[0102] 核酸(例如,载体)有时包括邻近(例如,直接或实质上邻近)ORF、与该ORF结合翻译或编码氨基酸标签的核苷酸序列。在该核酸中,编码标签的核苷酸序列可以位于ORF的3’和/或5’,由此编码位于ORF编码的蛋白或肽的C端或N端的标签。可以利用不取消
(abrogate)转录和/或翻译的任何标签并且可以进行适当选择。
[0103] 例如,标签有时特异性结合一个分子或固相的一部分或一个可检测出的标记,由此具有用于分离、纯化和/或检测该ORF编码的蛋白或肽的效用。在一些实施例中,标签包
括以下元件中的一个或多个:FLAG(例如,DYKDDDDKG)、V5(例如,GKPIPNPLLGLDST)、c-myc(例如,EQKLISEEDL)、HSV(例如,QPELAPEDPED)、流行性感冒血凝素、HA(例如,YPYDVPDYA)、VSV-G(例如,YTDIEMNRLGK)、细菌谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、链霉抗生物素蛋白-或抗生物素蛋白-结合标签(例如,pcDNA 6BioEase  生物素化作用系统
(英杰公司))、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白、荧光蛋白(例如,绿色荧光蛋白以及它的许多颜色变体)、聚赖氨酸或聚精氨酸序列、聚组氨酸序列(例如,His6)或螯合金属(例如,钴、锌、镍、)的其他序列、和/或结合到含砷分子上的富含半胱氨酸的序列。在某些实施例中,富含半胱氨酸的标签包括氨基酸序列CC-Xn-CC,其中X是任何氨基酸并且n是
1至3,并且该富含半胱氨酸的序列有时是CCPGCC。在某些实施例中,该标签包括一个富含
半胱氨酸的元件以及一个聚组氨酸元件(例如,CCPGCC以及His6)。
[0104] 标签通常方便地结合到一个结合配偶体上。例如,一些标签结合抗体(例如,FLAG)并且有时特异性结合小分子。例如,聚组氨酸标签特异性地螯合一种二价金属,
像铜、锌、镍、以及钴;聚赖氨酸或聚精氨酸标签特异性地结合锌指;谷胱甘肽-S-转移
酶标签结合谷胱甘肽;并且富含半胱氨酸的标签特异性结合含砷分子。含砷分子包括
LUMIO 剂(英杰公司,加利福尼亚州),如FlAsH ([4',5'-双(1,3,2-二硫杂砷杂环戊
烷-2-基)荧光素-(1,2-乙二硫醇)2])以及ReAsH试剂(例如,Tsien(钱永健)等人,
题为“(Target Sequences for Synthetic Molecules用于合成分子的靶序列)”的美国
专利5,932,474;Tsien(钱永健)等人,题为“Methods of Using Synthetic Molecules and Target Sequences(使用合成分子和靶序列的方法)”的美国专利6,054,271;美国专利6,451,569以及6,008,378;公开的美国专利申请2003/0083373,以及公开的PCT专利
申请WO99/21013,全部都是Tsien(钱永健)等人,全部题为“Synthetic Molecules that Specifically React with Target Sequences(与靶序列特异性反应的合成分子)”,通过引用全部结合针对含砷染料、tetracys序列标签以及蛋白检测的全部披露)。如在下文更
加详细描述,此类抗体和小分子有时连接到用于方便分离重组多肽的固相上。标签有时是
不同于病毒融合蛋白的多肽,例如促进病毒融合蛋白纯化的多肽。此类多肽的非限制性实
例包括谷胱甘肽结合蛋白或麦芽糖结合蛋白。
[0105] 标签有时包括将翻译的蛋白或肽定位于转录和/或翻译系统中的一个组分处的序列,在此将其称作“信号序列”或“定位信号序列”。信号序列通常结合在靶蛋白或靶肽的N端,并且有时结合在C端。信号序列的实例是本领域中已知的,易于结合到核酸中,并
且通常根据病毒融合蛋白制备自其的细胞进行选择。在一些实施例中,信号序列将翻译的
蛋白或肽定位于细胞膜处。信号序列的实例包括但不局限于,细胞核靶向信号(例如,甾体受体序列以及SV40病毒大T抗原的N-端序列);线粒体靶向信号(例如,形成两亲性螺旋的氨基酸序列);过氧化物酶体靶向信号(例如,来自酿酒酵母(S.cerevisiae)YFG中的C端序列);以及分泌信号(例如,来自酿酒酵母中转化酶、交配因子α、PHO5以及SUC2的N-端序列;纳豆芽孢杆菌(B.subtilis)蛋白的多个N-端序列(例如,Tjalsma(杰西迈)等人,Microbiol.Molec.Biol.Rev.(《微生物学分子生物学研究》)64:515-547(2000));α淀粉酶信号序列(例如,美国专利号6,288,302);果胶酸裂解酶信号序列(例如,美国专利号
5,846,818);前胶原信号序列(例如,美国专利号5,712,114);OmpA信号序列(例如,美国专利号5,470,719);lamβ信号序列(例如,美国专利号5,389,529);B.brevis信号序列(例如,美国专利号5,232,841);以及巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)信号序列(例如,美国专利号5,268,273))。
[0106] 标签有时直接邻近ORF编码的氨基酸序列(即,不存在插入序列)并且有时标签有时实质上邻近ORF编码的氨基酸序列(即,存在插入序列)。插入序列有时包括用于蛋白酶的识别位点,这对于从靶蛋白或肽上切割标签是有用的。例如,在一些实施例中,插入序列由因子Xa(例如,识别位点I(E/D)GR)、凝血酶(例如,识别位点LVPRGS)、肠激酶(例如,识别位点DDDDK)、TEV蛋白酶(例如,识别位点ENLYFQG)或PreScission 蛋白酶(例如,识别位点LEVLFQGP)切割。
[0107] 在此有时将插入序列称为“接头序列”,并且可以具有任何合适长度。接头序列有时是约1至约20个氨基酸的长度,并且有时是约5至约10个氨基酸的长度。技术员可以选择接头长度以实质上保护靶蛋白或肽功能(例如,除非由接头分离,标签可以降低靶蛋白或肽功能),从而当存在蛋白酶酶切位点时增强标签从靶蛋白或肽上的解离(例如,当接头存在时可以增强酶切),并且用来增强标签/靶蛋白产物与固相的相互作用。接头可以具有任何合适的氨基酸含量,并且通常包括更高比例的、具有相对短的侧链的氨基酸(例如,甘胺酸、丙氨酸、丝氨酸以及苏氨酸)。
[0108] 核酸有时包括标签元件与插入元件或ORF之间的终止密码子,其对于具有或不具有该标签的ORF的翻译可以是有用的。识别终止密码子(上述)的突变体tRNA分子抑制
翻译终止并且由此被认定为“抑制子tRNA”。抑制子tRNA可以导致氨基酸插入以及越过
终止密码子的翻译的继续(例如,美国专利申请号60/587,583,2004年7月14日提交,题
为“Production of Fusion Proteins by Cell-Free Protein Synthesis(由无细胞蛋白
合成的融合蛋白的生产)”;Eggertsson(埃格特森)等人(1988)Microbiological Review(《微生物评论》)52(3):354-374,以及Engleerg-Kukla(恩格勒-卡拉)等人(1996)in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology(在大肠杆菌以及
氏菌内的细胞以及分子生物学),第60章,909-921页,Neidhardt(奈德哈特)等人编,ASM出版社,华盛顿)。多个抑制子tRNA是已知的,包括但不局限于,supE、supP、supD、supF以及supZ抑制子,它们抑制琥珀终止密码子的翻译终止;supB、glT、supL、supN、supC以及supM抑制子,它们抑制赭石终止密码子的功能以及glyT、trpT以及Su-9抑制子,它们抑制
蛋白石终止密码子的功能。一般而言,抑制子tRNA在该tRNA反密码子环(允许该tRNA与
通常功能是终止密码子的密码子碱基配对)中包含一个或多个突变。突变tRNA充满它同源
的氨基酸残基,并且当遇到终止密码子时,该同源氨基酸残基插入正在翻译的多肽中。增强终止抑制子的效力(即,增加终止密码子通读)的突变已经被鉴定出。这些包括但不局限于,uar基因(也被称为prfA基因)中的突变,ups基因中的突变,sueA、sueB以及sueC基因中
的突变,rpsD(ramA)以及rpsE(spcA)基因中的突变以及rplL基因中的突变。
[0109] 因此,包括位于ORF与标签之间的终止密码子的核酸当无抑制子tRNA存在时可以仅生产翻译的ORF,并且当抑制子tRNA存在于该系统中时可以生产翻译的ORF-标签融
合物。在一些实施例中,该终止密码子位于插入元件或ORF的3’以及标签的5’,并且该
终止密码子有时是琥珀密码子。抑制子tRNA有时在无细胞提取物内(例如,该无细胞提
取物制备自产生抑制子tRNA的细胞),有时作为分离的分子被添加到该无细胞提取物中,
并且有时作为一种提取物的一部分被添加到另一种无细胞提取物中。提供的抑制子tRNA
有时载有二十种天然发生的氨基酸中的一种或一种非天然氨基酸(在此描述的)。抑制子
tRNA可以在用编码该tRNA的核酸转染的细胞中产生(例如,可以将包含人tRNA-Ser抑制
子基因的无复制能力的腺病毒转染到细胞中)。用于合成抑制子tRNA以及用于翻译ORF
的、具有或不具有标签的载体由技术员可获得(例如,Tag-On-Demand 试剂盒(英杰公司,加利福尼亚州);Tag-On-Demand 抑制子上清液指导手册,B版本,2003年6月6日,http
地址www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_supernatant_man.p df;
Tag-On-Demand  载体指导手册,B版本,2003年6月20日,http地址www.
invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_vectors_man.pdf;以及Capone(卡
波尼)等人,Amber,ochre and opal suppressor tRNA genes derived from a human
serine tRNA gene(《衍生自人丝氨酸tRNA基因的琥珀、赭石以及蛋白石抑制子tRNA基
因》).EMBO J.(欧洲分子生物学组织杂志)4:213,1985)。
[0110] 核苷酸以及氨基酸序列比较
[0111] 如在此使用,术语“一致的(等同)”是指两个或更多个核苷酸序列当彼此比较时,具有基本上相同的核苷酸序列。如在此使用,术语“一致的(等同)”还是指两个或更多个氨基酸序列当彼此比较时,具有基本上相同的氨基酸序列。用于确定两个核苷酸序列或氨基酸序列是否基本上一致的一个试验是确定共享的、一致的核苷酸序列或氨基酸序列百分
比。
[0112] 可以如以下进行序列一致性的计算。出于最佳比较的目的将序列对齐(例如,在一个第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入间隙以用于最佳对齐并且出于比较目的,非同源序列可以被忽视)。出于比较目的对齐的参比序列的长度有时是该参比序列长度的30%或更大、40%或更大、50%或更大,通常是60%或更大,并且更通常是70%或更大、80%或更大、90%或更大、或100%。然后,在相应核苷酸或多肽位置处的核苷酸或氨基酸各自地与这两个对齐的序列进行比较。当该第一序列中的一个位置被与该第二序列中的对应位置
相同的核苷酸或氨基酸占据时,该核苷酸或氨基酸被认为是在那个位置处一致的。两个序
列之间的百分比一致性是这些序列共享的多个一致性位置的一个函数,考虑了间隙数目以
及每个间隙的长度,引入以用于两个序列的最佳对齐。
[0113] 序列比较以及两个序列之间的百分比一致性的确定可以使用数学算法完成。两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比一致性可以使用迈耶斯&米勒(Meyers&Miller)算法,
CABIOS4:11-17(1989),其已经结合到ALIGN程序(2.0版)中,使用PAM120权重残基表,间隙长度罚分12以及间隙罚分4来确定。同样地,两个氨基酸序列之间的百分比一致性可以
使用Needleman&Wunsch(尼德曼&温驰),J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48:444-453(1970)算法,其已经被结合到GCG软件包(在http地址www.gcg.com可得)中的GAP程序
里,使用Blossum62矩阵亦或PAM250矩阵来确定。通常与Blossum62打分矩阵一起使用的
一套参数包括间隙开放罚分12、间隙延伸罚分4、以及移码间隙罚分5。两个核苷酸序列之
间的百分比一致性可以使用GCG软件包(在http地址www.gcg.com可得)中的GAP程序,使
用NWSgapdna.CMP矩阵以及间隙权重60和长度权重4来确定。
[0114] 用于确定两个核酸是否基本上一致的另一种方法是在严格条件下评估一个多核苷酸与将要杂交一个核酸的另一个核酸是否同源。如在此使用,术语“严格条件”是指用于杂交以及洗涤的条件。严格条件是本领域的普通技术人员已知的并且可以发现于Current
Protocols in Molecular Biology(《分子生物学当前技术》),约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons),N.Y.,6.3.1-6.3.6(1989)中。在该参考文献中描述了水性和非水性的方法并且任一种都可使用。严格杂交条件的一个实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约
45 C进行杂交,随后在0.2X SSC、0.1%SDS中在50°C下洗涤一次或多次。严格杂交条件
的另一个实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45 C进行杂交,随后在0.2X SSC、
0.1%SDS中在55°C下洗涤一次或多次。严格杂交条件的又一个实例是在6X氯化钠/柠
檬酸钠(SSC)中在约45 C进行杂交,随后在0.2X SSC、0.1%SDS中在60 C下洗涤一次或
多次。通常,严格杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45 C进行杂交,随后
在0.2X SSC、0.1%SDS中在65 C下洗涤一次或多次。更加通常地,严格条件是在0.5M磷
酸钠、7%SDS、在65 C,随后在0.2X SSC、1%SDS中在65 C下洗涤一次或多次。
[0115] 密码子修饰以及GC含量
[0116] 在此提供的、编码病毒融合蛋白的核酸可以通过改变遍及核苷酸序列的一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰。如在此使用,“核苷酸碱基”是指四种脱氧核糖核酸碱基,腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、以及胸腺嘧啶(T)中的任一种,或是四种核糖核酸碱基,腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、以及尿嘧啶(U)中的任一种。如在此使用,“密码子”是指用于编码具体氨基酸的一串三个核苷酸碱基。遗传码呈现图22中,其中集合了基本上全部可能的三个核苷酸碱基组合,并且,在大多数情况下,指定一种具体氨基酸。通常,每个氨基酸可以由一个或多个密码子编码。下表1呈现了针对每个氨基酸的
基本上全部的密码子可能。
[0117]
[0118]
[0119] 在此提供的核苷酸序列可以通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰,使得编码的病毒融合蛋白的氨基酸序列类似于未修饰的核苷酸序列编码的
蛋白的氨基酸序列。编码的病毒融合蛋白与未修饰的序列编码的蛋白可以具有90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的一致性。在一些实施例中,由修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列一致。如在表1中指出
的,氨基酸和终止密码子的一个子集可由至少两个密码子可能性编码。例如,谷氨酸可由
GAA或GAG编码。如果用于谷氨酸的密码子存在于如GAA的核酸序列之内,在第三位上的核
苷酸碱基从A变为G,将导致仍然编码谷氨酸的修饰的密码子。因此,一个密码子内的一个
或多个核苷酸碱基的具体变化仍然可以导致相同氨基酸的编码。在一些情况下,这个过程
在此称作密码子优化。在此提供了针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核
苷酸碱基进行修饰的RSV-F(列出于SEQ ID NO:16与17中)的核苷酸序列的实例,由此该
RSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:2中)编码的氨基酸序列一
致。在此还提供了,例如,针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的可溶性RSV-F(列出于SEQ ID NO:4、5与6中)的核苷酸序列,由此该sRSV-F氨
基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:7中)编码的氨基酸序列一致。在此还提供了,例如,针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修
饰的hPIV3-F(列出于SEQ ID NO:11中)的核苷酸序列,由此该hPIV3-F氨基酸序列与由
未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:12中)编码的氨基酸序列一致。
[0120] 在此提供的核苷酸序列可以通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰,使得a)编码的病毒融合蛋白的氨基酸序列与未修饰的核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列类似或一致;以及b)鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(%GC)相比于未修饰的核苷酸序列在修饰的核苷酸序列中增加。例如,%GC可以是约45%、46%、47%、48%、49%、50%、
51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%或更大。如在表1中指出的,可以进行密码子第一、第二和/或第三位置上的核苷酸碱基变化,由此A或T变为G或C同时保留氨基酸和/或终止密
码子分配。在此提供了针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进
行修饰的RSV-F(列出于SEQ ID NO:17中)的核苷酸序列的一个实例,由此RSV-F氨基酸序
列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:2中)编码的氨基酸序列一致,并且鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(%GC)相比于未修饰的核苷酸序列(35%GC;列出于SEQ ID NO:1中)在修饰的核苷酸序列中增加(58%GC)。在此还提供了,例如,针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的可溶性RSV-F(例如,列出于SEQ ID NO:4、5与6中)的核苷酸序列,由此sRSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID
NO:7中)编码的氨基酸序列一致,并且鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(%GC)相比于未修饰的核苷酸序列(35%GC;列出于SEQ ID NO:3中)在修饰的核苷酸序列(对于SEQ ID NO:4为
46%GC;对于SEQ ID NO:6为51%GC;对于SEQ ID NO:5为58%GC)中增加。在此还提供了,例如,针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的hPIV3-F
(列出于SEQ ID NO:11中)的核苷酸序列,由此hPIV3-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:12中)编码的氨基酸序列一致,并且鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数
(%GC)相比于未修饰的核苷酸序列(36%GC;列出于SEQ ID NO:10中)在修饰的核苷酸序列(60%GC)中增加。
[0121] 在此提供的核苷酸序列可以通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰,使得a)编码的病毒融合蛋白的氨基酸序列与未修饰的核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列类似或一致;b)鸟嘌呤与胞嘧啶的组合百分数(%GC)相比于该未修饰的核苷酸序列在该修饰的核苷酸序列中增加;以及c)在第三核苷酸密码子位置上的鸟嘌呤与
胞嘧啶的总的组合百分数(%GC3)相比于该未修饰的核苷酸序列在该修饰的核苷酸序列中
增加。例如,该%GC3可以是约55%、56%、57%、58%、59%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%。如在表1中指出的,大部分核苷酸碱基改变可能性存在于第三核苷酸密码子位置上。在一些实施例中,每一个密码子,包括终止密码
子,在第三核苷酸密码子位置上已经具有G或C或可以被修饰为在第三核苷酸密码子位置
上具有G或C而不改变氨基酸分配。因此,对于任何给出的核苷酸序列,遍及核苷酸序列,
在每一个第三核苷酸密码子位置上可能具有高达100%的G或C(GC3)。在一个实施例中,
在此提供了针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的
RSV-F(列出于SEQ ID NO:17中)的核苷酸序列,由此RSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷
酸序列(列出于SEQ ID NO:2中)编码的氨基酸序列一致,并且在第三核苷酸密码子位置上的鸟嘌呤与胞嘧啶的总的组合百分数相比于未修饰的核苷酸序列(31%GC3;列出于SEQ ID NO:1中)在修饰的核苷酸序列(100%GC3)中增加。在一个实施例中,在此还提供了针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的sRSV-F(列出于SEQ
ID NO:4、5与6中)的核苷酸序列,由此sRSV-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:7中)编码的氨基酸序列一致,并且在第三核苷酸密码子位置上的鸟嘌呤与胞嘧啶的总的组合百分数相比于未修饰的核苷酸序列(31%GC3;列出于SEQ ID NO:3中)在修饰的核苷酸序列(对于SEQ ID NO:4为58%GC3;对于SEQ ID NO:6为76%GC3;对于SEQ ID
NO:5为100%GC3)中增加。在一个实施例中,在此还提供了针对已经通过改变一个或多个密码子内的一个或多个核苷酸碱基进行修饰的hPIV3-F(列出于SEQ ID NO:11中)的核苷酸序列,由此hPIV3-F氨基酸序列与由未修饰的核苷酸序列(列出于SEQ ID NO:12中)编码的氨基酸序列一致,并且在第三核苷酸密码子位置上的鸟嘌呤与胞嘧啶的总的组合百分数相比
于未修饰的核苷酸序列(29%GC3;列出于SEQ ID NO:10中)在修饰的核苷酸序列(100%GC3)中增加。
[0122] 顺式调节元件
[0123] 在某些实施例中,核苷酸序列可以包括顺式调节元件。顺式调节元件或顺式元件是调节位于同一个DNA分子上的基因的表达的DNA或RNA区域。顺式调节元件可以是用于
一个或多个反式作用因子的结合位点。例如,顺式元件在一个内含子中可以位于它控制基
因的编码序列的5'(在启动子区域或另外的上游区),或在非翻译或非转录区,位于ORF的
3'。可以将顺式调节元件添加到工程化的表达构建体中以调节体外或体内表达系统中的
mRNA转录和/或mRNA加工。顺式调节元件的实例非限制地包括,转录后调节元件(PRE)、移码元件、效应元件(IRE)、内部核糖体进入位点(IRES)、TATA盒、Pribnow盒、SOS盒、CAAT盒、CCAAT盒、上游激活序列(UAS)、多聚腺苷酸化信号、富含AU的元件、以及本领域中已知的其他顺式RNA调节元件。
[0124] 在一些实施例中,核苷酸序列可以包括转录后调节元件。转录后调节元件是可以增加细胞质的mRNA水平的顺式作用RNA元件。病毒通常利用转录后调节元件(PRE)通过
赋予mRNA稳定性以及3’末端形成来增强基因表达,并且促进mRNA从宿主细胞细胞核向细
胞质的输出。还可以将PRE添加到工程化的表达构建体中以帮助升高衍生自体外或体内表
达系统中转录的mRNA水平。
[0125] 转录后调节元件的实例非限制地包括,乙型肝炎病毒(HPRE)以及土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件。两种PRE都是肝炎DNA病毒的顺式作用RNA元件,可以通过促进mRNA从细胞核向细胞质的输出,增强3’末端加工及稳定性来增加无内含子基因的细胞质mRNA的累积。HPRE和WPRE两者都可以用于增加来自表达载体的表达效力。在一些实施例
中,将HPRE添加到表达构建体中。有时将WPRE添加到表达构建体中。例如,可以使得WPRE
与在此提供的任何核苷酸序列功能相关地放置(例如,与核苷酸序列的5’位置处,与核苷酸序列的3’位置处,或表达载体内的任何位置处)。在一些实施例中,可以将WPRE与在此提供的任何核苷酸序列功能相关地放置在该核苷酸序列的3’末端的下游位置处。在某些实
施例中,可以将WPRE与在此提供的任何核苷酸序列功能位地放置在该核苷酸序列的3’末
端的下游位置处以及存在于表达载体中的SV40polyA(聚A)区的5’末端的上游位置处。
[0126] 细胞
[0127] 表达载体可以在任何适合蛋白表达的细胞系中繁殖。在一些实施例中,可以将表达载体用于提供来自感染的表达载体的蛋白表达的有用水平的粘附或非粘附哺乳动物细
胞系中。如在此使用,术语“蛋白表达的有用水平”是指希望的蛋白的产生处于这样一个水平,该水平允许分离足够量的蛋白以用于蛋白的生产。哺乳动物细胞的非限制性实例包括
CHO细胞、CHO-S细胞、CAT-S细胞、Vero细胞、BSR-T7细胞、Hep-2细胞、MBCK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、HeLa细胞以及LLC-MK2细胞。
[0128] 粘附细胞
[0129] 粘附细胞通常需要一个表面,如组织培养塑料器具或微载体,可以将其涂覆有胞外基质组分以增加粘附特性并提供生长和分化所需的其他信号。衍生自固体组织的许多细
胞是粘附性的。粘附性培养的另一种类型被称为器官型培养。器官型培养方法典型地涉及
不同于二维的(例如,2D)彼德里氏皿的、在一个三维的(例如,3D)环境中生长细胞。3D培养系统在生物化学和生理学上更类似于体内组织,但是对维持具有更高的技术挑战。粘附性
细胞系的非限制性实例包括Vero细胞、MRC-5细胞以及BSR-T7细胞。
[0130] Vero细胞
[0131] Vero细胞是已经被广泛用于繁殖病毒来制造疫苗的一个细胞系。Vero细胞在1962年衍生自非洲绿猴(African Green Monkey或Cercopithecus aethiops)的肾上皮细
胞。Vero细胞对广泛范围的病毒易感并且经常用于开发对抗与那些病毒相关的疾病的疫
苗。Vero细胞可用于多种目的,其非限制性的实例包括:(i)对大肠杆菌毒素进行筛选(例如,这个细胞系之后,大肠杆菌毒素最早被命名为“Vero毒素”,并且随后由于它与分离自痢疾志贺菌的志贺毒素的类似性被称作“志贺样毒素”,(ii)作为用于生长病毒的宿主细胞
(例如,研究药物存在或不存在下的测量复制,检验狂犬病毒的存在,或出于研究目标的病毒母液(viral stock)的生长),以及(iii)作为用于真核生物寄生虫(例如,锥虫)的宿主细胞。
[0132] Vero细胞谱系是连续和非整倍体的。连续的细胞谱系可以通过多个循环的分裂进行复制并且是不会衰老的。非整倍性是具有异常数目染色体的特征。Vero细胞还可以是
干扰素缺陷型,不同于正常哺乳动物细胞,当被病毒感染时,Vero不分泌I型干扰素,然而,Vero细胞具有干扰素-α/β受体,因此当将另外来源的干扰素添加到培养基中时,它们正
常响应。
[0133] 已经示出Vero细胞具有不同谱系。Vero“衍生的”细胞谱系的非限制性实例包括:Vero细胞(例如,ATCC No.CCL-81)、Vero76(例如,ATCC No.CRL-1587,1968年分离自Vero细胞)、以及Vero E6细胞(例如,ATCC No.CRL-1586,克隆在Vero76细胞)。Vero细胞已经被适应于在无血清培养基中生长。
[0134] MRC-5细胞
[0135] MRC-5细胞(例如,ATCC No.CCL-171)是衍生自正常胎儿肺组织的、人类男性二倍体(例如,46个染色体,XY)的细胞系。MRC-5细胞通常具有纤维细胞样细胞形态。该细胞谱系最早在1966年建立。MRC-5细胞通常不被认为是连续的(例如,永生的),因为在约42-48次加倍之后发生衰老,衰老发生之前可见多达60-70次加倍。MRC-5对广泛范围的人
类病毒易感,使得其成为对病毒繁殖和疫苗生产有用的细胞系。MRC-5细胞对其易感的病毒的非限制性实例包括腺病毒;柯萨奇病毒A;巨细胞病毒;柯病毒;单纯疱疹病毒;脊髓灰质炎病毒;鼻病毒;呼吸道合胞病毒;以及水痘-带状疱疹病毒。MRC-5细胞有时还用于
体外细胞毒性试验。
[0136] BSR-T7/5细胞
[0137] BSR-T7/5细胞是BHK-21(C-13)衍生的细胞系,组成型表达T7RNA聚合酶。BSR-T7/5细胞已经被用于建立用于以下病毒的无动物病毒恢复系统;引起新城疫的病毒、
牛呼吸合胞病、埃博拉病毒、狂犬病毒、立夫特山谷热病毒以及其他病毒。BSR-T7/5细胞还已经被用于建立无痘苗病毒水泡性口炎病毒(VSV)恢复系统。
[0138] BHK-21(C-13)(例如,ATCC No.CCL-10)是一种在仓鼠与裸鼠中引起肿瘤的、永生的叙利亚金仓鼠幼鼠(immortalized baby Syrian golden hamster)(例如,金仓鼠(Mesocricetus auratus))肾细胞系。1961年,BHK-21(C-13)的亲系衍生自五个失去性征的、1-日-龄仓鼠的肾脏。连续培养84天之后,仅通过冻保存8天来中断,克隆13(例
如,(C-13))通过单细胞分离开始。BHK-21衍生的细胞是具有四倍性发生约4%的假二倍
体。BHK-21衍生的细胞具有成纤维细胞样细胞形态。BHK-21衍生的细胞对多种病毒易感,
其非限制性实例包括:人腺病毒25、呼肠孤病毒3、水泡性口炎病毒以及人脊髓灰质炎病毒
2。
[0139] 非粘附细胞
[0140] 非粘附细胞通常存在于悬浮液中而不粘附到表面上。和通常彼此粘附和/或粘附到下面基质中的组织细胞不同,非粘附细胞的一个非限制性实例是在正常在血流中循环存
在的血细胞。某些细胞系已经被修饰以用于在悬浮培养基中培养,以允许这些细胞生长至
比粘附条件下正常将允许的更高密度。非粘附性哺乳动物细胞的非限制性实例是CHO-衍
生的细胞、CHO-S细胞以及CAT-S细胞。在一些实施例中,在CAT-S细胞中繁殖蛋白表达载
体。
[0141] CHO以及CHO-衍生的细胞
[0142] CHO细胞(例如,CHO-K1、ATCC No.CCL-61、ECACC登录号85051005)是衍生自中国仓鼠(Chinese hamster)(例如,中国地鼠)卵巢的粘附细胞系。该细胞系作为亚克隆衍生自起始自1957年的成年中国仓鼠卵巢活组织的亲本CHO细胞系。这些细胞是脯氨酸营养缺陷型的并且不表达表皮生长因子受体(EGFR)。由于CHO细胞的快速生长以及高蛋白生
产,它们已经成为一个广泛使用的细胞系。CHO衍生的细胞系经常用于研究和生物技术中,尤其是当需要蛋白的长期、稳定的基因表达以及高产率时。
[0143] 已经分离出了非粘附的和松弛粘附的CHO细胞谱系。非粘附的CHO-衍生的细胞系的非限制性实例包括CHO-Pro5(例如,ATCC No.CRL-1781)以及CHO-AA8(例如,ATCC
No.CRL-1859)。额外的CHO-衍生的谱系已经建立自CHO-AA8,它们即便不是全部也有很多
可以生长在悬浮液中(例如,CHO-UV41、ATCC No.CRL-1860;CHO-EM9、ATCC No.CRL-1861;
CHO-UV20、ATCC No.CRL-1862;CHO-UV5、ATCC No.CRL-1865;CHO-UV24、ATCC No.CRL-1866;
以及CHO-UV135、ATCC No.CRL-1867)。许多CHO-衍生的细胞具有上皮细胞样形态,而一些展示出成纤维细胞样细胞形态。
[0144] CHO-S细胞
[0145] CHO-S细胞(英杰公司)是一种稳定的、非整倍体、克隆的分离群,衍生自CHO-K1细胞。针对生长和转染率,选择CHO-S亲本细胞系。CHO-S细胞被适应于在补充有L-谷氨酰胺以及HT补充物的CD CHO培养基(英杰公司)中无血清悬浮培养,用于重组蛋白的瞬时或
稳定表达。
[0146] CAT-S细胞
[0147] CAT-S细胞是CHO-K1-衍生的一种细胞系,生长于悬浮液中并且与CHO-S细胞进行比较示出了改进的蛋白产率。CAT-S细胞(ECACC登录号10090201)还已经被适应于无血清
悬浮生长。
[0148] 转染与转化
[0149] 转染是将核酸或生物分子导入细胞的无病毒过程。该术语通常用来指将核酸或其他生物分子(例如,蛋白、抗体、siRNA、RNA、寡核苷酸)导入动物-衍生的真核细胞中,而术语转化用来指细菌细胞以及非-动物真核细胞。核酸或其他生物分子向真核细胞(例如,哺乳动物细胞)中的导入经常涉及提供用于该核酸通过细胞膜并进入细胞的途径或方法。可
以使用用于将核酸导入宿主细胞中的任何合适方法。适合在转染方法中使用的方法的非
限制性实例包括电穿孔,声孔效应(例如,声波诱导的细胞膜小孔),刺穿染(例如,包覆有纳米纤维的DNA向细胞中的导入),脂转染(例如,宿主细胞中包含核酸的融合脂质体),磷酸沉淀,阳离子型聚合物介导的胞吞作用(例如,DEAE-葡聚糖,或聚乙烯亚胺转染),基因枪或生物颗粒转染(例如,包覆有纳米颗粒的DNA直接射入细胞核中),光学转染(例如,使用激光以在细胞膜中产生瞬时微孔),热休克,磁转染,树枝状转染(例如,结合DNA并且可以运输通过细胞膜的高分支的有机化合物),以及专有权转染试剂、实验方案、和/或装置的使用,如脂质体转染(英杰公司)、脂质体(Lipofectin)、Dojindo Hilymax、Fugene(Fugent、LLC)、jetPEI、Effectene、核转染仪、Promofectin、Uptifectin、GENEporter 或DreamFect。
[0150] 稳定转染与瞬时转染
[0151] 转染有时是稳定转染并且有时是瞬间转染。在该转染过程中导入的核酸(例如,DNA、RNA、PNA、类似物或其组合)通常未插入到核基因组中,因此导入的遗传物质典型地在细胞进行有丝分裂的时间左右最终丢失。其中转染的核酸不进入核基因组和/或不提供
选择有利性(例如,抗毒素的选择,例如,使用新霉素基因的G418)的过程通常被称作瞬时转染。对于多种应用(例如,瞬时表达分析,用于限定生长周期的生物反应器中蛋白、病毒或抗体的生产),转染基因的瞬时表达是足够的。
[0152] 如果希望转染的核酸(例如,DNA、RNA)保留在该细胞的基因组中并且它的子细胞持续一个延长的时期,可以采用稳定转染(例如,整合到基因组中,在整个选择标记的选择中维持后生元件)。具有基因组整合的稳定转染子可以进一步通过去除选择压力一个限定时期,随后再运用选择压力进行选择。当去除选择压力一个时期时,后生元件经常丢失,因此再运用选择压力可以对携带有并且丢失后生抗性元件的那些细胞进行选择。
[0153] 细胞质转染与核转染
[0154] 在一些实施例中转染可以是细胞质转染,或在某些实施例中转染可以是核转染。如果转染物质提供选择有利性并且维持选择压力,细胞质转染有时可以导致稳定转染。尽
管效力更低,核转染提供转染的核酸(例如,DNA)的稳定整合的更高发生率。
[0155] 许多转染方法将核酸或其他生物分子插入宿主细胞的细胞质中(例如,脂质体介导的转染或脂质转染法、磷酸钙沉淀、等)。细胞一般利用运输机制将mRNA从细胞质携带
至核中(例如,非均质的核内核糖核蛋白-Al(hnRNP-A1))。表达构建体或其他核酸(例如,mRNA、siRNA、质粒DNA、线状DNA、等)中的特异性核靶向信号的使用可以增加向核运输的转染物质的比例,和或可以增加运输至细胞核中的细胞质转录的RNA的比例。核靶向信号的
非限制性实例是hnRNP-A1的M9组分。还可以使用非特异的核载体来增加核转染效率。非
特异的核载体的非限制性实例包括:鱼精蛋白、聚赖氨酸/pDNA,以及阳离子胆固醇。
[0156] 细胞DNA整合
[0157] 核酸已经被转染到宿主细胞中并且被运输到核中之后,可以通过遗传重组事件发生向宿主细胞基因组的稳定整合(例如,整合到染色体中)。遗传重组是通过其核酸(例如,DNA、RNA)分子被打断并且然后结合一个不同核酸的方法。重组可以在具有相似核酸序列
的DNA分子之间发生,如同源重组,或在具有不相似核酸序列的DNA分子之间发生,如非同
源末端联接。重组是细菌与真核生物两者中DNA修复的一种通用方法。在真核生物中,在
减数分裂中也可以发生重组,其中促进染色体互换。如在此使用,术语“染色体互换”是指配对染色体之间的重组,通常发生在减数分裂过程中。在前期I过程中,四个可用染色单体彼此处于紧密形成状态。在该形成过程中,两个染色单体上的同源位点(例如,具有相似核酸序列的位点)可以彼此紧密配合(mesh),以促进遗传信息的交换(例如,重组)。非同源重组可以发生在序列不相似(例如,不具有序列同源性)的DNA序列之间,并且通常被称为非同源末端联接。非同源末端联接(NHEJ)通常用于修复DNA中打断的双链。NHEJ被称为“非
同源的”是因为与同源重组(需要同源序列来指导修复或交换迁移)相比,打断的末端直接连接而无需同源模板。不恰当的NHEJ可以导致易位和端粒融合,这是肿瘤细胞的标志。
[0158] 当转染的核酸被运输到核中时,同源重组信号可以被工程化到核酸试剂或表达载体中以进一步增加基因组整合的机会。在一些实施例中,核酸载体包括一个或多个重组酶
插入位点。如上所述,重组酶插入位点是核酸分子上的一个识别序列,通过重组蛋白参与整合/重组反应。还如上所述,用于哺乳动物细胞转染的核酸载体还可以包括用于重组的拓
扑异构酶整合。
[0159] 转录
[0160] 如在此所述,术语“转录”、“转录活性”、“细胞质转录”以及“细胞核转录”是指产生起始核酸的核酸拷贝的过程。转录通常涉及DNA核酸的RNA拷贝的生成,并且有时还可以涉及起始RNA核酸的DNA拷贝的生成(例如,反转录)。
[0161] 对于真核细胞,转录可以特征在于以下步骤:(1)由于氢键断裂DNA解旋/“拉开拉链”;(2)游离的RNA核苷酸与互补的DNA碱基配对;(3)在RNA聚合酶辅助下,形成RNA
糖-磷酸主链;(4)解螺旋的RNA/DNA杂链的氢键断裂,游离出新转录的RNA;以及(5)进
一步加工该RNA并且然后通过小核孔移动到细胞质中。转录还可以被视为具有五(5)个阶
段,与上述步骤重叠。转录的这五个阶段包括起始前、起始、启动子清除、延长以及终止。
[0162] 起始前
[0163] 在真核生物中,RNA聚合酶识别DNA中的核心启动子序列。启动子是真核生物中促进转录的DNA区域,通常发现于自转录起始位点上游的-30、-75以及-90碱基对处。已
经示出,核心启动子序列中的突变可以消除转录起始。在不同特异性转录因子存在下,RNA聚合酶能够结合到核心启动子上。真核生物中核心启动子序列的非限制性实例是称为TATA
盒的短DNA序列,发现于自转录起始位点上游的25-30碱基对处。作为核心启动子,TATA盒
是称作TATA结合蛋白(TBP)的转录因子的结合位点,TBP本身是另一个转录因子的一个亚
基,称作转录因子II D(TFIID)。TFIID经由TBP结合到TATA盒上之后,五个更多的转录
因子以及RNA聚合酶在一串阶段中组合到TATA盒周围以形成一个预起始复合物。一个转
录因子、具有螺旋酶活性的DNA螺旋酶参与双链DNA的相反链的分离(例如,上述步骤(1)
的解旋)以提供与单链DNA模板的接触。仅有低的或基本的速率的转录单独由该预起始复
合物驱动。称作活化剂以及阻抑物的其他蛋白,连同任何相关的共活化剂或共阻抑物负责
调制转录速率。
[0164] 起始
[0165] 预起始复合物形成并且游离RNA与互补DNA碱基配对之后,合成该第一键,并且RNA聚合酶转移以允许在下一个碱基处形成键。
[0166] 启动子清除
[0167] 合成第一键之后,DNA多聚酶通过沿着DNA转移清除该启动子。此时,RNA聚合酶有时释放RNA转录物并且产生截短的转录物。这称作流产起始并且对于真核生物以及原核
生物两者都是常见的。流产起始继续发生直到σ因子重排,产生转录延伸复合物(例如,给出35bp的移动足迹)。σ因子典型地在80核苷酸的mRNA合成之前释放。一旦转录达到约
23个核苷酸,聚合酶复合物不再滑动并且可以发生延长。转录中的许多步骤是能量依赖型
的,消耗腺苷三磷酸(ATP)分子以用于每一个键的形成。启动子清除与真核生物中RNA Pol的羧基端结构域上的丝氨酸5的磷酸化同时发生,其进而通过TFIIH磷酸化。
[0168] 延长
[0169] 随着转录进行,RNA聚合酶穿过模板链并且使用碱基配对与DNA模板互补以产生RNA拷贝。虽然RNA聚合酶从3'向5'穿过该模板链,但是编码(非-模板)链以及新形成
的RNA也可以被用作参考点,这样转录可以被描述为5'至3'发生。这从5'向3'生成编
码链的精确拷贝(除尿嘧啶取代胸腺嘧啶外)的RNA分子。mRNA转录可以涉及单链DNA模
板上的多个RNA聚合酶以及多个循环的转录(具体mRNA的扩增),如此多的mRNA分子可以
从一个基因的单拷贝(例如,单链mRNA分子)迅速产生。延长还涉及可以替换错误掺入的碱基的校对机制。真核生物中,校对功能可以符合允许适当的RNA编辑因子结合的转录过程
中的短中止。这些中止可以是RNA聚合酶固有的或归因于染色质结构。
[0170] 终止
[0171] 认为真核生物中的转录终止涉及新RNA转录物的切割,随后是在称作聚腺苷酸化作用的过程中A核苷酸在新生成的3'末端的模板独立型添加。聚腺苷酸化位点上游发生
的公认的真核终止信号是核苷酸序列AAUAAA。细菌中的转录终止涉及特异性终止蛋白和/
或终止序列。
[0172] 反转录
[0173] 某些病毒具有将RNA转录为DNA的能力。RNA病毒具有复制为DNA的RNA基因组。所得DNA可以与宿主细胞的基因组DNA合并。参与从RNA模板合成DNA的酶称作逆转录酶。
[0174] 细胞质转录与核转录
[0175] 转录通常发生在细胞的细胞核中,未剪接杂核的RNA被运输到细胞质中用于剪接(例如,内含子序列的去除)并且成熟的mRNA被运输到细胞核或其他细胞器(例如,内质网)中用于翻译成蛋白。一些DNA病毒(例如,痘病毒)以及许多RNA病毒的复制、转录以及翻译发生在细胞的细胞质中。细胞质病毒转录有时涉及病毒基因组编码的蛋白的活性。
[0176] 转录的测量和检测
[0177] 能以多种方式测量和检测转录。可以用于检测转录的测定法的非限制性实例包括:核连缀分析(例如,测量新形成的转录物的相对丰度);核糖核酸酶保护测定以及RNAP的ChIP-Chip的(例如,检测活性转录位点);RT-PCR(例如,测量全部或核RNA水平的绝对丰度);DNA微阵列(例如,测量总体或核RNA水平的相对丰度);原位杂交(例如,检测一个或多个特异性转录物的存在);MS2标签(例如,使用具有高亲和力、与MS2茎环序列特异性相互作用的GFP以及MS2外壳蛋白的融合物检测MS2RNA茎环标签;GFP向转录位点的募集被显现
为单个荧光斑);RNA印迹(例如,基于用DNA或RNA互补探针探查的RNA印迹的核酸杂交);
RNA-Seq(例如,涉及整个转录子的序列分析(例如,基因笔迹分析)的测序技术,这允许RNA相对丰度的测量;以及额外变体(例如融合基因)、翻译后编辑以及新剪接位点的检测)。
[0178] 细胞培养和蛋白生产
[0179] 本技术提供了无血清细胞培养基以及高度重复性有效可扩展方法。在某些实施例中,提供了用于在生物反应器中生产相对大量蛋白的方法,包括但不局限于一次性生物反
应器以及标准可重复使用生物反应器(例如,不锈以及玻璃容器生物反应器)。
[0180] 在一些实施例中,本技术提供了支持细胞(例如,CAT-S细胞)增殖到一个高细胞密度的一种浓缩无血清细胞培养基。用来增殖细胞的细胞培养基可以影响一个或多个细胞特征,包括但不局限于,非肿瘤发生的、非瘤原性的、生长为粘附细胞、生长为非粘附细胞、具有上皮样形态、培养时支持不同病毒的复制、以及支持如在此描述的希望的蛋白产物(例如,抗体、病毒颗粒以及类似物)的生产。将用于蛋白生产的组织培养应用中的血清或动物提取物的使用最小化,或消除以降低外源因子(例如,支原体、病毒、以及朊病毒)引起污染的险,从而确保满足预-GMP条件并且消除可以使蛋白纯化过程复杂化的额外蛋白的引
入。细胞培养程序期间所需操作数量的最小化可以显著减少污染的机会。
[0181] 在一些实施方案中,细胞被培养在无血清培养基(serum-free culture medium)中(在此也称作“无血清培养基(serum-free medium)”)。无血清培养基有时是浓缩的,并且有时按分批培养法培养细胞(不用更换或补充培养基)。在某些实施例中,无血清培养基包括CD-CHO培养基(英杰公司)的所有组分。
[0182] 在一些实施例中,无血清培养基包括植物水解产物。植物水解产物包括但不局限于,来自以下一个或多个水解产物:玉米、籽、豌豆、大豆、麦芽、马铃薯以及小麦。植物水解产物可以通过酶水解产生,并且通常包含肽、游离氨基酸以及生长因子的混合物。植
物水解产物很容易从多个商业来源获得,这些来源包括,例如,Marcor Development公司、HyClone公司以及Organo Technie公司。在某些实施例中,酵母水解产物也可以用于替代
植物水解产物或与其组合。
[0183] 酵母水解产物可以从商业来源获得,这些来源包括,例如,Sigma-Aldrich公司、USB Corp公司、Gibco/BRL公司及其他公司。在某些实施例中,合成水解产物可以用于添加至植物或酵母水解产物中或代替植物或酵母水解产物。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约0.1g/L至约5.0g/L、或约0.5g/L至约4.5g/L、或约1.0g/L至约4.0g/L、
或约1.5g/L至约3.5g/L、或约2.0g/L至约3.0g/L之间的植物水解产物。在某些实施例
中,无血清培养基包括最终浓度在2.5g/L的植物水解产物。在一些实施例中,无血清培养
基包括最终浓度在2.5g/L的小麦水解产物。
[0184] 在某些实施例中,无血清培养基包括脂质补充物。可以被用来补充培养基的脂质包括但不局限于化学上定义的动物和植物衍生的脂质补充物连同合成地衍生的脂质。可
以存在于脂质补充物中的脂质的非限制性实例包括:胆固醇、饱和和/或不饱和脂肪酸(例如,花生苷、亚油精、亚麻酸、肉豆蔻、油酸、棕榈以及硬脂酸)。胆固醇能以0.10mg/ml与
0.40mg/ml之间的浓度存在于脂质补充物的IOOX母液中。脂肪酸能以1μg/ml与20μg/
ml之间的浓度存在于脂质补充物的IOOX母液中。适合培养基配制品的脂质容易地从许多
商业来源获得,这些来源包括,例如,HyClone公司、Gibco/BRL公司以及Sigma-Aldrich公司。
[0185] 在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约0.1X至约2X之间、或约0.2X至约1.8X之间、或约0.3X至约1.7X之间、或约0.4X至约1.6X之间、或约0.5X至约1.5X
之间、或约0.6X至约1.4X之间、或约0.7X至约1.3X之间、或约0.8X以及约1.2X之间的一
种化学上定义的脂质浓缩物。在某些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在1X的一种化
学上定义的脂类浓缩物(CDCL)溶液,其中在某些实施例中X在约0.01微克/ml至约40微克
/mL之间。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在IX的一种化学上定义的脂类浓
缩物(CDCL)溶液。在某些实施例中,无血清培养基包括微量元素。可以使用的微量元素包括但不局限于CuSCVSH2O、ZnSO4-7H2O、亚硒酸盐-2Na、柠檬酸铁、MnS(VH2O、Na2SiO3-9H2O、钼酸-铵盐、NH4VO3、NiSO4-6H2O、SnCl2(无水的)、A1C13-6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2-6H2O、CrCl3(无水的)、NaF、GeO2、KI、RbCl、ZrOCl2-8H2O。微量元素的浓缩母液很容易从多个商业来源获得,包括,例如,Cell Grow(见目录号99-182、99-175以及99-176)。
[0186] 在某些实施例中,无血清培养基包括一种或多种激素、生长因子和/或其它生物分子。激素包括但不局限于三碘甲腺原氨酸、胰岛素以及氢化可的松。生长因子包括但不
局限于表皮生长因子(EGF)、胰岛素生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)以及成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些实施例中,无血清培养基包括表皮生长因子(EGF)。其他的生物分子,包括细胞因子(例如,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素类、白细胞介素、TNF)、趋化因子(例如,Rantes、嗜酸细胞活化趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白(MIP))以及前列腺素类(例如,前列腺素类E1和E2)。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约
0.0001mg/L至约0.05mg/L之间、或约0.0005mg/L至约0.025mg/L之间、或约0.001mg/L至
约0.01mg/L之间、或约0.002mg/L至约0.008mg/L之间、或约0.003mg/L至约0.006mg/L之
间的生长因子。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在0.005mg/L的EGF。在一些
-12 -12 -12
实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约1x10 M至约10x1010 M之间、或约2x1010 M
-12 -12 -12 -12 -12
至约9x10 M之间、或约3x10 M至约7x1010 M之间、或约4x10 M至约6x10 M之间的
-12
三碘甲腺原氨酸。在某些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在5x1010 M的三碘甲腺
原氨酸。在一个实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约1mg/L至约10mg/L之间或约
2.0mg/L至约8.0mg/L之间或约3mg/L至约6mg/L之间的胰岛素。在一些实施例中,无血
清培养基包括最终浓度在5mg/L的胰岛素。在某些实施例中,无血清培养基包括最终浓度
在约0.001mg/L至约0.05mg/L之间、或约0.005mg/L至约0.045mg/L之间、或约0.01mg/L
至约0.04mg/L之间、或约0.015mg/L至约0.035mg/L之间、或约0.02mg/L至约0.03mg/L
之间的前列腺素。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在0.025mg/L的前列腺素。
在某些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在0.025mg/L的前列腺素E1。
[0187] 在一些实施例中,无血清培养基用一种或多种选自下组的培养基组分强化,该组由以下项组成:腐胺、氨基酸类、维生素、脂肪酸以及核苷。在某些实施例中,本技术的无血清培养基用一种或多种培养基组分强化,使得该培养基组分的浓度是比典型地发现于常规
用于繁殖细胞的培养基(例如像杜尔贝科氏(Dulbecco)改良的Eagle's培养基/Ham's F12培养基(DMEM/F12))高约1倍、或约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍或更多倍。在一些实施例中,无血清培养基用腐胺强化。在某些实施例中,无血清培养基用腐胺强化,使得腐胺的浓度比典型地发现于DMEM/F12中的高约5倍或更多。
[0188] 可以用于强化该无血清培养基的脂肪酸的非限制性实例包括,不饱和的脂肪酸,包括但不局限于,亚麻酸以及α-亚麻酸(还被称作必需的脂肪酸),肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸;饱和脂肪酸,包括但不局限于,丁酸、己酸、辛酸、癸醇、十二烷醇、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、二十二酸、二十四烷酸、含硫脂肪酸包括硫辛酸。在某些实施例中,除由上所述脂类补充物所提供的之外,无血清培养基用额外的脂肪酸强化。在一个特定实施例中,无血清培养基用亚油酸和亚麻酸强化。在一些实施例中,无血清培养基用亚油酸和亚麻酸强化,使得亚油酸和亚麻酸的浓度比典型地发现于DMEM/F12中的高约5倍或更多。
[0189] 可以用于强化该无血清培养基的氨基酸的非限制性实例包括二十种标准氨基酸(丙氨酸,精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,和缬氨酸)连同胱氨酸连同非标准氨基酸。在某些实施例中,不由CAT-S细胞或其他哺乳动物细
胞合成的一种或多种氨基酸,通常被称作“必需氨基酸”,被强化。例如,八种氨基酸通常被称作人类必需的氨基酸:苯丙氨酸,缬氨酸,苏氨酸,色氨酸,异亮氨酸,蛋氨酸,亮氨酸,赖氨酸。在一些实施例中,无血清培养基用胱氨酸以及除了谷氨酰胺外的所有标准氨基酸
(DMEM/F12通常不用分别添加的谷氨酰胺配制)强化,使得胱氨酸及标准氨基酸的浓度比典型地发现于DMEM/F12中的高5倍或更多。在某些实施例中,无血清培养基包括浓度在约
146mg/L至约1022mg/L之间,或约292mg/L至约876mg/L之间,或约438mg/L至约730mg/L
之间的谷氨酰胺。在一些实施例中,无血清培养基包括浓度在约584mg/L的谷氨酰胺。
[0190] 可以用于强化无血清培养基的维生素的非限制性实例包括抗坏血酸(vit A)、d-生物素(vit B7以及vit H)、D-泛酸钙、胆钙化醇(vit D3)、氯化胆碱、氰钴胺(vit B12)、麦钙化醇(vit D2)、叶酸(vit B9)、甲基萘醌(vit K2)、肌醇、烟酰胺(vit B3)、对氨基苯甲酸、泛酸(vit B5)、叶绿醌(vit Ki)、吡哆醇(vit B6)、视黄醇(vit A)、核黄素(vit B2)、α-生育酚(vit E)和硫胺素(vit Bi)。在一个具体的实施例中,无血清培养基用d-生物素,D-钙,泛酸钙,氯化胆碱,氰钴胺素,叶酸,肌醇,烟酰胺,吡哆醇,核黄素,硫胺素强化,以使得这些指出的维生素的浓度比典型地发现于DMEM/F12的高5倍或更多。
[0191] 用于强化无血清培养基的核苷的非限制性实例包括,不限制于胞苷,尿苷,腺苷,胸苷,鸟苷,肌苷以及次黄嘌呤。在一些实施例中,无血清培养基用次黄嘌呤和胸苷强化,使得次黄嘌呤和胸苷的浓度比典型地发现于DMEM/F12的高约5倍或更多。
[0192] 可以添加到无血清细胞培养基中的额外组分的非限制的实例包括碳酸氢钠、碳源(例如,葡萄糖),以及铁结合剂。在一个实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约1200mg/L至约7200mg/L之间、或约2400至约6000mg/L之间、或约3600mg/L至约4800mg/L之间的
碳酸氢钠。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在4400mg/L的碳酸氢钠。在某些
实施例中,无血清培养基包括葡萄糖作为碳源。在一些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在约1g/L至约10g/L、或约2g/L至约10g/L、或约3g/L至约8g/L、或约4g/L至约6g/L、或
约4.5g/L至约9g/L之间的葡萄糖。在某些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在4.5g/
L的葡萄糖。在不同实施例中,可以添加到无血清培养基中的额外的葡萄糖用于CAT-S细胞
增殖到高密度,以及随后的大量的表达蛋白产物的产生。因此,在某些实施例中,无血清培养基包括额外的1-5g/L的葡萄糖,用于最终葡萄糖浓度在约5.5g/L至约10g/L之间。
[0193] 可以用于无血清培养基的铁结合剂的非限制性实例包括蛋白质,例如转铁蛋白以及化合物如环庚三烯酚酮(参见,例如美国专利5,045,454;5,118,513;6,593,140;以及PCT公开号WO01/16294)。在一些实施例中,无血清培养基包括环庚三烯酚酮(2-羟
基-2,4,6-环庚三烯-l)以及替代转铁蛋白的铁源(例如,柠檬酸铁铵、铁硫酸铵)。在某些实施例中,环庚三烯酚酮或环庚三烯酚酮衍生物将以超过该培养基中存在的铁的摩尔浓度
存在,摩尔比在约5:1与1:1之间。在一些实施例中,无血清培养基包括环庚三烯酚酮或环
庚三烯酚酮衍生物,以超过培养基中存在的铁的摩尔浓度存在,摩尔比约5:1,或约3:1、或约2:1、或约1.75:1、或约1.5:1、或约1.25:1。在某些实施例中,无血清培养基包括最终浓度在0.25mg/L的环庚三烯酚酮以及最终浓度在0.20mg/L的柠檬酸铁铵(FAC)。
[0194] 向培养基配制品中添加组分有时可以改变所得配制品的摩尔渗透压浓度。在某些实施例中,一个或多个典型地发现于DMEM/F12中的组分的量被减少以维持希望的摩尔渗
透压浓度。在一个实施例中,减小在此所述的无血清培养基中的氯化钠(NaCl)的浓度。在一些实施例中,无血清培养基中的NaCl的浓度是典型地存在于DMEM/F12中的约10%至约
90%、或约20%至约80%、或约30%至约70%、或约40%至约60%之间。在某些实施例中,无血
清培养基中的NaCl的最终浓度是典型地存在于DMEM/F12中的50%。在一些实施例中,无血
清培养基中的NaCl的最终浓度是3500mg/L。
[0195] 在某些实施例中,无血清培养基中存在的动物衍生组分的数量被最小化甚至消除。例如,可以用可商购的重组蛋白(例如胰岛素)以及衍生自非动物源的转铁蛋白(例如,各自地为生物学行业分类号(Biological Industries Cat.No.)01-818-1以及密理博分
类号(Millipore Cat.No.)9701,)替代衍生自动物源的蛋白。在一些实施例中,除了可以是化学上定义的脂类混合物的组分胆固醇外,所有动物衍生组分可以被非动物衍生产物替
代。在一些实施例中,为了最小化典型地与动物衍生产物相关的风险,胆固醇可以来自于位于与包括但不局限于朊病毒的外源因子无关的区域的绵羊毛。
[0196] 病毒融合蛋白(例如,可溶性病毒融合蛋白)有时可以产生于培养的CAT-S细胞。CAT-S细胞适应于增殖和/或生产浓缩无血清培养基中的希望的蛋白产物。在某些实施例
中,可以使用无血清培养基来支持CAT-S细胞的增殖,其中在该无血清培养基中的这些细
胞在至少20代之后、或至少30代之后、或至少40代之后、或至少50代之后、或至少60代
之后、或至少70代之后、或至少80代之后、或至少90代之后、或至少100代之后仍有活力。
在一些实施例中,CAT-S细胞的增殖由无血清培养基支持在高密度。在某些实施例中,无血
5 5 5
清培养基支持CAT-S细胞的增殖至至少5x10 细胞/mL、至少6x10 细胞/mL、至少7x10 细
5 5 6 6
胞/mL、至少8x10 细胞/mL、至少9x10 细胞/mL、至少I x I0 细胞/mL、至少1.2x10 细胞
6 6 6 6
/mL、至少1.4x10 细胞/mL、至少1.6x10 细胞/mL、至少1.8x10 细胞/mL、至少2.0x I0 细
6 6 6 7
胞/mL、至少2.5x10 细胞/mL、至少5x10 细胞/mL、至少7.5x10 细胞/mL、或至少I x10
的密度。
[0197] 蛋白生产
[0198] 本技术提供了用于生产来自用编码病毒融合蛋白(例如,可溶性病毒融合蛋白)的表达载体转染的细胞系(例如,CAT-S细胞)的大量蛋白的方法。在一些实施例中,在诱导蛋5 7
白生产之前,细胞生长至约5X10 至约1X10 的细胞密度。在某些实施例中,蛋白生产(例
如,表达)在转染的CAT-S细胞的对数生长期进行诱导。在一些实施例中,来自转染的构建体的蛋白表达是组成型的。
[0199] 在一些实施例中,蛋白生产(例如,来自转染的核酸的蛋白产物的表达)可以在生物反应器中进行。可以在需氧或厌氧条件下,在生物反应器中生产重组蛋白。生物反应器通常是圆柱形的,尺寸范围是从升至立方米,并且通常由不锈钢制成。生物反应器还可以是指意在细胞培养的背景下生长细胞或组织的装置或系统。基于操作模式,生物反应器可以被分为分批型(batch)、分批进料型(fed batch)或连续型(例如,连续搅拌槽式反应器模型)。
连续生物反应器的一个实例是恒化器。
[0200] 连续和分批处理反应器
[0201] 当进料和产物流被连续加料并且从该系统中取出撤出时,该反应器称为连续反应器。在一些实施例中,反应器可以具有连续或再循环流,但是不连续加料营养素或产物收获并且仍然被认为是分批反应器。在过程运行过程中,分批反应器可以具有或不具有培养基
撤出。通常广泛使用分批生产法,这是由于它们的简明性以及在像疫苗生产的工业中的有
用性。分批和填料分批过程是类似的过程,都是在更低活力细胞密度下接种细胞到选择培
养基中。允许细胞以指数方式生长同时很少或不进行外部操纵直到营养素在某种程度上耗
尽并且细胞接近稳定期。去除培养的一部分并且用新鲜培养基替代。去除和替代过程可以
重复若干次。
[0202] 重组蛋白的进料分批生产与分批进料培养的不同在于,当细胞仍在生长且培养基开始耗尽时,连续或间歇地添加浓缩的进料培养基(典型地在10X与20X的基本培养基浓度
之间)以供应额外的营养素并支持更高的最终细胞密度。为了接纳新鲜培养基的添加,相对于给定尺寸的生物反应器,进料分批培养通常始于低于分批培养的体积。在一些实施例中,对于给定尺寸的生物反应器,进料分批培养起始体积将在约40%至约60%的分批进料培养
之间。
[0203] 连续培养通常结合很多与分批和进料分批培养相同的要素的使用。连续培养通常涉及类似培养基的使用并且以类似方式影响起始细胞生长。一旦细胞到达某一密度,起始
流入流和收获流并且细胞达到稳态密度。
[0204] 在最适条件下,微生物或细胞在生物反应器中能够以100%的成功率执行它们的希望的功能。该生物反应器的环境条件,像气体(即,空气、氧气、氮气、二氧化碳)、流速、温度、pH以及溶解氧水平,以及搅动速度/循环速率通常受到监测和控制以最优化蛋白生产。
[0205] 适合培养用于大规模蛋白生产的高密度细胞的生物反应器的非限制性实例是波生物反应器系统(Wave Bioreactor System)(GE医疗保健公司(GE Healthcare))。波生物反应器组合了一次性生物反应器(例如,一次性细胞袋)以及永久性生物反应器(摇摆平台以及监测系统)的多个方面。
[0206] 在一些实施例中,病毒融合蛋白(例如,RSV-F或hPIV3-F)在生物反应器中增殖的转染细胞系中表达。在某些实施例中,收获细胞以分离希望的蛋白产物。在一些实施例
中,该希望的蛋白产物被该转染细胞分泌到培养基中,并且从该培养基中收获蛋白。在一些实施例中,该希望的蛋白产物的生产在约0.001克每升至约40克每升之间(例如,约0.001
克 / 升(g/L)、0.002g/L、0.006g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、
0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、
1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L、
5.5g/L、6.0g/L、6.5g/L、7.0g/L、7.5g/L、8.0g/L、8.5g/L、9.0g/L、9.5g/L、10.0g/L、10.5g/L、11.0g/L、11.5g/L、12.0g/L、12.5g/L、13.0g/L、13.5g/L、14.0g/L、14.5g/L、15.0g/L、
17.5g/L、20.0g/L、22.5g/L、25.0g/L、27.5g/L、30.0g/L、32.5g/L、35.0g/L、37.5g/L、以及
40.0g/L)。
[0207] 蛋白纯化
[0208] 蛋白纯化是包括一个或多个旨在从复合混合物中分离单型蛋白的步骤的一个过程。分离步骤通常利用蛋白大小、物理-化学特性和/或结合亲和力的差异。在一些实施例
中,分离基于大小、形状、电荷、疏水性、生物活性、等或其组合。在一些实施例中,可以使用非特异性纯化方法、亲和纯化方法或其组合对蛋白进行纯化。在某些实施例中,亲和纯化方法可以基于特异性标签识别(例如,6xHis标签)或基于特异性表位(例如,FLAG亲和纯化)。
[0209] 蛋白纯化的许多形式可以与不同层析法组合,包括不同分离培养基以及不同类型层析(例如,分批、柱HPLC、FPLC,等等)的使用。蛋白纯化物质和方法是本领域中已知的,并且每种蛋白纯化方案取决于多种因素,包括大小、pI、疏水性等。因此为了分离蛋白至
90%或更大纯度,可能需要可以针对每种蛋白要求优化的纯化方案的组合。可以用于纯化
蛋白的层析类型的非限制性实例包括,离子交换层析法(例如,根据化合物的离子电荷的性质和程度分离化合物)、亲和层析(例如,基于分子构象的分离技术,这经常利用应用特异性树脂,这些树脂具有附接到它们的表面上的、特异性针对要分离的化合物的配体)、金属结合层析(例如,在强烈结合到二价金属离子(例如镍和钴)上的蛋白的N-或C-端中的6至
8个组氨酸的序列,该蛋白可以通过包含固定的镍离子的柱,镍离子结合聚组氨酸标签)、免疫亲和性层析(例如,使用抗体到靶蛋白的特异性结合来选择性纯化该蛋白,这个程序涉及将一种抗体固定到柱材料上,柱材料然后选择性结合该蛋白,而其他每种物质流动通过)、高效液相层析(例如,应用高压来驱动溶质更快通过该柱,导致扩散受限且分离度提高的层析的一种形式)、等和/或其组合。通常使用的HPLC形式是“反相”HPLC,其中柱材料是疏水的。该蛋白由一个梯度的增加量的有机溶剂(例如乙腈)洗脱,并且根据它们的疏水性洗脱蛋白。
[0210] 重组病毒融合蛋白(例如,可溶性病毒融合蛋白)可以被纯化至一个希望水平的纯度。在一些实施例中,病毒融合蛋白被纯化至90%或更大(例如,约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.50%、99.95%)。
[0211] 蛋白定量
[0212] 可以在纯化的任何步骤进行蛋白鉴定和定量。在一些实施例中,在蛋白纯化的每一个步骤获取蛋白样品的等分部分,用于确定相对纯化倍数和蛋白纯度。在一些实施例中,在纯化的每一个连续步骤之后,通过鉴别样品中污染物质(例如,其他蛋白)的数量的任何减少,使用SDS-PAGE监测纯化成功。SDS-PAGE凝胶上的蛋白标准曲线的使用还可以促进蛋
白浓度的确定。
[0213] 用于确定蛋白浓度的方法是布拉福德(Bradford)蛋白测定。后者可以由布拉福德总蛋白测定或由280nm处的光的吸光度来确定。可以用于蛋白定量的另一种方法是
表面等离子体共振(SPR)。SPR可以检测结合到芯片表面上的无标签分子。额外的非限
制性蛋白定量方法包括,劳里(Lowry)测定、氟特性蛋白定量(Fluoroprofile protein quantification)、以及微连苯三酚红蛋白定量法。在一些实施例中,制备中蛋白的量可以表示为蛋白总量、蛋白浓度或该蛋白的活性浓度,作为总蛋白百分数。在此提供的病毒融合蛋白还可以通过在此提供的免疫测定法,包括,例如,定量的夹心ELISA,以及其他免疫测定法进行定量,包括,例如,间接ELISA、竞争性ELISA、敏感的荧光酶免疫测定法(FEIA)、纳米免疫测定法(NIA)、放射免疫测定、磁性免疫测定法以及本领域中已知的任何测定法,用于蛋白定量。
[0214] 可检出的特征以及固相支撑
[0215] 在一些实施例中,核酸或重组病毒融合蛋白(例如,可溶性病毒融合蛋白)可以用一个或多个可检出的特征修饰。核酸可以由位于5'端、3'端、5'与3'端之间及其组合的可检出特征修饰。蛋白可以由位于N-端、C-端、N-端与C-端之间及其组合的可检出特征
修饰。可检出特征可以作为合成的一部分结合,或在检测、定量或使用核酸或重组蛋白之前添加。在一些实施例中,可检出特征的结合可以在液相中或在固相上进行。
[0216] 可以适当地选择适合核酸或重组蛋白的检测的任何可检出特征。可检出特征的实例是荧光标记例如荧光素、碱性玫瑰精、以及其他(例如,安娜莎(Anantha)等人,Biochemistry(《生物化学》)(1998)37:27092714;以及Qu(吴)&Chaires(查尔斯),Methods Enzymol(《酶学方法》)(2000)321:353369);放射性同位素(例如,125I、131I、35S、31P、32P、
33P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、65Zn、67Cu、68Ge、82Sr、83Rb、95Tc、96Tc、103Pd、109Cd、以 及
127Xe);光散射标记(例如,美国专利号6,214,560,以及可商购的标记(英杰公司);化学发光标记以及酶底物(例如,二氧杂环丁烷以及吖啶酯),酶或蛋白标记(例如,绿色荧光蛋白(GFP)或其颜色变体,荧光素酶、过氧化酶);其他发色标记或染料(例如,菁蓝),以及其他协同因子或生物分子如异羟基洋地黄毒苷、strepdavidin、生物素(例如,结合配对成员例如像生物素以及抗生物素蛋白),亲和力捕获部分,3’阻断剂(例如,磷酸基、硫醇基、硫代磷酸酯、氨基修饰剂、生物素、生物素-TEG、胆甾醇基-TEG、异羟基洋地黄毒苷NHS酯、硫醇修饰剂C3S-S(二硫化物)、反向dT、C3间隔子)等。在一些实施例中,寡核苷酸种类组合物可以用亲和力捕获部分标记。还包括在可检出特征中的是对用于用质谱法(例如,基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱法以及电喷射(ES)质谱法)检测的质量修饰有用的那些标记。
[0217] 核酸或重组蛋白可以与固相支撑体关联。如在此使用,术语“固相支撑体”或“固相”是指核酸或蛋白可以与其关联的不溶性材料,并且这些术语可以互换使
用。固相支撑体的实例包括但不局限于,胶、玻璃(例如可控孔度玻璃(CPG))、尼龙、纤维素、金属表面(例如钢、金、、硅以及铜)、磁性材料、
塑料材料(例如,聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF))、芯片、平表面过滤器、一个或多个毛细管和/或纤维、阵列(array)、过滤器、珠子、珠子(例如,顺磁性的珠子、磁珠、微珠、纳米珠)以及颗粒(例如,微颗粒、纳米颗粒)。珠子和/或颗粒可以是游离的或彼此连接的(例如,烧结的)。在一些实施例中,该固相可以是颗粒的一个集合。在某些实施例中,这些颗粒可以包括硅石,并且硅石可以包括二氧化硅。在一些实施例中,硅石可以是多孔的,并且在某些实施例中硅石可以是非多孔的。在一些实施例中,这些颗粒进一步包括赋予这些颗粒顺磁性特性的试剂。在某些实施例中,该试剂包含一种金属,并且在某些实施
2+ 3+
例中,该试剂是金属氧化物(例如,铁或氧化铁,其中氧化铁包含Fe 与Fe 的混合物)。
[0218] 实例
[0219] 下面列出的实例说明了某些实施例并且不限制本技术。
[0220] 实例1:材料和方法
[0221] 除非另外指出,在该实例中列出的材料和方法用于进行实例2-5中描述的实验。
[0222] A.全长RSV-F表达
[0223] 以下方法适用于使用全长RSV-F表达构建体进行的实验。
[0224] 1.细胞和病毒
[0225] 将BSR-T7、MRC-5、Vero、以及HEp-2细胞维持在包含5%-10%FBS以及以下补充物中若干种的MEM中:2%胰蛋白示磷酸盐肉汤(西格玛公司)、2-4mM L-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、50U/ml青霉素、以及50μg/ml链霉素。将293F细胞维持在293FREESTYLE中。将293Ad细胞维持在补充有10%FBS、100U/
ml青霉素、以及100μg/ml链霉素的DMEM中。将可获得自英杰公司的FLP-IN TREX系统用
于产生293-衍生的细胞系中的FGC-WPRE以及FGC的稳定的、四环素诱导型表达。将这些细胞维持在包含高葡萄糖以及2mM谷氨酸酯的DMEM中,补充有10%Tet-核准的FBS(Clontech
公司)、100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素、15μg/ml杀稻瘟菌素以及150μg/ml潮霉
素。为了诱导F蛋白表达,将四环素(Teknova公司)添加到该培养基中以达到15μg/ml的
最终浓度。将细胞系在37°C维持在5%CO2中,除了维持在8%CO2中的293F细胞。除非另
外说明,细胞培养试剂获得自英杰公司。将RSV A Long株在HEp-2细胞中繁殖,并且通过
以下步骤制造病毒母液:在0.2的MOI处感染新鲜制备的HEp-2细胞的合生单层、感染后
48h通过刮除细胞到上清液中收获病毒、将细胞和上清液放置于一个管中、在50%功率处声
处理两次、并且通过离心分离聚集细胞碎片。将等体积50%蔗糖水溶液(w/v)添加到该病
毒收获物中,等分,在干冰/乙醇浴中快速冰冻,并且储存于-80°C。针对RSV ALong感染
的蛋白质印迹在0.5的MOI进行并且感染后24h收获。将重组b/hPIV3/RSV F2,表达来自
第二基因位置处的RSV F的一种牛/人副流感嵌合体病毒,如前所述进行繁殖(Tang(唐)
等人,2003J.Virol.(《病毒学杂志》)77,10819-10828)。
[0226] 2.F蛋白表达载体
[0227] 在该研究中使用的RSV-F基因序列来自RSV亚型A并且包括来自通过RT  PCR直接克隆自感染的HEp-2细胞的、Long株的野生型F基因序列(FLong)、来自以类似方式克隆的A2链的野生型F蛋白基因序列(FA2)、使用蒙特卡洛算法(Monte Carlo algorithm)通过DNA2.0Inc.进行密码子优化的A2株F基因序列(Fopt)(Villalobos(维拉罗伯士)等人,
2006BMC Bioinform.7,285)、以及以保藏氨基酸序列由DNA2.0,Inc.合成的方式富含G或C
核苷酸百分数的A2株F基因序列(FGC)。在核苷酸和氨基酸两个水平上,FLong以及FA2序列具有98%的一致性。FA2、Fopt、以及FGC序列首先被克隆到pCMVscript表达载体(Stratagene公司)中。FA2、Fopt、以及FGC序列还被克隆到先前描述的b/hPIV3重组病毒载体中(唐等人,
2003J.Virol.(《病毒学杂志》)77,10819-10828)。此外,FLong、FA2、Fopt、以及FGC序列被克隆到一个表达载体,pEBNA中,包含CMVIE启动子、SV40多腺苷酸化序列、以及埃巴病毒核抗原(EBNA)序列。pEBNAF蛋白表达载体包括优化的Kozak序列,ggcggcacc,F蛋白基因起始密码子的正上游。如在图1A中说明,克隆自系统生物科学质粒(System Biosciences plasmid)pCDH1-MCS1-Ef1-Puro的WPRE序列放置在F基因终止密码子之后以及SV40多腺苷酸化序
列之前。通过双脱氧测序法分析(应用生物技术公司(Applied Biotechnology,Inc.))对序列进行确认。使用凯杰公司(Qiagen)DNA纯化试剂盒对质粒进行纯化,用于转染。
[0228] 3.转染
[0229] 将BSR-T7、MRC-5、以及Vero细胞系播种于6-孔板中用于在转染时的80%合生。根据英杰公司的实验方案,为了转染,使用1μg质粒DNA以及4μl的LIPOFECTAMINE2000
(英杰公司)。次日,将转染培养基用2ml的OPTI MEM+庆大霉素替代,并且对这些细胞进行进一步孵育。在一些情况下,如下所述,在收集溶解产物并且用于经由蛋白质印迹进行蛋白表达分析之前,将细胞培养长达72小时。
[0230] 根据英杰公司的实验方案,在具有相同摩尔量的每一个表达载体的30-ml培养基6
中(占包含WPRE质粒的更大尺寸,或约30μg),在1×10 细胞/ml时,用40μl293FECTIN
(英杰公司)转染293F细胞。根据Clontech实验方案,将293F细胞转染的均匀度考虑在内,将来自READY-TO-GLOW分泌荧光素酶报告试剂盒(READY-TO-GLOW secreted Luciferase
Reporter kit)(Clontech公司)的1.5μg pMetLuc2-对照载体与F蛋白编码表达载体共转
6
染,并且在转染后24h进行对分泌的荧光素酶的测定。将293Ad细胞在6-孔板中以1×10
细胞/孔,用相同摩尔量的每种表达载体或约4μg以及5μl LIPOFECTAMINE2000进行转
染。
[0231] 4.蛋白质印迹
[0232] 通过去除培养基并且添加具有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液或包含裂解缓冲液的NP-40,随后离心分离碎片,收获蛋白溶解产物。将细胞溶解产物用12%Tris 甘氨酸即
刻凝胶剂(READY GELS)或10%NU-PAGE凝胶剂(英杰公司)分离并且转移到PVDF或硝酸
维素滤膜(英杰公司)上。将该膜在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或tris缓冲盐水以及包含5%脱脂奶粉的0.01%吐温20(TBS-T)中进行封闭。对于F蛋白检测,将高亲和力抗RSV-F蛋白
单克隆抗体(莫维珠单抗)(Wu吴等人,2007J.Mol.Bio.(《分子生物学杂志》)368,652-665)用作第一检测抗体。用PBS以及0.05%吐温20(PBS-T)或TBS-T进行洗涤。将HRP-结
合的兔或驴抗人类抗体(DAKO或杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))添加到PBS-T或TBS-T中的印迹中作为第二检测抗体。将该印迹用PBS-T或TBS-T洗涤,用ECL
试剂盒(Amersham Pharmacia公司)或LUMIGLO(KPL)显影并且曝光于柯达(KODAK)胶片上。对于β-肌动蛋白检测,除了所使用的第一抗体是抗-β-肌动蛋白单克隆抗体(密理博MAB1501)或β-肌动蛋白兔多克隆抗体(西格玛公司)并且所使用的第二抗体是山羊抗-小鼠抗体(分子探针公司(Molecular Probes))或山羊抗-兔抗体(西格玛公司)外,印迹程序相同。
[0233] 在一些情况下,转染后在通过每孔添加0.3mL的包含β巯基乙醇的Laemmli缓冲液产生溶解产物之前,将细胞培养长达72小时。收集溶解产物并且在12%SDS聚丙烯酰胺
凝胶上进行跑胶并且将蛋白转移至PVDF膜上。将印迹在5%脱脂奶粉中封闭并且然后用包
含1%脱脂奶粉(w/v)的PBS-吐温20中的1μg/ml莫维珠单抗进行孵育。用抗-人HRP结
合的第二抗体的1:5000稀释物孵育之后,蛋白带用ECL底物(GE医疗保健公司)显现并且
将其可变长度曝光于柯达Biomax胶片上。随后将印迹用抗-肌动蛋白单克隆抗体再次进
行探针探测以允许蛋白上样标准化。
[0234] 5.RT-PCR
[0235] 根据凯杰公司的实验方案,用RNEASY RNA纯化试剂盒(凯杰公司)从转染的293F细胞中纯化RNA。根据英杰公司的实验方案,在该实验方案的最后用额外的乙醇沉淀法步
骤,使用扩增级DNase(英杰公司)使得该RNA经受DNase处理。根据英杰公司的实验方案,第一链合成用寡(dT)N以及莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(RT)(英杰公司)进行。
第二链合成包括与CMV启动子内转录起始位点下游区域互补的正向引物以及与包括终止
密码子的每个F基因序列的最后21个核苷酸互补的反向引物。对于第二链合成,热廊线如
下:95°C持续3min,随后是30个循环:95°C持续30s、48°C持续30s、并且72°C持续
2min,随后是72°C持续10min的最终延伸步骤。
[0236] 6.cDNA末端3’快速扩增(RACE)RT-PCR
[0237] 如更早所述从转染的293F细胞中纯化RNA。按照英杰公司针对非嵌套第二链合成选项的实验方案,用3’RACE试剂盒(英杰公司)进行3’RACE分析。不包括在用于第二链合成的试剂盒中的前向基因特异性引物与包括起始密码子的每个F基因序列的最初21个核
苷酸互补。对于第二链合成,热廊线与针对RT-PCR描述的相同。
[0238] 7.TOPO TA克隆和测序
[0239] 来自3’RACE RT-PCR反应的主要DNA种类使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司)从琼脂糖凝胶中提取。使用英杰公司的实验方案,在TOP10细胞(英杰公司)的转染之前,将四微升的凝胶-提取的PCR片段添加到1μl TOPO TA pCR2.1载体(英杰公司)连同1μl供应
的缓冲液中并且在室温孵育30min。使用DNA小量制备试剂盒(凯杰公司)分离来自细菌克
隆的质粒DNA。使用M13引物以及Big Dye terminator试剂盒使得纯化的质粒经受双脱氧
测序法分析。如更前所述进行测序反应。
[0240] 8.显微镜检查法
[0241] 使用具有109NA0.25物镜的尼康TE2000-E显微镜(尼康仪器公司)记录影像。该系统配备有由METAMORPH,版本7.1.3.0(分子设备公司(Molecular Devices))驱动的COOL SNAP ES2摄像机(Photometrics公司)。具有465-495nm的激发的尼康B-2E/C FITC过滤
器用于显现GFP表达。
[0242] 9.结合至F蛋白表达细胞系上的抗体的确定
[0243] 根据制造商的说明(Perkin Elmer公司),莫维珠单抗以及R3-47,一种阴性对照单3+
克隆抗体,是使用DELFIA Eu-N1-ITC标记螯合物的Eu -标记并且是特征化的。进行纯化
3+
RSV-F蛋白的八重峰单克隆抗体亲和力测定(ForteBio公司)以确认Eu 标记不改变单克
隆抗体结合特性。
[0244] 如所述,将TREx-FGC-WPRE以及-FGC细胞系生长至合生并且用四环素诱导F蛋白表7
达。诱导后20h以及44h,收集细胞并且重悬浮至约1×10 个活细胞/ml于50%培养基
/50%LR结合缓冲液中(基于Tris的缓冲系统,Perkin Elmer公司)。在100-μl反应体积
5 3+
中将约1×10 个细胞与25nM Eu 标记的莫维珠单抗或LR结合缓冲液中的R3-47混合。将
加上单克隆抗体的细胞在4°C孵育1h,并且然后添加至Pall GHP真空滤器板上。将未结
合的单克隆抗体用具有DELFIA测定洗涤缓冲液(Perkin Elmer公司)的5×200μl洗液洗
3+
去,并且随着200μl增强溶液(Perkin Elmer公司)的添加释放Eu 光。伴随温和震荡在
37°C孵育1h之后,在Envision读取器(Perkin Elmer公司)上读出时间分辨荧光。将
3+
Eu 计数转换为结合的ng IgG,并且通过从总的结合的莫维珠单抗中减去R3-47非特异性
结合来计算特异性结合的莫维珠单抗。
[0245] B.可溶性RSV-F以及hPIV3-F表达
[0246] 以下方法适用于使用可溶性RSV-F和/或hPIV3-F表达构建体进行的实验。
[0247] 1.表达构建体产生
[0248] a.可溶性RSV-F表达构建体
[0249] 针对可溶性RSV-F蛋白(sRSV-F)的表达,对若干修饰的核苷酸序列进行评估。如前所述,这些核苷酸序列编码一致的sRSV-F氨基酸序列并且产生自在pCMVscript重组载体内克隆的野生型RSV-F亚型A2株(Huang(黄)等人,2010Virus Genes(《病毒基因》)
40:212-221)。RSV-F构建体的野生型序列从株A2通过PCR进行扩增。删除编码对应于SEQ
ID NO:2的525-574位氨基酸的、RSV-F蛋白的50个氨基酸C端跨膜结构域的核苷酸,以允
许蛋白分泌到细胞培养基中。对于密码子优选的构建体(OPT),通过DNA2.0(Menlo Park公司,加利福尼亚州)进行野生型序列的密码子优化以及基因合成。高鸟嘌呤/胞嘧啶含量(GC3)的构建体还可以通过DNA2.0合成并且通过改变野生型序列中的每一个第三碱基对
为鸟嘌呤亦或胞嘧啶来产生。不对其中第三碱基对已经是鸟嘌呤或胞嘧啶的密码子进行改
变。尽管并非HL2构建体中的全部密码子都改变,但是中等鸟嘌呤/胞嘧啶含量(HL2)构
建体通过与GC3构建体相同的方式由DNA2.0产生。GH5合成的RSV-F构建体被设计为各
自地容纳编码区域的5’和3’端处的FseI以及SbfI限制酶切位点,并且由整合DNA技术
(Integrated DNA Technologies)公司(爱荷华州,珊瑚村)产生。用于最初克隆进pCMV载体的PCR引物呈现于下表2中。
[0250]
[0251]
[0252] 对于CAT-S细胞中的这些可溶性RSV-F构建体的表达,将每一个构建体亚克隆到pCLD550v4-合成的MCS pA载体中。简言之,使用上述RSV-F构建体进行PCR反应,该构建
体包括野生型可溶性、密码子优化的(OPT)、富含GC的构建体(GC3),中等GC构建体(HL2)以及GH5,全部都在pCMVscript载体内。PCR引物被设计为导入这一扩增片段的5'和3'端
的FseI以及SbfI限制酶切位点以促进下游亚克隆(参见下表4)。同样地,邻近每个cDNA
的跨膜结构域导入终止密码子。使用该策略来确保所得蛋白将通过在野生型蛋白中存在跨
膜锚定之前终止转录而从细胞分泌。将2μl的每个扩增反应连接到TOPO TA载体(英杰公
司)并且通过限制酶切消化以及序列分析来筛选克隆。通过用FseI&SbfI消化,容纳适当序列的代表性sRSV-F克隆从TOPO TA载体上切割下并且连接到类似切割的pCLD550v4-合成
的MCS-pA载体中(图2)。图3中说明了克隆到pCLD载体中的可溶性高GC构建体(GC3)。
通过广泛的限制性内切酶消化来筛选克隆并且通过DNA测序来确认代表性克隆。
[0253]
[0254] 表4:用于扩增和构建三种sRSV-F构建体的5’和3’引物序列呈现在此。5’引物序列内整合的是FseI限制酶切位点并且3’引物序列内整合的是SbfI限制酶切位点(加下
划线的)。针对每一个构建体,将过早的终止密码子(TTA;以粗体指出)插入到邻近跨膜结构域的位置处以产生该蛋白的截短形式。
[0255] 针对克隆的细胞系发育,在使用SspI(pCLD中富含GC的sRSV-F)亦或PvuI(野生型可溶性)以及pCLD中密码子优化的sRSV-F),通过限制性内切酶消化转染之前,将表达构建体线性化。从罗氏公司(Roche)获得无动物组分的SspI以及PvuI以确保满足cGMP规
格。线性化的DNA是苯酚-氯仿纯化的并且由凝胶电泳和分光光度计进行分析以各自地确
定线性化和量。
[0256] 在一些情况下,通过Qiagen MaxiPrep程序(凯杰公司)制备每个序列-确认的DNA质粒并且经由Nanodrop(Thermo-Fisher Scientific公司)分析进行定量。随后使用仅具有靠近氨苄青霉素耐药性ORF的一个酶切位点并且因此远离融合蛋白以及谷氨酸酯合成
酶编码区两者去除的SapI酶(New England Biolabs公司)通过限制酶切消化将质粒线性
化。线性化质粒DNA是乙醇-沉淀的,通过Nanodrop分析定量,并且随后用于悬浮液CAT-S
和/或CHO-S细胞的转染。
[0257] b.可溶性hPIV3-F表达构建体
[0258] 使用针对来自前述衍生质粒(携带来自株Texas/12084/1983的野生型hPIV3-FORF)的野生型hPIV3-F的模板,通过PCR扩增hPIV3融合蛋白(hPIV3-F)的野生型序列。
使用携带FseI(正向引物)以及SbfI(反向引物)限制酶切位点序列的引物进行PCR扩增。
删除C-端51个氨基酸,对应SEQ ID NO:9的489-539位氨基酸,以产生一种可溶性的、分
泌的蛋白。通过将野生型序列中的每一个第三位密码子改变为鸟嘌呤或胞嘧啶来产生HL1
构建体。不对其中该第三碱基对已经是鸟嘌呤或胞嘧啶的密码子做出改变。通过DNA2.0进
行基因合成。随后将该产物用作PCR扩增以及亚克隆到pCLD中的模板。用于PCR扩增以
及将野生型和富含GC(HL1)的hPIV3-F构建体亚克隆到pCLD载体中的引物呈现于下表6
中。用于野生型和富含GC(HL1)的hPIV3-F构建体的额外的PCR引物(呈现于表6中)被
用于产生包含His标签的构建体。
[0259]
[0260]
[0261]
[0262] 通过Qiagen MaxiPrep程序(凯杰公司)制备每个序列-确认的DNA质粒并且经由Nanodrop(Thermo-Fisher Scientific公司)分析进行定量。随后使用仅具有靠近氨苄青
霉素耐药性ORF的一个酶切位点并且因此远离融合蛋白以及谷氨酸酯合成酶编码区两者
去除的Sap酶(New England Biolabs公司)通过限制酶切消化将质粒线性化。线性化质粒
DNA是乙醇-沉淀的,通过Nanodrop分析定量,并且随后用于悬浮液CHO(例如,CAT-S)细
胞的转染。
[0263] 2.细胞培养条件
[0264] 为了优化RSV-F表达,选择能够有效产生高滴度的促进研究性以及疫苗开发的可溶性RSV-F蛋白的生产细胞。为了此目的,采用CAT-S细胞,这是因为它们可以用无动物组
分培养基以及补充物培养,确保满足预-GMP条件。额外地,利用无血清来生长细胞系将通
过最小化来自培养基的不想要的蛋白来简化纯化过程。
[0265] 将CAT-S悬浮液CHO细胞(登录号10090201)维持在补充有6mM L-谷氨酰胺(英杰公司)、化学定义的CHO培养基(CD-CHO;英杰公司)中。确定培养基组分是无动物组分的以确保满足质量保证要求,用于未来临床级重组蛋白生产。将细胞在37°C在5%CO2中培
养于设定在140rpm的增湿震荡孵育器中以确保悬浮液培养物的连续和充分混合。每3-4
天,通过ViCell分析(Beckman Coulter Instruments公司)确定细胞生长以及活性,并且通常地,针对亲本CAT-S细胞系而言,范围在从95%-98%活力。相对于细胞活力和密度两者,CAT-S细胞在模仿位点上的生长与获得自另一个位点上的CAT-S细胞的生长并行。将细胞
保持在37°C、在5%CO2中。
[0266] 将英杰公司的悬浮CHO-S细胞维持在补充有8mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养基中。通常使用与上文针对CAT-S细胞描述的相同条件生长CHO-S细胞。在一些情况下,约
6
每3-4天,一旦达到大约2×10 活细胞每ml的密度,对CAT-S和CHO-S细胞系两者进行亚
6
克隆,在该点这些细胞以1:10(最终浓度0.2×10 细胞/mL)分到新鲜培养基中。培养试
剂获得自英杰公司。
[0267] 3.转染
[0268] 通过在300g离心10min,在大于90%活力收获悬浮CHO培养物、CAT-S以及CHO-S。将处于cGMP级Amaxa Nucleofector Solution V(Amaxa公司)的CAT-S(并且在一些情况
8
下是CHO-S)细胞的100μl等分部分(1×10 细胞/ml)与2μg线性DNA(如上所述)混合。
7
在一些情况下,将每转染聚集的1×10 细胞重悬在每转染100μL的Amaxa Nucleofector
Solution V中,并且添加到包含10μg线性质粒DNA(如上所述)的核转染比色皿中。随后
且单个地将比色皿放置在Amaxa Nucleofection装置中并且按程序#U024(先前已经由医学
免疫公司确定)进行电穿孔。将细胞立即稀释到不含L-谷氨酰胺的、50ml预热的(37°C)
CD-CHO培养基中。将该细胞溶液的50μl等分部分添加到十个96-孔板的每个孔中并且
在5%CO2增湿的条件下静止地孵育过夜,以促进细胞恢复。第二天向每个孔中添加150μl
的选择培养基、包含蛋氨酸亚砜亚胺(MSX;西格玛公司)的CD-CHO。用于选择的MSX的最终浓度是65μM。将细胞静态地孵育21天,以允许克隆发育。在该MSX选择性培养基中进行
大约21天的选择后,分析细胞培养物的百分比活性,并且将上清液去除,并对每个转染子
6
的活细胞密度进行标准化(2×10 活细胞每mL)。随后,鉴定具有单克隆的孔并且从每个孔中去除20μl的培养基等分部分用于经由蛋白质印迹分析(在还原以及非还原条件下运行)和/或定量ELISA进行蛋白定量,以确定RSV或PIV3融合蛋白的表达。
[0269] 4.蛋白质印迹分析
[0270] 为了评估由CAT-S克隆细胞系生产的sRSV-F,将培养基从板中去除并且在300g离心10min以去除残余细胞或细胞碎片。将所得的上清液以3体积培养基比1体积4X
SDS样品缓冲液(英杰公司)进行混合,并且上样到4%-12%Tris-甘氨酸Novex凝胶(英杰
公司)上,用于非简化样品(non-reduced sample)。为了确定还原蛋白带模式,在上样到
4%-12%Tris-甘氨酸凝胶上之前,将样品用10%还原溶液(DTT,英杰公司)在70°C孵育15
分钟。将蛋白凝胶在150伏特在室温跑胶1小时。将分离的蛋白转移到PVDF膜上并且然
后在包含5%脱脂奶粉的PBS中进行封闭。将印迹首先用多克隆山羊抗-RSV抗体(密理博
MAB1128)进行孵育,并且然后用兔抗-山羊HRP结合的第二抗体(Dako公司)进行孵育。在用SuperSignal ECL底物(Pierce公司)孵育,并且曝光于柯达Biomax胶片上之后,蛋白条带显现。将泳道上样等效量的细胞培养上清液,这样就可以跨衍生自每个sRSV-F构建体的
多个克隆做出比较。
[0271] 在一些情况下,根据以下实验方案进行蛋白质印迹。
[0272] a.还原性SDS-PAGE
[0273] 将样品稀释在包含β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中,煮沸10分钟并且在12%Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司)上跑胶。使用XCell-II印迹系统(英杰公司)将蛋白转移到PVDF上,并且使用莫维珠单抗(医学免疫公司)亦或山羊抗-RSV(密理博公司)抗体进行探针探测。将这些印迹各自地用HRP-结合的抗-人以及抗-山羊抗体进行探针探测。使
用ECL Plus(GE医疗保健公司)以及放射自显现胶片检测信号。
[0274] b.非还原性SDS-PAGE
[0275] 将样品用 体积的4X LDS上样缓冲液(英杰公司)进行稀释,并且直接上样到4%-12%Tris-甘氨酸梯度凝胶(英杰公司)上。使用XCell-II印迹系统(英杰公司)将分离的蛋白转移到PVDF(0.45μM孔径)上,并且然后使用莫维珠单抗(医学免疫公司)亦或山羊抗-RSV(密理博公司)抗体进行探针探测。将这些印迹各自地用HRP-结合的抗-人以
及抗-山羊抗体进行探针探测。使用SUPERSIGNAL Femto ECL试剂(Pierce)以及放射自
显现胶片检测信号。
[0276] 5.ELISA筛选
[0277] 使用研究纯的蛋白作为标准,通过定量ELISA,针对sRSV-F表达,对包含经克隆生长的转染的细胞的孔进行筛选。简言之,在4°C,用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.0)中的多克隆山羊抗-RSV抗体(密理博MAB1128)的1:1000稀释液,将96孔Immulon4B板(高
结合性)涂覆过夜。在将板用200μlSuperblock溶液(Pierce公司)在室温下封闭1小时
之前,反复用包含0.05%吐温20(PBS-TWEEN)的磷酸盐缓冲盐水对板进行洗涤。在添加
从显示克隆生长的孔中去除的细胞培养基的1:10稀释液(在PBS中的10%Superblock)之
前,用PBS-吐温反复洗涤ELISA板。在洗涤以及用第一检测抗体,单克隆小鼠抗-RSV抗体
(来自密理博公司的MAB8262)的1:1000稀释液孵育之前,将样品板在室温孵育2小时。随
后,去除未结合的第一抗体,将板用抗-小鼠HRP第二抗体(Dako公司)孵育,并且然后使用TMB底物显影。通过添加HCl停止TMB显影,并且使用SoftMax Pro软件(分子设备公司)
在SpectraMax5板读取器上针对450nm吸光度对板进行测定。将单个样品的A450值与产
生自b/hPIV3-表达的以及研究纯的sRSV-F的标准曲线进行比较。
[0278] 在一些情况下,使用以下ELISA实验方案。去除来自每个转染细胞群的上清液培6
养基,并且标准化为活细胞密度(2×10 活细胞每mL)。然后针对RSV融合蛋白的表达,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对上清液样品进行分析。将上清液从净样品(起始培养基)1:2稀释至1:2048,在96-孔板的二重孔中进行检验,并且与衍生自已知量的纯sRSV-F的标准
曲线进行比较。简言之,在添加样品之前,将板用1μg/mL莫维珠单抗(PBS中)涂覆过夜,然后用300μL/孔Superblock(Pierce公司)封闭1小时。在一些情况下,将100μl体积
中的150ng莫维珠单抗用于涂覆每个孔。随后,使用单克隆小鼠抗-RSV抗体(MAB8262;密
理博公司)的1:1000稀释液,接着是1:10000的兔抗-小鼠过氧化酶以及过氧化酶底物TMB
的添加对sRSV-F结合进行检测。将板在SpectraMax板读取器上进行读取,并且从制备自纯
sRSV-F稀释的1:3从4μg/mL至0.2ng/mL的标准曲线计算存在于每个样品中的sRSV-F。
[0279] 在一些情况下,使用具有更严格的纯度以及定量的b/hPIV3-表达的sRSV-F(0.4mg/ml)的显影-纯的形式来产生标准曲线(范围是4至0.031ng/ml)。在sRSV-F水平
测定中,实施这些改进并且随后提供更大的CV值以及更低的误差率,即,更大置信度
[0280] 6.细胞培养扩大(CAT-S细胞)
[0281] 将最初96-孔克隆相对于重组蛋白表达水平划分等级,并且将具有可检出蛋白的那些克隆转移到24孔板,用于细胞扩增。在转移到6孔培养板并且最终到具有10ml选择
性培养基的125锥形摇瓶中之前,在24孔板培养物上迭代反复地进行ELISA以及蛋白质
印迹。在接种到锥形瓶中约一周后,将培养的细胞从静态孵育器移到震荡孵育器中并且开
始在80rpm混合7天。轻柔震荡一周之后,对每一个摇瓶培养确定针对细胞密度和活力的
ViCell分析。然后将震荡增高至100rpm持续4天,并且在其之后最终至140rpm的优化的
维持速度。周期性分析摇瓶中的蛋白表达以及细胞密度/活力,以确定生产力和生长,从而确定单个克隆的等级。在用于选择最高生产培养物的扩大过程中,具有小于最高克隆10%
表达水平的克隆周期性下降。
[0282] 在进料以及非进料分批的条件下,通过用0.2×106细胞每ml选择性培养基接种摇瓶并且周期性取样蛋白表达和细胞生长,来确定过度生长的培养生产。将医学免疫公司
培养基CDC-3(化学定义的CHO-3)用于生物反应器中的CAT-S生长,并且将医学免疫公司
M20A进料用于进料分批培养的补充进料。
[0283] 7.流式细胞计量
[0284] 在对RSV-F蛋白表达染色之前,通过在300g离心10min,收获CAT-S以及CHO-S6
细胞培养物。将包含大约3×10 活细胞每样品的细胞团重悬于500μL固定溶液(Becton
Dickinson Cytofix/Cytoperm试剂盒公司;加利福尼亚州,圣地亚哥市)中,并且在4°C孵育过夜。根据制造商的实验方案,将固定的细胞用Becton Dickinson’s Cytoperm溶液进
行透化,并且然后用1μg/mL莫维珠单抗在4°C孵育1小时。洗涤细胞以去除未结合的莫
维珠单抗,并且随后用抗-人FITC结合的检测抗体(Dako Cytomation公司)的1:1000稀
释液在4°C孵育1小时。然后洗涤细胞,并且在LSR II亦或FacsCalibur流式细胞计量
仪上分析细胞,并且各自地经由FACSDIVA或CELLQUEST软件对细胞进行表达分析。
[0285] 实例2:全长RSV-F表达的优化
[0286] 为了评估核苷酸序列会对全长RSV-F蛋白表达的影响,将细胞系用包含野生型的、密码子优化的、亦或富含GC译本的全长RSV-F核苷酸序列的DNA构建体转染。根据实
例1列出的方法,将编码同一RSV-F蛋白的核苷酸构建体克隆到pCMVscript表达载体中并
转染到BSRT7、MRC-5以及Vero细胞中。核苷酸序列变体以及顺式作用核输出元件对全长
RSV-F蛋白表达的影响如下所述。
[0287] A.通过增加的GC丰度以及顺式作用核输出元件改进重组RSV-F蛋白表达水平。
[0288] 进行第一项测试来确定增加GC丰度以克服富含AU的天然病毒转录物对核输出的负面影响是否可以改进重组F蛋白表达水平。将野生型RSV A2F基因序列(FA2)、密码子优化RSV A2F序列(Fopt)、以及富含G或C核苷酸百分比的RSV A2F序列(但编码氨基酸序
列(FGC))克隆到pCMVscript表达载体中。如图1B示出,这些RSV-F序列GC含量差异超过
10%。每个表达载体被转染到BSR-T7、MRC-5或Vero细胞中。选择这些细胞类型是因为它
们通常各自地用于复苏重组病毒、繁殖活的减毒RSV疫苗、以及繁殖RSV。在转染后36h收
集的细胞溶解产物上进行F蛋白表达的蛋白质印迹,并标准化为β-肌动蛋白。使用高亲
合力的单克隆抗体(吴等,2007,《分子生物学杂志》,368,652-655)检测F蛋白,该单克隆抗体识别F蛋白的迁移至48kDa的F1片段,并且一致地识别另一个更小的未经确认的迁移至
约22kDa的片段。BSR-T7细胞中,Fopt的表达水平高于天然FA2,但此观察在MRC-5以及Vero细胞(图4和5)内不能检测到。改进F蛋白转录物的GC丰度(FGC)导致所有细胞类型中F
蛋白表达水平相比于FA2以及Fopt的提高(图4和5)。这些结果提高了以下可能性:来自标准哺乳动物表达载体的用于重组表达的RSV-F蛋白基因序列的密码子优化的作用部分地
是改进GC丰度。
[0289] 为了进一步评估F蛋白的重组表达是否受差的核输出的阻碍,如在图1中示出,将WPRE导入pEBNA F蛋白表达载体中。将相同摩尔量的每个表达载体转染到293F细胞中,
选择这些细胞是因为它们对转染的高度容许性。在一些实验中,编码分泌的荧光素酶的载
体与pEBNA F蛋白表达载体共转染,并且在转染后24小时收获上清液的等分部分。测定
这些上清液中的荧光素酶活性,示出对于所有构建体,转染率类似。转染后48h收集细胞
溶解产物,并且使用图4和5中使用的、与用来检测F蛋白相同的高亲和力抗体进行蛋白
质印迹。为了便于比较,基于β-肌动蛋白,将溶解产物首先稀释至标准化,用于蛋白上样,并且在上样之前进一步稀释这些标准化的溶解产物,使得示出更高F蛋白表达的溶解产物
比具有更少F蛋白表达的溶解产物多稀释10倍(图6)。pEBNA载体克隆观察到的趋势与
pCMVscript载体克隆观察到的相同(图4和5),其中F蛋白表达通过密码子优化和增加的
GC优化而改进(图6)。如通过在F蛋白表达时,在48kDa处代表F蛋白的F1部分的清晰、模
糊条带以及仅由蛋白质印迹可检测出的22kDa的明显条带的外观所观察到的(图6),通过
将WPRE添加到FLong以及FA2表达载体中增强F蛋白表达。当WPRE包括在Fopt以及FGC表达
载体中时,由WPRE引起的增强更不明显(图6)。出于比较目的,示出了以同样方式,用来自RSV感染的HEp-2细胞溶解产物进行的的蛋白质印迹。由F蛋白特异性抗体检测出了相同
的两个条带,表明未经确认的条带不是重组F蛋白表达的具体结果(图6)。WPRE以及增加
的GC丰度改进F蛋白表达的观察结果提示F蛋白的低重组表达水平可能归因于,或至少部
分地归因于F蛋白转录物的无效核输出。
[0290] B.在细胞质重组病毒表达载体的背景下,增加的GC丰度不改进重组F蛋白表达
[0291] 如果低水平的来自标准哺乳动物表达载体的F蛋白表达是差的核输出的结果,则当在细胞质中发生转录时,FA2、Fopt以及FGC的RSV-F表达水平应当是大致相同的。然而,如果由F基因的密码子优化或增加的GC丰度引起的F蛋白表达的改进不是改进的核输出的
结果,则当在细胞质中发生转录时,Fopt以及FGC的表达水平应当高于野生型FA2的水平。因此,从b/hPIV3,衍生自牛副流感病毒型3(bPIV3)的一种重组病毒表达载体并且是如前所述(唐等人,2003J.Virol.(《病毒学杂志》77,10819-10828)表达FA2、Fopt、以及FGC,以检验这种推测(scenario)(图7A)。来自b/h PIV3的RSV-F基因的表达以类似于RSV-F基因在
RSV感染的细胞中的表达的方式发生在受感染细胞的细胞质中。如在图7A中示出,将RSV-F
基因克隆到bPIV3N以及bPIV3P基因之间的第二基因位置。感染后48h,收集来自表达不
同F基因译本的、经b/h PIV3/RSV-F重组病毒感染的Vero细胞的溶解产物用于蛋白质印
迹法。蛋白质印迹分析示出,增加的GC丰度在病毒载体背景下不改进F蛋白表达水平(图
7B)。这些数据进一步表明差的核输出造成低水平的来自标准基于质粒的哺乳动物表达载
体的F蛋白表达。
[0292] C.过早的聚腺苷酸化作用造成低水平的重组RSV-F蛋白表达
[0293] 除评估核输出之外,进行试验以确定RNA聚合酶II而非正常转录这个基因的病毒聚合酶引起的重组F蛋白转录是否将导致已经历假剪接和/或过早聚腺苷酸化作用的转录
物。为了确定F基因的RNA聚合酶II衍生的转录物被剪接,转染后48h从具有相同摩尔量
的每个pEBNA F蛋白表达载体的293F细胞纯化总RNA。对每个样品通过F蛋白的终止密码
子进行跨CMVIE启动子内的转录起始位点的RT-PCR。RT-PCR的凝胶分析示出,全长转录物
是经F基因的所有译本转染的293F细胞中表达的主要转录物。因此,剪接不是造成低水平
的重组F蛋白表达的主要因素。
[0294] 重组表达过程中的F基因转录物的过早聚腺苷酸化作用是以前报道过的((Ternette腾安特)等人,2007Virol.J.(《病毒学杂志》)4,51)。通过识别转录物起始位点连同转录物终止位点,RACE分析常规用于表征转录物的5’亦或3’端。因此,使用3’RACE分析来检验过早聚腺苷酸化的F转录物。如在图8A中总结的,基于FLong、FA2以及Fopt序列中识别的聚腺苷酸化信号序列,预期这些基因可以经历过早聚腺苷酸化,而由于缺乏聚腺
苷酸化信号序列,FGC序列将不经历过早聚腺苷酸化。转染后48h,从具有相同摩尔量的每个pEBNA F蛋白表达载体的293F细胞中纯化总RNA并且经历3’RACE分析。3’RACE PCR被
设计为扩增全长F转录物,对于不含WPRE的转录物长度应当接近1,700个核苷酸,对于含
WPRE的转录物长度应当接近2,325个核苷酸。如通过凝胶光密度测定法定量的,3’RACE分
析揭示在经FLong以及FA2表达载体转染的293F细胞中检测到的大多数F蛋白转录物小于
1,700或2,325个核苷酸(图8B)。在这些样品中可能存在全长转录物,因为全长转录物由
用于剪接的PCR分析检测到,并且全长F蛋白生产由蛋白质印迹在经FLong以及FA2蛋白表
达载体(包含WPRE(图6))转染的细胞中检测到,但是低于3’RACE分析的检测限度。相比之下,在经Fopt表达载体转染的293F细胞中检测到的更小转录物被认为是更低丰度的(对
于Fopt以及Fopt-WPRE各自地是3%与40%)。这些更小转录物的大小与FLong、FA2、以及Fopt中的多聚腺苷酸化信号序列相关(图8A)。过早的聚腺苷酸化作用特异性针对RNA聚合酶II,因为在其中F蛋白由该病毒聚合酶转录的病毒复制(图8B)过程中未检测到这些截短的转录
物。除了揭示截短的转录物,3’RACE RT-PCR证明转录物丰度存在差异。进入RACE分析的
每个RT步骤的相同量的RNA,与针对FLong以及FA2样品的2μl相比,仅有0.5μl的第一链
反应物进入针对Fopt以及FGC样品的第二链合成,以达到图8B中所示的结果。因此,FLong以及FA2转录物的丰度看来低于Fopt以及FGC转录物。
[0295] 将主要的3’RACE PCR产物克隆到TOPO TA pCR2.1中并且进行测序以鉴别聚腺苷酸化作用事件的存在与精确定位。测序结果确认FLong以及FA2截短的转录物是与位于F基
因内的1282核苷酸位置处的多聚腺苷酸化信号序列相关的过早的聚腺苷酸化作用事件的
结果,而全长转录物鉴定为Fopt以及FGC。这些结果表明过早的聚腺苷酸化作用造成低水平的重组F蛋白表达并且密码子优化(Fopt)不足以完全抵消这个问题。然而,增加的GC含量(FGC)导致全部过早的聚腺苷酸化作用信号序列,AATAAA的消除以及重组RSV-F蛋白的更好表达。
[0296] D.与更高融合活性相关的增加的重组RSV-F蛋白表达
[0297] 为了确定改进的重组F蛋白表达是否影响功能,使用瞬时和稳定表达两种方法来评估F蛋白-介导的细胞与细胞之间的融合或合胞体形成。对于瞬时表达,将293Ad细胞
用相同摩尔量的每个pEBNA F蛋白表达载体的等效物进行转染。转录后24h通过显微镜检
查分析F蛋白-介导的细胞与细胞之间的融合。目测示出合胞体形成的程度(图9)与增
加的F蛋白表达水平密切相关(图4-6)。最广泛的合胞体形成与经FGC-WPRE表达载体转染的细胞中观察到的一致(图9)。为了分析F蛋白的稳定表达,产生在四环素诱导时表达FGC或FGC-WPRE的293-衍生的细胞系。发展了用来确定特异性针对RSV-F蛋白的抗体结合至这些细胞系的的量的测定法(吴等,2007,《分子生物学杂志》,368,652-655)。诱导后44h,与FGC细胞系相比,结合至FGC-WPRE细胞系上的抗体具有平均6.31-倍±0.58(SEM)的更高量,表明F蛋白表达的更高量。F蛋白表达水平中的这种差异对F蛋白功能具有显著影响,因为仅在
FGC-WPRE细胞系中观察到合胞体形成并且FGC细胞系中未观察到。
[0298] 实例3:CAT-S以及CHO-S细胞中的可溶性RSV-F蛋白的生产
[0299] 为了评估核苷酸序列可以对RSV-F蛋白的可溶性译本(sRSV-F)表达的影响并且确定哪一种细胞系最适于sRSV-F蛋白生产,将CAT-S以及CHO-S细胞系用包含sRSV-F核苷
酸序列不同译本的DNA构建体进行核转染。确切地,使用了以下构建体:可溶性野生型(SEQ ID NO:3)、可溶性密码子优化的(OPT;SEQ ID NO:4)、可溶性高GC(GC3;SEQ ID NO:5)、可溶性中等GC3(HL2;SEQ ID NO:6)以及可溶性GH5;它们编码相同的sRSV-F氨基酸序列
(SEQ ID NO:7)。在这个实例中使用的sRSV-F核苷酸构建体编码RSV-F蛋白的胞外域。如
在实例1中描述,将编码包含该蛋白的跨膜以及内部结构域的羧基端的50个氨基酸从每个
构建体上删除。根据实例1中描述的方法,亚克隆到pCLDv4550-合成的MCS-poly A表达
载体中的每个sRSV-F构建体是Amaxa核转染到CAT-S以及CHO-S细胞中。根据实例1中
描述的方法,培养细胞并且使用蛋白质印迹、ELISA以及FACS针对sRSV-F蛋白测定这些培
养物。
[0300] 根据实例1中呈现的方法进行蛋白质印迹。用于CAT-S细胞中sRSV-F生产的蛋白质印迹结果呈现于图10和11中。用于CHO-S细胞中sRSV-F生产的蛋白质印迹结果呈
现于图12和13中。根据实例1中描述的方法进行ELISA分析。用于CAT-S以及CHO-S细
胞中sRSV-F生产的ELISA结果呈现于图14中。根据ELISA分析,sRSV-F蛋白的表达在经
高GC构建体(GC3)转染的CAT-S细胞中最高,随后是中等GC(HL2)以及密码子优化的构
建体。与CHO-S细胞系相比,CAT-S细胞系中的总体蛋白生产高大于2倍。根据实例1中
呈现的方法进行FACS分析。用于CAT-S以及CHO-S细胞中sRSV-F生产的FACS结果呈现
于图15、16、以及17中。根据FACS分析,不论利用哪种细胞系,sRSV-F蛋白的表达在经高
GC构建体(GC3)转染后等级最高,随后是中等GC(HL2)。野生型、密码子优化的(OPT)、以及GH5译本在上述背景水平下无显著差异。
[0301] 实例4:CAT-S细胞中的可溶性RSV-F核苷酸序列的优化
[0302] 为了评估核苷酸序列对RSV-F蛋白的可溶性译本(sRSV-F)表达的可能影响,将CAT-S细胞系用包含野生型的、密码子优化的、或富含GC译本的sRSV-F核苷酸序列(各自
地是SEQ ID NO:3、4、和5)的DNA构建体进行核转染,它们全部编码相同的sRSV-F氨基酸
序列(SEQ ID NO:7)。全部三种sRSV-F核苷酸构建体编码RSV-F蛋白的胞外域。如在实
例1中描述,将编码包含该蛋白的跨膜以及内部结构域的羧基端的50个氨基酸从每个构建
体上删除。亚克隆到pCLDv4550-合成的MCS-poly A表达载体中的每个sRSV-F构建体是
Amaxa核转染到CAT-S细胞中。
[0303] A.稳定的、克隆细胞系产生
[0304] 将核转染的CAT-S细胞稀释在96-孔板之中以用于克隆细胞系产生。选择性生长3周之后,在每个构建体转染的板上进行克隆。在野生型可溶性板中人工鉴定127个克隆,
并且这116个克隆(91.3%)具有代表产生自单细胞克隆的那些的克隆形态。在密码子优化
的板中人工鉴定111个克隆,其中99个似乎是单细胞克隆的结果(89.2%)。最终,尽管这些克隆全部(100%)具有出现自单细胞的希望的形态,但是在富含GC的转染板中仅27个孔具
有适当的细胞生长。
[0305] B.sRSV-F蛋白生产以及ELISA筛选
[0306] 在这个实验中,针对每个sRSV-F核苷酸构建体对蛋白生产进行测定。如在上文部分A中所述,从来自单细胞克隆的显示生长的细胞中去除培养基的20μl等分部分,并且经
由定量ELISA检验蛋白生产。在来自野生型可溶性构建体的表达转录物克隆中的sRSV-F
蛋白水平通常低于或最多在检出水平边缘(约0.1μg/mL)。在密码子优化的克隆中重组表达水平略微提高(范围是约0.2至1.1μg/mL),但是对于其中许多在该测定中使用的标准
曲线之上的富含GC的克隆最强(范围是0.1至大于10μg/mL)(图18)。
[0307] 来自表达可检出sRSV-F水平的所有孔的细胞按比例扩大到24孔培养板中并且然后在6孔板经21-28天,取决于细胞生长速率。在该按比例扩大过程内的多个时间点,通过
ELISA测定sRSV-F生产。在不同时间点生产的sRSV-F蛋白的量呈现于图23中。
[0308] 在每个测定时间点,优势生产的克隆是唯一的并且与经富含GC的构建体转染的细胞中发现的一致。由密码子优化的克隆生产的sRSV-F水平与富含GC的细胞系相比是适
度的,并且在野生型可溶性细胞系中最低限度地检出。结果是,野生型可溶性细胞系从该研究系统地下降并且仅富含GC的以及密码子优化的亲本系继续向前进入发育。
[0309] C.选择的亲本克隆中的sRSV-F蛋白生产
[0310] 基于sRSV-F的表达水平以及细胞生长特征两者,针对生产能力对亲本克隆划分等级并且将最高的22个克隆(确切是,GC克隆3G1、3D12、4C6、8D4、3B6、1D7、4C3、5H9、4C10、
2F11、9A5、2H10、6G11、6E10、以及2E7,以及CO克隆1E6、4F12、6A3、6A5、5B8、8A6、以及3B3)置于摇瓶中在140rpm培养。这些条件最适于悬浮CAT-S细胞系的生长并且预期升高生产滴
定度并且细胞生长水平高于静态平板生长获得的那些。随后将最高的9个亲本系置于摇瓶
6
培养过夜以评估可能是最好的生产者的那些。这种培养方式在第0天以同一水平(0.2×10
细胞每ml)播种克隆细胞并且测定细胞活力/密度以及经14天进一步培养(不具有额外的
培养基变化或进料)的sRSV-F生产两者。这种方法允许评估响应生长应力,单个细胞系如何存活。因为细胞密度在约第7天达到峰值,所以预期培养基构成开始限制细胞生长。针对最高的四个克隆的表达滴定以及活力数据说明于图19中,揭示获得高达90μg/ml的sRSV-F
水平。这些结果代表至少6倍高于Vero细胞生物反应器(先前利用的最适生产系统)中可
达到的水平。经由蛋白质印迹分析(图20)进一步确认摇瓶过度生长结果。
[0311] D.生物反应器sRSV-F蛋白生产
[0312] 生物反应器以及进料分批生物反应器数据已经证明,用8D4亲本亚克隆达到大于500μg/ml的sRSV-F生产水平,针对克隆3B6的大于340μg/ml的sRSV-F生产水平,针对
克隆3G1的大于280μg/ml的sRSV-F生产水平。另外的数据已经证明,针对克隆1D7的约
1.3mg/ml的sRSV-F生产水平,并且针对克隆8D4的约1.6mg/ml的sRSV-F生产水平。
[0313] 实例5:CAT-S细胞中的hPIV3-F生产
[0314] 为了确定高GC3途径是否可以适用于除RSV-F之外的其他病毒糖蛋白,使用修饰的核苷酸序列构建体对CAT-S细胞中的hPIV3-F生产进行检验。在这个实例中使用的
hPIV3-F构建体包括可溶性野生型(SEQ ID NO:10)、可溶性高GC(HL1;SEQ ID NO:11)、His-标记的可溶性野生型(SEQ ID NO:13)、以及His-标记的高GC(SEQ ID NO:14)。高GC构建体被产生为100%GC3构建体,其中每个密码子在每一个第三碱基对处包含鸟嘌呤或胞
嘧啶。由于少数抗-hPIV3-F可用于蛋白质印迹法,所以添加6X his-标签。使用实例1中
描述的用于RSV-F的方法将hPIV3-F构建体克隆到pCLD质粒中并且转染到CAT-S细胞中。
如所述培养细胞并且对CAT-S转染子溶解产物进行蛋白质印迹。
[0315] 对取自三个独立孔(用来自每个转染混合物的细胞接种的)的CAT-S转染子溶解产物进行蛋白质印迹,使用多克隆抗-PIV3抗体(VMRD PI-3病毒(牛)抗血清、山羊来源的批次G197/031306)、抗-HIS抗体(西格玛公司目录#H1029小鼠中产生的单克隆抗-聚组氨酸抗体)、以及抗-C-端HIS抗体(英杰公司目录#R930-25抗-his(Cterm)抗体)。his-标签
的F0前体蛋白的预期大小是约55kDa并且his-标签的F1蛋白为约40kDa。蛋白质印迹结
果呈现于图21中。这些结果示出高-GC3hPIV3-F表达显著高于野生型序列的表达。因此
这一途径可以适用于除RSV-F外的病毒糖蛋白。
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325]
[0326]
[0327]
[0328]
[0329]
[0330]
[0331]
[0332] 实例7:实施例的实例
[0333] 下文提供地是本技术的某些实施例的非限制性实例。
[0334] A1.一种分离的核酸,该核酸包括具有约51%或更大GC含量的、编码一种可溶性病毒融合蛋白的一个核苷酸序列,该融合蛋白包括与SEQ ID NO:7具有90%或更大一致性的
一个氨基酸序列。
[0335] A2.如实施例A1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:7具有95%或更大一致性的氨基酸序列的一个蛋白。
[0336] A3.如实施例A1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的一个蛋白。
[0337] A4.如实施例A1至A3中任一项所述的分离的核酸,其中该可溶性病毒融合蛋白缺乏一个功能膜相关区域。
[0338] A5.如实施例A4所述的分离的核酸,其中该可溶性病毒融合蛋白缺乏对应SEQ IDNO:2的525至574位氨基酸的C端跨膜区域氨基酸。
[0339] A6.如实施例A1至A5中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白包括一个标签。
[0340] A6.1如实施例A1至A5中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白不包括标签。
[0341] A7.如实施例A1至A6.1中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量是76%或更大。
[0342] A8.如实施例A7所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:6。
[0343] A9.如实施例A1至A8中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC含量是约58%或更大。
[0344] A10.如实施例A9所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量约100%。
[0345] A11.如实施例A9或A10所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:5。
[0346] A12.如实施例A1至A11中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ IDNO:3具有65%或更大的一致性。
[0347] A13.如实施例A12所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有73%或更大的一致性。
[0348] A14.如实施例A13所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有77%或更大的一致性。
[0349] A15.如实施例A1至A14中任一项所述的分离的核酸,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的一个顺式调节元件。
[0350] A16.如实施例A15所述的分离的核酸,其中该顺式调节元件包括一个转录后加工元件。
[0351] A17.如实施例A16所述的分离的核酸,其中该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病毒。
[0352] A18.如实施例A1至A17中任一项所述的分离的核酸,其位于一个表达载体中。
[0353] B1.一种细胞,包括实施例A18所述的分离的核酸。
[0354] B2.一种细胞,包括整合到细胞DNA内的、实施例A1至A14中任一项所述的核苷酸序列。
[0355] B3.如实施例B1或B2所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少2微克蛋白。
[0356] B4.如实施例B3所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少6微克蛋白。
[0357] B5.如实施例B4所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少200微克蛋白。
[0358] B6.如实施例B5所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少500微克蛋白。
[0359] B7.如实施例B6所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少1毫克蛋白。
[0360] B8.如实施例B7所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少1.3毫克蛋白。
[0361] B9.如实施例B8所述的细胞,细胞表达每毫升细胞至少1.6毫克蛋白。
[0362] B10.如实施例B1至B9中任一项所述的细胞,其分泌可溶性病毒融合蛋白。
[0363] B11.如实施例B1至B10中任一项所述的细胞,其是一种哺乳动物细胞。
[0364] B12.如实施例B11所述的细胞,其中该细胞是一种非粘附细胞。
[0365] B13.如实施例B11或B12所述的细胞,其中该细胞是一种CHO细胞或CHO衍生的细胞。
[0366] B14.如实施例B13所述的细胞,其中该细胞是CAT-S细胞。
[0367] B15.如实施例B13所述的细胞,其中该细胞是一种CHO-S细胞。
[0368] B16.如实施例B11所述的细胞,其中该细胞是一种Vero细胞。
[0369] B17.如实施例B11所述的细胞,其中该细胞是一种MRC-5细胞。
[0370] B18.如实施例B11所述的细胞,其中该细胞是一种BSR-T7细胞。
[0371] B19.如实施例B1至B18中任一项所述的细胞,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
[0372] B20.如实施例B1至B19中任一项所述的细胞,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的、实施例A15至A17中任一项所述的顺式调节元件。
[0373] C1.用于表达可溶性病毒融合蛋白的一种方法,包括:将包括实施例A1至A14中任一项所述的核苷酸序列的多个细胞与在其下蛋白产生的条件相接触。
[0374] C2.如实施例C1所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的表达载体中。
[0375] C3.如实施例C1所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的细胞DNA中。
[0376] C4.如实施例C1至C3中任一项所述的方法,其中该细胞是哺乳动物细胞。
[0377] C5.如实施例C4所述的方法,其中该细胞是非粘附细胞。
[0378] C6.如实施例C5所述的方法,其中该细胞是CHO细胞或CHO衍生的细胞。
[0379] C7.如实施例C6所述的方法,其中该细胞是CAT-S细胞。
[0380] C8.如实施例C6所述的方法,其中该细胞是CHO-S细胞。
[0381] C9.如实施例C4所述的方法,其中该细胞是Vero细胞。
[0382] C10.如实施例C4所述的方法,其中该细胞是MRC-5细胞。
[0383] C11.如实施例C4所述的方法,其中该细胞是BSR-T7细胞。
[0384] C12.如实施例C1至C11中任一项所述的方法,其中每毫升细胞产生至少2微克蛋白。
[0385] C13.如实施例C12所述的方法,其中每毫升细胞产生至少6微克蛋白。
[0386] C14.如实施例C13所述的方法,其中每毫升细胞产生至少200微克蛋白。
[0387] C15.如实施例C14所述的方法,其中每毫升细胞产生至少500微克蛋白。
[0388] C16.如实施例C15所述的方法,其中每毫升细胞产生至少1毫克蛋白。
[0389] C17.如实施例C16所述的方法,其中每毫升细胞产生至少1.3毫克蛋白。
[0390] C18.如实施例C17所述的方法,其中每毫升细胞产生至少1.6毫克蛋白。
[0391] C19.如实施例C1至C18中任一项所述的方法,其中该细胞分泌该蛋白。
[0392] C20.如实施例C1至C19中任一项所述的方法,其中该蛋白产生持续7天或更多天。
[0393] C21.如实施例C1至C20中任一项所述的方法,其中该细胞培养在无动物产品培养条件下。
[0394] C22.如实施例C1至C21中任一项所述的方法,进一步包括确定由这些细胞产生的蛋白的量。
[0395] C23.如实施例C1至C22中任一项所述的方法,进一步包括分离该蛋白。
[0396] C24.如实施例C1至C23中任一项所述的方法,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
[0397] C25.如实施例C1至C24中任一项所述的方法,其中该细胞进一步包括与实施例A1至A14中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、实施例A15至A17中任一项所述的顺式
调节元件。
[0398] C26.如实施例C1至C25中任一项所述的方法,包括向该细胞核中导入实施例A1至A14中任一项所述的核苷酸序列。
[0399] C27.如实施例C26所述的方法,包括向该细胞核中导入与实施例A1至A14中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、实施例A15至A17中任一项所述的顺式调节元件。
[0400] C28.如实施例C26或C27所述的方法,其中向该细胞核中的导入通过核转染进行。
[0401] D1.一种分离的核酸,该核酸包括一个核苷酸序列,该核苷酸序列(i)具有约51%或更大的GC含量,(ii)与SEQ ID NO:1具有73%或更大得一致性,并且(iii)编码包括与
SEQ ID NO:2具有90%或更大一致性的一个氨基酸序列的一种病毒融合蛋白。
[0402] D2.如实施例D1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:2具有95%或更大一致性的氨基酸序列的一个蛋白。
[0403] D3.如实施例D1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个蛋白。
[0404] D4.如实施例D1至D3中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白包括一个标签。
[0405] D4.1如实施例D1至D3中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白不包括标签。
[0406] D5.如实施例D1至D4.1中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量是76%或更大。
[0407] D6.如实施例D1至D5中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC含量是约58%或更大。
[0408] D7.如实施例D6所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量约100%。
[0409] D8.如实施例D6或D7所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:17
[0410] D9.如实施例D8所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有77%或更大的一致性。
[0411] D10.如实施例D1至D9中任一项所述的分离的核酸,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的一个顺式调节元件。
[0412] D11.如实施例D10所述的分离的核酸,其中该顺式调节元件包括一个转录后加工元件。
[0413] D12.如实施例D11所述的分离的核酸,其中该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病毒。
[0414] D13.如实施例D1至D12中任一项所述的分离的核酸,其位于一个表达载体中。
[0415] E1.一种细胞,包括实施例D13所述的分离的核酸。
[0416] E2.一种细胞,包括整合到细胞DNA内的、实施例D1至D9中任一项所述的核苷酸序列。
[0417] E3.如实施例E1至E2中任一项所述的细胞,其中该蛋白被保留在该细胞膜中。
[0418] E4.如实施例E1至E2中任一项所述的细胞,其分泌该病毒融合蛋白。
[0419] E5.如实施例E1至E4中任一项所述的细胞,其是一种哺乳动物细胞。
[0420] E6.如实施例E5所述的细胞,其中该细胞是一种非粘附细胞。
[0421] E7.如实施例E5或E6所述的细胞,其中该细胞是一种CHO细胞或CHO衍生的细胞。
[0422] E8.如实施例E7所述的细胞,其中该细胞是一种CAT-S细胞。
[0423] E9.如实施例E7所述的细胞,其中该细胞是一种CHO-S细胞。
[0424] E10.如实施例E5所述的细胞,其中该细胞是一种Vero细胞。
[0425] E11.如实施例E5所述的细胞,其中该细胞是一种MRC-5细胞。
[0426] E12.如实施例E5所述的细胞,其中该细胞是一种BSR-T7细胞。
[0427] E13.如实施例E1至E12中任一项所述的细胞,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
[0428] E14.如实施例E1至E13中任一项所述的细胞,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的、实施例D10至D12中任一项所述的顺式调节元件。
[0429] F1.用于表达可溶性病毒融合蛋白的方法,包括:将包括实施例D1至D9中任一项所述的核苷酸序列的多个细胞与在其下蛋白产生的条件相接触。
[0430] F2.如实施例F1所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的一个表达载体中。
[0431] F3.如实施例F1所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的细胞DNA中。
[0432] F4.如实施例F1至F3中任一项所述的方法,其中该细胞是哺乳动物细胞。
[0433] F5.如实施例F4所述的方法,其中该细胞是非粘附细胞。
[0434] F6.如实施例F5所述的方法,其中该细胞是CHO细胞或CHO衍生的细胞。
[0435] F7.如实施例F6所述的方法,其中该细胞是CAT-S细胞。
[0436] F8.如实施例F6所述的方法,其中该细胞是CHO-S细胞。
[0437] F9.如实施例F4所述的方法,其中该细胞是Vero细胞。
[0438] F10.如实施例F4所述的方法,其中该细胞是MRC-5细胞。
[0439] F11.如实施例F4所述的方法,其中该细胞是BSR-T7细胞。
[0440] F12.如实施例F1至F11中任一项所述的方法,其中该蛋白被保留在该细胞膜中。
[0441] F13.如实施例F1至F11中任一项所述的方法,其中该细胞分泌该蛋白。
[0442] F14.如实施例F1至F13中任一项所述的方法,其中该蛋白产生持续7天或更多天。
[0443] F15.如实施例F1至F14中任一项所述的方法,其中该细胞培养在无动物产品培养条件下。
[0444] F16.如实施例F1至F15中任一项所述的方法,进一步包括确定这些细胞产生的蛋白的量。
[0445] F17.如实施例F1至F16中任一项所述的方法,进一步包括分离该蛋白。
[0446] F18.如实施例F1至F17中任一项所述的方法,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
[0447] F19.如实施例F1至F18中任一项所述的方法,其中该细胞进一步包括与实施例D1至D9中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、实施例D10至D12中任一项所述的顺式调
节元件。
[0448] F20.如实施例F1至F19中任一项所述的方法,包括向该细胞核中导入实施例D1至D9中任一项所述的核苷酸序列。
[0449] F21.如实施例F20所述的方法,包括向该细胞核中导入与实施例D1至D9中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、实施例D10至D12中任一项所述的顺式调节元件。
[0450] F22.如实施例F20或F21所述的方法,其中向该细胞核中的导入通过核转染进行。
[0451] G1.一种核酸,该核酸包括具有约51%或更大GC含量的、编码一种病毒融合蛋白的一个核苷酸序列,该融合蛋白包括与SEQ ID NO:12具有90%或更大一致性的一个氨基酸序
列。
[0452] G2.如实施例G1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括与SEQ ID NO:12具有95%或更大一致性的氨基酸序列的一个蛋白。
[0453] G3.如实施例G1所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列编码包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的一个蛋白。
[0454] G4.如实施例G1至G3中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白包括一个标签。
[0455] G4.1如实施例G1至G3中任一项所述的分离的核酸,其中该蛋白不包括标签。
[0456] G5.如实施例G1至G4.1中任一项所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC含量是约60%或更大。
[0457] G6.如实施例G5所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列的GC3含量约100%。
[0458] G7.如实施例G5或G6所述的分离的核酸,包括核苷酸序列SEQ ID NO:11。
[0459] G8.如实施例G7所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有65%或更大的一致性。
[0460] G9.如实施例G7所述的分离的核酸,其中该核苷酸序列与SEQ ID NO:10具有75%或更大的一致性。
[0461] G10.如实施例G1至G9中任一项所述的分离的核酸,其中该病毒融合蛋白缺乏一个功能膜相关区域。
[0462] G11.如实施例G10所述的分离的核酸,其中该病毒融合蛋白缺乏对应SEQ IDNO:9的489至539位氨基酸的C端跨膜区域氨基酸。
[0463] G12.如实施例G1至G11中任一项所述的分离的核酸,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的一个顺式调节元件。
[0464] G13.如实施例G12所述的分离的核酸,其中该顺式调节元件包括一个转录后加工元件。
[0465] G14.如实施例G13所述的分离的核酸,其中该转录后调节元件来自土拨鼠肝炎病毒。
[0466] G15.如实施例G1至G14中任一项所述的分离的核酸,其位于一个表达载体中。
[0467] H1.一种细胞,包括实施例G15所述的分离的核酸。
[0468] H2.一种细胞,包括整合到细胞DNA内的、实施例G1至G11中任一项所述的核苷酸序列。
[0469] H3.如实施例H1至H2中任一项所述的细胞,其中该病毒融合蛋白被保留在该细胞中。
[0470] H4.如实施例H1至H2中任一项所述的细胞,其分泌该病毒融合蛋白。
[0471] H5.如实施例H1至H4中任一项所述的细胞,其是一种哺乳动物细胞。
[0472] H6.如实施例H5所述的细胞,其中该细胞是一种非粘附细胞。
[0473] H7.如实施例H5或H6所述的细胞,其中该细胞是一种CHO细胞或CHO衍生的细胞。
[0474] H8.如实施例H7所述的细胞,其中该细胞是一种CAT-S细胞。
[0475] H9.如实施例H7所述的细胞,其中该细胞是一种CHO-S细胞。
[0476] H10.如实施例H5所述的细胞,其中该细胞是一种Vero细胞。
[0477] H11.如实施例H5所述的细胞,其中该细胞是一种MRC-5细胞。
[0478] H12.如实施例H5所述的细胞,其中该细胞是一种BSR-T7细胞。
[0479] H13.如实施例H1至H12中任一项所述的细胞,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
[0480] H14.如实施例H1至H13中任一项所述的细胞,进一步包括与该核苷酸序列功能相关的、实施例G12至G14中任一项所述的顺式调节元件。
[0481] I1.用于表达可溶性病毒融合蛋白的方法,包括:将包括实施例G1至G11中任一项所述的核苷酸序列的多个细胞与在其下蛋白产生的条件相接触。
[0482] I2.如实施例I1所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的一个表达载体中。
[0483] I3.如实施例I1所述的方法,其中该核苷酸序列位于这些细胞内的细胞DNA中。
[0484] I4.如实施例I1至I3中任一项所述的方法,其中该细胞是哺乳动物细胞。
[0485] I5.如实施例I4所述的方法,其中该细胞是非粘附细胞。
[0486] I6.如实施例I5所述的方法,其中该细胞是CHO细胞或CHO衍生的细胞。
[0487] I7.如实施例I6所述的方法,其中该细胞是CAT-S细胞。
[0488] I8.如实施例I6所述的方法,其中该细胞是CHO-S细胞。
[0489] I9.如实施例I4所述的方法,其中该细胞是Vero细胞。
[0490] I10.如实施例I4所述的方法,其中该细胞是MRC-5细胞。
[0491] I11.如实施例I4所述的方法,其中该细胞是BSR-T7细胞。
[0492] I12.如实施例I1至I11中任一项所述的方法,其中该蛋白被保留在该细胞中。
[0493] I13.如实施例I1至I11中任一项所述的方法,其中该细胞分泌该蛋白。
[0494] I14.如实施例I1至I13中任一项所述的方法,其中该蛋白产生持续7天或更多天。
[0495] I15.如实施例I1至I14中任一项所述的方法,其中该细胞培养在无动物产品培养条件下。
[0496] I16.如实施例I1至I15中任一项所述的方法,进一步包括确定这些细胞产生的蛋白的量。
[0497] I17.如实施例I1至I16中任一项所述的方法,进一步包括分离该蛋白。
[0498] I18.如实施例I1至I17中任一项所述的方法,其中该细胞在细胞核中合成编码该病毒融合蛋白的核酸。
[0499] I19.如实施例I1至I18中任一项所述的方法,其中该细胞进一步包括与实施例G1至G11中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、实施例G12至G14中任一项所述的顺式
调节元件。
[0500] I20.如实施例I1至I19中任一项所述的方法,包括向该细胞核中导入实施例G1至G11中任一项所述的核苷酸序列。
[0501] I21.如实施例I20所述的方法,包括向该细胞核中导入与实施例G1至G11中任一项所述的核苷酸序列功能相关的、实施例G12至G14中任一项所述的顺式调节元件。
[0502] I22.如实施例I20或I21所述的方法,其中向该细胞核中的导入通过核转染进行。
[0503] * * *
[0504] 在此参考的每个专利、专利申请、出版物以及文件的整体通过引用结合在此。上述专利、专利申请、出版物以及文件的引用不是上述任何有关现有技术的认可,也不构成这些出版物或文件的内容或日期的任何认可。
[0505] 可以对上述内容做出修饰而不偏离该技术的基本方面。虽然该技术已经参考一个或多个特定实施例描述了大量的细节,但是本领域普通技术人员将认识到,可以对本申请
中具体披露的实施例进行改变,而这些修饰和改进在本技术的范围和精神内。
[0506] 适当地,在此不确切地披露的任何一种或多种元件不存在的情况下,在此示例性地描述的技术可以是实用的。因此,例如,每一种情况中的术语“包括”涵盖术语“主要由…组成”或“由...组成”。已采用的术语和表达用作说明的术语而非出于限制,此类术语和表达的使用并不排除示出和描述的特征或其部分的任何等价物,并且可能进行的不同修饰
在本技术要求的范围之内。术语“一个/一种”(“a”或“an”)可以指它修饰的一个或多个元素(例如,“一种试剂”可以指一种或多种试剂)除非它根据上下文清楚描述了是这些元素中的一个亦或是这些元素中的多于一个。在一串的值的开头使用的术语“约”修饰每个值
(即“约1、2和3”是指约1、约2、以及约3)。在某些情况下,单位和格式表示为超文本标记语言(HTML)格式,本领域的普通技术人员可以将其翻译为另一种常规格式(例如,“.sup.”是指上标格式)。因此,应理解,虽然本技术已被代表性实施例和选项特性确切公开,但是在此披露的概念的修饰和变更可以由本领域的普通技术人员诉诸实践,并且这类修饰和变更
被认为是在本技术的范围内。
[0507] 本技术的某些实施例列出于以下一个或多个权利要求中。
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