1.发明领域

本发明涉及治疗剂、放射性治疗剂、放射性诊断剂、和非放射性诊断剂 以及用于制备这些诊断剂和治疗剂的方法。本发明也涉及环状肽，该肽特异 性地与在哺乳动物细胞表面，特别是患肿瘤或转移瘤的哺乳动物细胞表面表 达的生长激素抑制素受体结合。一方面，本发明涉及用于在哺乳动物体某部 位成像的闪烁照相成像剂。在这方面，该成像剂包含一种特异性结合肽，它 特异性地与生长激素抑制素受体表达的体内细胞结合，其中通过放射性标记 物结合部分，用锝-99m(Tc-99m)标记该肽，由此形成肽与Tc-99m的 络合物。另一方面，本发明提供放射性碘处理的成像剂。本发明也提供治疗 剂，它包括放射性碘处理剂、放射性金属-试剂络合物和非放射性金属-试 剂络合物，所有这些治疗剂都具有治疗作用。本发明提供制备本发明诊断和 治疗剂中每一种具体的诊断和治疗剂用的试剂、其放射性标记的实例和非放 射性金属络合物、标记所述试剂的方法和试剂盒，该试剂盒包含本发明试剂 的非放射性具体组分及便于制备本发明放射性标记的诊断和治疗剂的其它组 分。

2.现有技术的说明

生长激素抑制素是十四肽，它是内源性地通过人和其它哺乳动物的下丘 脑和胰腺而生产的。该肽具有式：

(在G.Zubay.Biochemistry(2d ed.)，1988，(MacMillan Publishing；New York)，P.33中可以找到氨基酸的专用字母缩写)。该肽在体内发生各种生理作 用。已知在生理上对中植神经系统、下丘脑、胰腺、和胃肠道发生作用。

生长激素抑制素抑制胰腺释放胰岛素和胰高血糖素，抑制下丘脑释放生 长激素和减少胃分泌。因此，生长激素抑制素具有减轻人和其它哺乳动物许 多疾病的临床和治疗用途，然而，由于天然存在的生长激素抑制素在体内的 半表期短，迅速被肽酶降解，因此其应用受限制。由于该原因，在现有技术 中已开发生长激素抑制素类似物其体内稳定性有了提高。

Freidinger在美国专利4,235,886中公开了用于治疗人类很多种疾病的环 六肽生长激素抑制素类似物。

Coy和Murphy在美国专利4,485,101中公开了合成的十二肽生长激素抑 制素类似物。

Freidinger在美国专利4,611,054中公开了用于治疗人类很多种疾病的环 六肽生长激素抑制素类似物。

Nutt在美国专利4,612,366中公开了用于治疗人类很多种疾病的环六肽 生长激素抑制素类似物。

Coy等在美国专利4,853,371中公开了合成的八肽生长激素抑制素类似 物。

Coy和Murphy在美国专利4,871,717中公开了合成的七肽生长激素抑制 素类似物。

Coy等在美国专利4,904,642中公开了合成的八肽生长激素抑制素类似 物。

Taylor等在美国专利5,073,541中公开了治疗小细胞肺癌的方法。

Brady在欧洲专利申请83111747.8中公开了用于治疗很多种人类疾病的 二环肽生长激素抑制素类似物。

Bauer等在欧洲专利申请85810617.2中公开了用于治疗很多种人类疾病 的生长激素抑制素衍生物。

Eck和Moreau在欧洲专利申请90302760.5中公开了治疗用八肽生长激 素抑制素类似物。

Coy和Murphy在国际专利申请PCT/US90/07074中公开了治疗用的生 长激素抑制素类似物。

Schally等在欧洲专利申请EPA911048445.2中公开了治疗用的环肽。

Bodgen和Moreau在国际专利申请PCT/US92/01027中公开了用于治疗 增生性皮肤病的组合物的方法。

生长激素抑制素通过与在细胞表面表达的特异性受体结合来发挥作 用，所述细胞包括中枢神经系统、下丘脑、胰腺和胃肠道的细胞。已发现， 在由这些组织产生的大多数具有内分泌活性的肿瘤细胞的表面，这些具有高 度亲和性的生长激素抑制素结合部位被充分表达。

在临床上，能够使用非侵害性方法来确定病人患病部位的病理症状，对 于医生来说是非常有利的。这些病理学症状包括肺、心、肝、肾、骨和脑的 疾病，也包括癌症，血栓形成，肺栓塞，感染，炎症和动脉粥样硬化。

在该医学领域中，通过检测小量口服给药的放射性标记示踪化合物(称放 射性示踪物或放射性药物)的分布，来对某些病理学症状及其范围进行定位或 评估。检测这些放射性药物的方法作为成像或放射性成像方法通常是已知 的。

在放射性成像中，放射性标记物是发射γ线的放射性核素，并且利γ线 检测相机确定放射性示踪物的位置(该方法常称作γ闪烁照相法)。由于所选 择的放射性示踪物或者定位在病理部位(称作正造影剂)或者不是特异性地定 位在该病理部位(称作负造影剂)，因此可检测到成像的部位。在很多情况下， 使用一种放射性标记的特异结合化合物作为放射性药物，特异性地定位到体 内病理部位是特别有利的。

例如，对于某些肿瘤细胞来说，生长激素抑制素高度亲和性结合部位的 表达是明显的，并且可以利用与生长激素抑制素的特异性结合来定位和定性 体内的该种肿瘤细胞。

对于那些已被修饰而含有酪氨酸(Tyr或Y)的生长激素抑制素类似物进 行放射性标记的方法，在现有技术中是已知的。

Albert等在UK专利申请8927255.3中公开了利用生长激素抑制素衍生 物，如由123I经标记的奥曲肽来进行放射性成像。

Bakker等在1990，J.Nucl.Med.31：1501-1509中描述了放射性碘处理 生长激素抑制素类似物及其在检测体内肿瘤中的应用。

Bakker等在1991，J.Nucl.Med.32：1184-1189中讲述了放射性标记生 长激素抑制素在体内放射性成像中的应用。

Bomarji等在1992，J.Nucl.Med.33：1121-1124中描述了利用碘处理的 (Tyr-3)奥曲肽来成像转移性类癌瘤。

或者，在现有技术中也公开了通过共价结合方法修饰肽使其含放射性核 素螯合基团来对生长激素抑制素进行放射性标记的方法。

Albert等在UK专利申请8927255.3中公开了利用生长激素抑制素衍生 物，如由111In通过结合到端氨基的螯合基团标记的奥曲肽来进行放射性成 像。

Albert等在国际专利申请Wo91/01144中公开了利用放射性标记的肽来 进行放射性成像，这些肽与生长因子、激素、干扰素和细胞因子(Cytokines) 有关，并且包含以共价键连接到放射性核素螯合基上的特异性识别肽。

Albert等在欧洲专利申请92810381.1中公开了具有连接螯合剂的端氨 基的生长激素抑制素肽。

Faglia等在1991，J.Clin.Enclocrinol，Metab，73：850-856中描述了病人 中生长激素抑制素受体的检测方法。

Kwekkeboom等在1991，J.Nucl.Med.32：981 Abstrct#305中提到用111In放射性标记生长激素抑制素类似物。

Albert等在1991，Abstract LM10，12th American Peptids，Symposium：1991 中描述了111In标记的二亚乙基-三氨基五乙酸衍生物的生长激素抑制素类似 物的应用。

Krenning等在1992，J.Nucl.Med.33：652-658中描述了用[111In][DTPA] 奥曲肽在临床上进行闪烁照相。

已知各种放射性核素都可用于放射性成像，包括67Ga、99mTc(Tc-99 m)、111In、123I、125I、169Yb或186Re。为了获得人体中最佳放射性成像， 必须考虑很多因素。为了最大限度地增加检测功效，优选使用能发射γ射线 能量为100-200KeV的放射性核素。为了最大限度地减小病人所吸收的射 线量，放射性核素的物理半衰期应该尽可能地短，只要满足成像过程的需要 即可。为了能够在任意天并且在该天的任意时间进行检查，最好具有一个在 临床上可随时获得的放射性核素源。Tc-99m是优选的放射性核素，因为 发射140KeV的γ线，其物理半衰期为6小时，并且可利用钼-99/锝-99 m发生器很容易就地获得。在现有技术中所使用的其它放射性核素都比Tc-99m差。这可能是因为这些放射性核素的物理半衰期长，结果病人吸收大 量射线(例如铟-111)。而且很多效果较差的放射性核素也不能利用就地发生 器生产。

Tc-99m是一种过渡金属，它可通过金属络合部分很好进行螯合。能 够结合Tc-99m的放射性标记的络合部分，它们能共价连接到各种特异性 结合的化合物上，从而提供了对这些特异性结合化合物进行放射标记的方 法。这是因为，通常大多数容易获得的Tc-99m的化学物种如高锝酸盐(TcO4-)不能直接结合到大多数特异性结合化合物上，其结合强度足以用作放射性 药物。Tc-99m与这些放射性标记的络合部分进行络合一般需要用还原剂 如氯化亚锡将高锝酸盐还原。

在现有技术中已知用螯合剂来络合Tc-99m。

Byme等在美国专利4,434,151中描述了含Tc-99m螯合剂的高半胱氨 酸。

Fritsberg在美国专利4,444,690中描述了一系列基于N，N’-二(巯基乙酰 基)-2，3-二氨基丙酸酯的锝螯合剂。

Byrne等在美国专利4,571,430中描述了含Tc-99m螯合剂的高半胱氨 酸。

Btyrne等在美国专利4,575,556中描述了含Tc-99m螯合剂的高半胱 氨酸。

Nosco等在美国专利4,925,650中描述了Tc-99m螯合的络合物。

Konclo等在欧洲专利申请公开号483700A1中描述了制备Tc-99m与 巯基-G1y-Gly-Gly部分络合物的方法。

欧洲专利申请号84109831.2中描述了用作肾功能监测剂的二氨基，二 巯基Tc-99m配位体及其盐。

Davison等在1981，Inory.Chem20：1629-1632中公开了氧锝螯合的络 合物。

Fritzberg等在1982，J.Nucl.Med.23：592-598中公开了基于N，N′-二 (巯乙酰基)-2，3-二氨基丙酸酯的Tc-99m螯合剂。

Byrne等在1983，J.Nucl.Med.24：P126中描述了含Tc-99m螯合剂的 高半胱氨酸。

Byme等在1988，Inorg.Chem.27：2154-2161中描述了对过量配位体不 稳定的锝-99中性络合物。

Misra等在1989.Tet.Lett.30：1885-1888中描述了用于放射性标记的 二胺二巯基化合物。

在本领域中已知利用螯合剂来放射性标记特异性结合的化合物。

Gansow等在美国专利4,472,509中讲述了生产和纯化Tc-99m螯合物 轭合的单克隆抗体的方法。

Stavrianopoulos在美国专利4,943,523中讲述了含金属螯合部分的可检测 分子。

Fritberg等在欧洲专利申请86100360.6中描述了二巯基、二氨基或二氨 基羧酸或胺络合物，用于制备锝标记的造影剂。

Albert等在UK专利申请8927255.3中公开了利用生长激素抑制素衍生 物如用111In通过结合到端氨基的螯合基标记的奥曲肽进行放射性成像。

Albert等在国际专利申请Wo91/01144中描述了利用放射性标记的肽来 进行放射性成像，这些肽与生长因子、激素、干扰素和细胞因子有关，并且 包含以共价键结合到放射性核素螯合基上的特异性识别肽。

Fischman等在国际专利申请公开号Wo93/13317中公开了结合到螯合基 部分上的趋化(chemotactic)肽。

Kwekkeboom等在1991，J.Nucl.Med.32：981Abstract#305提到用111In放射性标记生长激素抑制素类似物。

Albert等在1991，Abstract LM10，12th American Peptide Symposium：1991 中描述了关于111In标记的二亚乙基-三氨基五乙酸衍生的生长激素抑制素类 似物的应用。

Cox等在1991，Abstract.7th Intemational Symposium on Radiopharmacology，P.16中公开了在通过闪烁照相对体内内分泌肿瘤进行放 射定位时，Tc-99m-，131I-和111In标记的生长激素抑制素的应用。

在现有技术中，已知用Tc-99m标记某种特异性结合的化合物的方 法。

Hnatowich在美国专利4,668,503中描述了Tc-99m蛋白质放射性标 记。

Tolman在美国专利4,732,684中描述了靶分子与金属硫蛋白 (metallothionein)片段的轭合。

Nicoloni等在美国专利4,861,869中描述了用于与生物分子如抗体形成轭 合物的双官能偶联剂。

Frizberg等在美国专利4,965,392中描述了用于标记蛋白质的各种以S- 保护的巯基乙酰基甘氨酰甘氨酸为基础的螯合剂。

Schochat等在美国专利5,061,641中描述了直接标记至少含一个“侧” 巯基的蛋白质。

Fritzberg等在美国专利5,091,514中描述了用于标记蛋白质的以各种与 保护的巯基乙酰基甘氨酰基甘氨酸为基础的螯合剂。

Gustavson等在美国专利5,112,953中公开了用于放射性标记的Tc-99 m螯合剂。

Kasina等在美国专利5,175,257中描述了各种靶分子与Tc-99m螯合 基的混合物。

Dean等在美国专利5,180,816中公开了用Tc-99m通过双官能螯合剂 放射性标记蛋白质的方法。

Sundrehagen，在国际专利申请公开号Wo851/03231中公开了Tc-99m 标记的蛋白质。

Reno和Bottino在欧洲专利申请87300426.1中公开了用Tc-99m放射 性标记抗体。

Bremer等在欧洲专利申请87118142.6中公开了Tc-99m放射性标记 抗体分子。

Pak等在欧洲专利申请Wo88/07382中公开了用Tc-99m标记抗体的 方法。

Goedemans等在PCT申请WO89/07456中公开了用环状巯基化合物， 尤其是2-iminothiolane及其衍生物放射性标记蛋白质。

Dean等在国际专利申请公开号WO89/12625中讲述了用于Tc-99m 标记蛋白质的双官能偶联剂。

Schoemaker等在国际专利申请公开号Wo90/06323中公开了含金属结合 区的嵌合蛋白质。

Thomback等在EPC申请号90402206.8中公开了利用含硫基的化合物， 尤其是用2-iminothiolane及衍生物来制备和使用放射性标记的蛋白质或 肽。

Gustavson等在国际专利申请公开号Wo91/09876中公开了用于放射性 标记蛋白质的Tc-99m螯合剂。

Rhodes，在1974，Sem.Nucl.Med.4：281-293中讲述了用锝-99m 标记人血清白蛋白。

Khaw等在1982，J.Nucl.Med.23：1011-1019中公开了用Tc-99m标 记具有生物活性的大分子的方法。

Schwartz等在1991，Bioconjugate Chem.2：333中描述了通过使用肼基烟 酰胺基，用Tc-99m标记蛋白质的方法。

在现有技术中已报道了在放射性标记肽方面的尝试。

Ege等在美国专利号4,832,940中讲述了在成像定位的T淋巴细胞中所 使用的放射性标记的肽。

Morgan等在美国专利号4,986,979中公开了用于炎症部位成像的方 法。

Flanagan等在美国专利号5,248,764中描述了放射性标记螯合部分和心 钠素衍生的肽之间的轭合物。

Ranby等在1988，PCT/US88/02276中公开了用于检测动物体中血纤蛋白 沉积物的方法，它包括通过共价键将放射性标记的化合物结合到血纤蛋白 上。

Lees等在1989，PCT/US89/01854中讲述了用于动脉显像的放射性标记 的肽。

Morgan等在国际专利申请公开号Wo90/10463中公开了用于炎症部位 显像的方法。

Flanagan等在欧洲专利申请号90306428.5中公开了Tc-99m通过一组 有机螯合剂分子对合成的肽片段进行放射性标记。

Stecttle在PCT申请公开号WO90/15818中描述了Tc-99m标记含RGD 的低聚肽。

Rodwell等在1991，PCT/US91/03116中公开了“分子识别单位”与“效 应区”的轭合物。

Cox在国际专利申请号PCT/US92/04559中公开了放射性标记的含两个 半胱氨酸基的生长激素抑制素衍生物。

Rhocles等在国际专利申请公开号Wo93/12819中讲述了含金属离子结 合区的肽。

Lyle等在国际专利申请公开号Wo93/15770中公开了Tc-99m螯合剂 和用Tc-99m标记的肽。

Coughlin等在国际专利申请公开号Wo93/21151中公开了用于放射性标 记靶分子的含硫脲基的双官能螯合剂。

Knight等在1990，37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine， Abstraet#209中阐明了用Tc-99m标记的肽进行血栓显像。

Babich等在1993，J.Nucl.Med.34：1964-1974中公开了Tc-99m标 记的含肼基烟酰胺基的衍生物的肽。

在1993年7月6日颁分的美国专利号5,225,180中公开了直接标记生长 激素抑制素，生长激素衍生物，生长激素的类似物或肽的方法，所述肽与生 长激素受体结合并且至少含2个形成二硫化物或者其中的二硫化物被还原为 巯基形式的半胱氨酸，该专利在参考文献中引用。

螯合剂在对肽进行放射性标记中的应用和用Tc-99m标记肽的方法是 现有技术中已知的并且公开于美国专利申请序号07/653,012，07/807,062， 07/871,282，07/893,981，07/955,466，08/092,355和08/095,760中。

Lister-James等在1994，J.Nuclear Med.35：257P-258P公开了Tc-99m标 记的生长激素抑制素受体结合的肽用于体内肿瘤成像。

目前仍需要合成(设计适宜的生产程序并顺利通过管理验收)体内稳定性 增加的生长激素抑制素的类似物。它们在治疗上，当用Tc-99m或其它可 检测的放射性同位素进行放射性标记后用于体内肿瘤的成像时，可作为闪烁 成像剂；并且当用具有细胞毒性的放射同位素，如铼-188进行射性标记时， 可作为放射性治疗剂。本发明提供少量合成的生长激素抑制素的类似物是专 用来满足该需要的。

发明概要

本发明提供生长激素抑制素类似物，它包括治疗和诊断用的环肽。治疗 上的应用包括放射性治疗用；诊断上应用包括放射性诊断用。该类似物尤其 是指闪烁成像用的环肽。与天然生长激素抑制素不同，本发明环肽不包含二 硫键。本发明也提供包含环肽生长激素抑制素类似物的环肽试剂，其中该肽 包含共价连接的金属离子的结合部分。本发明提供这些环肽、环肽试剂和放 射性标记的环肽试剂，它们都是闪烁照像成像剂、放射性诊断剂和放射性治 疗剂。本发明闪烁照相成像剂包括用放射性同位素(尤其是锝-99m)进行放 射性标记的环肽试剂。本发明的放射性治疗剂包括用细胞毒性放射性同位素 (尤其是铼-186或铼-188)进行放射性标记的环肽试剂。也提供制备和使用 这些环肽、环肽试剂及其放射性标记的实例的方法。

本发明提供物质的组合物，它包含特异性结合肽，该肽特异性地结合到 哺乳物体内的生长激素抑制素受体上，并共价连接到金属离子络合部分。本 发明物质的组合物具有下式：

环(N-CH3)-Phe-Tvr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH2COX) 其中X为(氨基酸)n-B-(氨基酸)m-Z。其中B为含硫基的部分，该部分 是半胱氨酸、高半胱氨酸、异半胱氨酸、或青霉胺；(氨基酸)n和(氨基酸)m 各自为初级α-或β-氨基酸，它不包含巯基；Z为-OH或-NH2；n和 m各自分别为2-5和0-5的整数。

在描述本发明物质组合物的通式中，应该知道，术语“环”和下面划线 的氨基酸序列连接起来是指下面划线的序列通过肽键将该序列中的第一个氨 基酸的端氨基与该序列中最后一个氨基酸的端羧基连接起来而使该序列环 化。如果接着是小括号内的一项如“(CH2COX)”，则这一项应当将其理解为 是指通过共价键将小括号内的这个序列连接到下面划线的氨基酸序列中含硫 羟的氨基酸侧链的硫原子上与其形成硫键。因此，在上述化学结构中，应该 知道，-CH2COX基是共价连接到高半胱氨酸的侧链硫原子上的。实施例2 中显示该化学结构的实例。

本发明物质组合物的优选实例具有下式的化合物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺)

本发明物质的组合物具有许多诊断和治疗用途。

因此，本发明一方面提供用于制备放射性标记的闪烁照相成像剂的试 剂，其中所述成像剂用于富含抑生长素受体的哺乳动物体各部位的成像。在 该实施方案中，金属离子络合部分包含放射性标记的结合部分，并且该试剂 通过与所述部分形成络合物来形成放射性标记的络合物。在本发明该方面的 一个实施方案中，将该试剂在还原条件下与Tc-99m络合，形成闪烁照相 成像剂。

因此，本发明也包括闪烁照相成像剂，它们是本发明试剂与Tc-99m 的络合物，还包括放射性标记该试剂的方法。本发明提供的Tc-99m放射 标记的络合物是在还原剂存在下将本发明试剂与Tc-99m反应而形成的。 优选的还原剂包括(但不限制于)连二亚硫酸离子、亚锡离子和亚铁离子。也 可以通过将预先还原的本发明Tc-99m络合物进行配位体交换，用Tc- 99m标记本发明试剂来形成本发明络合物。

本发明用于制备闪烁照相成像剂的试剂其优选实例是具有下式的化合 物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺) 优选的成像剂包括这种试剂的Tc-99m络合物。

本发明也提供制备闪烁照相成像剂用的试剂盒，其中所述成像剂是用Tc-99m放射性标记的本发明试剂。用Tc-99m标记本发明试剂的试剂盒包 含一个密封的管形瓶，其中包含预先测定量的本发明一种试剂和其量足以用 Tc-99m标记该试剂的还原剂。

本发明的第二方面是提供成像剂，其中用碘的放射性同样素，优选I- 123、I-125、或I-131来放射性标记本发明物质的组合物。本发明提供 放射性碘处理的成像剂，它们是具有放射性标记碘的本发明试剂的络合物。

制备放射性碘处理的成像剂用的试剂其优选实例是具有下式的化合 物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺) 优选的成像剂包括经放射性碘处理的这种具体试剂。

本发明第三方面是提供非放射性标记的成像剂，它包括这样的试剂，该 试剂是与顺磁金属离子或颗粒络合的本发明物质组合物。在本发明该方面的 实例中，顺磁金属离子是用络合金属离子的部分来络合的。在使用颗粒，特 别是使用超顺磁金属颗粒的实例中，通过共价键或使用Weissleder等所述的 方法(1992.Radiology182：381-385)，将本发明物质的组合物连接到超顺磁 颗粒上。本发明提供了用于磁共振成像的该成像剂。也提供了制备这些非放 射性标记的成像剂的方法。

本发明用于制备非放射性标记的成像剂的试剂优选实例是具有下式的 化合物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)

优选的非放射性标记的成像剂包括该试剂的高铁离子络合物。

本发明也提供治疗剂。本发明的第四方面是提供未与金属离子络合的本 发明物质的组合物本身作为治疗剂。本发明提供的该治疗剂的优选实例是具 有下式的化合物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)

在第五方面，本发明提供放射性标记的治疗剂，它包括制备该治疗剂的 试剂，其中所述治疗剂是本发明提供的物质的组合物。在这些实施方案中， 提供本发明物质的组合物，其中，金属离子络合部分与发射β-粒子或发射 转化电子的放射性同位素络合。发射β-粒子的放射性同位素的优选实例为 铼-186和铼-188。优选发射转化电子的放射性同位素为锡-117m。本 发明提供本发明物质组合物的这些放射性同位素络合物，用于放射性治疗生 长激素抑制素受体表达的病理细胞和组织，特别是肿瘤和转移瘤细胞。也提 供制备这些治疗用本发明物质组合物的放射性同位素络合物的方法。

本发明提供的制备这些放射性治疗剂的优选试剂的实例为具有下式的 化合物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺) 优选的放射性治疗剂包括发射β-粒子或转化电子的金属离子与该试剂的络 合物。

另一方面，所提供的本发明放射性治疗剂是这样的一些放射性治疗剂， 其中用碘的放射性同位素(优选I-125或I-131，或用砹-211)放射性标 记本发明物质的组合物。本发明也提供其放射性治疗剂本身以及放射性标记 该试剂的方法。

本发明提供的制备这些放射性碘处理或放射性砹处理的治疗剂用的试 剂，其优选实例是具有下式的化合物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺) 优选的放射性治疗剂包括该试剂的放射性碘处理或放射性砹处理的一些具体 治疗剂。

所提供的治疗剂是非放射性标记的金属原子络合剂，它包含的试剂是与 非放射性金属原子如铜、锌或铼络合的本发明物质的组合物。在本发明该方 面的实例中，非放射金属离子与金属离子络合部分络合。本发明提供的这些 治疗剂所治疗的疾病是其相关组织的细胞中过渡表达了生长激素抑制素受 体。该治疗剂是治疗过渡表达生长激素抑制素受体的肿瘤细胞。也提供制备 这些与非放射性标记的金属原子络合的治疗剂的方法。

本发明提供的制备非放射性标记的治疗剂的优选试剂实例为具有下式 的化合物：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺) 优选的非放射性标记治疗剂包括该试剂的铼络合物。

本发明提供通过体外化学合成制备含肽的本发明具体试剂的方法。在优 选实例中，通过固相肽合成法合成肽。

本发明提供了本发明的诊断剂和放射性诊断剂、以及治疗剂和放射性治 疗剂的使用方法。就放射性标记的本发明这些具体试剂，例如Tc-99m标 记的闪烁照相成像剂而言，按诊断或治疗有效量的本发明诊断或放射性诊断 剂，或者治疗或放射性治疗剂来给药。在放射性诊断实施方案中，用常规方 法，如γ闪烁照法来检测放射性标记的定位。在非放射性诊断的实施方案中， 用磁共振成像技术来定位本发明顺磁金属标记的诊断剂的积累部位。本发明 提供的成像剂用于肿瘤成像，尤其是用于初期或转移期肿瘤部位的成像，其 中所述的肿瘤细胞表达生长激素抑制素受体(SSTR)，尤其是那些在临床上用 常规方法难以检测的初期或转移期肿瘤细胞。另外，本发明成像剂还用于检 测那些与疑难病或病理有关的T细胞蓄积的部位，例如患有肺结核的病人可 产生T细胞蓄积。

本发明提供使用本发明生长激素抑制素类似物来减轻动物，尤其是人的 某些疾病的方法。这些疾病包括但不限制于糖尿病或与糖尿病有关的视网膜 病、肝硬化和传染性肝炎、出血性溃疡和其它胃肠道出血、胰腺炎、中枢神 经系统疾病、内分泌疾病、阿耳茨海默氏病、肢端肥大症和其它疾病以及与 体内产生不适宜量的生长激素有关的疾病，和癌症，特别是那些生长依赖于 或受产生的生长激素影响的癌症。非放射性标记的具体治疗剂也用于治疗与 过渡表达SSTR相关的疾病，如由过渡表达SSTR的促胃液素瘤引起的腹泻。 本发明所提供的生长激素抑制素的剂量可以与通常在治疗上述疾病或其它疾 病时所使用的天然生长激素抑制素的剂量相同，或者，由于本发明化合物在 体内半衰期长，也可以用较小剂量。

治疗应用也包括放射性治疗肿瘤和转移性恶性肿瘤细胞摘除的肿瘤患 者，其中所述肿瘤的细胞表达生长激素抑制素受体。本发明放射性治疗剂的 应用包括主要治疗那些用常规治疗方法难以治疗的肿瘤和不宜手术的肿瘤， 以及作为外科手术，放射性治疗或常规化疗的辅助性治疗。

本发明放射性标记的具体应用还有在外科手术期间，用作外科导子来确 定表达生长激素抑制素受体的肿瘤组织。对于放射性同位素引导外科手术的 这种应用，可以在常规外科手术期间识别并切除那些外科医生本来看不见的 恶性肿瘤组织。

从下列对某些优选实例的更详细说明和权利要求中，可以更清楚地理解 本发明特定的优选实施方案。

附图的简要说明

图1显示患有肿瘤的鼠中，由99mTc标记的P587的图像，由箭头指示， 表明在该后腿肿瘤部位摄入量较高。

详细说明优选实施方案

本发明提供环状肽，它们是生长激素类似物并且不包含二硫键。因此， 与天然生长激素抑制素相比，这种生长激素类似物的体内稳定性增加。这些 环状肽本身是使动物(包括人)的疾病缓解的治疗剂。

本发明也提供放射性碘处理或放射性砹处理并因此可用于放射性治疗 和放射性诊断的环状肽。

本发明提供的这些环状的另一实施方案是环状肽试剂，其中本发明环状 肽通过共价键连接到金属离子络合部分。可以将这些环状肽试剂进行放射性 标记来做成放射性诊断或放射性治疗剂。利用本发明放射性标记的试剂进行 放射性诊断的一个实例是用来进行闪烁照相成像，其中可测定携带生长激素 抑制素受体的肿瘤部位和范围。也可以用具有细胞毒性的放射性同位素如放 射性治疗用的铼-186或铼-188对本发明环状肽试剂进行有效的放射性标 记。本发明环状肽试剂也用于制备其与非放射性金属的络合物，所述络合物 在治疗学上是有用的。

用Tc-99m标记是本发明的一个优点，因为该同位素的原子核和放射 活性使得它成为理想的闪烁照相成像剂。该同位素的单个光子能量为140 KeV，放射性半衰期大约为6小时，并且容易从99Mo-99mTc发生器中获得。 本发明公开了其它放射性核素也可用于实施本发明。

本文中所使用的术语闪烁照相成像剂是指可以用放射性检测方法(包括 但不限制于γ-照相，Geiger-Muller计数器和闪烁检测器探查)检测的放 射性标记试剂。

另一方面，可以用具有细胞毒性的放射性同位素，包括但不限制于铜- 67，碘-125，碘-131，铼-186，铼-188和砹-211，最优选186Re或188Re，有效地放射性标记本发明具体的放射性治疗剂。这些具体治疗剂 用于治疗与生长激素抑制素有关的动物(优选人)的疾病，所述疾病包括但不 限制于癌症和其它以恶性或良性肿瘤的生长为特征的疾病，其中所述肿瘤能 通过对在这些肿瘤细胞的细胞表面上生长激素抑制素受体的表达，结合生长 激素抑制素或生长激素抑制素类似物。

本发明提供用于制备诊断和放射性诊断剂、治疗和放射性治疗剂的试 剂。本发明提供的该试剂包含通过共价键连接到特异性结合肽上的金属离子 络合部分，其中所述特异性结合肽结合到哺乳动物体内的生长激素抑制素受 体部位。

小的化合物，优选分子量少于10,000道尔顿的化合物具有独特的商业优 势。该种小化合物可以很容易生产。而且，它们很可能不具有致免疫性并且 可迅速从血管系统中清除，因此可更好和更快地成像。相反，大分子，如抗 体或其片段，或者通过生物学方法衍生的大于10,000道尔顿的肽，生产费用 高，并且很可能是致免疫性的和从血流中清除慢，因此干扰体内快速诊断。

在对共价键连接的放射性标记物结合部分进行放射性标记的条件下，本 发明提供的生长激素抑制素类似物中所包含的非二硫环键是稳定的，这是本 发明提供的生长激素抑制素类似物的一个优点。相反，例如Tc-99m与通 过共价键连接到天然生长激素抑制素上或具有二硫键的生长激素类似物上的 Tc-99m结合部分的轭合可引起二硫键的还原，同时伴发生物活性的丧失。 当使用天然生长激素抑制素，或任何具有二硫键的生长激素抑制素类似物 时，也可在体内产生这种生物活性的丧失。本发明不存在类似的体内生物活 性丧失，因为在本发明每种生长激素抑制素类似物中的非二硫环键都包含稳 定的共价键。

就本发明目的而言，术语“特异性结合肽”是指特异性地结合到由大量 生长激素抑制素受体(SSTR)分子所限定的哺乳动物体靶部位的任何肽化合 物。本领域技术人员将知道，“特异性结合”是指将肽定位在靶部位到周围组 织的较大范围内。在包含该特异性结合肽的诊断用成像剂中，这种特异结合 是有利的，因为该诊断用成像剂在给药后分布到哺乳动物全身并且这种结合 放射性的试剂的特异性定位使视觉限定在体内靶的部位。

本发明每种特异性结合肽的实例均含一个氨基酸序列。本发明中所述的 氨基酸包括所有L-和D-、初级α-和β-氨基酸，可以是天然存在的、 修饰的、取代的、改变的等等。本发明试剂的特异性结合肽的实例包括分子 量小于大约5,000道尔顿的特异性结合肽。特别优选的本发明特异性结合肽 的实例包括这样一些肽，它们特异性地并且具有高度亲和性地结合到在SSTR 表达细胞，特别是肿瘤细胞和激活性的T-淋巴细胞上的生长激素抑制素受 体(SSTR)。本发明提供的包含特异结合肽的试剂包括但不限制于包含具有下 列氨基酸序列的肽的试剂(除另外说明，下列肽中的氨基酸是L-氨基酸)：

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCK.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCR.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCRD.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCRK.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCRR酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCKK.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCKKK.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.Om酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCKDK胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGC.Orn.D.Orn.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.Orn.D.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.KKC.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.KRC.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.RRC.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.KKCK.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GRCK.酰胺)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GKCR.酰胺)

(在Zubay，1988，Biochemistry，(2d.ed.)，MacMillan Publishing：NeW York， P.33中可见氨基酸的单字母缩写；其它缩写见Legend表I)，该表中所列的 试剂是说明本发明并不是限定本发明，并且本领域技术人员将知道，包含本 发明所公开的肽或其它等同物的试剂可通过共价键连接到本发明的任何螯合 剂部分并且在本发明范围内。

在优选实例中，本发明试剂具有式：

包含本发明试剂的特异性结合肽可以在体外通过化学方法合成。通常， 可以在肽合成器(Synthesizer)上有效地制备这些肽。利用本文所描述的技术 (例如，见实施例2，小组O)，在体外化学合成过程中，通过共价键将金属 离子络合部分连接到肽上，由此可合成本发明肽。

在本发明闪烁照相成像剂实例中，形成锝-99m与本发明试剂的络合 物。为了实现这一点，在还原剂存在下，将Tc-99m，优选Tc-99m的 高锝酸盐与本发明试剂反应。优选的还原剂为连二亚硫酸盐、亚锡和亚铁离 子；最优选的还原剂为亚锡盐如氯化亚锡。在另一优选实例中，还原剂是固 态还原剂。为了方便，络合物和制备该络合物用的试剂是在一个试剂盒中， 所述试剂盒中包含一个密封的小瓶，该小瓶中含预先测定量的待标记的本发 明试剂和用Tc-99m标记试剂时足够量的还原剂。或者，可以通过将本发 明试剂与预先形成的不稳定的锝络合物和已知作为转移配位体的另一化合物 (例如酒石酸盐、构橼酸盐、糖酸盐或甘露糖醇)反应来制备该络合物。已知 该过程为配位体交换并且是本领域技术人员已知的。本发明使用的Tc-99m 高锝酸盐包括碱金属盐如钠盐、或铵盐或低级烷基铵盐。

通过将适宜量的Tc-99m或Tc-99m络合物加到小瓶中并在下文实 施例3中所描述的条件下反应，可以制备锝-99m标记的本发明闪烁照相成 像剂。通常，试剂盒中也可以包含药用佐剂物质，如调节渗透压的可药用盐、 缓冲剂、防腐剂等。试剂盒中的组分可以是液体、冷冻或干燥形式。在优选 实例中，所提供的试剂盒的组分是冻干形式的。可通过在下文实施例3所描 述的条件下反应来制备放射性标记的本发明闪烁照相成像剂。

本发明提供的放射性标记试剂具有适宜量的放射活性。例如，在形成Tc-99m放射性络合物时，通常优选在含放射性浓度大约为每毫升0.01毫居 里(mCi)到100mCi的溶液中制备放射性络合物。

本发明所提供的成像剂可用于显影器官如肾脏来诊断这些器官的疾 病、和肿瘤，尤其是胃肠道肿瘤、骨髓瘤、小细胞肺癌和其它APUD癌、内 分泌肿瘤如髓质甲状腺癌和垂体刖瘤、脑肿瘤如脑脊膜瘤和星形细胞瘤，也 可以成像前列腺、乳腺、结肠和卵巢的肿瘤。按照本发明，Tc-99m标记 的肽试剂以单一的单位注射剂量给药。可以在任何常规静脉注射介质如盐水 介质，或在血浆介质中，通过静脉给予本发明所提供的Tc-99m标记的肽 试剂。通常，给药的单位剂量具有的放射性为约0.01mCi-约100mCi，优 选1mCi-20mCi，其以单位剂量注射的溶液为约0.01mL-约10mL。静 脉给药后，在几分钟后进行体内显影。然而，如果需要，可在将放射性标记 的肽注入人体后几小时，甚至更长的时间后显影。在大多数情况下，足够量 的给药剂量在大约0.1小时内，在待显影的区域蓄积，使得可以拍摄闪烁照 片。按照本发明，可以使用任何常规诊断用闪烁照相成像的方法。

在临床上，可以使用与生长激素抑制素受体结合的环状肽和本发明环状 肽试剂的非放射性金属络合物，作为治疗剂来促进某种类型肿瘤的消除，特 别是那些表达生长激素抑制素受体的肿瘤的消除。本发明生长激素类似物环 状肽也可用于减少激素的过渡分泌，这种激素的过度分泌常常伴发某些癌 症，如APUD癌。本发明用作治疗剂的肽可以通过任何适宜的途径，包括 静脉、肌肉或口服，并且在任何适宜的药用载体中，以大约0.01-49mg/kg 体重/天的剂量范围来给药。

本发明也提供用具有细胞毒性的放射性同位素如铼-186或铼-188来 进行放射性标记的肽，该肽可用于放射性治疗上述某些肿瘤。就该目的而言， 可通过任何临床给药途径，优选通过静脉注射来给予大约10mCi-200mCi 量的放射性同位素。

在下列实施例中更详细地说明制备和标记这些化合物的方法。这些实施 例说明上述方法和有效结果的某些方面，并且对本发明只是说明而并非限 制。

实施例1

固相肽的合成

固相肽的合成是在0.25毫摩尔(mmol)标度下，使用Appleid Biosystems Model431A型的肽合成器，使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)端氨基保护，与 二环已基-碳化二亚胺/羟基苯并三唑或2-(1H-苯并-三唑-1基)-1，1 3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸盐/羟基苯并三唑(HBTU/HOBT)偶联，并且对于羧 基端为酸的，使用对-羟甲基-苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)或SasrinTM树脂， 或者对于羧基端为酰胺的，使用Rink酰胺树脂。由此进行固相肽合成 (SPPS)。

通过用三苯甲醇在三氟乙酸中进行三苯甲基化作用，然后按照Atherton 等的方法(1989，固相肽合成，IRL Press：Oxoford)和进一步在下文实施例2 小组J中所描述的方法进行Fmoc衍化作用，由适宜的氨基酸制备Fmoc.Hcy(S -三苯甲游基)和Fmoc.青霉胺(S-三苯甲游基)。Fmoc-S-3-(叔-丁 氧基羰基(Boc)-氨基丙基)半胱氨酸是从甲醇钠中的L-半胱氨酸和Boc- 氨基丙基溴化物制备。然后，在pH10下，用O-9-芴基甲基O′-N-琥 珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc O Su)处理。

通过用适宜的2-卤代乙酸作为在SPPS过程中被偶联的最后基团，或 通过用在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的2-卤代乙酸/二异丙基碳化二 酰亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺或在NMP中的2-卤代乙酸酐/二异丙基乙胺来 处理结合到树脂上的N-端游离氨基的肽，由此引入L-卤代乙酰基。

在室温，pH10下，将含巯基的肽与含氯乙酰基的巯基保护的Tc-99m 络合部分反应0.5-24小时，然后视情况可用乙酸酸化并蒸发溶液，得到相 应的肽-硫化物加合物，如下文实施例2小组O中更详细的描述。按照常规 方法脱保护并纯化，得到螯合剂-肽共轭物。

用在二氯甲烷中的1％TFA溶液，将与SasrinTM树脂结合的肽裂解，得 到被保护的肽。

如果需要，通过用二苯基磷酰基叠氮化物让侧链受保护的氨基端游离的 胺与羧基端游离的酸反应，在氨基和羧基端之间，将被保护的肽的前体环化， 如下文实施例2小组M中更详细的描述。

按照常规方法，将与HMP或Rink酰胺树脂结合的产物裂解并在室温下 用含二氟乙酸(TFA)，或TFA和二氯甲烷以及视情况可含比例为100∶5∶5∶2.5∶2 的水、苯硫基甲烷、乙烷二硫醇、和三异丙基硅烷的溶液，将被保护的环状 肽脱保护0.5-3小时。如果需要，将产物在三酚甲醇/TFA中重新S-三苯 甲基化，并且用(Boc)2O将N-Boc基重新引入肽中。

通过制备性高效液相色谱法(HPLC)，使用Waters Delta-Pak C18柱并且 经乙腈改性的0.1％TFA水溶液梯度洗脱来纯化粗品肽。柱子洗脱后，将乙 腈从洗脱的馏分中蒸发掉，然后冷冻干燥。通过快速原子轰击质谱(FABMS) 或电子喷射质谱(ESMS)来确定如此制备并纯化的每种产物的特性。

实施例2

合成环(N-CH3)苯丙氨酰基-酪氨酰基-D-色氨酰基-赖氨酰基- 缬氨酰基-高半胱氢酸，S-2-乙酰基-甘氨酰基-甘氨酰基-半胱氨酰 基-赖氨酰胺(P587)

A.合成N-α-苄酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酸，N-羟基-琥 珀酰亚胺酯

向在冰水浴中冷却的，在180ml无水四氢呋喃(THF)中的N-α-苄酯 基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酸123g，60.5mmol)和N-羟基琥珀酰亚 胺(7.1g61.7mmol)的混合物中，加入二异丙基碳化二亚胺(9.66ml，61.7 mmol)。将该反应混合物搅拌过夜然后过滤并将滤液蒸发。然后将滤液的残 渣溶解在少量乙酸乙酯，200ml乙醚和200ml己烷中。标题化合物从该混合 物中沉淀出来并通过过滤回收，用冷已烷洗涤并干燥，得到28.1g(58.9mmol， 97％产率)。

B.合成N-α-苄酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酸酰基-缬氨酸， 甲酯

向在150ml THF中的缬氨酸甲酯(8.38g，50mmol)和二异丙基乙胺(12.7 ml，50mmol)的溶液中加入N-α-苄酯基-N-ε-叔丁氧基羰基赖氨酸，N -羟基琥珀酰亚胺酯(23.9g，50mmol)，再加入50mlTHF。2小时后，蒸发 除掉溶剂并向残渣中加入50ml乙酸乙酯。将该溶液先后用200ml5％的枸 橼酸、200ml饱和碳酸氢钠和200ml饱和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过 滤并蒸发。将得到的油溶解在少量乙酸乙酯、200ml乙醚和200ml己烷中。 通过过滤分离标题化合物并干燥，得到20g(40.5mmol，81％产率)。

C.合成N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯

向在100ml乙酸乙酯的N-α-苄酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰 基-缬氨酸，甲酯(19g，38.5mmol)和乙酸(1ml)的溶液中，加入10％含钯碳 催化剂(0.19g)并在氢气压下搅拌过夜。将反应混合物在Celite上过滤，将滤 液蒸发并将残渣溶解在100ml含1ml乙酸的甲醇中。向该溶液中加入10％ 含钯碳(0.19g)并在45磅/英寸2的压力下，用Parr氢化器，将混合物氢化2 小时。将反应混合物再次经Celite过滤并将滤液蒸发，得到13.56g标题化合 物(37.7mmol，98％产率)。

D.合成芴基甲氧基羰基-D-色氨酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯

向在冷水浴中冷却的，在250ml无水THF中的N-α-芴基甲氧基羰 基-D-色氨酸半水合物(25g，82.1mmol)和N-羟基正琥珀酰亚胺(9.78g， 85mmol)的溶液中，加入二异丙基碳二亚胺(13.3mL，85mmol)。将反应混合 物搅拌过夜，过滤并将滤液蒸发。将残渣溶解在甲苯和己烷中。通过过滤分 离标题化合物并干燥，得到34g(66.5mmol，81％产率)。

E.合成芴基甲氧基羰基-D-色氨酰基-N-α-叔丁氧基-羰基-赖 氨酰基-缬氨酸，甲酯

向在200mlTHF中的N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯 (13g，36.1mmol)的混合物中，加入芴基甲氧基羰基-D-色氨酸，N-羟 基琥珀酰亚胺酯(18.9g，36.1mmol)。加入二异丙基乙胺来调节反应混合物的 pH至pH8，并将反应物搅拌2天。蒸发除掉溶剂并将残渣溶解在乙酸乙酯 中，用5％的枸橼酸，饱和碳酸氢盐，和饱和的盐水洗涤，然后经硫酸钠干 燥。将溶液过滤并蒸发，将残渣溶解在乙酸乙酯中。将该溶液几次结晶后回 收标题化合物，得到17.3g产物(22.5mmol，62％产率)。

F.合成N-芴基甲氧基羰基-O-叔丁基酪氨酸，N-羟基-琥珀酰亚 胺酯

向在冷水浴中冷却的，在250ml无水THF中的N-α-芴基甲氧基羰 基-O-叔丁基酪氨酸(25g，54.3mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(6.62g，57.5 mmol)的溶液中，加入二异丙基碳化二亚胺(9.0ml，57.5mmol)，将反应混合 物搅拌过夜，过滤并将滤液蒸发。将残渣溶解在甲苯和己烷中，通过过滤将 标题化合物分离出来并干燥，得到27.7g(49.7mmol，92％产率)。

G.合成N-芴基甲氧基羰基-O-叔丁基酪氨酰基-D-色氨酰基- N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯

在室温下，将芴基甲氧基羰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰 基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯(17g，22.1mmol)用40ml二乙胺和40mlTHF 处理1.5小时。将反应混合物蒸发，重新悬浮在100mlTHF中并再蒸发三次。 将残渣溶解在120ml无水THF中，并加入N-芴基甲氧羰基-O-叔丁基 酪氨酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(12.3g，22.1mmol)，再加入20ml无水THF 和4ml二异丙基乙胺，产生的溶液pH为9。搅拌过夜后，将反应物蒸发并 将残渣溶解在乙酸乙酯中。用5％的枸橼酸，饱和碳酸氢钠和饱和盐水洗涤 该乙酸乙酯溶液，经硫酸镁干燥并蒸发。将残渣溶解在乙酸乙酯、乙醚和己 烷中，标题化合物沉淀出来。通过过滤分离沉淀的化合物并干燥，得到14.6g 标题化合物(14.8mmol，67％产率)。

H.合成N-芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸，N-羟基琥珀酰亚 胺酯

向在冷水浴中冷却的，在180ml无水THF中的N-α-芴基甲氧基羰 基-N-甲基苯丙氨酸(25g，62.3mmol)和N-羟基正琥珀酰亚胺(7.5g，65 mmol)的溶液中，加入二异丙基碳二亚胺(10mL，64.2mmol)。将反应混合物 搅拌过夜，过滤并将滤液蒸发。将残渣溶解在甲苯和己烷中。通过过滤分离 标题化合物并干燥，得到28.3g(57mmol，91％产率)。

I.合成N-芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基 -D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯

在室温下，用35ml二乙胺和35mlTHF将芴基甲氧基羰基-O-叔丁 基-酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨 酸，甲酯(14g，14.2mmol)处理1小时。然后将反应混合物蒸发，重新悬浮在 100mlTHF中并再蒸发二次。将残渣溶解在乙酸乙酯和己烷中。产物O-叔 丁基酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨 酸，甲酯沉淀，通过过滤分离并干燥，得到9.7g(12.7mmol，90％产率)。将 O-叔丁基酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基-赖氨酰基-缬氨 酸，甲酯溶解在35ml无水THF中，并加入N-芴基甲氧基羰基-N-甲基 苯丙氨酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(6.35g，14.2mmol)，再加入3ml二并丙基 乙胺，得到pH为9的溶液。搅拌过夜后，将反应物蒸发并将残渣溶解在乙 酸乙酯中，用5％的枸橼酸、饱和碳酸氢钠和饱和盐水洗涤该乙酸乙酯溶液， 经硫酸镁干燥并蒸发。将残渣溶解在乙酯乙酯、乙醚和己烷中，标题化合物 沉淀出来。通过过滤分离沉淀的化合物并干燥，得到12.4g标题化合物(11.5 mmol，81％产率)。

J.合成N-芴基甲氧羰基-S-三苯甲基高半胱氨酸

a.向在干冰/乙醇浴中冷却至-78℃下的大约400ml液氨中，加入少量 元素钠，再加入足够量的高半胱氨酸骤熄得到的蓝色钠/氨溶液直到消耗5.7 g(248mmol)钠和9.75g(36.3mmol)高半胱氨酸并将此蓝色的钠/氨溶液持续大 约15分钟。加入氯化铵骤熄最终的蓝色，然后将反应物从冷却浴中撤出并在 氩气流下氨蒸发。将烧瓶微热以便蒸馏掉全部残余的氨。

向残渣中加入三苯基甲醇(23.6g，91mmol)并将反应烧瓶在冰/水浴中冷 却。加入250ml三氟酸(TFA)，并在30分钟后，将混合物蒸发，将残渣溶解 并用氯仿再蒸发三次。然后将残渣溶解300ml水中并用5％的枸橼酸和1M KOH调节pH至4。产物以胶质形式沉淀并通过过滤收集。将残渣与乙醚一 起研制，得到S-三苯甲游离-高半胱氨酸(7g，186mmol，26％产率)。通过 从二甲基甲酰胺(DMF)/水中结晶，过滤分离出第二批产物，总产量为24.2g(64 mmol，89％)。

b.向在150ml丙酮/100ml水中的S-三苯甲游基-高半胱氨酸(20g，53 mmol)的溶液中加入碳酸钠(11.5g，109mmol)，然后加入溶解在200ml丙酮中 的O-芴基甲基-O′-(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯(17.5g，52mmol)，所有这 些加入过程大约在1小时完成。将反应混合物搅拌大约2天，然后将有机溶 剂蒸发掉。向水性残渣中加入300ml乙酸乙酯并用1M HCl将混合物酸化。 分离有机相并相继用1M HCl、0.5M HCl和0.25M HCl洗涤，然后经硫酸 镁干燥，过滤并蒸发。将粗品在硅胶上层析(100％氯仿→3％甲醇/氯仿)得 到标题化合物(19.4g，32mmol，62％产率)。

K.合成N-芴基甲氧基羰基-S-三苯甲游基-高半胱氨酸-N-甲 基苯丙氨酸-O-叔-丁基酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基 羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯

在室温下，用28ml二乙胺和30ml THF，将芴基甲氧基羰基-N-甲 基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基 羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯(9.8g，8.5mol)处理1小时。然后将反应混合 物蒸发，再悬浮在100ml THF中并再蒸发三次。将残渣溶解在乙酸乙酯和己 烷中。产物N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基酪氨酰基-D-色氨酰基-N -ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酸，甲酯沉淀，通过过滤分离并干燥， 得到4.9g(8.1mmol，95％产率)。

向在-15℃冷却浴中冷却的，在50ml无水THF中的N-芴基甲氧基 羰基-S-三苯甲游基-高半胱氨酸中加入N，N′-双(2-氧-3-唑烷基) 膦酰氯(Bop-Cl；2.47g，9.7mmol)和1.7ml二异丙基乙胺(9.7mmol)并将反 应混合物搅拌30分钟，加入在50ml无水THF中的N-甲基苯丙氨酸-O -叔丁基酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬 氨酸，甲酯(7.48g)，再加入1.7ml二异丙基乙胺。通过蒸发，将反应物体积 减少50％，然后在室温下搅拌2天。通过蒸发除掉溶剂，并将残渣溶解乙酸 乙酯中，用5％的枸橼酸，饱和碳酸氢钠和饱和盐水洗涤，并经硫酸镁干燥。 将残渣溶解在乙酸乙酯、乙醚和己烷中，标题化合物沉淀，通过过滤分离沉 淀的化合物，得到10.2g(6.77mmol，84％产率)。

L.合成S-三苯甲游基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基 -酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酸

将N-芴基甲氧基羰基-S-三苯甲基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙 氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基- 赖氨酰基-缬氨酸，甲酯(10g，6.6mmol)和LiOH·2H2O在50mlTFH和4ml 水中的溶液搅拌3天。再加入25mol％的LiOH·2H2O，并在2小时后， 将溶剂蒸发，将残渣溶解在乙酸乙酯中。然后用5％枸橼酸，饱和碳酸氢钠 和饱和盐水洗涤该溶液，经硫酸镁干燥，过滤并蒸发。将残渣溶解在乙酸乙 酯、乙醚和己烷中，标题化合物沉淀，通过过滤分离并干燥。将得到的粗品 在硅胶上层析，用氯仿/10％甲醇∶氯仿洗脱，得到3.46g纯标题化合物(47 mmol，41％产率)。

M.合成环-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基酪氨酰基-D-色氨酰基 -N-ε-叔丁氧基羰基-赖氨酰基-缬氨酰基-S-三苯甲游基-高半胱 氨酸

将溶解在1740mlDMF中的S-三苯甲游基-高半胱氨酸-N-甲基 苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰 基-赖氨酰基-缬氨酸(3.42g，2.69mmol)溶液在冰水浴中冷却，并加入1.16 ml二异丙基乙胺和二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA；5.4g，1.16mmol)。在-20 ℃下，将反应物培育5天并再加入25mol％的DPPA，然后加入100mol％ 二异丙基乙胺。通过蒸发除掉DMF溶剂并将标题化合物粗品在乙酸乙酯、 乙醚和己烷中结晶，得到2.43g(1.9mmol，69％)。

N合成环-N-甲基苯丙氨酸-酪氨酰基-D-色氨酰基-赖氨酰基 -缬氨酰基-S-三苯甲基-高半胱氨酸

在室温下，用18.7mlTFA，2ml二氯甲烷，0.94ml水，0.47ml乙二 硫醇和0.37ml三异丙基硅烷将环-S-三苯甲基-高半胱氨酸-N-甲基 苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰 基-赖氨酰基-缬氨酸(2.43g，1.9mmol)处理1小时。通过蒸发除掉TFA， 将残渣溶解在10ml氯仿中并倾入400ml冷乙醚中。通过过滤收集粗品的沉 淀并通过C18制备性反相HPLC纯化(用30％乙腈→60％乙腈/水梯度洗脱， 所有溶剂都含0.1％TFA)，得到标题化合物(1g，1.2mmol，62％产率)。与理 论上(平均)预测的值855，09相比，快速原子轰击质谱(FABMS)分析表明MH+ 为855。

O.合成环-N-甲基苯丙氨酸-酪氨酰基-色氨酰基-赖氨酰基-缬 氨酰基-S-三苯甲游基-高半胱氨酸，S-2-乙酰基-甘氨酰基-甘氨 酰基-半胱氨酰基-赖氨酰胺(P587)

将环-N-甲基苯丙氨酰基-酪氨酰基-D-色氨酰基-赖氨酰基- 缬氨酰基-高半胱氨酸(250mg，0.29mmol)和2-氯乙酰基-甘氨酰基-甘 氨酰基-S-三苯甲游基-半胱氨酰基-赖氨酰胺(如实施例1所述，由SPPS 制备，238mg，0.35mmol)溶解在7ml乙腈和7ml100mM碳酸钠/0.5mM EDTA，pH10的溶液中并搅拌过夜。然后将反应混合物蒸发至干并如实施例1 所述，在含三异丙基硅烷的TFA中脱保护。通过反相HLPC将标题化合物纯 化，得到92.4％的理论上预计的产率。与理论上(平均)预测的值1257.70比， 快速原子轰击质谱分析表明MH+为1258。由下式表示该产物，称P587的 结构：

实施例3

放射性标记的一般方法

将0.1mg如实施例1中制备的肽试剂溶解在0.1ml水，或0.9％氯化钠， 或10％羟丙基环糊精(HPCD)，或50∶50乙醇∶水，或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)， 或50mM磷酸钾缓冲剂(pH＝5，6或7.4)中。通过用1.0ml含量不超过200mCi 的Tc-99m高锝酸钠重新配制一个Glucosacan小瓶(E.I.Dupont de Nemours， Inc.，Wilmington，DE)来制备Tc-99m葡庚糖酸盐。并在室温下放置15分 钟。将25μlTc-99m葡庚糖酸盐加到试剂中并在室温或在100℃下反应5 -30分钟，然后通过0.2μm滤器过滤。

通过HPLC，用下列条件测定Tc-99m标记的肽试剂纯品：Warters Delta-Pak RP-18分析柱，大小5μm×4.6mm×220mm，装入每种 放射性标记的肽，在1ml/min的溶剂流速下洗脱。经10-20分钟，用开始 为100％溶剂A(0.1％TFA/水)并且最后为100％溶剂B(0.1％TFA/90％乙 腈/水)的线性梯度进行梯度洗脱。通过一台连接到积分记录仪上的连机放射 性检测器，检测放射性组分。在这些条件下，在1-4分钟之间洗脱Tc- 99m葡庚糖酸盐和Tc-99m高锝酸钠，同时在经过较长的时间后洗脱Tc-99m标记的肽。

下表说明使用本文所描述的方法，成功地用Tc-99m标记实施例1所 制备的肽。

                    表I

肽                  FABMS  放射化学产率    HPLC

                     MH+   (％)*        RT(min) 环(N-甲基)FYWDKV.- Hcy.(CH2CO.GGC.酰胺)   1129    982        5.1，17.2 环(N-甲基)FYWDKV.- Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺)  1258    992        15.0 环(N-甲基)FYWDKV.- Hcy.(CH2CO.GGCR.酰胺)  1285    991        15.1 环(N-甲基)FYWDKV.- Hcy.(CH2CO.GGCKK.酰胺) 1386    N.D         N.D 环(N-甲基)FYWDKV.- Hcy.(CH2CO.GGC.Orn酰胺) 1244   983        7.0 *表1中上标指下列标记条件

1＝在室温下，在10％HPCD中

2＝在室温下，在50/50乙醇/水中

3＝在100℃下，在0.9％NaCl中

HPLC方法(由RT时间后的上标表示)：

Waters-1柱，在10分钟内，100％溶液A→100％溶液B。

在Zubay，ibid.P33中可找到氨基酸的单字母缩写。划线部分表示在所连 接的氨基酸衍生物基团之间形成酰胺键或硫羟键。Acm是乙酰氨基甲基； Orn是鸟氨酸；FD是D-苯丙氨酸；YD是D-酪氨酸；WD是D-色氨酸； APC-L-[S-(3-氨基丙基)半胱氨酸；并且Hcy是高半胱氨酸。

如Seevers等(1982，Chem.Rev.82：575-590)所述进行放射性碘处理和 放射性砹处理。

通过在二甲基甲酰胺或乙腈/水中，将每种本发明肽试剂与大约1摩尔 当量的如Cotton等(1966，Inorg.Chem.5；9-16)所述方法制备的氧代四溴铼 酸(+5)四丁基铵盐共溶并搅拌0.5-5天来制备非放射性铼络合物。如上关 于Tc-99m标记的肽所述，通过反相HPLC分离铼络合物并通过FABMS 或ESMS来确定其特性。

使用Tc-99m标记时相同的实验条件，由适宜的高铼酸盐来制备放射 性铼络合物，例如Re-186或Re-188络合物，或者通过将还原剂加到肽 和高铼酸盐的溶液中，或者视情况可使用配位体转化剂如枸橼酸盐并且将反 应物在室温-100℃的温度下培育5-60分钟。

实施例4

结合到AR42J鼠胰腺瘤细胞膜上的[125I-Tyr11]生长激素抑制素-14的 抑制作用

在肽试剂介导的抑制放射性标记的生长激素抑制素类似物与包含生长 激素抑制素受体的细胞膜结合的分析中证明了本发明各种生长激素抑制素受 体结合剂在体外与生长激素抑制素受体结合的能力。

在含有10％胎牛血清(FCS)和8mM谷氨酰胺的杜皮克氏改良爱哥尔氏 培养基(DMEM)中，在湿润的5％CO2环境中和温度为37℃下，培养表达 生长激素抑制素受体的鼠胰腺瘤细胞系AR42J。在冷的缓冲剂(50mM Tris-HCl，pH7.4)中，将收集的细胞搅匀，并在4℃下，以39,000g的转速， 将匀浆离心10分钟。用缓冲剂将离心片洗涤两次并再次悬浮在冰冷却的10 mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.4)中。然后，在30℃下，将等分试样的该细胞膜 制剂与[125I-Tyr11]生长激素抑制素-14(Amersham，Arlington Heights，IL)(最 终浓度为0.5nM，同位素脉冲为750,000cpm/ml，特异活性为2000Ci/mmol) 和肽或本发明肽-铼络合物(最终浓度为10-11M-10-6M)一起，在50mM， pH7.4，含1％牛血清白蛋白，5mM MgCl2，0.02mg/ml肝菌肽，0.02mg/ml 苯基甲基-磺酰氟和200,00IU抑肽酶的HEPES缓冲剂中培育25分钟。

培育后，将膜混合物通过聚乙烯亚胺洗涤的GC/F滤器(Whatman Ltd.， Maidstone，England)过滤，并用5ml冷的HEPES缓冲剂将保留在滤器上的残 渣洗涤3次。将滤器和滤器上洗涤下来的样品在计数器上计数。为了评定非 特异性结合，按所述方法，在200mn未标记生长激素抑制素-14存在下进 行分析。如Bylund和Yamamura(1990，Methods in Neuro-transmitter Receptor Analysis，Yamamura et al.，eds.，Raven Press：N.Y.)所述，数据分析包括数据的 Hill图，由此得抑制常数，利用该分析和本发明试剂得到结果如下：

                 表II

               肽                           K(nM)

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCKK.酰胺)   0.26

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺)    2.5

环(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGC.酰胺)     2.6

这些结果表明，本发明肽试剂与生长激素抑制素受体的体外结合具有高 度亲和性。

实施例5

生长激素抑制素受体(SSTR)表达鼠肿瘤的定位作用和体内成像

如Bakker等(1991，Life Sciences49：1593-1601)所述，进行由鼠肿瘤细 胞表达的生长激素抑制素受体的体内成像。

按照每只动物0.05-O.1ml悬浮液的量，将从冷冻的肿瘤浆解冻得到 CA20948鼠胰腺瘤细胞经肌肉注射植入6周大的Lewis鼠的右侧后腿中。让 肿瘤生长到大约0.5-2g时，取出，其肿瘤浆用于植入第二只首次用来作实 验的lewis鼠中。重复这种方式的肿瘤培育以便成功地获得携带肿瘤的动物。 用于体内研究的携带肿瘤的动物通常是第三至第五代动物并且携带0.2～2g 的肿瘤。

为了研究肿瘤中放射性示踪物定位的特征，在注射放射性示踪物前30 分钟，皮下给予所选择的动物SSTR-阻滞剂量(4mg/kg)的奥曲肽。(Bakker 等显示了该实验记录，其结果表明，肿瘤摄入111In-[DTPA]奥曲肽的量降低 40％。

将第三至第五代携带CA20948肿瘤的Lewis鼠管理起来并通过背侧尾 静脉注射剂量为0.15-0.2mCi的99mTc-标记的肽，该剂量与每0.2-0.4ml 含3-8μg肽相当。

在所选择的时间，通过颈脱位将动物处死并选择性尸检。将获得的组织 样品称重并在γ#式计数管中与等分试样的注射剂量一起计数。

表I显示所选择的放射性标记肽90分钟的分布结果。显然，99mTc- P587、99mTc-P617、99mTc-P726和99mTc-P736显示肿瘤摄入和肿瘤/ 血比很高，这表明它们在靶(肿瘤)组织高度特异性地被摄入。

图1显示在携带肿瘤的鼠中，99mTc-P587的图像。显而易见，在大腿 根的肿瘤中(箭头)摄入量高。

将经或未经预先注射奥曲肽治疗的鼠的肿瘤中99mTc-P587的摄入进行 比较，已知生长激素类似物结合到体内生长激素抑制素受体上。在这些实验 中，通过在给予99mTc-P587前给予奥曲肽引起的受体阻滞使得肿瘤特异 性摄入放射性标记肽的量减少76％。这些结果证明了99mTc-P587的体内 结合是SSTR特异性的。

                       表III

                                     ％ID/g No.            肽                肿瘤    血    肿瘤/血 P736    环(N-甲基)FYWDKV.

    Hcy.(CH2CO.GGCRK.酰胺)  2.1    0.24    9 P587    环(N-甲基)FYWDKV.

    Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺)   3.4    0.61    6 P617    环(N-甲基)FYWDKV.

    Hcy.(CH2CO.GGCR.酰胺)   6.7    0.73    9 P726    环(N-甲基)FYWDKV.

    Hcy.(CH2CO.KKC.酰胺)    2.5    0.30    8

实施例6

用Tc-99m标记的P587表达人体生长激素抑制素受体(SSTR)的肿瘤 进行体内成像

在临床试验中，用Tc-99m标记的P587试剂获得患SSTR表达型肿瘤 的病人的闪烁照相成像。

总计10名患者，女性4人，男性6人，年龄27-69岁，预先诊断患 生长激素分泌型垂体腺瘤(4人)，黑素瘤(1人)，髓质甲状腺癌(1人)，小细胞 肺癌(SCLC；1人)，非何杰金淋巴瘤(1人)或胃类癌瘤(1人)。每个病人都以每 0.2-0.5mg10-22mCi的剂量，通过静脉注射给予Tc-99m标记的P587。 每个病人在注射后4小时都如本文所述进行闪烁照相成像。

在注射的同时开始γ照相机成像。在最初10分钟时，获得作为动力学 研究对象的前期图像(10秒钟即可获得)，然后在注射后1，2，3和4小时获得 静态图像。在注射后大约10-20分钟和在注射后大约1，2，3和4小时获得 500,000计数或20分钟(以较短的为准)的前期图像。

发现，在注射后30分钟内，由于在循环系统中保留注射剂量的不到10 ％，结果闪烁照相成像剂迅速从血流中显现出来。这样使得在注射闪烁照相 成像剂后15-30分钟，就获得肿瘤部位的图像。在该研究中检测到所有已 知的肿瘤，以及从前未检测到的转移性损害，所述转移性损害后来通过使用 计算机辅助型X线断层照相术(CAT扫描)确定。

这些结果证明，本发明闪烁照相成像剂在检测人体内SSTR表达型初期 或转移期肿瘤中是非常有效的。

应该知道，上述公开的发明强调了本发明的某些特定实例并且所有相应 的修饰或改变都在如权利要求中所阐述的本发明的构思和范围内。

发明背景