用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法
阅读：1022发布：2020-10-21
专利汇可以提供用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用阴离子修饰 纳米粒子 增强拉曼 光谱 的方法，涉及激光拉曼光谱的检测。方法为制备金属纳米粒子为 内核 ，满 单层 强 吸附 的阴离子为修饰层的表面改性的纳米粒子；将纳米粒子溶胶与待测 生物 分子均匀混合；直接进行表面增强拉曼光谱检测。本发明用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法操作简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性好、有效维持生物分子的天然构象、结果准确可靠、适于研究生物分子。，下面是用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法专利的具体信息内容。
1.用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备金属纳米粒子为内核，阴离子为修饰层的表面改性的纳米粒子；
2）将纳米粒子溶胶与待测分子均匀混合；
3）进行表面增强拉曼光谱检测。
2.如权利要求1所述的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于所述金属纳米粒子为银纳米粒子、金纳米粒子或铜纳米粒子。
3.如权利要求1所述的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于所述金属纳米粒子为球形金属纳米粒子或棒状金属纳米粒子。
4.如权利要求1所述的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于所述金属纳米粒子的粒径为10～300nm。
5.如权利要求1所述的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于所述阴离子为碘离子、溴离子、氯离子或者硫离子。
6.如权利要求1所述的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于所述阴离子修饰的程度为满单层的0.1-10倍。
7.如权利要求1所述的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，其特征在于所述阴离子修饰的程度为满单层。
8.一种用于增强拉曼光谱检测的纳米粒子，其特征在于：其内核为金属纳米粒子，该内核上修饰有阴离子，所述阴离子为碘离子、溴离子、氯离子或者硫离子。
9.如权利要求8所述的一种用于增强拉曼光谱检测的纳米粒子，其特征在于：所述金属纳米粒子为银纳米粒子、金纳米粒子或铜纳米粒子。
10.如权利要求8所述的一种用于增强拉曼光谱检测的纳米粒子，其特征在于：修饰的阴离子的量为满单层吸附量的0.1-10倍。
用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及激光拉曼光谱的检测，尤其是涉及一种用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法。
背景技术
[0002] 表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS）是一种具有极高的表面灵敏度的谱学技术，可以通过分子的振动特征鉴别吸附在纳米结构表面的物种。因此，SERS在物理、化学、表面科学、纳米科学和生物医学等领域受到了越来越广泛的关注。其中，生物医学是一个最受关注的应用领域，因为利用表面增强拉曼光谱不仅可以实现低浓度生物样品的高灵敏度检测，还可以在接近生理条件下获得组织或细胞的光谱信息，从而从分子水平解释生命相关现象。然而，用SERS研究生物体系时往往会遇到重现性差、灵敏度低的问题，大大限制了SERS技术在生物医学领域的应用前景。所以如何提高生物分子的SERS重现性和灵敏度成为了发展SERS技术在生物领域应用的关键问题。
[0003] 生物分子的SERS重现性和灵敏度低的原因主要来自两方面，一是生物分子的特性，二是SERS活性纳米粒子的界面性质。大多数生物分子的拉曼散射界面较小，在金属纳米粒子的表面吸附比较弱，分子体积通常较大，不容易靠近SERS活性最高的“热点”，另外它们的结构灵活多变且稳定性不高。而SERS活性纳米粒子的界面性质对灵敏度和重现性的影响更为显著。因为SERS是一种表面敏感的技术，所以界面性质决定了靠近表面的物种组成、取向以及构型，最终决定SERS光谱的特征。另外有研究表明，生物分子与柠檬酸钠还原的银纳米粒子直接作用容易引起生物分子的构象变化甚至变性（S.Oellerich,H.Wackerbarth and P.Hildebrandt,Spectroscopic Characterization of Nonnative Conformational States of Cytochrome c.J.Phys.Chem.B,2002,106,6566.）。
[0004] 为了提高生物分子的稳定性，在测生物分子的SERS时，人们提出样品应该保持在溶胶状态而不是完全干的状态（X.X.Han，G.G.Huang,B.Zhao,Y.Ozaki,Label-Free Highly Sensitive Detection of Proteins in Aqueous Solutions Using Surface-Enhanced Raman Scattering.Anal.Chem.2009,81,3329.），因为溶液状态更接近正常生理状态。在溶液状态下，蛋白质的SERS光谱的重现性相比于干态有一定提高。
[0005] 另一方面，人们想出了各种办法调控金属纳米粒子的界面性质，从而提高SERS的灵敏度和重现性。人们曾经提出用控制电位的方法来控制金属纳米粒子表面的电性，然后通过静电作用吸引带相反电荷的目标分子（N.S.Lee,Y.Z.Hsieh,R.F.Paisleyand M.D.Morris,Surface-enhanced Raman spectroscopy of the catecholamine neurotransmitters and related compounds.Anal.Chem.,1988,60,442.），从而提高灵敏度和重现性。但是这个方法实际效果有限，操作麻烦，而且电位对生物分子的电荷转移以及结构的影响也不可忽视。2010年，Tian小组提出了用壳层隔绝纳米粒子增强拉曼光谱的方法（SHINERS），在SERS活性纳米粒子上包覆一层极薄且无针孔的惰性致密壳层，惰性壳层的隔离可以避免由于生物分子与金属纳米粒子相互作用可能引起的各种变化。所以光谱的稳定性和可靠性大大加强，但是惰性壳层厚度至少有2～3nm，而生物分子本身的体积较大，所以将这种方法用于研究生物分子时灵敏度非常低。2011年，巯基十一酸等硫醇类分子被用于纳米粒子的表面改性（A.Sivanesan,H.K.Ly,J.Kozuch,M.Sezer,U.Kuhlmann,A.Fischer,I.M.Weidinger,Functionalized Ag nanoparticles with tunable optical properties forselective protein analysis.Chem.Commun.2011,47,3553.）。结果发现，在硫醇修饰的纳米粒子上，细胞色素c的表面增强共振拉曼光谱重现性很好，而且保全了蛋白分子的天然构象。硫醇修饰层的厚度大约在1nm以内，相比于SHINERS其厚度明显降低，所以灵敏度也明显提高。但是该方法的缺点是，硫醇分子本身也会产生很强的SERS信号干扰目标分子的信号，当应用于大多数没有共振效应的普通生物分子时，这种干扰就会非常明显。所以需要在综合前人经验的基础上，进一步改进，发明新方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种操作简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性好、有效维持生物分子的天然构象、结果准确可靠的、适于研究生物分子的用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明包括以下步骤：
[0010] 1）制备金属纳米粒子为内核，阴离子为修饰层的表面改性的纳米粒子；
[0011] 2）将纳米粒子溶胶与待测分子均匀混合；
[0012] 3）进行表面增强拉曼光谱检测。
[0014] 所述金属纳米粒子最好为球形或棒状等各种形状的金属纳米粒子，所述金属纳米粒子的粒径最好为10～300nm。
[0015] 所述阴离子最好为碘离子、溴离子、氯离子或者硫离子等在金属表面强吸附的阴离子。
[0016] 一种用于增强拉曼光谱检测的纳米粒子，其特征在于：其内核为金属纳米粒子，该内核上修饰有阴离子，所述阴离子为碘离子、溴离子、氯离子或者硫离子。
[0017] 所述金属纳米粒子为银纳米粒子、金纳米粒子或铜纳米粒子。
[0018] 修饰的阴离子的量可以为满单层吸附量的0.1-10倍。最好为满单层。
[0019] 本发明的原理是：
[0020] 在高SERS活性的金属（银、金、铜）纳米粒子上修饰满单层的阴离子（碘离子、溴离子、氯离子、硫离子等），即得到一个表面干净，界面性质单一的纳米粒子，然后将该纳米粒子与待测样分子混合，因为有表面阴离子层的隔离，生物分子不容易直接跟金属纳米粒子发生相互作用，从而影响其构象。如果待测分子带正电，那么由于静电作用，分子靠近带负电的粒子表面并诱导粒子发生聚集，形成热点并将分子包含在其中。如果待测分子带负电，那么在加入待测分子之后，再加入MgSO4等聚集剂也可以诱导粒子形成热点。所以无论待测分子的电性如何，都可以给出强的SERS信号。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下的优点和技术效果：
[0022] 1）本发明的阴离子修饰纳米粒子的制备方法及原材料简单易得，其中金属拉曼粒子的大小以及修饰的完整程度都是可控的。
[0023] 2）本发明与SHINERS技术相比较，灵敏度有很大提高。
[0024] 3）本发明与硫醇类分子修饰方法相比较，不存在修饰层分子信号的干扰，因为-1Ag-I，Ag-Br只在200cm 以下的低波速区有单一的振动。
[0025] 4）本发明克服了以往SERS应用于生物领域的两大问题：重现性和灵敏度。不仅如此，本方法还能测到生物分子的天然构象。
[0026] 5）本发明不仅可以得到单一生物分子的可靠的SERS光谱，还可以得到多组分生物分子的可靠的SERS光谱。
[0028] 图1为制备阴离子修饰纳米粒子的实验流程示意图。
[0030] 图3为确定阴离子满单层吸附的量，对比不同修饰程度的SERS效果。
[0031] 图4为溶菌酶分子的常规拉曼，在阴离子修饰纳米粒子上的SERS，在无修饰的纳米粒子上的SERS比较。
[0032] 图5为本发明的方法的重现性及灵敏度表征。
[0033] 图6为用本发明方法测得的混合蛋白质的SERS谱图
[0034] 图7为用本发明方法测得的血清的SERS谱图
[0035] 图8为实施例7、8、9的检测结果。
具体实施方式
[0036] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
[0037] 实施例1
[0038] 一种阴离子修饰纳米粒子的制备：
[0039] 图1给出制备阴离子修饰纳米粒子的实验流程示意图。
[0040] 以碘离子修饰银纳米粒子为例，其具体制备方法是：
[0041] 取200mL浓度为1mM的硝酸银溶液，搅拌条件下加热至沸腾，然后加入6mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，并保持微沸1h，溶液最终变为黄绿色。自然冷却至室温，即得直径约为50nm的银纳米粒子溶胶。取4.5mL银纳米粒子溶胶，室温离心（5000r/min,10min），去上清液，使纳米粒子溶胶浓缩至约50μL。加入50μL1mM KI，混合均匀，25℃下静置20min，使碘离子在银纳米粒子表面满单层吸附，得到碘离子修饰的银纳米粒子溶胶。
[0042] 图2A是碘离子修饰银纳米粒子前后的紫外可见光谱，从该谱图可以看出碘离子修饰前后，银纳米粒子溶胶的紫外可见吸收峰并没有明显位移，峰宽也没有明显变化，说明碘离子的加入并没有引起银纳米粒子的明显团聚。
[0043] 图2B是碘离子修饰银纳米粒子前后的SERS谱图。在图2B中，横坐标是拉曼位移，纵坐标是拉曼强度。曲线a代表碘离子修饰银纳米粒子前的SERS谱图，几乎看不到SERS谱-1峰。曲线b代表碘离子修饰银纳米粒子后SERS谱图，在108cm 处出现的强峰归属于Ag-I-1
的振动，说明碘离子已经有效的修饰到纳米粒子表面。同时在200～1800cm 范围内没有明显的峰出现，保证了这种碘离子修饰的纳米粒子对后续的物种检测不会有谱峰干扰。
的振动，说明碘离子已经有效的修饰到纳米粒子表面。同时在200～1800cm 范围内没有明显的峰出现，保证了这种碘离子修饰的纳米粒子对后续的物种检测不会有谱峰干扰。
[0044] 实施例2
[0045] 检验阴离子是否满单层修饰，并对比不同修饰程度的纳米粒子用于蛋白质SERS检测的效果：
[0046] 取1.5mL银纳米粒子溶胶，室温离心（5000r/min,10min），去上清液，再加入超纯水使纳米粒子溶胶的体积为1.5mL，检测溶胶的zeta电位值。连续向该溶胶中加入5μL1mM KI溶液，每次加完之后在25℃下平衡10min，然后检测溶胶的zeta电位值。每个样品点都连续测5次，取平均值。
[0047] 取4.5mL银纳米粒子溶胶，室温离心（5000r/min,10min），去上清液，使纳米粒子溶胶浓缩至约50μL。分别加入50μL不同浓度的KI溶液，混合均匀，25℃下静置20min，然后与50μL1mg/mL的溶菌酶蛋白溶液充分混合，转移到96孔板中，立即检测SERS。
[0048] 图3A是zeta电位的结果，可见，对于1.5mL银纳米粒子溶胶来说，当1mM KI的量达到15～20μL时，碘离子在纳米粒子表面达到饱和吸附，近似于满单层吸附。所以我们SERS实验中用的4.5mL银纳米粒子溶胶对应的1mM KI的饱和吸附量是45～60μL,我们实际的用量50μL在此范围内。
[0049] 图3B是不同修饰程度的纳米粒子用于蛋白质SERS检测的效果对比。曲线a、b、c、d分别代表所用的KI的浓度依次为0mM，0.1mM，1mM，10mM。当加入KI的量约等于满单层吸附所需的量（50μL，1mM）时，溶菌酶蛋白的SERS光谱质量最好。当KI不足时，容易得到碳包而得不到蛋白质的信号，当KI过量10倍时，蛋白质的信号强度有所降低。
[0050] 实施例3
[0051] 利用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法研究蛋白分子，以溶菌酶分子为例，对比溶菌酶分子的常规拉曼，在阴离子修饰纳米粒子上的SERS以及在无修饰的纳米粒子上的SERS：
[0052] 合成了碘离子修饰的银纳米粒子和不经过修饰的银纳米粒子，分别与50μL1mg/mL的溶菌酶蛋白溶液充分混合，转移到96孔板中进行表面增强拉曼测试。另取适量的100mg/mL的溶菌酶溶液于96孔板中进行常规拉曼测试。
[0053] 图4是实施例3的实验结果。图4中曲线a代表溶菌酶溶液的常规拉曼谱图，曲线b代表溶菌酶在碘离子修饰银纳米粒子上的SERS谱图，对比a和b可以发现，溶菌酶在阴离子修饰纳米粒子上的SERS谱图与其常规拉曼谱图特征非常相似，而强度平均增强了约1200倍。曲线c代表同样的测试条件下溶菌酶在无修饰的银纳米粒子上的SERS谱图，其特征与常规拉曼谱图特征差别较大。
[0054] 实施例4
[0055] 考察利用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法的重现性和灵敏度：
[0056] 将碘离子修饰的银纳米粒子与50μL1mg/mL的溶菌酶蛋白溶液充分混合，转移到96孔板中进行表面增强拉曼测试。连续采谱10次。
[0057] 将碘离子修饰的银纳米粒子与50μL不同浓度的溶菌酶溶液充分混合，溶菌酶的最终浓度分别为300μg/mL,30μg/mL,3μg/mL,0.3μg/mL,转移到96孔板中进行表面增强拉曼测试。
[0058] 图5是实施例4的实验结果。图5A中，10条曲线依次代表10次连续采谱的结果，它们基本上相互重合，说明本发明方法的重现性非常好。图5B中表明对于溶菌酶的SERS检测，检测限低至3μg/mL，灵敏度较高。
[0059] 实施例5
[0060] 利用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，进行混合蛋白质的检测：
[0061] 以细胞色素c和溶菌酶的二元混合蛋白为例，将碘离子修饰的银纳米粒子分别与50μL细胞色素c，50μL溶菌酶，以及50μL细胞色素c和溶菌酶的混合溶液充分混合，它们的最终浓度分别为3μg/mL,300μg/mL,1.5μg/mL:15μg/mL,然后分别转移到96孔板中进行表面增强拉曼测试。
[0062] 图6是实施例5的结果。如图6所示，细胞色素c和溶菌酶的混合溶液也可以得到质量很好的SERS谱图，而且细胞色素c和溶菌酶的各自的谱峰特征都非常明显。
[0063] 实施例6
[0064] 利用阴离子修饰纳米粒子增强拉曼光谱的方法，进行的血清的SERS检测：
[0065] 将碘离子修饰的银纳米粒子与50μL10%的胎牛血清充分混合，转移到96孔板中进行表面增强拉曼测试。
[0066] 图7是实施例6的结果。在图7中，1000cm-1,1030cm-1是血清中主要成分牛血清白蛋白的特征峰，说明血清虽然成分复杂，但是真正与碘离子修饰的银纳米粒子发生作用的主要还是牛血清白蛋白。这一结果也表明本发明的方法在血清等成分复杂的样品上也可以得到可靠的结果。
[0067] 实施例7
[0068] 溴离子修饰的方法
[0069] 方法步骤同实施例1和实施例2，只是将原来1mM KI换成1mM KBr，以溶菌酶蛋白为检测分子。
[0070] 实施例8
[0071] 氯离子修饰的方法
[0072] 方法步骤同实施例1和实施例2，只是将原来1mM KI换成1mM KCl，以溶菌酶蛋白为检测分子。
[0073] 实施例9
[0074] 硫离子修饰的方法
[0075] 方法步骤同实施例1和实施例2，只是将原来1mM KI换成1mM Na2S，以溶菌酶蛋白为检测分子。
[0076] 图8是实施例7、8、9的结果。如图8所示，a是碘离子修饰的方法的检测结果，作为对比和参考；b是溴离子修饰的方法的检测结果；c是氯离子修饰的方法的检测结果；d是硫离子修饰的方法的检测结果，为了看得更清楚，信号强度放大了5倍。从这4条谱图对比发现，碘离子、溴离子、氯离子和硫离子等阴离子修饰纳米粒子之后，都可以得到特征与常规拉曼相似的可靠的蛋白质SERS谱图，但是同等条件下，碘离子修饰的方法得到谱图信噪比最好，信号最强。
[0077] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质说作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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