混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池
阅读：803发布：2023-03-05
专利汇可以提供混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 产电领域，特别涉及混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物 燃料 电池 。本发明通过构建工程化的混合菌群，使其具有分工明确的特点， 发酵 菌1为体系提供 电子 传递的载体核黄素，发酵菌2将最常用、低廉的 葡萄糖 转化为小分子酸提供给产电菌使用，扩大了产电菌的 碳 源谱。本发明选择大肠杆菌或枯草芽孢杆菌——原核生物革兰氏阴性菌和 革兰氏阳性菌 的模式菌株，通过基因工程改造等手段，构建出2种不同用途的发酵菌，拓展了 微 生物燃料 电池 的碳源谱，增强了产电菌的电子传递效率。同时，从物质流、 能量 流、信息流三个重要 角 度出发，构建稳定、合理、高效的功能性混菌共生产电体系。，下面是混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池专利的具体信息内容。
1.一种混合菌群，其特征在于，包括发酵菌和产电菌。
2.根据权利要求1所述的混合菌群，其特征在于，发酵菌包括高产核黄素的菌。
3.根据权利要求1或2所述的混合菌群，其特征在于，发酵菌包括能够利用五碳糖、六碳糖、纤维二糖为碳源生产小分子酸的菌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的混合菌群，其特征在于，所述高产核黄素的菌为枯草芽孢杆菌；所述以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的菌为大肠杆菌；
所述产电菌为希瓦氏菌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的混合菌群，其特征在于，所述高产核黄素的菌与所述产电菌的接菌比例不大于1:1。
6.如权利要求3所述的混合菌群，其特征在于，所述以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的菌与所述产电菌的接菌比例不大于1：20。
7.根据权利要求1至6任一项所述的混合菌群在将化学能转化为电能中的应用。
8.一种微生物产电体系，其特征在于，包括如权利要求1至6任一项所述的混合菌群。
9.根据权利要求8所述的微生物产电体系，其特征在于，所述混合菌群在所述微生物产电体系中的接菌量为产电菌不超过4OD。
10.一种微生物燃料电池，其特征在于，包括如权利要求1至6任一项所述的混合菌群或如权利要求8或9所述的微生物产电体系。
混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物产电领域，特别涉及混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池。
背景技术
[0002] 微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell，MFC)是一种利用微生物将有机物中的化学能直接转化成电能的装置。其基本工作原理是：在阳极室厌氧环境下，有机物在微生物作用下分解并释放出电子和质子，电子依靠合适的电子传递介体和产电菌特殊的细胞膜上电子传递机制在生物组分和阳极电极之间进行有效传递，并通过外电路传递到阴极形成电流，而质子通过质子交换膜传递到阴极，氧化剂在阴极得到电子被还原与质子结合成水。
[0003] 与现有的其它利用有机物产能的技术相比，微生物燃料电池具有操作上和功能上的优势：首先，它将底物直接转化为电能，保证了具有高的能量转化效率；其次，不同于现有的所有生物能处理，微生物燃料电池在常温环境条件下能够有效运作；第三，微生物燃料电池不需要进行废气处理，因为它所产生的废气的主要组分是二氧化碳，一般条件下不具有可再利用的能量；第四，微生物燃料电池不需要输入较大能量，因为若是单室微生物燃料电池仅需通风就可以被动的补充阴极气体；第五，在缺乏电力基础设施的局部地区，微生物燃料电池具有广泛应用的潜力，同时也扩大了用来满足我们对能源需求的燃料的多样性。
[0004] 综合上述，微生物燃料电池是利用能够将细胞内通过代谢反应产生的电子通过特有的细胞膜蛋白运输出细胞的产电微生物，将化学能转化成电能的装置，能够克服风能、太阳能等再生能源受环境的限制，在环境处理和新型能源领域起到重要作用，具有很好的发展前景。但由于产电菌生长环境苛刻，产电效率低，电子传递过程较慢，至今无法实现工业化应用。
[0005] 以希瓦式菌为主的产电菌一直被科学家广泛研究，人们集中于对产电菌的改造和对电极材料的优化，但效果并不显著。例如：(1)无法利用广泛、廉价 的底物作为碳源(碳源谱窄)；(2)为维持产电量，需要外添加大量的核黄素，成本较高；(3)经基因改造后的产电菌生长更加缓慢，产电活力没有野生菌好；(4)持续时间短、产电不稳定；(5)产电菌较脆弱，加重其产核黄素的代谢负担会影响其产电；(6)“发酵－产电”多任务由单一产电菌完成；(7)培养基中需要加入复杂的矿物质溶液和复合维生素溶液，成本较高、配制复杂。现有的微生物燃料电池在产电过程中需要不断取样，检测体系内关键物的含量，如果不够，需要及时添加来维持菌种活性和体系稳定性。体系稳定性和重复性差，产电持续时间短，需外添加数十种矿物质和维生素溶液，成本较高，体系复杂。
[0006] 因此，提供一种高效、稳定的微生物燃料电池具有重要的现实意义。
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明提供一种混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池。本发明通过构建混合菌群，使其分工明确的特点，发酵菌1为体系提供电子传递的载体核黄素，发酵菌2将最常用、低廉的葡萄糖转化为小分子酸提供给产电菌使用。本发明选择大肠杆菌——原核生物模式菌株，通过基因工程改造等手段，构建出2种不同用途的发酵菌，拓展了微生物燃料电池的碳源谱，增强了产电菌的电子传递效率。同时，从物质流、能量流、信息流三个重要角度出发，构建稳定、合理、高效的功能性混菌共生体系。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种混合菌群，其特征在于，包括发酵菌和产电菌。
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，所述混合菌群中发酵菌包括高产核黄素的菌。
[0013] 在本发明中，产电过程不需要外添加物质、以葡萄糖为碳源，底物可延伸为木糖、纤维二糖、甚至是纤维素的处理液均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述混合菌群中所述高产核黄素的菌为枯草芽孢杆菌；所述以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的菌为大肠杆菌；
[0015] 所述产电菌为希瓦氏菌。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，所述混合菌群中所述高产核黄素菌与所述产电菌的接菌比例不大于1:1；
[0017] 所述以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的菌与所述产电菌的接菌比例不大于1：20。
[0018] 在本发明的另一些具体实施方案中，所述混合菌群中所述发酵菌与所述产电菌的接菌比例为1:20。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述混合菌群中所述高产核黄素菌与所述产电菌的接菌比例不小于1:10000；
[0020] 所述以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的菌与所述产电菌的接菌比例1:20。
[0021] 本发明还提供了所述混合菌群在将化学能转化为电能中的应用。
[0022] 本发明还提供了一种微生物产电体系，包括所述混合菌群。
[0023] 在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物产电体系中的所述混合菌群在所述微生物产电体系中的接菌量为产电菌不超过4OD。
[0024] 在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物产电体系还包括硝酸盐。
[0025] 在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物产电体系中所述硝酸盐在所述微生物产电体系中的终浓度不大于10mM。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物产电体系的pH值为6.2～7.2。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物产电体系还包括缓冲液，所述缓冲液为HEPES。优选为1×HEPES。
[0028] 在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物产电体系中碳源的浓度为10g/L。
[0030] 本发明还提供了一种微生物燃料电池，包括所述的混合菌群或所述的微生物产电体系。
[0031] 本发明通过构建混合菌群，使其分工明确的特点，发酵菌1为体系提供电子传递的载体核黄素，发酵菌2将最常用、低廉的葡萄糖转化为小分子酸提供给产电菌使用。本发明选择大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，通过基因工程改造等手段，构建出2种不同用途的发酵菌，拓展了微生物燃料电池的碳源谱，增强了产电菌的电子传递效率。同时，从物质流、能量流、信息流三个重要角度出发，构建稳定、合理、高效的功能性混菌共生体系。
[0032] 本发明提供的微生物产电体系和微生物燃料电池解决了如下问题：
[0033] (1)微生物燃料电池自身持续时间短、产电不稳定，需要定时外添底物和电子载体等昂贵物质来维持较高的产电量；
[0034] (2)产电菌希瓦氏菌的底物谱、碳源谱窄，只能利用小分子的乳酸、甲酸、氨基酸等物质，不能利用广泛碳源——五、六碳糖，如葡萄糖、木糖等，不能将纤维素或者广泛、廉价的葡萄糖转化中丰富的化学能转化为电能；
[0035] (3)从“体系自身供给”的角度，开发一个独立、稳定、高效的微生物燃料电池体系；
[0036] (4)混菌燃料电池中不同菌株不能共培养的问题。如何使产电菌和发酵菌间协同作用，提高体系的产电量和产电时间的问题；
[0037] (5)如何选择和工程改造发酵菌，作为重要物质的输入。
[0038] 本发明能够做到，只需在起始时加入一定的葡萄糖，中间不需要外添加任何物质，可以实现高效产电超过100小时。
[0039] 本发明的微生物产电体系简单，只需要不超过10种基本、廉价的盐组成的溶液就可以，体系不需要添加复杂的矿物质盐溶液和复合维生素溶液。
[0040] 本项专利突破了微生物燃料电池领域传统的单菌改造思维，使用混合菌群分工明确的优势和特点，构建大肠杆菌－枯草芽孢杆菌－希瓦氏菌的混合产电体系，相较于其他燃料电池具有电量较高、持续时间较长、成本很低、中间不需要补料等优势。
[0041] 在构建过程中，使用两种不同功能的经过基因改造的大肠杆菌作为发酵菌为体系提供关键物质，成为为菌间相互交流、互利共生和行驶功能的重要的物质、能量和信息驱动力。
[0042] 其中一种大肠杆菌利用葡萄糖代谢出小分子酸(乳酸、甲酸、氨基酸等)供产电菌利用，另一种工程化的枯草芽孢杆菌生产核黄素，作为电子传递的载体，供产电菌提高电子传递效率，能够有效的提高产电量。同时，在产电特殊的条件下，产电菌也能够促进发酵菌的代谢速度，使体系电输出持续时间更长。此外，混合培养条件和接菌比例等条件控制也对产电效果有重要的影响意义。
[0043] 经大量的条件摸索，如图2所示：在混菌燃料电池培养条件下， 为在葡萄糖为碳源，单独希瓦氏菌的产电图，产电量极低，48小时候基本没电。 为三种菌混合的结果，效果明显。
[0044] 我们的混菌体系用到了3个种属、三种菌来实现其共能。
[0045] (1)物质流、能量和信息流的切入点核黄素和小分子酸分配到2种发酵菌中。(混菌微生物燃料电池的彻底分工的概念)
[0046] (2)选择大肠杆菌+枯草芽孢杆菌作为发酵菌，大肠具有基因操作简单、繁殖速度快、培养条件很简单等自身独特的优势，初级代谢产物的生产和分泌能力较强、是生物化工角度最广泛使用的工程菌。枯草芽孢杆菌本身就是核黄素的生产菌(不需要基因改造就能产、但此处用到的是世界上经改造的最高产核黄素的枯草)，是革兰氏阳性菌的模式菌，研究较为广泛和透彻。
[0047] (3)电池的效果：产电量超过520mV、产电时间超过100小时。
[0048] (4)产电过程不需要外添加物质、以葡萄糖为碳源，底物可延伸为木糖、纤维二糖、甚至是纤维素的处理液。
[0051] 图1示实施例5的产电效果对比图；其中， 示希瓦氏菌； 示希瓦氏菌+大肠杆菌； 示希瓦氏菌+大肠杆菌+大肠杆菌；
[0052] 图2示实施例6的产电效果对比图；其中， 示希瓦氏菌； 示希瓦氏菌+枯草芽孢杆菌+大肠杆菌；
[0053] 图3示pH值试纸图；其中图3(A)指pH试纸对照图；图3(B)指实施例7的pH值试纸图；
[0054] 图4示实施例7接菌比例和pH对体系的影响；其中， 示希瓦氏菌+小分子酸； 示希瓦氏菌+大肠杆菌； 示希瓦氏菌+大肠杆菌+大肠杆菌(产点菌比发酵菌＝20:1)； 示希瓦氏菌+大肠杆菌+大肠杆菌(产点菌比发酵菌＝10:1)；
[0055] 图5示燃料电池装置图。
具体实施方式
[0056] 本发明公开了一种混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0057] 本发明提供的混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池中所用的原料及试剂均可由市场购得。
[0058] 其中，所述以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的菌的构建方法为：为了增强厌氧条件下发酵菌2产生小分子酸的能力，本发明在大肠杆菌中导入ldhE基因(产乳酸基因，乳酸杆菌来源)，利用λ－Red同源重组技术敲除了pflB基因；
[0059] 所述高产核黄素的大肠杆菌的构建方法为：在大肠杆菌中导入ribABDEC基因簇；
[0060] 所述高产核黄素的枯草芽孢杆菌的构建方法为：过表达枯草芽孢杆菌中prs 和ywlF 基 因，下 调 了Pur 操 纵 子 和PurR调 控 基 因 (glyA,guaC,pbuG, xpt-pbuX,yqhZ-folD,and pbuO)。菌 种按照 文章 构建：Shi S,Chen T,Zhang Z,et al.Transcriptome analysis guided metabolic engineering of Bacillus subtilis for riboflavin production[J].Metabolic engineering,2009,11(4):243-252.[0061] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0062] 实施例1混合菌群
[0063] 构建高产核黄素的枯草芽孢杆菌：通过基因操作，过表达枯草芽孢杆菌中prs和ywlF基因，下调了Pur操纵子和PurR调控基因(glyA,guaC,pbuG,xpt-pbuX,yqhZ-folD,and pbuO)。
[0064] 构建以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌：在大肠杆菌中利用λ－Red同源重组技术敲除了pflB基因，然后导入ldhE基因(产乳酸基因，乳酸杆菌来源，GENWIZE公司合成)，方法是：通过EcoRI和PstI酶切、连接到pSB1C质粒上然后将连有ldhE基因的质粒导入上述敲掉pflB基因的大肠杆菌中，氯霉素抗性进行筛选，筛选出正确的转化子。取构建的高产核黄素的枯草芽孢杆菌、构建的以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌与希瓦氏菌混合，按照：
[0065] 高产核黄素的枯草芽孢杆菌与产电菌希瓦氏菌按照不超过1:1的接菌比例混合；
[0066] 以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌与产电菌希瓦氏菌按照不超过1:20的接菌比例混合。
[0067] 实施例2混合菌群
[0068] 构建高产核黄素的枯草芽孢杆菌：通过基因操作，过表达枯草芽孢杆菌中prs和ywlF基因，下调了Pur操纵子和PurR调控基因(glyA,guaC,pbuG,xpt-pbuX,yqhZ-folD,and pbuO)。
[0069] 构建以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌：在大肠杆菌中利用λ－Red同源重组技术敲除了pflB基因，然后导入ldhE基因(产乳酸基因，乳酸杆菌来源，GENWIZE公司合成)，方法是：通过EcoRI和PstI酶切、连接到pSB1C质粒上然后将连有ldhE基因的质粒导入上述敲掉pflB基因的大肠杆菌中，氯霉素抗性进行筛选，筛选出正确的转化子。
[0070] 取构建的高产核黄素的枯草芽孢杆菌、构建的以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌与希瓦氏菌混合，按照：
[0071] 高产核黄素的枯草芽孢杆菌与产电菌希瓦氏菌按照1:20的接菌比例混合；
[0072] 以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌与产电菌希瓦氏菌按照1:200的接菌比例混合。
[0073] 实施例3混合菌群
[0074] 构建高产核黄素的大肠杆菌1：在大肠杆菌中导入ribABDEC基因簇；
[0075] 构建以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌2：在大肠杆菌中利用λ－Red同源重组技术敲除了pflB基因，然后导入ldhE基因(产乳酸基因，乳酸杆菌来源，GENWIZE公司合成)，方法是：通过EcoRI和PstI酶切、连接到pSB1C质粒上然后将连有ldhE基因的质粒导入上述敲掉pflB基因的大肠杆菌中，氯霉素抗性进行筛选，筛选出正确的转化子。
[0076] 取构建的高产核黄素的大肠杆菌1、构建的以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌2与希瓦氏菌混合，按照：
[0077] 高产核黄素的大肠杆菌1与产电菌希瓦氏菌按照不超过1:1的接菌比例混合；
[0078] 以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌2与产电菌希瓦氏菌按照1:20的接菌比例混合。
[0079] 实施例4混合菌群
[0080] 构建高产核黄素的大肠杆菌1：在大肠杆菌中导入ribABDEC基因簇；
[0081] 构建以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌2：在大肠杆菌中利用λ－Red同源重组技术敲除了pflB基因，然后导入ldhE基因(产乳酸基因，乳酸杆菌来源，GENWIZE公司合成)，方法是：通过EcoRI和PstI酶 切、连接到pSB1C质粒上然后将连有ldhE基因的质粒导入上述敲掉pflB基因的大肠杆菌中，氯霉素抗性进行筛选，筛选出正确的转化子。
[0082] 取构建的高产核黄素的大肠杆菌1、构建的以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌2与希瓦氏菌混合，按照：
[0083] 高产核黄素的大肠杆菌1与产电菌希瓦氏菌按照1:20的接菌比例混合；
[0084] 以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌2与产电菌希瓦氏菌按照不超过1:200的接菌比例混合。
[0085] 实施例5微生物产电体系
[0087] 阳极：分别取希瓦氏菌、希瓦氏菌+大肠杆菌2(以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌)、实施例3制备的希瓦氏菌+大肠杆菌2(以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌)+大肠杆菌1(高产核黄素的大肠杆菌)；
[0088] 两级中间夹着一层质子交换膜(杜邦公司购买)；
[0090] 实验顺序：(1)先进行阳极和阴极组装(中间不加质子交换膜)，插入电极，不连电阻，装好后进行灭菌(121℃15min)烘干，加入配好的阴极液，然后在阳极加入混合好的培养液(在配好的基本培养基中加入HEPES、硝酸盐、葡萄糖)，计算培养好的菌体浓度，离心，用阳极里面的培养液重悬菌体，将其加入电池中，加入顺序为希瓦氏－大肠杆菌－大肠杆菌，最后装上电阻。放入30℃培养箱中培养，每隔2-15小时拿出，用万用表测电压。在摸索条件的过程中，每隔4小时从瓶子中取500uL左右的液体，离掉其中的菌体，过滤，用HPLC(高效液相色谱)检测其中关键代谢物的含量，同时使用pH试纸检测体系的pH是否处于中性状态。
[0091] 其中，培养液包括：
[0092]
[0093]
[0094] 结果：电池接好后，放入30℃培养箱，每隔4或8小时取出，用万用表纪录数据，纪录每次通过万用表纪录的电压值，绘制成时间－电压曲线。
[0095] 见表1和图1。
[0096] 表1数据结果
[0097]
[0098] 从图1可以看出，产电菌不能利用葡萄糖，产电量很低，不超过100mV且48小时后产电基本停止。希瓦氏菌和大肠杆菌两种菌共培养条件下产电量最高 达到250mV，在200mV出稳定近100小时，本专利发明的三种菌(发酵菌为大肠杆菌，产电菌为希瓦氏菌)的微生物燃料电池在产电量上有很好的提升(超过350mV)，持续时间超过100小时。
[0099] 实施例6微生物产电体系
[0100] 阴极：铁氰化钾(sigma公司购买)溶液；
[0101] 阳极：分别取希瓦氏菌、希瓦氏菌+大肠杆菌(以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌)、实施例1制备的希瓦氏菌+大肠杆菌(以五碳糖、六碳糖为碳源生产小分子酸的大肠杆菌)+枯草芽孢杆菌(高产核黄素的枯草芽孢杆菌)；
[0102] 两级中间夹着一层质子交换膜(杜邦公司购买)；
[0103] 中间的导线连着2k电阻，在瓶内和导线连着多孔碳布(阳极为2.5cm×2.5cm，阴极为2.5cm×3cm)。
[0104] 实验顺序：(1)先进行阳极和阴极组装(中间不加质子交换膜)，插入电极，不连电阻，装好后进行灭菌(121℃15min)烘干，加入配好的阴极液，然后在阳极加入混合好的培养液(在配好的基本培养基中加入HEPES、硝酸盐、葡萄糖)，计算培养好的菌体浓度，离心，用阳极里面的培养液重悬菌体，将其加入电池中，加入顺序为希瓦氏－大肠杆菌－枯草芽孢杆菌，最后装上电阻。放入30℃培养箱中培养，每隔2-15小时拿出，用万用表测电压。在摸索条件的过程中，每隔4小时从瓶子中取500uL左右的液体，离掉其中的菌体，过滤，用HPLC(高效液相色谱)检测其中关键代谢物的含量，同时使用pH试纸检测体系的pH是否处于中性状态。
[0105] 其中，培养液包括：
[0106]
[0107]
[0108] 结果：电池接好后，放入30℃培养箱，每隔4或8小时取出，用万用表纪录数据，纪录每次通过万用表纪录的电压值，绘制成时间－电压曲线。
[0109] 见表2和图2。
[0110] 表2数据结果
[0111]
[0112] 如图2所示，产电菌不能利用葡萄糖，产电量很低，不超过100mV且48小时后产电基本停止。本专利发明的三种菌(发酵菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，产电菌为希瓦氏菌)的微生物燃料电池在产电量上有很好的提升(最高可以达到520mV)，持续时间超过100小时。
[0113] 实施例7燃料电池体系的优化
[0114] 燃料电池为阴阳两个瓶子(装置图详见图5)，阴极铁氰化钾(sigma公司购买)溶液，两个瓶子中间夹着一层质子交换膜(杜邦公司购买)，阳极为菌液，中间的导线连着2k电阻，在瓶内和导线连着多孔碳布(阳极为2.5cm×2.5cm，阴极为2.5cm×3cm)。实验顺序：(1)先进行瓶子组装(中间不加质子交换膜)，插入电极，不连电阻，装好后进行灭菌(121℃15min)烘干，加入配好的阴极液，然后在阳极加入混合好的培养液(在配好的基本培养基中加入HEPES、硝酸盐、葡萄糖)，计算培养好的菌体浓度，离心，用阳极里面的培养液重悬菌体，将其加入电池中，加入顺序为希瓦氏－大肠杆菌－大肠杆菌(或枯草芽孢杆菌)，最后装上电阻。放入30℃培养箱中培养，每隔一定时间拿出，用万用表测电压。在摸索条件的过程中，每隔4h从瓶子中取500uL左右的液体，离掉其中的菌体，过滤，用HPLC(高效液相色谱)检测其中关键代谢物的含量，同时使用pH试纸检测体系的pH是否处于中性状态(因为产电菌的耐受范围为pH：6.2-7，pH一般要控制在6.5～6.8以上)。
[0115] 其中，培养液包括：
[0116]
[0117] 菌液：
[0118] 1#是希瓦氏菌+小分子酸(外添加乳酸钠)；
[0119] 2#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)
[0120] 3#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)+大肠杆菌(发酵菌2产核黄素)——实施例3制备；
[0121] 4#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)+大肠杆菌(发酵菌2产核黄素)——实施例1制备；
[0122] 结果：纪录每次通过万用表纪录的电压值，绘制成时间－电压曲线，结果见图4。
[0123] 测定接菌比例和pH值对燃料电池产电的影响：
[0124] 测体系pH，如图3所示：
[0125] 检测电池阳极的pH，结果如图3所示，1号希瓦氏菌+小分子酸，体系基本维持中性，2号希瓦氏菌+大肠杆菌体系pH和标准pH试纸对照，认为pH低于5.4，3号希瓦氏菌希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)+大肠杆菌(发酵菌2产核黄素)(产电菌：发酵菌＝(1～10):1)，和标准pH试纸相比，pH接近5.4，偏酸性。4#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)+大肠杆菌(发酵菌2产核黄素)(产电菌：发酵菌大于20:1)，和标准pH试纸相比，pH接近6.2，仍偏酸性。
[0126] 结论：
[0127] 1#是希瓦氏菌+小分子酸(外添加乳酸钠)，体系pH为中性；
[0128] 2#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)，pH较低，影响产电；
[0129] 3#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)+大肠杆菌(发酵菌2产核黄素)(产电菌：发酵菌＝(1～10):1)，pH较2#好一些，但仍然偏酸，造成体系开始电量很快上升，但由于发酵菌产生小分子酸的积累，不是产电菌的生存和产电的环境，造成产电菌无法产电甚至死亡。
[0130] 4#是希瓦氏菌+大肠杆菌(发酵菌1，产小分子酸)+大肠杆菌(发酵菌2产核黄素)(产电菌：发酵菌大于20:1)，发酵菌比例较小，产酸量较少，对体系影响相对于3#要小一些，电量更高。经过优化，加入了1×HEPES，保证体系的pH在中性范围左右，适合产电菌的生存，同时降低了体系内发酵菌的比例，避免小分子酸在开始时的过量积累(缓慢产生，缓慢消耗)，延长了产电时间，结果如图2所示。
[0131] 关于葡萄糖浓度，主要是对产酸的量的影响，产电菌总共需要的小分子酸的量很少，尝试10g/L的葡萄糖初始浓度，产的小分子酸过多，无法继续 试验。逐渐降低到10g/L以下。(中间取样测葡萄糖的消耗和产乳酸的情况的曲线，基本情况是乳酸一直就有且够用)，因此减少葡萄糖的量就是为了控制产酸的量，防止产电菌代谢不了过多造成的酸积累影响体系pH。
[0132] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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