技术领域
本发明涉及微生物菌种保藏方法,主要涉及酵母菌、芽胞杆菌、曲霉菌种 的长期保藏方法。
背景技术
目前微生物菌种通常采用斜面定期移植保藏法、液体
石蜡保藏法、冷冻干 燥、液氮超低温保藏、-80℃低温冷冻保藏。低温条件下保藏可减缓微生物菌种 的代谢活动,抑制其繁殖速度,达到减少菌株突变,延长菌种保藏时间的目的。
斜面定期移植保藏法:通常是采用在带
棉塞的玻璃试管内,用少于1/3管的 无菌的固体培养基摆成斜面,中央划线的接种方法,在28-30℃培养2-3天后, 置于
冰箱内4℃保藏,这种方法是用于微生物菌种的主要保藏方法,优点是操作 简单,缺点是斜面培养基与空气
接触面大,脱
水较快,一般在半年内就会干缩; 棉塞容易吸水变潮,容易导致菌种染菌;保藏
温度较高,酵母菌种仍有一定的 代谢活动,可进行繁殖,为了防止菌种死亡,通常3-4个月就应该传代转管;加 大了菌种保藏的工作量;由于菌种传代频繁,菌种变异
频率较高,需要对菌种 定期的分离复壮,给菌种的保藏带来较高的技术要求和较大的工作量。
液体石蜡保藏法:是定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡
覆盖下,菌 种的生物代谢受到抑制,细胞老化被推迟。此方法可阻止
氧气进入,使好气菌 不能继续生长,也可防止因培养基的水分
蒸发而引起的菌体死亡,达到延长菌 种保藏时间的目的。该方法优点是菌种保藏时间长,一般2-10年不等。缺点是 只适应于不能分解液体石蜡的微生物菌种的保藏;菌种保藏时必须用试管架竖 直摆放,保藏占用的空间较大,保藏场所应保持干燥,防止棉塞污染;整个操 作比较繁琐。
冷冻干燥法是将微生物冷冻,在减压下利用
升华作用除去水分,使细胞的 生理活动趋于停止,从而长期维持存活状态。
氮超低温保藏是将菌种保藏在-196℃的液态氮,或在-150℃的氮气中的长 期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地 保藏微生物。
-80℃低温冷冻保藏是将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进 行冷冻的一种保藏方法。
上述三种方法都能较好地保藏微生物菌种,保藏周期长,变异频率低,缺 点是操作复杂,技术含量高,设备投入高,运行成本高,只适合专业保藏机构 使用,不适合生产企业使用。
发明内容
本发明目的是针对上述保藏方法所存在的
缺陷,提供一种适用于生产企业, 保藏时间长又操作简单实用、菌种
质量稳定可靠,保藏成本低的微生物菌种保 藏方法。
本发明所述微生物菌种保藏方法如下:
1、培养基的制备
培养基的重量配比:玉米面40-70%,麸皮5-30%,
豆粕粉15-35%, 料水配比为:1∶0.8-1.2。
2、培养基分装与灭菌
按上述配量将培养基物料与水混合,分装于试管中,通常试管中装量为 1/3~2/3,塞好棉塞,高压灭菌,1.0-1.2atm,30-45min,取出趁热摇散,冷 却备用;
3、接种与培养
在无菌条件下接入1-2环菌种(0.1-0.2ml),用接种针搅匀,松散水平放 入
培养箱中26-30℃培养2-3天。
4、干燥与保藏
在40-45℃条件下干燥2-3天,使物料水份控制在≤6%,用
牛皮纸包好,放 至冰箱中1~4℃冷藏或-16~-20℃冷冻保存,保藏期达到3~5年。
5、菌种复苏方法
将所保藏试管中的物料颗粒,在无菌条件下转入到新鲜斜面培养基上数粒, 放到培养箱中进行适温培养即可。
本发明优选的培养基重量配比为玉米面50~60%,麸皮15~20%,豆粕粉25~ 30%,料水配比1∶0.~1.0。
本发明首先选择适当的培养基及培养条件让微生物在培养物中生长,然后 在较温和的条件下将菌种脱水干燥,由于菌种细胞中
含水量很低,可放入冰箱 中冷藏或冷冻保藏。此方法是将斜面试管保藏、冷冻干燥保藏、和低温保藏结 合起来的一种保藏方法。本法保藏微生物菌种,4℃冷藏可保藏3-4年,-18℃ 冷冻可保藏4-5年。此方法设备投入少,在普通的冰箱就能实现菌种长期保藏, 实用性强,具有操作简单、稳定可靠、成本低廉、保藏期长的特点。
具体实施方式
实施例1
培养基的配制:玉米面60%,麸皮15%,豆粕粉25%,料水比1∶0.85。
将原料按上述比例混合,加入定量的水,分装于试管中,通常试管中装量为 1/3,塞好棉塞,高压灭菌,1.2atm,30~45min,取出趁热摇散,冷却备用。
在无菌条件下接入1-2环菌种(0.1-0.2ml),所保藏的菌种如下:
编号 学名 中文名称 用途 E3-1 Saccharomyces cerevisiae
酿酒酵母 白酒
酿造 E5-2 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 果酒酿造 E4-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母
啤酒酿造 20238 Saccharomyces rouxii Boutr 鲁氏酵母 酱油酿造 20124 Handenula anomala 异常汉逊酵母 白酒生香 R15 Candida utilis 产朊假丝酵母
饲料酵母 S-02 Endomyces decipiens 近似内孢霉 饲料酵母 E2-3 Geotrichum candidum 白地霉 饲料酵母 Ys-01 Bacillus licheniformis 地衣芽胞杆菌 饲料 Ys-02 Bacillus cereus 腊样芽胞杆菌 饲料 As3.951 Aspergillus oryzae 米曲酶 酱油酿造 As3.350 Aspergillus awamori 泡盛曲酶 酱油酿造
用接种针搅匀,松散水平放入培养箱中28-30℃培养2-3天。
在40-45℃条件下干燥2-3天,检测试管中菌种的细胞数。用牛皮纸包好, 放至冰箱中4℃冷藏保存和-18℃冷冻保存。
菌种保藏初始细胞数测定结果
编号 学名 中文名称 细胞数(亿/ 克) E3-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 240 E5-2 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 45 E4-1 Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 22 20238 Saccharomyces rouxii Boutr 鲁氏酵母 36 20124 Handenula anomala 异常汉逊酵母 47 R15 Candida utilis 产朊假丝酵母 68 S-02 Endomyces decipiens 近似内孢霉 88 E2-3 Geotrichum candidum 白地霉 18 Ys-01 Bacillus licheniformis 地衣芽胞杆 45 Ys-02 Bacillus cereus 腊样芽胞杆菌 42 As3.951 Aspergillus oryzae 米曲酶 130 As3.350 Aspergillus awamori 泡盛曲酶 110
4℃冷藏保存结果
4℃条件下不同年限菌种保藏存活率(%)单位:年
编号 中文名称 1年 2年 3年 4年 E3-1 酿酒酵母 87 80 15 0 E5-2 酿酒酵母 85 83 18 0 E4-1 酿酒酵母 92 88 21 0 20238 鲁氏酵母 85 79 20 0 20124 异常汉逊酵母 89 85 24 0 R15 产朊假丝酵母 88 84 31 0 S-02 近似内孢霉 87 79 22 0 E2-3 白地霉 82 68 0 Ys-01 地衣芽胞杆菌 95 88 72 54 Ys-02 腊样芽胞杆菌 95 90 81 62 As3.951 米曲酶 88 80 51 32 As3.350 泡盛曲酶 87 76 43 26
-18℃冷冻保藏结果
-18℃条件下不同年限菌种保藏存活率(%)单位:年
编号 中文名称 1年 2年 3年 4年 5年 E3-1 酿酒酵母 92 88 79 67 53 E5-2 酿酒酵母 95 84 72 63 49 E4-1 酿酒酵母 95 85 75 64 55 20238 鲁氏酵母 94 83 72 61 48 20124 异常汉逊酵母 92 81 68 57 46 R15 产朊假丝酵母 95 87 73 61 42 S-02 近似内孢霉 91 78 66 48 39 E2-3 白地霉 91 75 52 36 0 Ys-01 地衣芽胞杆菌 95 95 87 76 66 Ys-02 腊样芽胞杆菌 95 95 88 79 69 As3.951 米曲酶 92 82 76 65 56 As3.350 泡盛曲酶 94 86 74 63 52