技术领域
[0001] 本
发明涉及一种抗
微生物组合物和一种在乙醇发酵方法中，特别是在用
甘蔗生产乙醇的过程中控制微生物污染的方法。
背景技术
[0002] 尽管在过去几年中人们对发酵方法进行了改进，但对于污染控制仍然没有取得令人满意的效果，因为对进行
压榨和加工成果汁的待发酵的原材料的污染
水平的控制的难度和高成本。
[0003] 如今，甘蔗加工在乙醇生产压榨机中的特性典型地导致细菌小型生物群的出现，4
其通常在发酵果汁中超过10 细胞/ml。此外，同样的果汁，果汁是一个有利于细菌生长的培养基，除了有发酵
酵母酿酒酵母菌，还携带着许多种的细菌污染物，如乳杆菌和野生酵母。
[0004] 污染物的存在可能导致发酵生产率的降低和其他操作问题。例如，野生酵母会与发酵酵母竞争，其从待发酵的果汁中吸收糖但不会将它转
化成乙醇。
[0005] 此外，发酵果汁中存在的细菌、乳杆菌和野生酵母容易引起这些生物体在发酵酵母的周围团聚，从而产生絮凝并削弱发酵酵母的生产能
力。
[0006] 应当进一步观察到，随着在发酵果汁中细菌和乳杆菌
密度的增加，
有机酸的浓度往往变得过高。高的有机酸浓度抑制发酵酵母的增殖，其可以使工业加工厂的生产率降低约10-20％。在污染更严重的情况下，可以观察到乙醇生产率更大的减少。
[0007] 迄今为止，抗生剂已被广泛用于控制发酵果汁的污染。然而，抗生剂的效力通常限于某一类细菌。例如，虽然目前可用的抗生剂能够理想的特异性作用于
革兰氏阳性菌和乳杆菌，但它们对野生酵母的作用则减弱了。因此，使用抗生剂并不能消除由于发酵果汁中存在野生酵母而导致的生产率损失，因为野生酵母与发酵酵母竞争待发酵的果汁中所含的糖。
[0008] 此外，抗生剂在发酵果汁中作用缓慢。抗生剂的这种特点使得在抗生作用的初始阶段野生酵母、细菌和乳杆菌能够生长。相应地，通常需要高用量的抗生剂以控制发酵果汁中细菌和乳杆菌污染物的增长率。此外，随着时间的推移，越来越多的细菌产生了抗生剂耐药性，这可能还需要高用量的抗生剂以获得可接受的生产率水平。
[0009] 抗生剂通常是昂贵的，抗生剂用量的增加可能会带来不可接受程度的发酵成本。而且，抗生剂的更高用量也可引起过敏和其他
疾病，影响方法中该阶段所涉及的操作者。此外，从消费者对由这些产品的发酵方法产生的副产物的日益增长的要求是能够生态友好并对人类和环境没有危害。这转换为一个需求，即产品中的抗生剂的残留量愈来愈少。
[0010] 作为使用抗生剂控制污染物的局限性和不便性的结果，人们已经尝试开发一种能够使以上评述的
缺陷最小化的
试剂，上述缺陷中的一些是能够有效地减少发酵方法中存在的细菌、乳杆菌和野生酵母的负面作用的同时，抗生剂高用量固有的。
[0011] 已知双胍类化合物作为抗微生物剂用于抑制污染物微生物
肿瘤病微生物在
植物上的生长。Ecolab公司的巴西
专利申请PI 0505795-7(对应于北美专利申请US60/640,595)披露了用于减少一系列对象，如柑橘类植物、水果、
种子、鲜切花等上的肿瘤病微生物(例如，柑桔肿瘤病微生物)种群的组合物。根据其
说明书，抗微生物组合物可包含金属抗微生物剂，例如
银离子，和
聚合物，例如聚(六甲双胍)(PHMB)。该组合物具有抑菌和/或杀生物作用，且可通过施用一定量的该抗微生物组合物来帮助控制肿瘤生长并持续足够长时间以减少小型生物群体。
[0012] 然而，在Ecolab公司的组合物中双胍类化合物或聚六甲双胍(PHMB)的作用是强制性地与另一种无机抗微生物剂相关，使其能有效地在“对象”中具有抗微生物功能，在形成组合物的组分的混合物中的某些量的所述试剂用于减少植物病原菌种群。虽然银基无机化合物是
现有技术中已知的，但它们在形成在乙醇发酵方法中控制微生物污染的组合物中的用途在经济上是不可行的，使得现有技术中缺少将其用于从乙醇发酵培养基制得乙醇的启示。
[0013] 聚六甲双胍(PHMB)的另一种应用记载于Elszetin，C.和Morais，M.A.，文章标题为“聚六甲双胍类可以从
燃料乙醇发酵方法中消除污染酵母菌”，发表于J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，(2008)，35：967-973。在这篇文章中，作者检验了聚(六甲双胍)(PHMB)的杀
真菌活性。基于在实验室培养物和工业样品中评估的PHMB对生长抑制和微生物杀灭的作用，作者提议使用200mg/l的PHMB来控制工业规模的主要的
燃料乙醇污染物。
[0014] 根据这篇文章，在从工业生产过程中直接收集的酿酒酵母菌株(JP1和P2)和布鲁塞尔德克氏酵母(D.bruxellensis)的野生酵母的细胞中对PHMB的杀真菌作用进行了检测。虽然这些结果显示，在第971页的表2中，PHMB的存在使得布鲁塞尔德克氏酵母降低至低于1 log(44％)，但结果也表明，在浓度高于20ppm时发酵酵母酿酒酵母PE2对PHMB非常敏感。因此，作者建议将PHMB与高发酵PHMB耐药菌株组合使用。作者还建议在预
发酵容器中单独使用PHMB
杀生物剂，其中使酵母的生物量通气并用稀释的甘蔗汁供养，当它们
接触到
蔗糖和低量的乙醇时可以防止或减少PHMB对酿酒酵母菌细胞的任何负面效应。
[0015] 虽然证明了PHMB在不同应用中作为杀生物剂的活性，但迄今所遇到的解决方案未考虑其中所建议的比例/浓度，就广泛使用的抗生剂类物质和聚(六甲双胍)化合物二者而言，对发酵酵母酿酒酵母菌自身的致命效应。
[0016] 近日，国际专利申请WO 2009/001205A2披露了一种生产发酵型产品，尤其是乙醇的方法，包括在一种添加剂如胍类化合物如PHMB，单独地或与其他有机杀生物剂如脂肪族和芳香族单
醛和二醛等存在下用酵母发酵含糖培养基，以减少或控制含糖培养基中的细菌群落。
[0017] 虽然可用的现有技术对发酵培养基中的微生物的控制和副产物(干酵母)中的抗生剂残留量的减少可以取得良好效果，然而现有的组合物或方法没有一个可以取得在增加发酵培养基中的野生酵母、乳杆菌和其他细菌的清除率的同时增加酿酒酵母的保存率，以便在发酵过程中提供意想不到的生产率。
[0018] 已知方法中的另一个缺陷是由酸的使用带来的，使用的酸用于处理压榨机接收的混合汁液，并用于处理果汁负荷的发酵中剩余的酵母以清除在发酵过程后仍然存活的细菌，从而使酵母得以在新负荷的果汁的发酵中使用。酸的使用有一系列的缺点，如需要提供耐酸
腐蚀的设备，与处理重复使用的酵母中剩余的大量细菌所需的更大量的酸相关的成本的增加，这种酸输入的毒性，和需要从发酵过程中的副产物(干酵母)中清除酸，特别是当用于生产动物的口粮时。
[0019] 已知的乙醇发酵工业生产方法在以经济上可行的方式，满足所有新的当前的需求上无一获得成功，这些需求与发酵方法的效率、用于该方法中抗生剂负荷的减少、副产物(干酵母)中残留的细菌和抗生剂的水平相关，并且也与减少用于处理酵母的酸(通常为
硫酸)用量相关，由于在其中会发现残留的细菌。
[0020] 发明概述
[0021] 鉴于现有技术的局限性，本发明的目的是提供一种抗微生物组合物，其可应用于生产乙醇的发酵桶中所含的果汁，用于控制发酵下的原料中存在的野生酵母、乳杆菌和细菌的污染，防止发酵酵母与所述污染微生物竞争培养基上可得到的营养物，并提高发酵方法的生产率和在发酵培养基中减少抗生剂的负荷。
[0022] 本发明的抗微生物组合物包含胍家族的抗微生物剂，例如聚六甲双胍(PHMB)，抗生剂和
表面活性剂，其用量足以充分控制待发酵果汁中所含的野生酵母、乳杆菌和细菌小型生物群；在所述果汁中产生反絮凝作用；并防止发酵酵母与污染物小型生物群竞争待发酵果汁中含有的糖。
[0023] 本发明进一步涉及一种在乙醇发酵培养基中控制微生物污染的方法，以便获得发酵产生的乙醇和/或其他产品，向待发酵果汁中加入足量的上述杀生物剂、抗生剂和表面活性剂，并充分控制待发酵果汁中所含的野生酵母、乳杆菌和细菌小型生物群；在所述果汁中产生反絮凝作用；并防止发酵酵母与上述污染物竞争待发酵果汁中含有的糖。
[0024] 另一方面，目前已知的由发酵过程结束后收回并加工以重新加入至新的发酵中的干酵母负荷的事实带来的处理呈现对抗生作用具有抗性的细菌负荷，需要使其失效，以便在新的发酵批次中不被重新引入。
[0025] 由于上述试剂的联合作用，使用的没有微生物污染的发酵酵母的性能得到改善，且关于污染，该酵母中含有的细菌的数量将减少或不含细菌，从而减少用于处理干酵母中残留细菌的酸(通常为硫酸)的必需量，其中酸是压榨中的难题。
[0026] 发明详述
[0027] 上述的总目的之一可通过提供抗微生物组合物来达到，该组合物含有：从约1％至约5％重量的胍家族的抗微生物剂，例如聚六甲双胍(PHMB)；从约0.05％至约0.5％重量的抗生剂；和从约98.95％至约94.5％重量的表面活性剂。
[0028] 抗生剂通常根据发酵果汁的特征和在所述果汁中发现的污染微生物污染物的小生物群，以及原料加入发酵桶前的环境来进行选择。
[0029] 考虑到甘蔗果汁(“garapa”)的发酵，形成本发明的抗微生物组合物所用的抗生剂可以是一种离子载体，选自维吉霉素、青霉素、青霉素V、克林霉素、丙
氨酸、β-内酰胺类、
四环素和优选地莫能菌素，如已知的来自Elanco公司的商品名为Kamoran的抗生素，以组合物的重量百分比计，如上文所述。
[0030] 本申请组合物中使用的杀生物剂，以上文定义的百分比计，是一种胍家族的抗微生物剂，聚六甲双胍(PHMB)，其杀生物/杀菌功能是现有技术中已知的。本申请使用的PHMB是商业上已知的“Vantocil IB”，由本申请的
申请人制造。
[0031] 为了更加提高的发酵方法的效率，抗微生物组合物包含合适的非离子型表面活性剂，包括烷
氧基化醇类，优选乙氧基化醇类。
[0032] 特别地，适当的非离子型表面活性剂活性化合物可以大致描述为通过天然(天然存在)的亲水性环氧烷
烃与有机疏水性化合物的缩合产生的化合物，其中有机疏水性化合物可以是天然(天然存在)的脂肪族或烷基芳族化合物。与任何特殊的疏水基缩合的亲水的或聚氧化亚烷基的长度可以很容易地调节，以产生符合预期的亲水性和疏水性成分之间的平衡程度的
水溶性化合物。优选的烷氧基化醇类选自下列通式的乙氧基化醇类：R-(OCH2CH2)-N-OH，其中R是直链或支链的，C8-C18是烷基或羟烷基且N平均为1-14。在本发明中使用的合适的醇类包括，例如，
椰子油脂肪醇和/或聚乙二醇醚，优选Clariant公司生产的商业名称为“Genapol”的产品，也可使用阳离子表面活性剂，两性表面活性剂和其他非离子型表面活性剂。
[0033] 应当理解，不同类型的表面活性剂可用于增加活性杀生物剂的分散度、果汁中发酵酵母的抗絮凝程度和所述酵母与糖的接触面积。
[0034] 使用上文定义的浓度的抗生剂和PHMB使得PHMB对发酵酵母菌无害，但对发酵果汁中含有的野生酵母和污染细菌(乳杆菌属和Acrobacter属)有效，施用所述组合物后能够立即控制污染物。
[0035] 作为控制手段的抗微生物组合物中的PHMB，以适当的有限浓度，以避免其对发酵酵母的有害作用，使得该杀生物剂对该野生酵母且甚至对大量的对其杀菌作用敏感的污染细菌快速地起作用，防止所述污染物与生产性酵母竞争发酵果汁中的营养物(糖类)。
[0036] 这种PHMB对野生酵母和对污染细菌的作用的一个重要方面基于以下事实：这种作用是在施用该组合物后即刻的，即，不到五分钟，PHMB就发挥其杀生物/杀菌作用，引起野生酵母的减少并控制对其作用敏感的细菌，且防止所述污染物的增殖和减少其对发酵酵母的团聚作用。
[0037] 由于PHMB对污染微生物的即刻作用，野生酵母菌和污染细菌的作用和增殖被中断，与PHMB的作用相比，要通过抗生剂的特异性作用减少细菌数量表现出相当慢的作用，其从约3至5小时。因此，将要携带到发酵方法中抗生剂的负荷可实质性地减少至与残留在发酵果汁中的细菌小型生物群一致的值。
[0038] 此外，根据抗微生物剂和抗生剂对待发酵果汁中含有的污染物小型生物群的作用，应当注意到，该组合物中的表面活性剂的存在使获得了在待发酵果汁中的解团聚作用，提供不仅发酵酵母的颗粒而且污染物小型生物群的颗粒的分离。这种解团聚增加发酵酵母与果汁(糖)之间的接触表面积，还增加污染物与抗微生物剂和抗生剂之间的接触表面积，使试剂对污染物小型生物群作用增加，也使酵母的发酵效率更好，增加了发酵方法的生产率。
[0039] 本申请抗微生物组合物可能的配方包括从约1％到约5％重量的胍家族的抗微生物剂，聚六甲双胍(PHMB)；从约0.05％到约0.5％重量的抗生剂；和从约98.95％至约94.5％重量的表面活性剂，考虑到所述组合物的建议剂量是在约为发酵果汁的负荷的0.052％重量或520ppm。
[0040] 本发明的另外一个目的是提供一种在乙醇发酵方法中，特别是在源自甘蔗发酵的乙醇和/或其他产品的生产中控制微生物污染的方法。该方法包括向发酵果汁加入以占发酵果汁负载的重量计下列量的试剂的步骤：约5ppm至约26ppm的胍家族抗微生物剂，例如聚(六甲双胍)(PHMB)；约0.26ppm至约2.6ppm的抗生剂，如先前对抗微生物组合物的配方所定义，且进一步地，约491ppm至约514ppm的表面活性剂，选自先前定义的与抗微生物组合物有关的组。
[0041] 除了抗生剂负荷的明显减少带来的巨大经济和环境效益，本控制组合物中的PHMB的提供从发酵过程的开始就减少发酵酵母中野生酵母和细菌小型生物群的团聚，削弱了酵母与果汁中的营养物质(糖)的接触和发酵方法的生产率。
[0042] 此外，由于本申请组合物的表面活性剂与PHMB和抗生剂的联合作用，避免了在发酵果汁中的絮凝，使发酵酵母与果汁中含有的营养物质(糖)高度接触，提高了发酵方法的效率。
[0043] 由于上述描述的本发明组合物，发酵酵母的性能得到改善。此外，干酵母中的细菌数量将减少或不含细菌，从而减少了在处理干酵母中的硫酸用量。
[0044] 以上描述的在乙醇发酵过程中控制微生物污染的三种组分的使用可通过本申请抗微生物组合物进行，或是粉末、凝胶、膏，液体、丸剂或片剂的形式，或者也可以将该组分单独地添加至发酵果汁中。
[0045] 下表显示在本乙醇发酵方法中的组合物的性能，与发酵果汁中的发酵酵母、野生酵母、乳杆菌和细菌的减少的结果有关。
[0046] 表1
[0047]
[0048] 上表1显示了使用下列物质处理时在发酵果汁中的发酵酵母、野生酵母、乳杆菌和其他细菌的减少：只使用抗生剂(Kamoran)；包含该抗生剂(Kamoran)和抗微生物剂(PHMB)的组合物；和包含该抗生剂(Kamoran)、抗微生物剂(PHMB)和表面活性剂(Genapol)的组合物。
[0049] 可以观察到，只使用抗生剂(Kamoran)，用量为发酵中的果汁负荷的3ppm(样品1)，其结果，与对照样品4相比，减少了约1log的发酵酵母；约3log的野生酵母；约4log的乳杆菌和约2log的其他细菌。可见，抗生作用对于实质地和肯定地减少污染物小型生物群是有效的，但是也导致了发酵酵母不希望的减少，没有使得发酵方法的效率提高。
