胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR‑T细胞及其制备方法和应用
阅读：581发布：2023-02-25
专利汇可以提供胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR‑T细胞及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR‑T细胞，包括如下细胞：胆固醇转酯酶SOAT1基因DNA 水 平敲除的表达hCAR19受体的T细胞；胆固醇转酯酶SOAT1基因mRNA水平敲减的表达hCAR19受体的T细胞；胆固醇转酯酶SOAT1基因在 蛋白质 水平受到 抑制剂 抑制作用的表达hCAR19受体的T细胞。本发明还公开了该胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR‑T细胞的制备方法以及该CAR‑T细胞在制备 肿瘤 的细胞 治疗 药物中的应用。通过一系列的临床前实验表明，胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR‑T细胞有着超越CAR‑T细胞的杀伤能 力 ，在肿瘤的细胞治疗中拥有极高的应用价值。，下面是胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR‑T细胞及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞，其特征在于，包括如下细胞：
胆固醇转酯酶SOAT1基因DNA水平敲除的表达hCAR19受体的T细胞，即hCAR19-KOSOAT1-T细胞；
胆固醇转酯酶SOAT1基因mRNA水平敲减的表达hCAR19受体的T细胞，即hCAR19-shRNASOAT1-T细胞；
胆固醇转酯酶SOAT1基因在蛋白质水平受到抑制剂抑制作用的表达hCAR19受体的T细胞，即hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞。
2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述胆固醇转酯酶SOAT1基因DNA水平敲除的表达hCAR19受体的T细胞，采用的DNA水平敲除方法通过Cas9、ZFN、或TALEN基因敲除方法来实现。
3.如权利要求2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述采用的DNA水平敲除方法通过Cas9基因敲除方法来实现，具体为：通过对人SOAT1外显子序列分析，首先，选定基因敲除的位点；随后，通过target length、GC percentage、PAM pattern、Potential off-target site筛选条件，最终选出6条target序列及一条negative control序列，具体序列如下：
6条target序列如下：
SOAT1-target1-F：如SEQ ID NO.4所示；
SOAT1-target1-R：如SEQ ID NO.5所示；
SOAT1-target2-F：如SEQ ID NO.6所示；
SOAT1-target2-R：如SEQ ID NO.7所示；
SOAT1-target3-F：如SEQ ID NO.8所示；
SOAT1-target3-R：如SEQ ID NO.9所示；
SOAT1-target4-F：如SEQ ID NO.10所示；
SOAT1-target4-R：如SEQ ID NO.11所示；
SOAT1-target5-F：如SEQ ID NO.12所示；
SOAT1-target5-R：如SEQ ID NO.13所示；
SOAT1-target6-F：如SEQ ID NO.14所示；
SOAT1-target6-R：如SEQ ID NO.15所示；
一条negative control序列如下：
SOAT1-target7-F：如SEQ ID NO.16所示；
SOAT1-target7-R：如SEQ ID NO.17所示；
上述任一所示核苷酸序列或具有与上述任一所示核苷酸序列>＝80％同源性的核苷酸序列用于慢病毒表达载体上，或用于逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或其它类型的表达载体上。
4.如权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的target序列为如下序列：
SOAT1-target3-F：如SEQ ID NO.8所示；SOAT1-target3-R：如SEQ ID NO.9所示。
5.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述胆固醇转酯酶SOAT1基因mRNA水平敲减的表达hCAR19受体的T细胞，采用的mRNA水平敲减方法，通过对人SOAT1mRNA序列分析，首先，通过siRNA pattern、GC percentage、T or A or G in a row、consecutiver GC、3’end nt pattern筛选条件，设计出一批候选序列；其次，对候选序列进行BLAST，通过thermodynamic value、siRNA target、identity、alignment筛选条件，最终选出12条siRNA序列及一条negative control序列，具体序列如下：
12条siRNA序列如下：
shRNA1SOAT1-F：如SEQ ID NO.25所示；
shRNA1SOAT1-R：如SEQ ID NO.26所示；
shRNA2SOAT1-F：如SEQ ID NO.27所示；
shRNA2SOAT1-R：如SEQ ID NO.28所示；
SOAT1
shRNA3 -F：如SEQ ID NO.29所示；
shRNA3SOAT1-R：如SEQ ID NO.30所示；
shRNA4SOAT1-F：如SEQ ID NO.31所示；
shRNA4SOAT1-R：如SEQ ID NO.32所示；
SOAT1
shRNA5 -F：如SEQ ID NO.33所示；
shRNA5SOAT1-R：如SEQ ID NO.34所示；
shRNA6SOAT1-F：如SEQ ID NO.35所示；
shRNA6SOAT1-R：如SEQ ID NO.36所示；
SOAT1
shRNA7 -F：如SEQ ID NO.37所示；
shRNA7SOAT1-R：如SEQ ID NO.38所示；
shRNA8SOAT1-F：如SEQ ID NO.39所示；
shRNA8SOAT1-R：如SEQ ID NO.40所示；
shRNA9SOAT1-F：如SEQ ID NO.41所示；
shRNA9SOAT1-R：如SEQ ID NO.42所示；
shRNA10SOAT1-F：如SEQ ID NO.43所示；
shRNA10SOAT1-R：如SEQ ID NO.44所示；
shRNA11SOAT1-F：如SEQ ID NO.45所示；
shRNA11SOAT1-R：如SEQ ID NO.46所示；
shRNA12SOAT1-F：如SEQ ID NO.47所示；
shRNA12SOAT1-R：如SEQ ID NO.48所示；
一条negative control序列如下：
shRNA13SOAT1-F：如SEQ ID NO.49所示；
shRNA13SOAT1-R：如SEQ ID NO.50所示；
上述任一所示核苷酸序列或具有与上述任一所示核苷酸序列>＝80％同源性的核苷酸序列用于慢病毒表达载体上，或用于逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或其它类型的表达载体上。
6.如权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的siRNA序列为如下序列：
shRNA6SOAT1-F：如SEQ ID NO.35所示；
shRNA6SOAT1-R：如SEQ ID NO.36所示。
7.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述抑制剂选自Avasimibe、Cyclandelate、Saracatinib中的一种或几种的组合。
8.如权利要求1-7任一项所述的胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从供者提供的外周血中分离PBMC；
(2)使用磁珠分离T细胞，目的抗体激活T细胞；
(3)采用hCAR19重组慢病毒载体以及SOAT1敲除重组慢病毒载体共同转导进入T细胞，产生hCAR19-KOSOAT1-T细胞；或者采用hCAR19重组慢病毒载体将hCAR19-shRNASOAT1基因转导进入T细胞，产生hCAR19-shRNASOAT1-T细胞；或者采用hCAR19重组慢病毒载体将hCAR19基因转导进入T细胞，并用抑制剂诱导产生hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞；
SOAT1 SOAT1 SOAT1
(4)hCAR19-KO -T、hCAR19-shRNA -T、hCAR19-Inhibitor -T细胞体外培养；
(5)hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞大量扩增；
(6)hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞最终收集、冻存以及功能检测。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述hCAR19重组慢病毒载体是重组后的复制缺陷型慢病毒载体，能将外源片段整合入宿主基因，一次性使用；所述hCAR19重组慢病毒载体是二代或者三代的慢病毒转基因载体；所述hCAR19重组慢病毒载体是靶向CD19抗原的hCAR19慢病毒转基因载体，hCAR19重组慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hCAR19重组慢病毒载体将CD19抗原识别区、CAR锚定区、共刺激因子区、细胞激活区共同组成的CAR嵌合受体表达在CIK细胞和T细胞的表面，当抗原识别区与CD19抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞一系列生物学效应。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述CAR嵌合受体中的共刺激因子区域选自4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、、TNFRSF13B、TNFRSF18等肿瘤坏死因子超家族中的一种或多种的任意组合。
11.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述hCAR19重组慢病毒载体包括CD19单链抗体的轻链VL和CD19单链抗体重链VH；所述CD19单链抗体的轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列有大于等于90％同源性的核苷酸序列；所述CD19单链抗体重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列有大于等于90％同源性的核苷酸序列；所述CD19单链抗体的轻链VL和CD19单链抗体重链VH经过人源化抗体优化。
12.一种如权利要求1-7任一项所述的胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞在制备肿瘤的细胞治疗药物中的应用。
胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于医学生物领域，具体涉及一种针对肿瘤免疫治疗的CAR-T细胞，尤其涉及胆固醇转脂酶SOAT1(sterol O-acyltransferase 1，gene ID:6646)被抑制的CAR-T细胞。此外，本发明还涉及该细胞的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。
[0003] 2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、效应区等共同组成的嵌合分子，导入T细胞基因组内，从而使T细胞对靶细胞的识别、信号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[Eleanor J.Cheadle,et al.CAR T cells:driving the road from the laboratory to the clinic.Immμnological Reviews 2014.Vol.257:91–106]。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。
[0004] CAR-T目前在在治疗B-ALL等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是在骨髓瘤、淋巴瘤甚至实体瘤方面，目前治疗效果不是很好，主要原因可能有以下几点：一、以氧化应激，营养缺乏，酸性pH值以及缺氧为主特征的肿瘤微环境；二、肿瘤细胞分泌的免疫抑制性因子的存在；三、抑制性免疫细胞的抑制作用，例如调节性T细胞(Treg)、髓养前体抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、未成熟的树突状细胞(iDC)等等；四、T细胞固有的免疫检查点调节机制。因此，增强CAR-T细胞的治疗活性成为了CAR-T细胞免疫治疗术走向下一个胜利的关键。
[0005] 通过对过继性T细胞免疫治疗(Adoptive T-cell Immunotherapy)中的肿瘤浸润性T细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的研究表明，当T细胞在肿瘤组织中被激活后，细胞内的合成代谢将十分旺盛，以适应急剧增加的物质和能量需求[Kidani Y,Elsaesser H,Hock MB,et al.Sterol regulatory element-binding proteins are essential for the metabolic programming of effector T cells and adaptive immunity.[J].Nature immunology,2013,14(5):489-499.]。作为细胞代谢中的重要组份，多种脂质合成代谢通路在激活的T细胞中重新编程并迅速上调[Bensinger SJ,Bradley MN,Joseph SB,et al.LXR signaling couples sterol metabolism to proliferation in the acquired immune response.[J].Cell,2008,134(1):97-111.]。早期的同位素富集(isotopomer-enrichment)实验证实激活的淋巴细胞可以导致其内胆固醇和脂肪酸的快速合成。在培养基中添加胆固醇替代物(Oxysterols)可以减弱脂质合成代谢并使细胞停滞在G1期，说明脂质代谢可影响细胞增殖。
[0006] 胆固醇是细胞脂质代谢中的重要成分。它具有调节胞膜表面的信号传递、组成脂伐等相关功能区域、影响细胞膜流动性等重要作用(如图2所示)[Wu W,Shi X,Xu C.Regulation of T cell signalling by membrane lipids.[J].Nature reviews.Immunology,2016,16(11):690-701.]。在激活的T细胞中，尤其是CD8+T细胞中，脂质代谢增强、胆固醇合成增多[Lochner M,Berod L,Sparwasser T.Fatty acid
metabolism in the regulation of T cell function.[J].Trends in immunology,
2015,36(2):81-91.]；而降低细胞内胆固醇含量，会导致T细胞功能减退[Kritchevsky SB,Kritchevsky D.Serum cholesterol and cancer risk:an epidemiologic perspective.[J].Annual review of nutrition,1992,12:391-416.]。
metabolism in the regulation of T cell function.[J].Trends in immunology,
2015,36(2):81-91.]；而降低细胞内胆固醇含量，会导致T细胞功能减退[Kritchevsky SB,Kritchevsky D.Serum cholesterol and cancer risk:an epidemiologic perspective.[J].Annual review of nutrition,1992,12:391-416.]。
发明内容
[0007] 本发明要解决的技术问题之一是提供胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞，该胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞有着超越CAR-T细胞的杀伤能力，在肿瘤免疫治疗领域有着巨大的应用价值。
[0008] 本发明要解决的技术问题之二是提供该胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞的制备方法，该方法能够制备出存活时间长、杀伤效果好、副作用小的用于临床级别的治疗性细胞。
[0009] 本发明要解决的技术问题之三是提供该胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞在制备肿瘤的细胞治疗药物中的应用。
[0010] 本发明所采用的增强CAR-T细胞的治疗活性的方法，是通过抑制脂质合成代谢通路中胆固醇转脂酶SOAT1(sterol O-acyltransferase 1，gene ID:6646)发挥功能，从而限制了胆固醇转化为胆固醇酯的速率，增加了细胞内胆固醇的含量，通过一系列的临床前实验表明，胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞有着超越CAR-T细胞的杀伤能力，在肿瘤免疫治疗领域有着巨大的应用价值。
[0011] 嵌合抗原受体(CAR)是CAR的核心部件(如图1所示)，赋予免疫细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的免疫细胞相较于天然免疫细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tμmor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性来是关键的决定因素。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0013] 在本发明的第一方面，提供胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞，包括如下细胞：
[0014] 胆固醇转酯酶SOAT1基因DNA水平敲除的表达hCAR19受体的T细胞，即hCAR19-KOSOAT1-T细胞；
[0015] 胆固醇转酯酶SOAT1基因mRNA水平敲减的表达hCAR19受体的T细胞，即hCAR19-shRNASOAT1-T细胞；
[0017] 作为本发明优选的技术方案，所述胆固醇转酯酶SOAT1基因DNA水平敲除的表达hCAR19受体的T细胞，采用的DNA水平敲除方法通过Cas9、ZFN、或TALEN基因敲除方法来实现。
[0018] 作为本发明优选的技术方案，所述采用的DNA水平敲除方法通过Cas9基因敲除方法来实现，具体为：通过对人SOAT1外显子序列分析，首先，选定基因敲除的位点；随后，通过target length、GC percentage、PAM pattern、Potential off-target site筛选条件，最终选出6条target序列及一条negative control序列，具体序列如下：
[0019] 6条target序列如下：
[0020] SOAT1-target1-F：如SEQ ID NO.4所示；SOAT1-target1-R：如SEQ ID NO.5所示；SOAT1-target2-F：如SEQ ID NO.6所示；SOAT1-target2-R：如SEQ ID NO.7所示；SOAT1-target3-F：如SEQ ID NO.8所示；SOAT1-target3-R：如SEQ ID NO.9所示；SOAT1-target4-F：如SEQ ID NO.10所示；SOAT1-target4-R：如SEQ ID NO.11所示；SOAT1-target5-F：如SEQ ID NO.12所示；SOAT1-target5-R：如SEQ ID NO.13所示；SOAT1-target6-F：如SEQ ID NO.14所示；SOAT1-target6-R：如SEQ ID NO.15所示；
[0021] 一条negative control序列如下：
[0022] SOAT1-target7-F：如SEQ ID NO.16所示；SOAT1-target7-R：如SEQ ID NO.17所示；
[0023] 上述任一所示核苷酸序列或具有与上述任一所示核苷酸序列>＝80％同源性(优选地，>＝90％同源性；等优选地，>＝95％同源性；最优选地，>＝97％同源性)的核苷酸序列用于慢病毒表达载体上，或用于逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或其它类型的表达载体上。
[0024] 所述选出的target序列优选为如下序列：
[0025] SOAT1-target3-F：如SEQ ID NO.8所示；SOAT1-target3-R：如SEQ ID NO.9所示。
[0026] 作为本发明优选的技术方案，所述胆固醇转酯酶SOAT1基因mRNA水平敲减的表达hCAR19受体的T细胞，采用的mRNA水平敲减方法，通过对人SOAT1mRNA序列分析，首先，通过siRNA pattern、GC percentage、T or A or G in a row、consecutiver GC、3’end nt pattern筛选条件，设计出一批候选序列；其次，对候选序列进行BLAST，通过thermodynamic value、siRNA target、identity、alignment筛选条件，最终选出12条siRNA序列及一条negative control序列，具体序列如下：
[0027] 12条siRNA序列如下：
[0028] shRNA1SOAT1-F：如SEQ ID NO.25所示；shRNA1SOAT1-R：如SEQ ID NO.26所示；shRNA2SOAT1-F：如SEQ ID NO.27所示；shRNA2SOAT1-R：如SEQ ID NO.28所示；shRNA3SOAT1-F：如SEQ ID NO.29所示；shRNA3SOAT1-R：如SEQ ID NO.30所示；shRNA4SOAT1-F：如SEQ ID NO.31所示；shRNA4SOAT1-R：如SEQ ID NO.32所示；shRNA5SOAT1-F：如SEQ ID NO.33所示；shRNA5SOAT1-R：如SEQ ID NO.34所示；shRNA6SOAT1-F：如SEQ ID NO.35所示；shRNA6SOAT1-R：如SEQ ID NO.36所示；shRNA7SOAT1-F：如SEQ ID NO.37所示；shRNA7SOAT1-R：如SEQ ID NO.38所示；
shRNA8SOAT1-F：如SEQ ID NO.39所示；shRNA8SOAT1-R：如SEQ ID NO.40所示；shRNA9SOAT1-F：如SEQ ID NO.41所示；shRNA9SOAT1-R：如SEQ ID NO.42所示；shRNA10SOAT1-F：如SEQ ID NO.43所示；shRNA10SOAT1-R：如SEQ ID NO.44所示；shRNA11SOAT1-F：如SEQ ID NO.45所示；
SOAT1 SOAT1 SOAT1
shRNA11 -R：如SEQ ID NO.46所示；shRNA12 -F：如SEQ ID NO.47所示；shRNA12 -R：如SEQ ID NO.48所示；
shRNA8SOAT1-F：如SEQ ID NO.39所示；shRNA8SOAT1-R：如SEQ ID NO.40所示；shRNA9SOAT1-F：如SEQ ID NO.41所示；shRNA9SOAT1-R：如SEQ ID NO.42所示；shRNA10SOAT1-F：如SEQ ID NO.43所示；shRNA10SOAT1-R：如SEQ ID NO.44所示；shRNA11SOAT1-F：如SEQ ID NO.45所示；
SOAT1 SOAT1 SOAT1
shRNA11 -R：如SEQ ID NO.46所示；shRNA12 -F：如SEQ ID NO.47所示；shRNA12 -R：如SEQ ID NO.48所示；
[0029] 一条negative control序列如下：
[0030] shRNA13SOAT1-F：如SEQ ID NO.49所示；shRNA13SOAT1-R：如SEQ ID NO.50所示；
[0031] 上述任一所示核苷酸序列或具有与上述任一所示核苷酸序列>＝80％同源性(优选地，>＝90％同源性；等优选地，>＝95％同源性；最优选地，>＝97％同源性)的核苷酸序列用于慢病毒表达载体上，或用于逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或其它类型的表达载体上。
[0032] 所述选出的siRNA序列优选为如下序列：
[0033] shRNA6SOAT1-F：如SEQ ID NO.35所示；shRNA6SOAT1-R：如SEQ ID NO.36所示。
[0034] 作为本发明优选的技术方案，所述抑制剂选自Avasimibe、Cyclandelate、Saracatinib中的一种或几种的组合。
[0035] 在本发明的第二方面，提供所述的胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞的制备方法，如图3所示，hCAR19-KOSOAT1-T细胞、hCAR19-shRNASOAT1-T细胞、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的构建策略，包括如下步骤：
[0036] (1)从供者提供的外周血中分离Peripheral Blood Mononuclear Cell(PBMC)；
[0037] (2)使用磁珠分离T细胞，目的抗体激活T细胞；
[0038] (3)采用hCAR19重组慢病毒载体以及SOAT1敲除重组慢病毒载体共同转导进入T细胞，产生hCAR19-KOSOAT1-T细胞；或者采用hCAR19重组慢病毒载体将hCAR19-shRNASOAT1基因转导进入T细胞，产生hCAR19-shRNASOAT1-T细胞；或者采用hCAR19重组慢病毒载体将hCAR19基因转导进入T细胞，并用抑制剂诱导产生hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞；
[0039] (4)hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞体外培养；
[0040] (5)hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞大量扩增；
[0041] (6)hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞最终收集、冻存以及功能检测。
[0042] 作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述hCAR19重组慢病毒载体是重组后的复制缺陷型慢病毒载体，能将外源片段整合入宿主基因，一次性使用，无法复制和增殖，安全可靠；所述hCAR19重组慢病毒载体是二代或者三代的慢病毒转基因载体；所述hCAR19重组慢病毒载体是靶向CD19抗原的hCAR19慢病毒转基因载体，hCAR19重组慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hCAR19重组慢病毒载体将CD19抗原识别区、CAR锚定区、共刺激因子区、细胞激活区共同组成的CAR嵌合受体表达在CIK细胞和T细胞的表面，当抗原识别区与CD19抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等一系列生物学效应。本发明中的CAR嵌合受体结构以及hCAR19重组慢病毒载体结构及其制备方法已经公开在发明名称为“一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用”，专利申请号为201610008360.5的专利申请说明书中。
[0043] 作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述CAR嵌合受体中的共刺激因子区域选自4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、、TNFRSF13B、TNFRSF18等肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)中的一种或多种的任意组合。能够增加转导后细胞的存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。
[0044] 作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述hCAR19重组慢病毒载体包括CD19单链抗体的轻链VL和CD19单链抗体重链VH；所述CD19单链抗体的轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列有大于等于90％同源性的核苷酸序列；所述CD19单链抗体重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列有大于等于90％同源性的核苷酸序列；所述CD19单链抗体的轻链VL和CD19单链抗体重链VH经过人源化抗体优化。
[0045] 在本发明的第三方面，提供上述胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞在制备肿瘤的细胞治疗药物中的应用。
[0046] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0047] 本发明是针对脂质合成代谢通路中的胆固醇转脂酶SOAT1(sterol O-acyltransferase 1，gene ID:6646)，分别在DNA水平、mRNA水平和蛋白质水平抑制了SOAT1发挥功能，从而限制了胆固醇转化为胆固醇酯的速率，增加了细胞内胆固醇的含量，增强了CAR-T细胞的治疗活性，通过一系列的临床前实验表明，胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞有着超越CAR-T细胞的杀伤能力。
[0048] 本发明使用的SOAT1引导RNA，经过精心设计筛选，能够引导cas9核酸酶对SOAT1的基因有较好的切割作用。
[0049] 本发明使用的SOAT1 shRNA，经过精心设计筛选，对SOAT1的mRNA有良好的抑制作用。
[0050] 本发明所采用的增强CAR-T细胞的治疗活性的方法，能够调节T细胞亚型比例，提高CD8+细胞在最终产品中的比例。
[0052] 本发明所述的CD19单链抗体轻链VL、CD19单链抗体重链VH经过人源化优化，避免了进入人体后产生HAMA，增加CAR-T细胞的存在时间。
[0053] 本发明提供的hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的制备方案，经过本公司长时间的摸索和优化，能够制备出存活时间长、杀伤效果好、副作用小的用于临床级别的治疗性细胞。
[0054] 本发明通过将CAR元件转导进入T细胞，使得T细胞表面增加了具有靶向功能的嵌合抗原受体，给T细胞增加了特异性杀伤的功能，使得CAR-T应用价值大大提高。
[0055] 本发明中使用的共刺激因子的一种或若干种组合，能够增加转导后细胞的存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。
[0056] 本发明采用的hCAR19-KOSOAT1-T、hCAR19-shRNASOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞由GMP级别的车间生产后，可用于人体临床实验。
[0058] 图1为本发明所述的CAR的示意图，其中，图1A是CAR的基本结构图，图1B是CAR的代次改进示意图；
[0059] 图2为本发明背景技术所述的胆固醇在膜蛋白聚集中的作用示意图；
[0060] 图3为本发明所述的SOAT1功能阻断的三种策略(基因敲除、mRNA干扰和抑制剂抑制酶的催化)示意图；
[0061] 图4为本发明实施例1所述的hCAR19-KOSOAT1-T细胞构建步骤(包含基因敲除载体设SOAT1计、基因敲除载体质粒构建和病毒包装、基因转导、体外培养、hCAR19-KO -T细胞鉴定等阶段)的流程示意图；
[0062] 图5为本发明实施例2所述的hCAR19-shRNASOAT1-T细胞构建的步骤(包含基因敲减载体设计、基因敲减载体质粒构建和病毒包装、基因转导、体外培养、hCAR19-shRNASOAT1-T细胞鉴定等阶段)的流程示意图；
[0063] 图6为本发明实施例3所述的hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞构建的步骤(包含分离培养、加药抑制、基因转导、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞鉴定等阶段)的流程示意图；
[0064] 图7为本发明实施例1中SOAT1敲除重组慢病毒质粒pCas9-SOAT1-1～pCas9-SOAT1-7的测序比对结果示意图；其中，A是pCas9-SOAT1-1的测序比对结果；B是pCas9-SOAT1-2的测序比对结果；C是pCas9-SOAT1-3的测序比对结果；D是pCas9-SOAT1-4的测序比对结果；E是pCas9-SOAT1-5的测序比对结果；F是pCas9-SOAT1-6的测序比对结果；G是pCas9-SOAT1-7的测序比对结果；
[0065] 图8为本发明实施例1中SOAT1敲除重组慢病毒lvCas9-SOAT1-1～lvCas9-SOAT1-7的滴度检测结果示意图；
[0066] 图9为本发明实施例1中hCAR19-KO1SOAT1-T～hCAR19-KO7SOAT1的SOAT1敲除检测结果示意图；
[0067] 图10为本发明实施例2中SOAT1重组敲减慢病毒质粒p-hCAR19-shRNA1SOAT1～p-SOAT1 SOAT1hCAR19-shRNA13 的测序比对结果示意图；其中，A是p-hCAR19-shRNA1 的测序比对结果；B是p-hCAR19-shRNA2SOAT1的测序比对结果；C是p-hCAR19-shRNA3SOAT1的测序比对结果；D是p-hCAR19-shRNA4SOAT1的测序比对结果；E是p-hCAR19-shRNA5SOAT1的测序比对结果；F是p-hCAR19-shRNA6SOAT1的测序比对结果；G是p-hCAR19-shRNA7SOAT1的测序比对结果；H是p-SOAT1 SOAT1
hCAR19-shRNA8 的测序比对结果；I是p-hCAR19-shRNA9 的测序比对结果；J是p-
hCAR19-shRNA10SOAT1的测序比对结果；K是p-hCAR19-shRNA11SOAT1的测序比对结果；L是p-hCAR19-shRNA12SOAT1的测序比对结果；M是p-hCAR19-shRNA13SOAT1的测序比对结果；
hCAR19-shRNA8 的测序比对结果；I是p-hCAR19-shRNA9 的测序比对结果；J是p-
hCAR19-shRNA10SOAT1的测序比对结果；K是p-hCAR19-shRNA11SOAT1的测序比对结果；L是p-hCAR19-shRNA12SOAT1的测序比对结果；M是p-hCAR19-shRNA13SOAT1的测序比对结果；
[0068] 图11为本发明实施例2中SOAT1敲减重组慢病毒lv-hCAR19-shRNA1SOAT1～lv-hCAR19-shRNA13SOAT1的滴度检测结果示意图；
[0069] 图12为本发明实施例2中hCAR19-shRNA1SOAT1-T～hCAR19-shRNA13SOAT1-T的SOAT1敲减检测结果示意图；
[0070] 图13为本发明实施例4中hCAR19-T、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的内毒素检测结果示意图；
[0071] 图14为本发明实施例4中hCAR19-T、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、SOAT1hCAR19-Inhibitor -T细胞的支原体检测结果示意图；其中，lane1为DL2000marker，从上到下条带条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2为阳性对照；
lane3为阴性对照；lane4为PBS；lane5为裂解液；lane6为hCAR19-T细胞；lane7为hCAR19-KO3SOAT1-T细胞；lane8为hCAR19-shRNA6SOAT1-T细胞；lane9为hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞；
lane3为阴性对照；lane4为PBS；lane5为裂解液；lane6为hCAR19-T细胞；lane7为hCAR19-KO3SOAT1-T细胞；lane8为hCAR19-shRNA6SOAT1-T细胞；lane9为hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞；
[0072] 图15为本发明实施例4中流式检测hCAR19-T(对照)、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的转导效率以及免疫分型结果示意图；其中，图15A表示hCAR19-T(对照)细胞的转导效率结果；图15B表示hCAR19-T(对照)细胞的免疫分型结果；图15C表示hCAR19-KO3SOAT1-T细胞的转导效率结果；图15D表示hCAR19-KO3SOAT1-T细SOAT1胞的免疫分型结果；图15E表示hCAR19-shRNA6 -T细胞的转导效率结果；图15F表示hCAR19-shRNA6SOAT1-T细胞的免疫分型结果；图15G表示hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的转导效率结果；图15H表示hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的免疫分型结果；
[0073] 图16为本发明实施例4中SOAT表达水平对T细胞基因转导效率和CD8+/CD4+比例的影响示意图；
[0074] 图17为本发明实施例5中不同效靶比条件下，hCAR19-T(对照)、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞对靶细胞杀伤效率折线图。
具体实施方式
[0075] 下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。材料
[0076] 1、lv-hCAR19重组慢病毒载体、p-hCAR19重组慢病毒载体质粒(SEQ ID NO.1)、pLenti-Cas9-monoKO慢病毒转基因载体质粒、慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白质粒pEnv-G、HEK293T/17细胞、同源重组酶、Oligo Annealing Buffer、支原体检测试剂盒、内毒素检测试剂盒、CD19+K562细胞购自世翱(上海)生物医药科技有限公司；hCAR19重组慢病毒载体的具体制备方法已经公开在发明名称为“一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用”，专利申请号为201610008360.5的专利申请说明书中；
[0077] 2、人新鲜外周血由健康供者提供；
[0078] 3、CD19单链抗体的轻链VL(如SEQ ID NO.2所示)、CD19单链抗体重链VH(如SEQ ID NO.3所示)的DNA序列由上海生物公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；
[0079] 4、工具酶BsmB I、Sal I、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；
[0080] 5、0.22μm-0.8μm PES滤器购自millipore公司；
[0081] 6、D-PBS(-)、0.4％台盼蓝、筛网、各类型细胞培养皿、培养袋、培养板均购自corning公司；
[0082] 7、Opti-MEM、Pen-Srep、Hepes、FBS、AIM-V、RPMI 1640、DMEM、lipofectamine 3000购自invitrogen公司；
[0083] 8、Biotinylated protein L购自GeneScript公司；
[0084] 9、LDH检测试剂盒购自promega公司；
[0085] 10、Ficoll淋巴细胞分离液购自GE公司；
[0086] 11、20％人血白蛋白注射液购自杰特贝林公司；
[0087] 12、CryoPremium冻存液、分选缓冲液来自上海优卡迪公司；
[0088] 13、rIL-2、rIL-1a、rIFN-γ，rIL-7，，rIL-15，rIL-21购自peprotech公司；
[0089] 14、CD3单克隆抗体，CD28单克隆抗体，CD3/CD28磁珠CD4/CD8磁珠购自德国Miltenyi公司；
[0090] 15、冷冻离心机(美国ThermoScientific公司；
[0091] 16、FACS流式细胞仪购自Thermo公司；
[0093] 18、CD4-FITC、CD8-APC购自BioLegend公司；
[0094] 19、0.9％生理盐水购自今迈公司；
[0095] 20、ProteinL Magnetic Beads购自BioVision公司；
[0096] 21、PrimeSTAR、RetroNectin购自Takara公司；
[0097] 22、phycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin购自BD Bioscience公司；
[0098] 23、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；
[0099] 24、感受态细胞TOP10购自tiangen公司；
[0100] 25、NaCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、Trypsin、EDTA、CaCl2、NaOH、PEG6000均购自上海生工；
[0101] 26、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAB工作液均购自北京中杉金桥；
[0102] 27、ECL+plusTM Western blotting system购自Amersham公司；
[0103] 28、DNeasy试剂盒购自上海捷瑞公司；
[0104] 29、SA-HRP购自上海翊圣公司；
[0105] 30、引物：根据引物设计原则设计扩增DNA片段和靶位点所需的引物，该引物由上海生物公司合成，
[0106] 具体为：
[0107] SOAT1-target1-F：5’-ACCGGAAGTCAGCATCATTAGATAAG-3’(SEQ ID NO.4)[0108] SOAT1-target1-R：5’-AAAACTTATCTAATGATGCTGACTTC-3’(SEQ ID NO.5)[0109] SOAT1-target2-F：5’-ACCGGTCAGCATCATTAGATAATGGG-3’(SEQ ID NO.6)[0110] SOAT1-target2-R：5’-AAAACCCATTATCTAATGATGCTGAC-3’(SEQ ID NO.7)[0111] SOAT1-target3-F：5’-ACCGGCAGCATCATTAGATAATGGTG-3’(SEQ ID NO.8)[0112] SOAT1-target3-R：5’-AAAACACCATTATCTAATGATGCTGC-3’(SEQ ID NO.9)[0113] SOAT1-target4-F：5’-ACCGGACAACCTTTTCTGTTCTTGAG-3’(SEQ ID NO.10)[0114] SOAT1-target4-R：5’-AAAACTCAAGAACAGAAAAGGTTGTC-3’(SEQ ID NO.11)[0115] SOAT1-target5-F：5’-ACCGGCTCTCCTTCAAGAACAGAAAG-3’(SEQ ID NO.12)[0116] SOAT1-target5-R：5’-AAAACTTTCTGTTCTTGAAGGAGAGC-3’(SEQ ID NO.13)[0117] SOAT1-target6-F：5’-ACCGGTGCTGACTTTTCAATGAGATG-3’(SEQ ID NO.14)[0118] SOAT1-target6-R：5’-AAAACATCTCATTGAAAAGTCAGCAC-3’(SEQ ID NO.15)[0119] negative control：SOAT1-target7-F：5’-ACCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTG-3’(SEQ ID NO.16)
[0120] negative control：SOAT1-target7-R：5’-AAAACACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’(SEQ ID NO.17)
[0121] WPRE-QPCR-F：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(SEQ ID NO.18)
[0122] WPRE-QPCR-R：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(SEQ ID NO.19)
[0123] Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQ ID NO.20)
[0124] Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO.21)
[0125] SOAT1-QPCR-F：5’-AGTTGGCAGTCACTTTGATGAT-3’(SEQ ID NO.22)
[0126] SOAT1-QPCR-R：5’-TTGTGAGAGCGCACCCACCA-3’(SEQ ID NO.23)
[0127] DNA模板：ccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaactccgg(SEQ ID NO.24)
[0128] shRNA1SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.25)
[0129] shRNA1SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaGCCGATTTGGAATGTTCTGATCTCGAGATCAGAACATTCCAAATCGGCCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.26)
[0130] shRNA2SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.27)
[0131] shRNA2SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaGTAATGGTCGAATTGACATAACTCGAGTTATGTCAATTCGACCATTACCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.28)
[0132] shRNA3SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.29)
[0133] shRNA3SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaattcccggttcatcattatattCTCGAGCGAATATAATGATGAACCG GGCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.30)
[0134] shRNA4SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.31)
[0135] shRNA4SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaatggtccatgactggctatattCTCGAGGTAATATAGCCAGTCATGGACCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.32)
[0136] shRNA5SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.33)
[0137] shRNA5SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaGTGCCTCGGGTACTAAATTCACTCGAGGCTGAATTTAGTACCCGAGGCCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.34)
[0138] shRNA6SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.35)
[0139] shRNA6SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaTTGGTGACAGGATGTTCTATACTCGAGCTTATAGAACATCCTGTCACCCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.36)
[0140] shRNA7SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.37)
[0141] shRNA7SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaCAGCACACTTGTAGTAGATTACTCGAGTGTAATCTACTACAAGTGTGCCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.38)
[0142] shRNA8SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.39)
[0143] shRNA8SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaATCTGCTGTAGTACACGAATACTCGAGCATATTCGTGTACTACAGCAGCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.40)
[0144] shRNA9SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGCC TATT-3’(SEQ ID NO.41)
[0145] shRNA9SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaAACCAGTATTTGTACTTCTTACTCGAGAATAAGAAGTACAAATACTGGCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.42)
[0146] shRNA10SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGC CTATT-3’(SEQ ID NO.43)
[0147] shRNA10SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaAATACCTACAGTCAACCAGTACTCGAGAATACTGGTTGACTGTAGGTACCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.44)
[0148] shRNA11SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGC CTATT-3’(SEQ ID NO.45)
[0149] shRNA11SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaAACAACCATAGAGCGAAGGATCTCGAGAAATCCTTCGCTCTATGGTTGCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.46)
[0150] shRNA12SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGC CTATT-3’(SEQ ID NO.47)
[0151] shRNA12SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaACCTACAGTCAACCAGTATTTCTCGAGACAAATACTGGTTGACTGTAGCCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.48)
[0152] negative control：shRNA13SOAT1-F：5’-CCTGCCCCCTCGCTAAGTCGACGCTAGCCCCCTTCACCGAGGGC CTATT-3’(SEQ ID NO.49)
[0153] negative control：shRNA13SOAT1-R：5’-GAGGTTGATTGTCGACGAATTCaaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGAC GTGACACGTTCGGAGAACCGGAGTTTCGTCCTTTCCA-3’(SEQ ID NO.50)[0154] 实施例1hCAR19-KOSOAT1-T细胞构建。
[0155] 参见图4，本发明所述hCAR19-KOSOAT1-T细胞的构建方法如下：
[0156] 一、SOAT1敲除重组慢病毒载体lvCas9-SOAT1-1～lvCas9-SOAT1-7的构建、纯化、检测方法。
[0157] 1、将合成好的SOAT1-target1～SOAT1-target7片段分别连接到pLenti-Cas9-monoKO质粒中，得到SOAT1敲除重组慢病毒质粒pCas9-SOAT1-1～pCas9-SOAT1-7。
[0158] (1)将重组慢病毒质粒pLenti-Cas9-monoKO使用BsmB I限制性内切酶进行酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认11127bp的片段V1，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
[0159]
[0160] 表1琼脂糖凝胶回收步骤
[0161] (2)将合成好的SOAT1-target1-F/R～SOAT1-target7-F/R分别用oligo annealing buffer(退火缓冲液)溶解成20μM，对应的F和R各取30μl混合。然后将SOAT1-target1-F&R～SOAT1-target7-F&R混合物在水浴锅中95℃加热5分钟，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链寡核苷酸片段。取1μl用于的连接反应(见表2)，4℃连接
16h，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
16h，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
[0162] 挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为SOAT1敲除重组慢病毒质粒pCas9-SOAT1-1～pCas9-SOAT1-7，其中pCas9-SOAT1-7为对照，对正确的克隆进行测序鉴定(见图7)，全部正确。
[0163]试剂 体积(μl)
H2O 13
V2 3
10×T4 DNA ligase Buffer 2
T4 DNA ligase 1
退火的双链寡核苷酸 1
H2O 13
V2 3
10×T4 DNA ligase Buffer 2
T4 DNA ligase 1
退火的双链寡核苷酸 1
[0164] 表2 20μl连接反应体系
[0165] 2、重组慢病毒载体lvCas9-SOAT1-1～lvCas9-SOAT1-7的包装；
[0166] (1)完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％FBS+5ml Pen-Srep，上下颠倒混匀即可；
[0167] (2)1XPBS溶液：称量NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g置于1000ml烧杯中，加入900ml Milli-Q grade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min；
[0168] (3)0.25％Trypsin溶液:称量Trypsin 2.5g，EDTA 0.19729g置于1000ml烧杯中，加入900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μM过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱；
[0169] (4)0.5M CaCl2溶液：称量36.75g CaCl2用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；用Milli-Q grade超纯水将总体积定容至500ml，混匀；0.22μm过滤除菌，分装保存到50ml离心管中，每管45ml左右，4℃保存；
[0170] (5)2XHBS溶液：称量4.09g NaCl，0.269g Na2HPO4，5.96g Hepes，用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；校准pH仪后，用2M NaOH溶液将HBS溶液的pH调到7.05。调整每瓶HBS的PH消耗2M NaOH为3ml左右；
[0171] (6)从液氮罐中取出冻存的HEK293T/17细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后2
转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm培养皿中，补足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm2dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代；
转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm培养皿中，补足含10％FBS的DMEM至8mL/10cm2dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代；
[0172] (7)选择细胞状态良好、无污染的HEK293T/17细胞，每2-6个培养皿为一组，将细胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml，避免培养皿变干；使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中；
[0173] (8)将上述2-6个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培养皿；
[0174] (9)盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个2 6
10cm培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×10个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×106个/皿的量接种；
10cm培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×10个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×106个/皿的量接种；
[0175] (10)每6个培养皿整理为一摞，注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右，前后晃动数次，使细胞充分铺开，然后放入5％CO2培养箱。剩余细胞做同样处理；
[0176] (11)检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养皿中均匀分布；
[0177] (12)为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9ml，并将培养箱的CO2浓度设定值提高到8％；
[0178] (13)按照N+0.5配DNA/CaCl2溶液。每皿HEK293T/17细胞转染质粒量按照下列比例使用：重组慢病毒质粒(20μg),pPac-GP(15μg)，pPac-R(10μg),pEnv-G(7.5μg)。取一个新的5ml离心管，加入0.5M CaCl2：0.25ml，重组慢病毒质粒20μg：pPac-GP 15μg：pPac-R 10μg：
pEnv-G 7.5μg，补充超纯水至0.5ml盖上盖子，充分混匀；
pEnv-G 7.5μg，补充超纯水至0.5ml盖上盖子，充分混匀；
[0179] (14)另取一支5ml离心管，加入0.5ml DNA/CaCl2溶液。打开涡旋振荡器，一只手拿住5ml离心管的上端，使管底接触振荡头，使液体在管壁上散开流动，另一只手拿一把1mL移液枪，吸取0.5mL 2×HBS溶液，缓慢滴加进入离心管，控制流速，以半分钟滴完为宜。2×HBS加入后，继续振荡5秒钟，停止振荡，可直接加入需要转染的细胞中；
[0180] (15)取一皿细胞，将离心管中的1mL钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中；
[0181] (16)钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％CO2培养箱中。确保培养皿水平放置，每摞培养皿不要超过6个。在5％CO2培养箱中放置(6–8h)；
[0182] (17)将第一个培养箱的CO2浓度设定值调回到5％；
[0183] (18)24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养基吸走，更换10ml新鲜的DMEM完全培养基；
[0184] (19)48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10mL新鲜培养基；
[0185] (20)72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起，丢弃培养皿；此时收集的上清里包含了重组慢病毒载体lvCas9-SOAT1-1～lvCas9-SOAT1-7。
[0186] 3、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体；
[0188] (2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5M NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8)；
[0189] (3)将2个离子交换柱串联放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次过柱；
[0191] (5)全部上清液过柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗一遍；
[0192] (6)根据上样量使用1-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)进行洗脱，收集洗脱液；
[0193] (7)将洗脱液分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存；
[0194] 4、重组慢病毒载体滴度测定；
[0195] (1)取24孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×104个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；
[0196] (2)准备3个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N；
[0197] (3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS),终体积为500ul；
[0198] (4)感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO2继续培养48小时；
[0199] (5)72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,并拍照；
[0200] (6)用0.2ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA并定量；
[0201] (7)准备目的DNA检测qPCRmix总管Ⅰ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.18---SEQ ID NO.19)：
[0202]
[0203]
[0204] n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe和788μl H2O混和。震荡后放在冰上；
[0205] (8)准备内参DNA检测qPCRmix管Ⅱ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.20---SEQ ID NO.21)：
[0206] 2×TaqMan Master Mix 25μl×n
[0207] 10×RNaseP primer/probe mix 2.5μl×n
[0208] H2O 17.5μl×n
[0209] n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震荡后放在冰上；
[0210] (9)在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。
[0211] (10)分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。
[0212] (11)分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。
[0213] (12)所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。
[0214] 数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
[0215] 滴度(integration units per ml，IU ml-1)的计算公式如下：
[0216] IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V
[0217] 其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数
[0218] N＝感染时细胞的数目(约为1×105)
[0219] D＝病毒载体的稀释倍数
[0220] V＝加入的稀释病毒的体积数
[0221] (13)SOAT1敲除重组慢病毒载体lvCas9-SOAT1-1～lvCas9-SOAT1-7的滴度结果(如图8所示)。
[0222] 二、hCAR19-KOSOAT1-T细胞的构建。
[0223] 1、分离PBMC。
[0224] (1)抽取健康供者新鲜外周血50ml；
[0225] (2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。
[0226] (3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。
[0227] (4)400g，20℃离心10min。
[0228] (5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g，离心30min，取上清到50ml离心管中待用。
[0229] (6)用D-PBS(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。
[0230] (7)取2个新50ml离心管，每管加入15ml Ficoll淋巴细胞分离液。
[0231] (8)向每管Ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。
[0232] (9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、无色透明的Ficoll层、红黑色的混合细胞层。
[0233] (10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加D-PBS(-)至50ml，颠倒混匀后500g，20℃离心10min。
[0234] (11)加入25ml 5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。
[0235] (12)弃上清，加入25ml 5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。
[0236] (13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加CryoPremium并冻存。
[0237] 2、CD4/CD8阳性T细胞分选。
[0238] (1)将获得的PBMC计数，以80ul/107cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。
[0239] (2)再以20ul/107cells的比例加入CD4/CD8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。
[0240] (3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。
[0241] (4)以500ul/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。
[0242] (5)用镊子夹取LS分离柱到磁力架上。
[0243] (6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：CD4-/CD8-细胞液(A管)、CD4+/CD8+细胞液(B管)。
[0244] (7)用3ml分离缓冲液润洗LS,并用A管接缓冲液。
[0245] (8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，收集得到CD4/CD8-细胞。
[0246] (9)LS分离柱与磁力架分离，用B管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞稍用力冲洗，收集为CD4+/CD8+细胞，取样计数。
[0247] (10)按1x106/ml-4x106/ml的细胞密度用AIM-V培养基重悬细胞沉淀，并加入2×105～1×106U/L IFN-γ因子。
[0248] 3、T细胞激活。
[0249] (1)提前一天将1×103ug/L～1×104ug/L CD3单克隆抗体和1×103ug/L～1×104ug/L CD28单克隆抗体加入24孔板，封口膜封口，4℃过夜包被。
[0250] (2)取出包被的T75瓶，倒掉包被液，用D-PBS(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞悬液接种到T75瓶中，摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0251] 4、SOAT1敲除重组慢病毒载体lvCas9-SOAT1-1～lvCas9-SOAT1-7分别与lv-hCAR19重组慢病毒载体共转导及hCAR19-KOSOAT1-T细胞诱导培养。
[0252] (1)提前一天包被1×103ug/L～1×104ug/L RetroNectin于24孔板内，封口膜封口，4℃过夜包被。
[0253] (2)往24孔板中，根据每孔5×105细胞量，按MOI＝5～20的量，分别加入2种慢病毒载体混合，同时添加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培养基37℃、5％CO2继续培养。
[0254] 5、hCAR19-KOSOAT1-T细胞体外扩增及SOAT1表达检测。
[0255] (1)每2天等量补加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培养基，使PH值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×105～2×106/ml之间，37℃、5％CO2继续培养10-14天。
[0256] (2)第7天左右，用ProteinL Magnetic Beads分离约1×106个hCAR19阳性细胞用于SOAT1基因表达检测。QPCR引物序列为SEQ ID NO.22---SEQ ID NO.23，结果如图9显示，其中hCAR19-KO3SOAT1-T细胞敲除效果最好，达到90％以上的效果。冻存培养的hCAR19-KO3SOAT1-T细胞用于后续检测。
[0257] 实施例2hCAR19-shRNASOAT1-T细胞构建。
[0258] 参见图5，本发明所述hCAR19-shRNASOAT1-T细胞的构建方法如下：
[0259] 一、重组敲减慢病毒载体lv-hCAR19-shRNA1SOAT1～lv-hCAR19-shRNA13SOAT1的构建、纯化、检测方法。
[0260] 1、将合成好的shRNA1SOAT1～shRNA13SOAT1片段分别与hU6片段共同连接到p-hCAR19SOAT1重组慢病毒载体质粒中，得到SOAT1重组敲减慢病毒质粒p-hCAR19-shRNA1 ～p-hCAR19-shRNA13SOAT1。
[0261] (1)将p-hCAR19重组慢病毒载体质粒使用Sal I限制性内切酶进行单酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认8519bp的片段V2，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见实施例1中的表1)，并测定产物的纯度和浓度；
[0262] (2)分别用引物对shRNA1SOAT1F/R～shRNA13SOAT1F/R以合成的SEQ ID NO.24为模板，使用实施例1的表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，58℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认约365bp的片段a1～a13，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见实施例1中的表1)，并测定产物的纯度和浓度；
[0263] (3)将DNA片段V1+a1～V1+a13以5μl总体积且摩尔比1:1的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。
[0264] 挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组敲减慢病毒质粒p-hCAR19-shRNA1SOAT1～p-hCAR19-shRNA13SOAT1，其中p-hCAR19-shRNA13SOAT1为对照，将鉴定正确的克隆进行测序，结果如图10所示，全部正确；
[0265] 2、重组慢病毒载体lv-hCAR19-shRNA1SOAT1～lv-hCAR19-shRNA13SOAT1的包装，具体步骤参见实施例1；
[0266] 3、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体，具体步骤参见实施例1；
[0267] 4、重组慢病毒载体滴度测定，具体步骤参见实施例1；
[0268] (1)重组慢病毒载体lv-hCAR19-shRNA1SOAT1～lv-hCAR19-shRNA13SOAT1的滴度结果(如图11所示)。
[0269] 二、hCAR19-shRNASOAT1-T细胞的构建。
[0270] 1、分离PBMC。
[0271] (1)抽取健康供者新鲜外周血50ml；
[0272] (2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。
[0273] (3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。
[0274] (4)400g，20℃离心10min。
[0275] (5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g，离心30min，取上清到50ml离心管中待用。
[0276] (6)用D-PBS(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。
[0277] (7)取2个新50ml离心管，每管加入15ml Ficoll淋巴细胞分离液。
[0278] (8)向每管Ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。
[0279] (9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、无色透明的Ficoll层、红黑色的混合细胞层。
[0280] (10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加D-PBS(-)至50ml，颠倒混匀后500g，20℃离心10min。
[0281] (11)加入25ml 5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。
[0282] (12)弃上清，加入25ml 5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。
[0283] (13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加CryoPremium并冻存。
[0284] 2、CD4/CD8阳性T细胞分选。
[0285] (1)将获得的PBMC计数，以80ul/107cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。
[0286] (2)再以20ul/107cells的比例加入CD4/CD8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。
[0287] (3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。
[0288] (4)以500ul/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。
[0289] (5)用镊子夹取LS分离柱到磁力架上。
[0290] (6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：CD4-/CD8-细胞液(A管)、CD4+/CD8+细胞液(B管)。
[0291] (7)用3ml分离缓冲液润洗LS,并用A管接缓冲液。
[0292] (8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，收集得到CD4/CD8-细胞。
[0293] (9)LS分离柱与磁力架分离，用B管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞稍用力冲洗，收集为CD4+/CD8+细胞，取样计数。
[0294] (10)按1x106/ml-4x106/ml的细胞密度用AIM-V培养基重悬细胞沉淀，并加入2×105～1×106U/L IFN-γ因子。
[0295] 3、T细胞激活。
[0296] (1)提前一天将1×103ug/L～1×104ug/L CD3单克隆抗体和1×103ug/L～1×104ug/L CD28单克隆抗体加入24孔板，封口膜封口，4℃过夜包被。
[0297] (2)取出包被的T75瓶，倒掉包被液，用D-PBS(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞悬液接种到T75瓶中，摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0298] 4、lv-hCAR19-shRNA1SOAT1～lv-hCAR19-shRNA13SOAT1转导及hCAR19-shRNASOAT1-T细胞诱导培养。
[0299] (1)提前一天包被1×103ug/L～1×104ug/L RetroNectin于24孔板内，封口膜封口，4℃过夜包被。
[0300] (2)往24孔板中，根据每孔5×105细胞量，按MOI＝5～20的量，加入慢病毒载体，同时添加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培养基37℃、
5％CO2继续培养。
5％CO2继续培养。
[0301] 5、hCAR19-shRNASOAT1-T细胞体外扩增及SOAT1表达检测。
[0302] (1)每2天等量补加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的
5～ 6
AIM-V培养基，使PH值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×10 2×10/ml之间，37℃、
5％CO2继续培养10-14天。
5～ 6
AIM-V培养基，使PH值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×10 2×10/ml之间，37℃、
5％CO2继续培养10-14天。
[0303] (2)第7天左右，用ProteinL Magnetic Beads分离约1×106个hCAR19阳性细胞用于SOAT1基因表达检测。QPCR引物序列为SEQ ID NO.22---SEQ ID NO.23，结果如图12显示，其中hCAR19-shRNA6SOAT1-T敲除效果最好，达到70％以上的效果，冻存培养的hCAR19-shRNA6SOAT1-T细胞用于后续检测。
[0304] 实施例3 hCAR19-T和hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞构建。
[0305] 参见图6，本发明所述hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的构建方法如下：
[0306] 1、分离PBMC。
[0307] (1)抽取健康供者新鲜外周血50ml；
[0308] (2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。
[0309] (3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。
[0310] (4)400g，20℃离心10min。
[0311] (5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g，离心30min，取上清到50ml离心管中待用。
[0312] (6)用D-PBS(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。
[0313] (7)取2个新50ml离心管，每管加入15ml Ficoll淋巴细胞分离液。
[0314] (8)向每管Ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。
[0315] (9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、无色透明的Ficoll层、红黑色的混合细胞层。
[0316] (10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加D-PBS(-)至50ml，颠倒混匀后500g，20℃离心10min。
[0317] (11)加入25ml 5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。
[0318] (12)弃上清，加入25ml 5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。
[0319] (13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加CryoPremium并冻存。
[0320] 2、CD4/CD8阳性T细胞分选。
[0321] (1)将获得的PBMC计数，以80ul/107cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。
[0322] (2)再以20ul/107cells的比例加入CD4/CD8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。
[0323] (3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。
[0324] (4)以500ul/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。
[0325] (5)用镊子夹取LS分离柱到磁力架上。
[0326] (6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：CD4-/CD8-细胞液(A管)、CD4+/CD8+细胞液(B管)。
[0327] (7)用3ml分离缓冲液润洗LS,并用A管接缓冲液。
[0328] (8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，收集得到CD4/CD8-细胞。
[0329] (9)LS分离柱与磁力架分离，用B管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞稍用力冲洗，收集为CD4+/CD8+细胞，取样计数。
[0330] (10)按1x106/ml-4x106/ml的细胞密度用AIM-V培养基重悬细胞沉淀，并加入2×105～1×106U/L IFN-γ因子。
[0331] 3、T细胞激活。
[0332] (1)提前一天将1×103ug/L～1×104ug/L CD3单克隆抗体和1×103ug/L～1×104ug/L CD28单克隆抗体加入24孔板，封口膜封口，4℃过夜包被。
[0333] (2)取出包被的T75瓶，倒掉包被液，用D-PBS(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞悬液接种到T75瓶中，摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0334] 4、CAR基因转导及hCAR19-T和hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞诱导培养。
[0335] (1)提前一天包被1×103ug/L～1×104ug/L RetroNectin于24孔板内，其中半数的孔中加入1～5μM Avasimibe(抑制剂)，封口膜封口，4℃过夜包被。
[0336] (2)往24孔板中，根据每孔5×105细胞量，按MOI＝5～20的量，加入hCAR19重组慢病毒载体，同时添加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培养基37℃、5％CO2继续培养。
[0337] 5、hCAR19-T和hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞体外扩增。
[0338] (1)每2天等量补加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培养基，使PH值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×105～2×106/ml之间，37℃、5％CO2继续培养10-14天。
[0339] (2)第7天左右，冻存培养的hCAR19-T和hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞用于后续检测，其中hCAR19-T细胞作为对照。
[0340] 实施例4
[0341] hCAR19-T、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞病原检测和表达检测。
[0342] 一、内毒素检测；
[0343] (1)、内毒素工作标准品为15EU/支；
[0344] (2)、鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml,0.5ml/管
[0345] (3)、内毒素标准品稀释：取内毒素标准品一支，分别用BET水按比例稀释成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震荡溶解15min；稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s；
[0346] (4)、加样：取鲎试剂若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分装至若干支无内毒素试管中，每管0.1ml。其中2支为阴性对照管，加入BET水0.1ml；
[0347] 2支为阳性对照管，加入2λ浓度的内毒素工作标准品溶液0.1ml；
[0348] 2支为样品阳性对照管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液(稀释20倍的待测样品1ml+4λ的内毒素标准品溶液1ml＝2ml含2λ内毒素标准品的稀释40倍样品)。
[0349] 样品管中加入0.1ml样品，稀释比例见表3，37±1℃水浴(或培养箱)保温60±1min；
[0350]
[0351] 表3内毒素稀释比例及对应内毒素含量
[0352] (5)、hCAR19-T、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的内毒素检测结果(如图13所示)，四种细胞的内毒素含量均在在0.25～1.25EU/ml之间，符合《中华人民共和国药典》中小于10EU/ml的标准。
[0353] 二、支原体检测；
[0354] (1)在实验前三日，细胞样品用无抗生素培养基进行培养；
[0355] (2)收集1ml细胞悬浮液(细胞数大于1*105)，置于1.5ml离心管中；
[0356] (3)13000g离心1min，收集沉淀，弃去培养基；
[0357] (4)加入500ul PBS用枪头吹吸或涡旋振荡，重悬沉淀。13000g离心5min；
[0358] (5)步骤(4)重复一次；
[0359] (6)加入50μl Cell Lysis Buffer，用枪头吹吸，充分混匀后,在55℃水浴中孵育20min；
[0360] (7)将样品置于95℃中加热5min；
[0361] (8)13000g离心5min后，取5μl上清作为模板，25μl PCR反应体系为：ddH20 6.5μl、Myco Mix 1μl、2x Taq Plus Mix Master(Dye Plus)12.5μl、模板5μl；PCR循环条件为：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。
[0362] (9)支原体检测结果显示(如图14所示)，hCAR19-T、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T中均不含支原体。
[0363] 三、CAR基因转导效率检测及免疫分型检测；
[0364] (1)收集经病毒转导后的T细胞，用含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞并调整为1×106/ml。
[0365] (2)向离心管中加入含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液1ml并混匀，350g离心5min，弃上清。
[0366] (3)重复步骤2一次。
[0367] (4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入1ul的1mg/ul protein L，5ul CD4-FITC，5ul CD8-APC，混匀，4℃孵育45min。
[0368] (5)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液并混匀，350g离心5min，弃上清。
[0369] (6)重复步骤5两次。
[0370] (7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入0.2ul PE-SA，混匀，37℃避光孵育15min。
[0371] (8)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重并混匀，350g离心5min，弃上清。
[0372] (9)用1ml D-PBS(-)溶液重悬细胞沉淀，350g离心5min，弃上清。
[0373] (10)重复步骤(9)两次。
[0374] (11)用0.4ml D-PBS(-)溶液重悬细胞沉淀，流式细胞仪进行检测。
[0375] (12)CAR基因转导效率及免疫分型检测检测结果如图15所示，数据分析如图16所示，SOAT1的催化功能随着蛋白水平抑制、mRNA水平敲减、DNA水平敲除越来越弱，CAR基因的转导效率也随之有一定程度的降低，但是CD8+/CD4+比例随着SOAT1功能的减弱有明显的提高，显示出令人激动的潜力。
[0376] 实施例5 hCAR19-T、hCAR19-KO3SOAT1-T、hCAR19-shRNA6SOAT1-T、hCAR19-InhibitorSOAT1-T细胞的功能检测。
[0377] 一、靶细胞杀伤效果评估。
[0378] (1)分别培养CD19+K562细胞和四种效应细胞；
[0379] (2)收集靶细胞(CD19+K562)4x105cells和效应细胞2.8x106cells，800g，6min离心，弃上清；
[0380] (3)用1ml D-PBS(-)溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；
[0381] (4)重复步骤3一次；
[0382] (5)用700ul培养基(AIM-V培养基+1～10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(AIM-V培养基+1～10％FBS)重悬靶细胞；
[0383] (6)设置效靶比为1:1、5:1、10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；
[0384] (7)250g，5min平板离心；
[0385] (8)37℃，5％CO2培养箱中培养4小时；
[0386] (9)250g，5min平板离心；
[0387] (10)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；
[0388] (11)避光孵育25min；
[0389] (12)每孔加入50ul终止液；
[0390] (13)酶标仪检测490nm吸光度；
[0391] (14)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。
[0392] (15)将步骤(14)中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。结果如图17所示，随着SOAT1功能的减弱，CD8+/CD4+比例有明显的提高，同时效应细胞的杀伤能力也有明显提高，hCAR19-KO3SOAT1-T细胞的杀伤效率最高；
[0393] 杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)X100％[0394] (16)上述实验结果表明，通过调控CAR-T的细胞脂质代谢，抑制了SOAT1，减少了胆固醇转化为胆固醇酯，增加了CAR-T内的胆固醇含量，能够有效提高CAR-T细胞中CD8+/CD4+细胞的比例，显著提高CAR-T细胞的杀伤作用，达到了预料不到的技术效果。经实验验证，胆固醇转脂酶SOAT1被抑制的CAR-T细胞有着超越CAR-T细胞的杀伤能力，因此调控CAR-T的细胞脂质代谢在肿瘤的细胞治疗中拥有极高的应用价值。
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