癌症，一种主要的致死性疾病，特征是由过度细胞分裂引起的恶性组 织的异常肿块。癌症细胞摆脱了对细胞生长的常规限制，并且侵入和占领 其它细胞正常保留的区域。癌症可以通过手术、放射性治疗、化学治疗、 激素治疗等进行治疗。
化学治疗是应用抗癌药物(或细胞毒素药物)来抑制或破坏癌细胞。 它通过靶向细胞生长周期的特定部分而抑制癌细胞生长。目前，存在多于 50种批准用于临床应用的化学治疗药物，并且多于百种的药物正在研究 中。化学治疗药物可以通过各种机制防止癌细胞进一步增殖。大多数化学 治疗药物利用癌细胞在细胞生长和分裂中更加活跃的事实。因此，妨碍细 胞生长周期或细胞分裂过程的药物将选择性地抑制癌细胞生长。
例如，多柔比星(阿霉素，Rubex，或盐酸多柔比星脂质体)是一种 通过插入和酶抑制实行其对癌细胞作用的蒽环霉素抗生素。作为一种嵌入 剂，它插入DNA中并且防止DNA复制或转录。作为酶抑制剂，它抑制 II型拓扑异构酶，导致DNA断裂。由于活跃分裂的癌细胞需要具有DNA 的合成和复制，多柔比星将比它影响正常细胞更多地影响活跃分裂的细胞 (即，癌细胞)。由于多柔比星的作用机制是全面的，所以这种药物有效 用于治疗广泛范围的癌症。
紫杉醇(泰素)或其类似物(诸如多西他赛(泰索帝))促进微管蛋 白的聚合，由此通过破坏细胞分裂和重要的间期过程所需要的正常的微管 动力学而引起细胞死亡。
已知维生素A代谢物、视黄酸(RAs)对发育、细胞增殖和分化、以 及肿瘤生长和侵入具有深远的作用。RAs对细胞增殖和迁移的广泛范围的 作用表明，它们是用于许多类型的癌症的有效的化学治疗剂。例如，全反 式视黄酸(ATRA)已被成功地用作许多白血病，诸如急性早幼粒细胞白血 病(APL)的“分化治疗”。ATRA激活类视黄醇受体(RAR)并且引起早幼粒 细胞分化(成熟)，从而防止这样的细胞增殖。
这些年来，尽管化学治疗在功效上得到了极大地改进并且减小了副作 用，但是癌症化学治疗的总体治愈率仍旧很低，并且远远不能令人满意。 因此，存在对于更有效的化学治疗的需要。
发明概述
本发明基于一个令人惊讶的发现，即，某些稠合的吡唑基化合物可以 与化学治疗药剂一起应用以产生协同作用。这样的协同作用在通过不同机 制作用的化学药剂上观察到。因此，本发明所述稠合的吡唑基化合物通常 可以与其它化学治疗药剂，诸如紫杉醇、多柔比星、或视黄酸一起应用， 以提高功效和/或将化学治疗药剂的副作用(size effects)最小化。
一方面，本发明着重描述治疗癌症的方法。所述方法包括给需要其的 受试者施用有效量的化学治疗药剂(例如，紫杉醇、多柔比星、或视黄酸) 和有效量的下式化合物：

在这一式中，A是H或 Ar1，Ar2和Ar3每一个独 立地为苯基，噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，或嘧啶基；R1，R2，R3，R4， R5，和R6每一个独立地为R，硝基，卤素，C(O)OR，C(O)SR，C(O)NRR’， (CH2)mOR，(CH2)mSR，(CH2)mNRR’，(CH2)mCN，(CH2)mC(O)OR， (CH2)mCHO，(CH2)mCH＝NOR，(CH2)mC(O)N(OR)R’，N(OR)R’，或者R1和 R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起为O(CH2)mO，其中每个R和R’ 独立地为H或C1～C6烷基；和m是0，1，2，3，4，5，或6，和n是0，1，2，或 3。(CH2)m可以是有分枝的或线性的。注意上述任何取代基中所示的左侧 原子最靠近稠合的吡唑环。还注意当稠合的吡唑化合物中存在一个或多个 R或(CH2)m部分时，所述R或(CH2)m部分可以是相同的或不同的。
在一些上述化合物中，Ar1可以是苯基，Ar2可以是呋喃基(例如，5’- 呋喃基)，和Ar3可以是苯基。
上述化合物的一个子集是其中A为 的那些。在一些 具体的实施方案中，Ar1是苯基，Ar2是5’-呋喃基，Ar3是苯基，和n是1。 此外，每个R1，R2，R5，和R6是H，n是1，R3和R4中一个是H，和另一 个是取代呋喃基位置2的CH2OH。这一子集的一个实例是1-苄基-3-(5’- 羟甲基-2’-呋喃基)吲唑(化合物1)。
上述化合物的另一个子集是其中A是H的那些。在一些具体的实施 方案中，Ar1是苯基，和Ar2是呋喃基。此外，每个R1和R2是H，和R3 和R4中一个是H，和另一个是取代呋喃基的位置2的CH2OH。
术语“Ar”，当用在本文时，是指芳基和杂芳基。芳基，例如，苯基， 是具有至少一个芳香环的烃环系统。杂芳基是具有至少一个其中含有至少 一个杂原子，诸如O，N，或S的芳香环的烃环系统。杂芳基的实例包括， 但不限于，噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，和嘧啶基。“Ar”可以在 其环上含有1个，2个，3个，或更多个取代基。除了指定为R1，R2，R3，R4， R5，和R6的那些(参见上文)，所述取代基还可以是硝基，C2～C6链烯基， C2～C6炔基，芳基，杂芳基，cyclyl，或heterocyclyl。烷基，链烯基，炔 基，烷氧基，芳基，杂芳基，cyclyl，和heterocyclyl，当用在本文时，任 选地用C2～C6烷基、卤素、氨基、羟基、巯基、氰基、或硝基进行取代。 注意术语“烷基”是指线性烷基和支链烷基。
如果可以应用的话，上述稠合的吡唑基化合物包括化合物本身，以及 其盐和其前体药物。这样的盐，例如，可以通过在稠合的吡唑基化合物上 的带负电的取代基(例如，羧酸基)和阳离子之间相互作用而形成。适当 的阳离子包括，但不限于，钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，和铵基阳 离子，诸如四甲铵(teteramethylammonium)离子。同样地，正电荷的取 代基(例如，氨基)可以与带负电荷的相反离子形成盐。适当的相反离子 包括，但不限于，氯，溴，碘，硫酸根，硝酸根，磷酸根，或醋酸根。前 体药物的实例包括酯和其它药用衍生物，当施用给受试者时，其能够提供 上述稠合的吡唑基化合物。
按照本发明的一个实施方案，与稠合的吡唑基化合物一起应用的化学 治疗剂可以通过各种机制起作用。例如，它可以通过DNA插入，通过调 节微管动力学，通过诱导细胞分化，通过诱导程序性细胞死亡，或者调节 细胞周期的任何机制而起作用。
当用于本说明书时，“癌症”包括细胞瘤/癌症，淋巴瘤，和白血病。 该术语意欲包括所有类型的癌生长，迁移组织或恶性转化的细胞、组织、 或器官，而不考虑组织病理学类型或侵入的阶段。癌症的实例包括，但不 限于，癌和肉瘤，诸如白血病，肉瘤，骨肉瘤，淋巴瘤，黑素瘤，卵巢癌， 皮肤癌，睾丸癌，胃癌，胰腺癌，肾癌，乳癌，前列腺癌，结肠直肠癌， 头颈癌，脑癌，食管癌，膀胱癌，肾皮层癌，肺癌，支气管癌，子宫内膜 癌，鼻咽癌，子宫颈癌，肝癌，或未知的原发位点的癌症。
含有一种或多种上述稠合的吡唑基化合物和用于治疗癌症的化学治 疗剂的组合物，和应用这种组合物用来制备治疗癌症的药物也在本发明范 围内。
本发明的其它特征，目的，和优点将通过详述和通过权利要求而显而 易见。
附图简述
图1显示施用或不施用化合物1(YC-1)、ATRA、与ATRA组合的 化合物1的BALB/c和WEHI-3/BALB/c小鼠(n＝8)的脾(A)和肝(B)重 量的变化。结果表示为平均值±S.D.，并且组间差异通过单向ANOVA进 行检验。对于WEHI-3B/BALB/c小鼠和各种治疗的值之间的显著差异显 示为*p＜0.05。
图2显示脾的石蜡切片的苏木精和曙红染色，所述脾来自对照小鼠 (A)，WEHI-3/BALB/c白血病小鼠(B)，化合物1处理的白血病小鼠(C)， ATRA处理的白血病小鼠(D)和化合物1与ATRA组合治疗的白血病小鼠 (E)。在治疗后14天，将小鼠处死。脾在4％甲醛中固定，并且在石蜡中 包埋。将脾的切片用苏木精和曙红染色。(R：红髓；W：白髓(while pulp)； ↓：渗透的未成熟的原粒细胞)
图3显示化合物1，ATRA和与ATRA组合的化合物1对WEHI-3细 胞分化和程序性细胞死亡的作用。(A)TUNEL/DAPI染色诱导的核形态变 化，(B)NBT还原和TUNEL染色。化合物1，ATRA和与ATRA组合的 化合物1处理的WEHI-3细胞在所有处理前培养24h，用TUNEL/DAPI(× 400)染色，接着进行显微镜分析。结果表示为平均值±S.D.。
图4显示化合物1在WEHI-3细胞中通过(A)DNA断裂和(B)胱天蛋 白酶-3活性而诱导程序性细胞死亡的作用。对于DNA断裂，将DNA提 取物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。胱天蛋白酶-3抑制剂对YC诱导的胱天 蛋白酶-3活化的作用。将细胞用胱天蛋白酶-3抑制剂，Z-DEVE-FMK， 预先处理1h，并且然后用5μM化合物1刺激。结果表示为平均值±S.D.， 并且组间差异通过单向ANOVA检验。在0小时处理和多小时处理的值之 间的显著差异显示为*p＜0.001。
发明详述
本发明涉及一种治疗癌症(例如，肾癌(renal cancer)，肺癌，肾癌 (kidney cancer)，或白血病)的方法，其通过给需要所述治疗的受试者施 用有效量的一种或多种稠合的吡唑基化合物和有效量的化学治疗药剂。术 语“治疗”是指将稠合的吡唑基化合物(或包括稠合的吡唑基化合物的组 合物)和化学治疗药剂应用或施用给受试者，所述受试者具有癌症，癌症 症状，或易患癌症的体质，目的是治愈，康复，减轻，减缓，改变，补救， 改善，提高，或影响癌症，癌症症状，或易患癌症的体质。“有效量”是 指活性药剂的用量，当施用给需要所述治疗的受试者时，需要其赋予对受 试者的治疗作用。有效剂量可以变化，如本领域的技术人员所公认的那样， 其取决于施用的途径，赋形剂的应用，和与其它治疗血管生成相关的疾病 的药剂共同应用的可能性。
用于实行本发明的方法的稠合的吡唑基化合物可以通过本领域熟练 的技术人员公知的流程进行制备。例如，美国专利号5,574,168，其转让 给本发明的受让人并且通过参考完全并入本发明，描述了包括下述合成步 骤的流程：首先，通过芳基碳酰氯与另一种芳基化合物偶联制备芳基芳基 酮。每种芳基化合物任选地是单或多取代的。然后将所述酮与芳烷基肼反 应，其芳基基团也任选地是单或多取代的，以形成含有3个芳基基团的腙。 将腙基团通过亚烷基连接转化到稠合的吡唑核上，另一芳基基团稠合到吡 唑核的4-C和5-C上，和第三个芳基基团直接与吡唑核的3-C连接。稠合 的吡唑基化合物的衍生物可以通过修饰任一芳基基团上的取代基而获得。
用于上述合成途径的化学药品可以包括，例如，溶剂，反应剂，催化 剂，保护基和去保护基试剂。所述合成途径还可以在本文具体描述的步骤 之前或之后额外地包括添加或移除适当的保护基的步骤，以最终允许合成 稠合的吡唑基化合物。另外，可以以变化的顺序或次序实行各个合成步骤， 以给出需要的化合物。有效用于合成可应用的稠合吡唑基化合物的合成化 学转化和保护基方法学(保护和去保护)是本领域已知的，并且包括，例 如，在R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers (1989)；TW.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis， 第二版，John Wiley和Sons(1991)；L. Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley和Sons(1994)；和L.Paquette， 编辑.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley和Sons (1995)以及其后续版本中描述。
如此合成的稠合吡唑基化合物可以进一步通过方法，诸如柱层析，高 效液相色谱，或重结晶而进行纯化。
已发现按照本发明的实施方案的稠合的吡唑基化合物具有抗血管生 成的作用和抗癌作用，如美国专利申请号2003/0186996，2005/0107406，和 2005/0209252中公开的那样，它们都是Teng等的，并且被转让给本发明 的受让人。这些申请通过参考完全并入本发明。
例如，已发现1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)吲唑(化合物1，将 在下文中详细描述)是一种新型的抗血小板药剂。机制研究揭示化合物1 的抗血小板活性与可溶的鸟苷酸环化酶(sGC)的NO-不依赖性活化相关。 最近，显示化合物1具有抗癌活性；它通过增加细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK)-抑制蛋白p21CIP1/WAP1和p27KIP1的表达而阻止人肝细胞癌HA22T 细胞中处于G0/G1的细胞周期，和抑制低氧诱导因子α(HIF-1)活性而阻 滞肿瘤的血管生成。化合物1还抑制Hep3B细胞中促红细胞生成素和血 管内皮生长因子的低氧诱导。
尽管先前发现化合物1具有针对某些癌症的抗癌作用，本发明的发明 人出乎意料地发现本发明的吡唑基化合物可以与其它化学治疗药剂一起 产生协同作用。用于实行本发明方法的化学治疗药剂是商购可获得的，或 者可以通过本领域公知的流程而合成。
与按照本发明的实施方案的稠合的吡唑基化合物一起应用的化学治 疗药剂可以通过各种机制起作用。例如，它可以通过DNA插入，通过调 节微管动力学，通过诱导细胞分化，通过诱导程序性细胞死亡，或者调节 细胞周期的任何机制而起作用。
DNA插入或DNA结合化学治疗药剂可以将其本身结合或插入到双链 DNA中。因此，依赖DNA的RNA转录被抑制。另外，DNA复制也受到 了妨碍。这些DNA结合剂中的一些还可以抑制拓扑异构酶I，其在DNA 复制过程中是必需的。因此，这些DNA结合剂可以导致DNA单链或双 链断裂。在细胞进入有丝分裂前，一些单链断裂物可以得到细胞中DNA 修复系统的修复。然而，没有得到修复的单链断裂物的部分和DNA双链 断裂物可以引起细胞染色体异常并且甚至是细胞死亡。DNA结合或插入 化学治疗药剂的实例可以包括，但不限于，多柔比星，柔红霉素，放线菌 素D，环磷酰胺和丝裂霉素C。
微管调节剂妨碍微管细胞骨架的装配和解装配。微管通过微管蛋白的 聚合而形成。由于微管骨架在细胞功能的各个方面起着重要的作用，所以 微管的聚合和解聚合是受控过程。可以妨碍微管的聚合和解聚合的药剂可 以用来调节细胞活性。秋水仙碱，秋水仙胺，和nocadazol通过与微管蛋 白结合和防止它加入到生长的微管的正端而抑制聚合。长春碱和长春新碱 聚集微管蛋白并且引起微管解聚，这通过停滞间期的细胞而阻滞有丝分 裂。泰素(紫杉醇)或环氧聚微管素通过与微管结合而稳定微管。
癌症可以由错乱的细胞分裂或细胞没有能力分化成为成熟的细胞型 而引起。因此，分化诱导剂可以用来诱导癌细胞分化。分化治疗药剂的实 例包括视黄酸代谢物和衍生物。例如，全反式视黄酸(ATRA)已经成功地 用作各种白血病，诸如急性早幼粒细胞白血病(APL)的“分化治疗”。ATRA 激活类视黄醇受体(RAR)并且引起早幼粒细胞分化(成熟)，从而防止这 样的细胞增殖。
其它化学治疗药剂及其机制的实例包括，但不限于，顺铂(顺式-二 氨基二氯化铂(II))，其通过与核DNA结合而诱导细胞毒性作用以妨碍正 常转录和/或DNA复制；博来霉素，其通过形成自由基而引起DNA分解； 托泊替康，伊立替康，或喜树碱，其抑制拓扑异构酶I；鬼臼毒素，其抑 制有丝分裂器官中的微管装配；普卡霉素，其与DNA结合并且以与放线 菌素D相似的方式抑制DNA、RNA、和蛋白合成；或者5-氟尿嘧啶，其 通过抑制胸腺嘧啶核苷的正常生产而抑制DNA合成。
上文所述是通常所用的化学治疗药剂和它们的作用机制。本领域的普 通技术人员应该理解，这些是示例性实例，并且本发明的实施方案并不限 于这些实例。相反，按照本发明的实施方案，稠合的吡唑基化合物可以与 任何已知的化学治疗药剂一起应用。
为了实行本发明的方法，稠合的吡唑基化合物和化学治疗药剂可以同 时或在不同的时间施用。例如，首先可以给癌症患者施用稠合的吡唑基化 合物(或含有稠合的吡唑基化合物的组合物)，并且然后给患者施用药用 载体和含有化学治疗药剂与药用载体的组合物。
在另一实例中，活性药剂同时施用，例如，应用含有稠合的吡唑基化 合物、化学治疗药剂、和药用载体的组合物。任何上述组合物可以口服、 肠胃外、通过吸入喷雾剂、或通过植入的储存库进行施用。当用于本文时， 术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜 内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或灌输技术。
口服施用的组合物可以是口服接受的剂量形式，包括，但不限于，片 剂、胶囊、乳剂和水性混悬液、分散液和溶液。对于片剂通常所用的载体 包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂，诸如硬脂酸镁，也典型地添加到片剂中。 对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服 施用水性混悬液或乳剂时，所述活性成分可以被悬浮或溶解在与乳化或悬 浮剂结合的油相中。如果需要，可以添加某些增甜剂、调味剂、或着色剂。
按照本领域已知的技术，应用适当的分散或湿润剂(诸如，例如，吐 温80)和悬浮剂，可以配制无菌注射组合物(例如，水性的或油质混悬 液)。无菌注射制备物还可以是在无毒的肠胃外可用的稀释剂或溶剂中的 无菌注射溶液或混悬液，例如，作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可用的赋 形剂和溶剂中，可以应用的是甘露醇、水、Ringer’s溶液和等渗氯化钠溶 液。另外，无菌的、不易挥发的(fixed)油便利地用作溶剂或混悬介质(例 如，合成单或甘油二酯)。脂肪酸，诸如油酸和其甘油酯衍生物有效地用 于制备注射剂，天然药用油、诸如橄榄油或蓖麻油、特别是它们的聚氧乙 烯化形式也是这样。这些油溶液或混悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散 剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。
按照药物配制领域公知的技术可以制备吸入组合物，并且可以制备成 在盐中的溶液，其应用苯甲醇或其它适当的防腐剂，提高生物利用度的吸 收增强剂，碳氟化合物，和/或本领域已知的其它增溶或分散剂。
药物组合物中的载体必须是“可接受的”，在该意义上，其与制剂的 活性成分相容(和优选地，能够稳定它)并且对要治疗的受试者没有毒害。 例如，稳定剂，诸如环糊精(其与稠合的吡唑基化合物形成特异的、更加 可溶的复合物)，可以用作药物赋形剂来递送稠合的吡唑基化合物。其它 载体的实例包括胶状二氧化硅，硬脂酸镁，纤维素，硫酸月桂钠，和D&C Yellow#10。
上述方法还可以包括放射性治疗。放射可以在患者施用需要剂量的稠 合的吡唑基化合物和化学治疗药剂之前，之中，或之后，应用到患者的癌 症位点。放射可以是电离辐射和非电离辐射。电离辐射具有足够的能量与 原子相互作用并且从它们的轨道上移除电子，这使得原子变成带电的或 “电离的”。它包括具有γ射线、X射线、中子、电子、α粒子、和β粒 子的辐射。非电离辐射是电磁辐射，其不具有足够的能量将电子从它们的 轨道上移除。它包括具有紫外线、可见光、红外线、微波、和无线电波的 辐射。辐射的剂量和时间应该足以赋予对所治疗的患者的治疗效果。它可 以有变化，如本领域的那些技术人员所公认的那样，取决于辐射的类型和 强度，要治疗的癌症的类型和位置，和患者的身体状况。
适当的体外检测可以用来初步评估一种或多种上述化合物和化学治 疗药剂的组合在抑制某些癌症细胞系的生长中的功效。所述组合还可以通 过体内检测进一步检验它在治疗癌症中的功效。例如，可以将所述组合施 用给患有癌症的动物(例如，小鼠模型)，并且然后评估其治疗功效。基 于所述结果，还可以确定适当的剂量范围和施用途径。
无需更详尽的描述，相信上述描述已经充分地能够实现本发明。因此， 下述具体的实施方案解释为仅仅是举例说明，并不是以任何方式限制本公 开内容的余下部分。本文所引用的所有的出版物，包括专利，通过参考完 全并入本文。
实施例
合成1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)吲唑(化合物1)
首先通过将无水氯化钙(88.8mg，0.8mmole)与硼氢化钠(60mg， 1.6mmole)在无水THF(20mL)中搅拌4hrs，而制备硼氢化钙。然后， 在30±2℃，将30mL含有88.0mg 1-苄基-3-(5’-甲酯基-2’-呋喃基)吲唑 (0.27mmole)逐滴加入到硼氢化钙溶液中。将所述混合物在回流下加热6 hrs，冷却，在碎冰中终止，置于减小的压力下以去除THF，并且过滤以 获得固体产物。将所述固体用二氯甲烷提取。将提取液浓缩至50mL，并 且加入石油醚后固体沉淀下来。收集所述沉淀物，并且通过柱层析(硅胶 -苯)进行纯化，以获得70.0mg 1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)吲唑，产 率为87％。
mp：108-109℃。
MS(％)，m/z：304(M+)。
IR(KBr)vmax：3350cm-1(-OH)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ：4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)， 5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz， H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45 (1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H.dd， J＝8.2.1.0Hz.C4-H)。
对癌细胞生长的抑制作用：
将无胸腺的裸鼠(BALB/c nu/nu雌性，6-8周龄)饲养在22℃，12h 光照/黑暗循环。将所述小鼠皮下注射A498肾癌细胞(107个细胞/小鼠)。 培养15天后，肿瘤长至100-150mm3大小。然后将小鼠随机分成6组(每 组5只小鼠)。组1(对照组)和组2的小鼠分别用0.5％羧甲基纤维素 (CMC)和在0.5％CMC中的化合物1(10mg/kg/天)口服处理。组3 和4的小鼠分别腹膜内注射紫杉醇和多柔比星(20mg/kg/周)。(紫杉醇和 多柔比星为商业产品)。组5的小鼠先用在0.5％CMC中的化合物1口服 处理(10mg/kg/天)，并且然后立即腹膜内注射紫杉醇(20mg/kg/周)。 组6的小鼠先用在0.5％CMC中的化合物1口服处理(10mg/kg/天)，并 且然后立即腹膜内注射多柔比星(20mg/kg/周)。每3-4天测量每只小鼠 中的肿瘤大小。当对照组的肿瘤大小达到1000-1500mm3时，将小鼠腹膜 内注射戊巴比妥施以安乐死。将肿瘤小心移出并且称重。
结果表明，用化合物1、紫杉醇、或多柔比星单独处理的小鼠具有比 对照组的肿瘤更小的肿瘤。它们还表明，用化合物1和紫杉醇结合或者化 合物1和多柔比星结合处理的小鼠具有比用化合物1、紫杉醇、或多柔比 星单独处理的那些小鼠出乎意料更小的肿瘤。
化合物1和全反式视黄酸(ATRA)在治疗白血病中的协同作用
22-28g重量8周龄的雄性BALB/c小鼠获得于实验室动物中心，国 立台湾大学医学院(Laboratory Animal Center，National Taiwan University College of Medicine(台北，台湾))。鼠科骨髓单核细胞白血病细胞系 WEHI-3获得于食品工业研究和发展学院(Food Industry Research and Development Institute(Hsinchu，台湾))。鼠科WEHI-3白血病细胞系最先 在1969年建立，并且表现出骨髓单核细胞白血病的特征。这种细胞系可 以在同基因(syngenic)BALB/c小鼠中诱导白血病，从而可用于评估药 物的抗白血病作用。(参见，He Q，Na X，“The effects and mechanisms of a novel 2-aminosteroid on murine WEHI-3B leukemia cells in vitro and in vivo，” Leuk.Res.25(6)：455-61，(2001))。将所述细胞置于75-cm2组织培养瓶中， 并且在37℃，在潮湿的5％CO2气氛下，在补充了10％胎牛血清、1％青 霉素-链霉素(10,000U/ml青霉素和10mg/ml链霉素)和1％谷氨酰胺的 RPMI 1640培养基中生长。
为了检测化合物1、ATRA、和与ATRA组合的化合物1对携带WEHI-3 白血病细胞的BALB/c小鼠(WEHI-3/BALB/c小鼠)存活的效果，将化合物 1、ATRA、和与ATRA组合的化合物1以30mg/kg/2天持续14天腹膜内 (i.p.)施用给已经接种1×105个WEHI-3细胞的BALB/c小鼠。具体地， 将BLAB/c小鼠分成4组。组I只用WEHI-3腹膜内(i.p.)注射。组II 在WEHI-3细胞注射后14天开始化合物1治疗(i.p.30mg/kg/2天持续14 天)。组III在WEHI-3细胞注射后14天开始ATRA治疗(i.p.30mg/kg/2 天持续14天)。组IV在WEHI-3细胞注射后14天开始化合物1和ATRA 治疗(i.p.30mg/kg/2天持续14天)。在将所述动物称重和采血以及处死 用于进一步实验之前，将对照小鼠和所有组的小鼠治疗2周。
这些研究的结果表明，化合物1、ATRA、和与ATRA组合的化合物 1显著地延长了WEHI-3/BALB/c小鼠的平均存活时间(表1)。 WEHI-3/BALB/c小鼠的平均存活时间为30天，并且当WEHI-3/BALB/c 小鼠分别用30mg/kg/小鼠的化合物1、ATRA、和与ATRA组合的化合物 1处理时，这增加到40，42和44天(P＜0.05，对数等级和普遍性Wilcoxon’s 检验)。
表1.化合物1、ATRA、和与ATRA组合的化合物1对携带WEHI-3白血 病细胞的BALB/c小鼠存活的作用。
组/治疗 小鼠数目 存活天数 平均值±S.D. 范围 组I 未治疗 10 26.0土3.9 20-30 组II YC-1 (30mg/kg/小鼠；QD*7) 10 32.3±4.9* 22-40 组III ATRA 10 33.9±5.0* 26-42
(30mg/kg/小鼠；QD*7) 组IV YC-1组合ATRA (30mg/kg/小鼠；QD*7) 10 35.9±5.2** 28-44
QD*7：2天1次，共7次
*p＜0.05，对数等级检验；*p＜0.05，普遍性Wilcoxon’s检验。
**p＜0.01，对数等级检验；**p＜0.01，普遍性Wilcoxon’s检验。
将脾和肝组织从个体动物分离，照相，称重，并且进行组织病理学检 查。代表性的结果在图1和2中显示。这些结果表明，化合物1、ATRA、 和与ATRA组合的化合物1在1个月的实验内改善白血病小鼠的体重减少 (数据未显示)。与未治疗的白血病小鼠中的相比较，在所有治疗组中脾、 淋巴结、肝转移的增大被显著地减小了(图1)。另外，脾切片的H-E染 色揭示成熟原粒细胞向脾红髓的渗透在化合物1、ATRA、和与ATRA组 合的化合物1治疗组中减小了(图2)。
为了研究化合物1、ATRA、和与ATRA组合的化合物1在WEHI-3 细胞中体外对细胞周期的生长抑制作用，具有TUNEL染色的NBT还原 被用来确定分化和程序性细胞死亡。在将细胞用化合物1(5μM)、ATRA (1μM)、和与ATRA组合的化合物1处理24h后，在ATRA和与ATRA 组合的化合物1处理的WEHI-3细胞中观察到明显的G0/G1停滞。这种 现象没有在ATRA处理的WEHI-3细胞中发生，但是化合物1和与ATRA 组合的化合物1处理的WEHI-3细胞具有增加的亚G1群体(数据未显示)。
为了研究化合物1诱导程序性细胞死亡和ATRA诱导WEHI-3细胞分 化的能力，在用化合物1、ATRA、和与ATRA组合的化合物1处理的 WEHI-3细胞中评估NBT还原活性和TUNEL/DAPI染色。在用化合物1 和与ATRA组合的化合物1培养24 h后，细胞表现出核收缩，染色质浓 缩核DNA断裂。在ATRA处理的WEHI-3细胞中没有观察到这一现象(图 3A)。同对照细胞相反，在用ATRA和与ATRA组合的化合物1处理的细 胞中观察到NBT还原的显著增加。在化合物1、ATRA、和与ATRA组合 的化合物1处理后，NBT阳性细胞的百分比分别为3.56，33.42和45.22 ％，和TUNEL阳性细胞分别为40.33，5.45和45.22％(图3B)。这些结 果表明，在WEHI-3细胞中ATRA诱导分化和化合物1诱导程序性细胞死 亡。
对于程序性细胞死亡的进一步评估，在化合物1处理的WEHI-3细胞 中我们检验了DNA断裂和胱天蛋白酶-3活性检测。琼脂糖凝胶电泳表明， 从用5μM化合物1处理12和24h的WEHI-3细胞提取的DNA断裂成为 180-200个碱基对的梯子(图4A)。为了确定对于由化合物1诱导的程序 性细胞死亡是否需要胱天蛋白酶-3的活化，在暴露于50μM化合物1前， 在WEHI-3细胞中，我们使用或不使用胱天蛋白酶-3抑制剂 (Z-DEVD-FMK)预处理。如在图4B中所示，YC-1处理12，18和24h引 起胱天蛋白酶-3活性的快速诱导。所诱导的胱天蛋白酶-3活性受到了 Z-DEVD-FMK预处理的阻滞。这些结果表明，化合物1对程序性细胞死 亡的诱导是由胱天蛋白酶-3活性引起的特异性生化事件。
其它实施方案
在本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式组合。本说明书中 公开的每一特征可以由提供相同的、等价的、或类似的目的的备选特征代 替。因此，除非另外清楚地表述，公开的每一特征仅是一类系列等价或相 似特征的实例。
从上述描述中，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的本质特 征，并且不背离其精神和范围，可以进行本发明的各种改变和改进以使之 适于各种应用和状况。例如，与稠合的吡唑基化合物结构类似的化合物也 可以用于实行本发明。因此，其它实施方案也属于本权利要求。