除非特殊定义,本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号 及缩写符号可以与其全名互换使用。例如:“PEG”和“聚乙二醇”具有相同的含义;“干扰素α”、 “IFN-α”及“α干扰素”含义也相同。
除非特殊指明,本文所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常 使用的技术和方法,可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。
试剂盒的使用是根据制 造商或供应商提供的
说明书进行。
本发明MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a及IFNα-2b四种蛋白的类似物可以通过氨基酸功 能等效分子的取代、添加或缺失来获得,如在本技术领域公知,用性质类似的一个或多个氨 基酸残基取代原序列内相应的氨基酸残基改变原蛋白质序列,形成沉默改变。
本发明中聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分,如本领域技术人员公知,可以具有直链或分 支结构。是一种巯基反应PEG化试剂,能够和半胱氨酸残基的巯基发生反应。本发明尝试用 分子量约5000、10000、12000、20000、30000和40000道尔顿的PEG对四种α干扰素突变 体进行修饰,均可以获得PEG-干扰素的衍生物。资料显示:PEG化蛋白的半衰期随着PEG 分子量的增大有不同程度延长。本发明实施例中用20000和40000道尔顿的PEG作为低、高 分子量的代表具体阐述PEG-干扰素衍生物的制作纯化方法及药效、药代试验。
在优选的实施例中,PEG化试剂是Nektar Therapeutics提供的mPEG-MAL[也写做 PEG-MAL(20KD)]或mPEG2-MAL[也写做PEG-MAL(40KD)],文中mPEG-MAL和 mPEG2-MAL有时也一般性的简写为PEG-MAL或PEG。
本发明中MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a及IFNα-2b四种α干扰素的工程菌由北京三元 基因工程有限公司提供。
下面实施例将进一步解释本发明。
实施例1A MIFNCys86的基因构建和扩增
采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),以重叠延伸的手段进行定点突变。定点突变技 术已经比较成熟,程序比较固定。可以根据具体试验调整的是引物的
位置长度和PCR的反应 条件,在实际操作中可以有多种组合,都可以达到定点突变的目的,均涵盖在本发明的保护 范围之内。本实施例所列为优选方案(同样原因,实施例1B~1D所列也为优选方案)。
设计两对引物,上游引物P1为T7 promoter primer(taatacgactcactataggg),P3序列为 ggaaaaattctgcaccgaactgt;下游引物P2为T7 terminator primer(gctagttattgctcagcgg),P4序列为 acagttcggtgcagaatttttcc。突变位点包含在P3和P4之中。
提取MIFN的质粒作为模板,首轮PCR包括两个反应体系:反应体系1引物为P1、P4, 扩增突变位点及其上游的DNA序列;反应体系2引物为P2、P3,扩增突变位点及其下游的 DNA序列。反应条件为94℃ 4min、94℃ 1min,然后55℃ 2min、72℃ 2min共30个循环。 第二轮PCR为重叠延伸PCR,以首轮PCR的产物为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增。 反应条件为94℃ 4min、94℃ 1min,然后56℃ 2min、72℃ 2min共30个循环。图1表示两轮 PCR产物的琼脂糖电泳图谱。
第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA
片段,用Nde I/EcoR I 双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1B IFN-Con 1Cys86的基因构建和扩增
设计两对引物,上游引物P1为T7 promoter primer(taatacgactcactataggg),P3序列为 ggataaattctgcaccgaactgt;下游引物P2为T7 terminator primer(gctagttattgctcagcgg),P4序列为 acagttcggtgcagaatttatcc。突变位点包含在P3和P4之中。
PCR反应程序同实施例1A,不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN-Con 1的 质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片段,用Nde I/EcoR I 双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1C IFN α-2aCys85的基因构建和扩增
引物设计同实施例1B,PCR反应程序同实施例1A,不同之处是本实施例中首轮PCR反 应模板为IFNα-2a的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片 段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1D IFNα-2bCys85的基因构建和扩增
引物设计同实施例1B,PCR反应程序同实施例1A,不同之处是本实施例中首轮PCR反 应模板为IFNα-2b的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片 段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例2A MIFNCys86重组质粒的构建、转化和鉴定
在重组质粒的构建和转化中,双酶往往可以有多种选择,连接反应的条件也可以有所变 化,都可以完成重组质粒的构建;本实施例中宿主细胞选择了实验室常用的JM109和DH5α, 并不排斥用其他宿主进行转化。本着科学、方便和快捷的原则,本实施例所列重组质粒的构 建、转化和鉴定方案为优选方案(同样原因,实施例2B~2D所列也为优选方案)。
将pET-23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切,经琼脂糖电泳回收并和实施例1A中最 后回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为:2×Rapid buffer 4~5μl、T4 DNA Ligase 1μl、 目的片段1~2μl、载体3μl,4℃过夜连接。
制备JM109或DH5α感受态细胞,转化上述连接产物,涂布氨苄平板,37℃过夜培养。
挑取单菌落作为模板,用本发明实施例1A中设计的引物P1、P2进行PCR扩增,扩增 产物经琼脂糖电泳(电泳图谱如图2所示),阳性克隆应在720bp左右出现特异条带。取阳 性克隆小量培养,提取质粒用Nde I/EcoR I双酶切,分别在3kb左右和500bp左右出现特 异的条带(琼脂糖电泳图谱如图3所示),与预计情况相符,初步说明重组质粒构建成功。为 了进一步确认其序列,以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例2B IFN-Con 1Cys86重组质粒的构建、转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例1B回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作 中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。 为确认序列,同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例2C IFNα-2aCys85重组质粒的构建、转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例1C回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作 中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。 为确认序列,同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例2D IFNα-2bCys85重组质粒的构建、转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例1D回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作 中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。 为确认序列,同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例3A MIFNCys86的表达和纯化
将实施例2A中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。 以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的MIFNCys86约占菌体总蛋白的30~50%,主要以 包涵体形式存在。
粗纯:将
发酵收集的菌体以TE溶解,超声破菌后收集包涵体,然后用6~8mol/L的 Gu·HCl或尿素溶解,室温搅拌或4℃放置过夜,再用浓度为0.05~0.2mol/L、pH8.0~10.5 的
硼酸复性,复性液置4℃过夜。4℃离心取上清,即为粗纯的MIFNCys86。
精纯:依次采用了疏水层析、DEAE阴离子交换层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工 艺。具体步骤如下:将复性液稀释成含10%~30%(NH4)2SO4的溶液上样到Phenyl Sepharose 层析柱,用两个柱体积的10%~30%(NH4)2SO4冲洗,然后用15%~35%乙二醇进行洗脱, 收集洗脱峰组分用A液(10~80mmol/L Tris-HCl pH7.5~10.5)充分
透析;将透析后的洗 脱液上样到用A液充分平衡的DEAE Sepharose FF层析柱,然后用B液(含0.2~0.4mol/L NaCl的A液)进行洗脱,收集洗脱峰组分;将DEAE Sepharose FF离子交换层析的洗脱峰 组分上样到用C液(20~40mmol/L PB+20~40mmol/L NaCl Ph6.5~7.5)充分平衡好的 Sephacryl S-100层析柱,用C液冲洗,收集洗脱峰组分。经以上纯化流程后,最后得到的 MIFNCys86纯度在95%以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例3B IFN-Con 1Cys86的表达和纯化
将实施例2B中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。 以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN-Con 1Cys86约占菌体总蛋白的30~50%,主 要以包涵体形式存在。
本实施例纯化方法和步骤与实施例3A完全相同。最后得到的IFN-Con 1Cys86纯度在95% 以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例3C IFN α-2aCys85的表达和纯化
将实施例2C中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。 以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFNα-2aCys85约占菌体总蛋白的30~50%,主要 以包涵体形式存在。
粗纯:本实施例所用到的粗纯方法与实施例3A相同。
精纯:依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯 化工艺。具体方法:将复性液以30mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀释10倍上样到DEAE Sepharose FF离子交换层析柱,用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液 洗脱,收集洗脱峰;将上一步洗脱样品经PBS(pH7.0)3倍稀释,上样到IFNα-2a单抗层析柱, 以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脱,收集洗脱峰;再将上一步洗脱 样品上样到Sephacryl S-100层析柱,以PBS(pH7.0)洗脱。最后得到的IFNα-2aCys85纯度在95% 以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例3D IFNα-2bCys85的表达和纯化
将实施例2D中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。 以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFNα-2bCys85约占菌体总蛋白的30~50%,主要 以包涵体形式存在。
粗纯:本实施例所用到的粗纯方法与实施例3A相同。
精纯:依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯 化工艺。具体方法:将复性液以30mmol/L Tris-HCl(pH8.0)稀释10倍上样到DEAE Sepharose FF离子交换层析柱,用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液 洗脱,收集洗脱峰;将上一步洗脱样品经PBS(pH7.0)3倍稀释,上样到IFNα-2b单抗层析柱, 以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脱,收集洗脱峰;再将上一步洗脱 样品上样到Sephacryl S-100层析柱,以PBS(pH7.0)洗脱。最后得到的IFNα-2bCys85纯度在95% 以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例4 MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85的PEG偶联
本发明四种干扰素α突变体可以和各种分子量的PEG偶联,在优选实施例中,PEG有两 种mPEG-MAL和mPEG2-MAL,平均分子量分别约为20KD、40KD。
1)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85的浓缩
以上四种干扰素α突变体可以分别用DEAE Sepharose FF层析柱进行浓缩。具体方法如 下:将实施例3A~3D其中之一纯化的蛋白样品以10~80mmol/L Tris-HCl pH7.5~8.5溶 液稀释2倍或以上,上样到DEAE层析柱,然后用20mmol/L PB缓冲液(pH7.6)+300mmol /L NaCl的洗脱得到目的蛋白的浓缩液。
2)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85与mPEG-MAL的偶联
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85与mPEG(20KD)-MAL偶联反应, 其单PEG衍生物分别写做:mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、 mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85。
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85与mPEG(40KD)-MAL偶联反应, 其单PEG衍生物分别写做:mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、 mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85。
偶联反应步骤具体如下:
取本实施例步骤1中适量体积的浓缩液,调整蛋白浓度到8~12mg/ml,加入摩尔比为1∶ 1的PEG粉末,轻轻摇动使粉末溶解后于4℃反应过夜,即反应时间应超过10小时。SDS-PAGE 检测反应的偶联程度(图5-6所示)。
实施例5 干扰素α突变体衍生物的纯化
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对修饰产物进行纯化,具体条件如下:采 用25mmol pH8.0 Tris缓冲体系将反应液稀释20~30倍后,以流速为3~4ml/min上样于平衡过 的DEAE柱,待基线平衡后,用含NaCl浓度为80mM的25mM pH8.0 Tris洗脱液洗脱得到 目的蛋白的洗脱峰。最后得到的重组蛋白纯度都在95%以上(SDS-PAGE图谱如图7-8所示)。
实施例6 通过WISH-VSV系统测定4种α干扰素、突变体及突变体聚乙二醇衍生物的体外 抗病毒活性
采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗病毒活性,是本技术领域 公知的方法,具体参照2005版《中华人民共和国药典》三部附录X C“干扰素的生物活性测 定”。
本实施例测定了16种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性,具体包括:
4种α干扰素:MIFN、IFN-Con 1、IFNα-2a和IFNα-2b;
4种α干扰素的突变体:MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85(本发 明实施例3A~3D制备);
还有8种聚乙二醇衍生物:mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、 mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、 mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85(本发 明实施例5制备)。
其体外抗病毒活性测定结果见下述表1~4。
表1:MIFN、MIFNCys86、mPEG(20KD)-MIFNCys86及mPEG(40KD)-MIFNCys86的体外抗 病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%) MIFN MIFNCys86 mPEG(20KD)-MIFNCys86 mPEG(40KD)-MIFNCys86 5.57±0.38×108 5.68±0.29×108 5.84±0.35×106 4.12±0.31×106 - 100 1.03 0.73
表2:IFN-Con 1、IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86及mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%) IFN-Con 1 IFN-Con 1Cys86 mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86 mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86 5.18±0.24×108 5.13±0.30×108 5.24±0.27×106 4.05±0.25×106 - 100 1.02 0.79
表3:IFNα-2a、IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85 的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%) IFNα-2a IFNα-2aCys85 mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85 mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85 1.09±0.20×108 1.06±0.23×108 1.79±0.30×106 1.28±0.21×106 - 100 1.69 1.21
表4:IFNα-2b、IFNα-2bCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85 的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%) IFNα-2b IFNα-2bCys85 mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85 mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85 1.10±0.20×108 1.12±0.27×108 1.64±0.33×106 1.20±0.26×106 - 100 1.46 1.07
实施例7 大鼠药代动力学研究
通过本实施例表5所示的药代动力学研究方案测定了12种干扰素(或衍生物)的体外抗 病毒活性,具体包括:
4种α干扰素的突变体:MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFNα-2bCys85(本发 明实施例3A~3D制备);
8种聚乙二醇衍生物:mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、 mPEG(20KD)-IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、 mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2bCys85(本发 明实施例5制备)。
表5:药代动力学研究方案:
α干扰素的突变体 α干扰素突变体的PEG衍生物 大鼠 给药途径 给药方式 给药剂量 取血时间点 测定方法 6只 皮下 单次 3.3MIU 0,0.2,0.5,0.75,1,2,4,8,12,16,24 WISH/VSV 6只 皮下 单次 5.4MIU 0,0.5,2,4,8,12,16,24,48,72,96,168 WISH/VSV
在上述试验方案中,从大鼠
眼底收集血样,然后离心分离收集血清,用CPE法(WISH/VSV 系统)检测血清样品中干扰素含量。
表6:MIFNCys86及其PEG衍生物的药代动力学参数表
PK参数 MIFNCys86 mPEG(20KD)-MIFNCys86 mPEG(40KD)-MIFNCys86 t1/2Ka(h) t1/2Ke(h) Tpeak(h) Cpeak(IU/ml) AUC(IU·h/ml) 0.25 1.57 0.78 23823.7 76230.8 15.0 18.0 24.3 26941.7 1744758.0 17.1 24.8 26.5 30628.6 2815579.3
经3P87
软件拟合发现MIFNCys86及其PEG衍生物在SD大鼠体内的代谢规律符合一级吸 收的一房室模型。PEG化可显著改善MIFNCys86的药代动力学性质,与MIFNCys86相比,mPEG- MIFNCys86的吸收半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长;药时曲线下面积显著增加;清除 率显著降低。可见,PEG化可以延长MIFNCys86的体内平均存留时间,降低清除率。
在IFN-Con 1Cys86及其PEG衍生物、IFNα-2aCys85及其PEG衍生物、IFNα-2bCys85及其 PEG衍生物的药代动力学试验中也有同样发现,即:与修饰前相比,PEG化的干扰素的吸收 半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长;药时曲线下面积显著增加;清除率显著降低。
由此证明,PEG化可以延长干扰素的体内平均存留时间,降低清除率。
至此,已经对本发明进行了较为充分的描述。优选的实施例只能阐述而不限制本发明, 对于本领域的技术人员来说,实现本发明的方法和手段可以变化和改进,均应涵盖在本发明 的保护范围之内。
后面附氨基酸和核苷酸的
序列表,其中IFN-Con 1、IFNα-2a和IFNα-2b的核苷酸序列 为公知序列,在本发明的具体实施例中只是把相应位点的密码子突变成tgc,因此本发明未附 IFN-Con 1Cys86、IFNα-2bCys85和IFNα-2bCys85的DNA序列。
附序列表:
序列表1为MIFNCys86的氨基酸序列;
序列表2为IFN-Con 1Cys86的氨基酸序列;
序列表3为IFNα-2aCys85的氨基酸序列;
序列表4为IFNα-2bCys85的氨基酸序列;
序列表5为MIFNCys86的DNA序列;
序列表1:
MIFNCys86的氨基酸序列
序列长度:166个氨基酸
序列描述:SEQ ID NO.1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg His Asp Phe Pro Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly
35 40 45
Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met
50 55 60
Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala
65 70 75
Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr
80 85 90
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly
95 100 105
Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val
110 115 120
Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys
125 130 135
Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg
140 145 150
Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys
155 160 165
Asp
166
序列表2:
IFN-Con 1Cys86的氨基酸序列
序列长度:166个氨基酸
序列描述:SEQ ID NO.2
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly
35 40 45
Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met
50 55 60
Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala
65 70 75
Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr
80 85 90
Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly
95 100 105
Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val
110 115 120
Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys
125 130 135
Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg
140 145 150
Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys
155 160 165
Asp
166
序列表3:
IFNα-2aCys85的氨基酸序列
序列长度:165个氨基酸
序列描述:SEQ ID NO.3
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile
50 55 60
Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala
65 70 75
Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln
80 85 90
Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
95 100 105
Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
110 115 120
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr
125 130 135
Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser
140 145 150
Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
155 160 165
序列表4:
IFNα-2bCys85的氨基酸序列
序列长度:165个氨基酸
序列描述:SEQ ID NO.4
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile
50 55 60
Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala
65 70 75
Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln
80 85 90
Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val
95 100 105
Thr Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
110 115 120
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr
125 130 135
Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser
140 145 150
Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
155 160 165
序列表5:
NIFN的核苷酸序列
序列长度:507bp
序列描述:SEQ ID NO.5
atgtgtgacc tgccgcagac ccactctctg ggttctcgtc gtaccctgat cctgctggct 60
cagatgcgtc gtatctctcc gttctcttgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg 120
caggaagagt tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctctgt tctgcacgaa 180
atgatccagc agaccttcaa cctgttctct accaaagact cttctgctgc ttgggacgaa 240
tctctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcatgc 300
gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc tatcctggtt 360
gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctctccgtgt 420
gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttctttct ctctgtctac caacctgcag 480
gaacgtctgc gtcgtaaaga ctaatag 507