干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物
阅读：1010发布：2020-05-11
专利汇可以提供干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，涉及干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法，两者的药物组合物和在制备 治疗 病毒性 疾病 的药物中的用途。所述的干扰素突变体是将干扰素 氨 基酸序列中从N端计的第112位的半胱氨酸突变为丝氨酸，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述的干扰素突变体的聚乙二醇衍生物是由所述的干扰素突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa–40KDa之间。本发明的干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物有更高的抗病毒活性，更好的药理作用与 稳定性 ，并具有更可靠的安全性。，下面是干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物专利的具体信息内容。
1.干扰素去半胱氨酸突变体，其特征是将干扰素氨基酸序列中从N端计的第112位的Cys突变为Ser，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的干扰素去半胱氨酸突变体的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇衍生物由所述的干扰素去半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa-40KDa之间。
3.根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在10KDa-20KDa之间。
4.根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是普通氨基聚乙二醇修饰剂，所述的普通氨基聚乙二醇修饰剂是修饰蛋白质中N末端氨基酸残基上的游离氨基和非N末端赖氨酸残基上的游离氨基的聚乙二醇修饰剂。
5.根据权利要求4所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的普通氨基聚乙二醇修饰剂选自羧基聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇修饰剂、苯并三唑碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺聚乙二醇修饰剂、琥珀酰羧甲基酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺丁酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺己酸酯聚乙二醇修饰剂、硝基苯碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺戊二酯聚乙二醇修饰剂、Y形NHS酯聚乙二醇修饰剂、Y形羧基聚乙二醇修饰剂中的一种。
6.根据权利要求2所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的聚乙二醇修饰剂是N末端氨基聚乙二醇修饰剂。
7.根据权利要求6所述的聚乙二醇衍生物，其特征是所述的N末端氨基聚乙二醇修饰剂选自丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形乙醛聚乙二醇修饰剂中的一种。
8.根据权利要求2-7之一所述的聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)制备浓缩的所述的干扰素去半胱氨酸突变体溶液，使其浓度达到2.0-20mg/ml，并使所述的干扰素去半胱氨酸突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二醇修饰反应的缓冲溶液体系；
2)将上述得到的浓缩的干扰素去半胱氨酸突变体溶液与聚乙二醇修饰剂接触进行修饰反应；
3)对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的聚乙二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的干扰素去半胱氨酸突变体，并除去连接有多个聚乙二醇分子的干扰素去半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物。
9.根据权利要求1-7之一所述干扰素去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物的药物组合物，其特征是含有治疗有效量的所述的干扰素去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物，以及适宜量的可药用载体。
10.根据权利要求1-7之一所述的干扰素去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物
技术领域
[0001] 本发明一般的涉及干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法，两者的药物组合物和在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途；特别的涉及干扰素λ的去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物，后者的制备方法，两者的药物组合物和在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
背景技术
[0002] 干扰素(interferon,IFN)是一种最初由动物机体产生的兼具抗病毒、抗增殖与免疫调节作用的细胞因子蛋白质类药物，根据其产生部位、作用机理、药效特点等的不同可以分为I、II、III三种大的类型。其中I型干扰素主要是指干扰素α与干扰素β，干扰素α又有包括干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素α1b在内的超过20种的天然亚型；II型干扰素主要是指干扰素γ；III型干扰素主要是指干扰素λ，包括干扰素λ1、干扰素λ2、干扰素λ3三种天然亚型。
[0003] 相较于I、II型干扰素，III型干扰素的发现与报道较晚。其中干扰素λ1最早由津莫吉尼蒂克斯公司公开于其国际专利申请PCT/US2001/021087(国际公布日2002年1月10日)中。其由181个氨基酸构成，并在自N端计的第15位、第49位、第112位、第145位、第171位有5个半胱氨酸。这5个半胱氨酸形成两对分子内二硫键。
[0004] 干扰素λ2与干扰素λ3随后亦由津莫吉尼蒂克斯公司公开于其国际专利申请PCT/US2002/012887(国际公布日2002年10月31日)中。它们均由175个氨基酸构成，并在自N端计的第16位、第48位、第50位、第115位、第148位、第167位、第174位有7个半胱氨酸。这7个半胱氨酸形成三对分子内二硫键。
[0005] 对比研究结果表明，在三种干扰素λ分子中，干扰素λ3的抗病毒活性最高，干扰素λ2的抗病毒活性最低，而干扰素λ1的抗病毒活性居中。
[0006] 干扰素λ1在最初公开时的代号为zcyto21，干扰素λ2在最初公开时的代号为zcyto20，干扰素λ3在最初公开时的代号为zcyto22。在随后的研究中由于发现它们的基因、蛋白质三级结构与白介素10(IL-10)非常接近，因此它们被归于白介素10家族，分别被重新命名为IL-29、IL-28A与IL-28B。
[0007] 尽管zcyto21、zcyto20与干扰素α的氨基酸序列一致性(也即同源性)只有17％，与干扰素β的氨基酸序列一致性只有14％，与干扰素γ的氨基酸序列一致性只有4％；zcyto22与干扰素α的氨基酸序列一致性只有16％，与干扰素β的氨基酸序列一致性只有13％，与干扰素γ的氨基酸序列一致性只有4％，但它们在随后的研究中都发现和确认与传统的干扰素有相似的信号转导途径，有很多类干扰素性质。因此从功能的角度出发，它们最终分别被命名为干扰素λ1、干扰素λ2与干扰素λ3。
[0008] 作为最早发现与最重要研究开发干扰素λ的公司，津莫吉尼蒂克斯公司在发现三种天然的干扰素λ分子并研究其作用机理与药理活性后，又研究了干扰素λ的突变体、干扰素λ或其突变体的聚乙二醇衍生物、干扰素λ或其突变体或其衍生物的制备方法、干扰素λ或其突变体或其衍生物的医药用途、干扰素λ或其突变体或其衍生物的联合用药等，并在此基础上形成了一系列的各国专利申请与授权专利。例如国际专利申请PCT/US2004/025864(国际公布日2005年3月17日)公开了诸多的干扰素λ的突变体及其聚乙二醇衍生物；国际专利申请PCT/US2005/026951(国际公布日2006年2月2日)公开了IL-28和IL-29治疗癌症和自身免疫性疾病的方法；国际专利申请PCT/US2006/039139(国际公布日2007年4月12日)公开了生产IL-29的方法；国际专利申请PCT/US2009/046451(国际公布日2009年12月10日)公开了IL-28A、IL-28B和IL-29治疗丙型肝炎的方法。
[0009] 虽然现有技术中与干扰素λ相关的绝大多数研究和/或开发工作由津莫吉尼蒂克斯公司从事与完成，并在此基础上形成了众多的专利与非专利公开文献，但国内外亦有一些其它公司/研究机构在从事干扰素λ的研究和/或开发工作，并报道了研究和/或开发成果。例如申请人帝国创新有限公司在其国际专利申请PCT/GB2006/050281(国际公布日2007年3月15日)中公开了干扰素λ治疗呼吸道疾病的方法；申请人汕头大学医学院在其中国专利申请200410052377.8(公布日2005年9月21日)中公开了IL-29的生产方法及重组IL-29工程菌；申请人武汉大学在其中国专利申请200910062246.0(公布日2009年11月11日)中公开了干扰素λ在抗人类免疫缺陷病毒中的应用；申请人北京凯因科技股份有限公司在中国专利申请201110020949.4(公布日2012年7月18日)中公开了PEG化的干扰素λ，其是由巯基聚乙二醇修饰剂修饰干扰素λ得到。
[0010] 一系列的研究结果表明，与传统的I、II型干扰素相比，干扰素λ有独特的细胞靶向性与受体分布的组织特异性，而且很多临床不良反应如骨髓抑制、ALT/AST升高、发热、恶寒、恶心、关节痛等明显降低，因此干扰素λ在治疗上呼吸道感染疾病中有明显的优势。但是由于干扰素λ本身的体内外活性低于传统的I、II型干扰素，加之干扰素λ作为细胞因子蛋白质类药物存在稳定性差、半衰期短的特点，这些缺点都限制了其临床推广应用的前景。因此，有必要在已有干扰素λ及其突变体的基础上研究新的干扰素λ突变体，以进一步改善干扰素λ的稳定性，并提高其生物学活性(抗病毒活性)。在此基础上，有必要优选与优化蛋白质的长效技术用于干扰素λ的突变体，以在尽可能高的保留干扰素λ的生物学活性的基础上进一步改善其稳定性，并延长其体内药代半衰期。
发明内容
[0011] 本发明的首要目的是提供一种干扰素λ的去半胱氨酸突变体，以解决现有的干扰素λ1氨基酸序列中有奇数个半胱氨酸，造成其性质不稳定，抗病毒活性偏低的缺点。
[0012] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的干扰素λ的去半胱氨酸突变体将干扰素λ1氨基酸序列中从N端计的第112位的半胱氨酸(Cys，C)突变为丝氨酸(Ser，S)，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0013] 为了获得干扰素λ的去半胱氨酸突变体，需要先后进行表达干扰素λ去半胱氨酸突变体分子的基因工程菌或基因工程细胞的构建、基因工程菌或基因工程细胞的发酵和发酵产物的纯化，优选进行表达干扰素λ去半胱氨酸突变体分子的大肠杆菌工程菌的构建、发酵和发酵产物的纯化。
[0014] 在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达干扰素λ去半胱氨酸突变体的基因，采用的方法包括但不局限于全基因合成、PCR法(包括重叠延伸PCR法)。在大量获得表达干扰素λ去半胱氨酸突变体的基因后选择适宜的载体，用本领域技术人员公知的构建重组载体的方法将表达干扰素λ去半胱氨酸突变体的基因转入所述载体从而构建重组载体。所述重组载体优选质粒载体，一般含有启动子、多克隆位点(MCS)和终止子，并应具有一组或多组双酶的各自单一的酶切位点，适宜被转入对应的宿主菌或宿主细胞。当选择的宿主菌或宿主细胞为真核宿主菌或真核宿主细胞时，还需进一步选择分泌表达或胞内可溶性表达的载体。例如当用毕赤酵母作为表达系统时前者包括但不局限于pHIL-S1、pPIC9、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα、pYAM75P，后者包括但不局限于pHIL-D2、pAO815、pPIC3K、pPIC3.5K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ。
[0015] 然后利用电穿孔法、PEG法、氯化锂法、原生质体转化法等本领域技术人员公知的方法将重组载体转入宿主菌或宿主细胞构建表达干扰素λ去半胱氨酸突变体的基因工程菌或基因工程细胞。所述的宿主菌或宿主细胞可以选择原核宿主菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸杆菌(Lacticacid bacteria)等，优选大肠杆菌；也可以选择真核宿主菌或宿主细胞，例如毕赤酵母(Pichia.pastoris)、汉逊酵母(Hansenula anomala)、CHO细胞等，优选毕赤酵母。
[0016] 工程菌或工程细胞的发酵应选择适宜其生长的培养基组成、pH、温度、通气量、培养时间与补料操作等条件。
[0017] 对于大肠杆菌工程菌的发酵条件：优选LB培养基，培养过程中的温度控制在30-37℃之间；pH控制在6.0-8.0之间(必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种有机氮源，优选氨水)；通气量(溶氧)应满足菌体或细胞的生长需要及产物表达合成的需要；培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的情况下培养时间为6-48小时之间。
[0018] 而对于真核表达系统工程菌的发酵条件，尤其是毕赤酵母工程菌的发酵条件：常用的诱导表达前培养基包括但不局限于LB培养基、YPD培养基、YPDS+Zeocin培养基、MGY培养基、MGYH培养基、BMG培养基、BMGY培养基、BSM培养基、RD培养基、RDH培养基、MD培养基、MDH培养基、SOC培养基、MM培养基；诱导表达后的培养基中需含有一定浓度的甲醇以全部替代或部分替代诱导表达前培养基中的碳源物质，由于甲醇浓度过低不利于产物的诱导表达，而甲醇浓度过高时会对产物的诱导表达形成抑制，所以培养基中甲醇的浓度优选在0.1-10g/L之间，并更优选在0.5-5g/L之间；菌体生长过程中的温度一般应控制在28-30℃之间，不可超过32℃，而诱导表达时的温度一般应低于菌体生长过程中的温度，在20-28℃之间；培养过程中的pH应控制在3.0-7.0之间(必要时选择pH调节剂控制pH，所述的pH调节剂包括但不限于NaOH、氨水及各种有机氮源，优选氨水)，且菌体生长和诱导表达时适宜的pH往往有所不同；通气量(溶氧)应满足菌体生长需要及产物表达合成的需要，一般应控制在20-30％之间；培养时间与补料操作的方式相关，在采取适宜的补料操作条件的情况下培养时间为12-180小时之间。
[0019] 干扰素λ去半胱氨酸突变体蛋白如果表达在工程菌或工程细胞内，需要对发酵培养收获的菌体或细胞进行破碎处理以释放出其中的干扰素λ去半胱氨酸突变体蛋白。而对于大肠杆菌等原核的工程菌，更需要破碎处理以释放出以包涵体形式表达的干扰素λ去半胱氨酸突变体蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超声波破碎、球磨机破碎、溶菌酶处理等。
[0020] 对于以包涵体形式表达的干扰素λ去半胱氨酸突变体蛋白，需要对破碎处理得到的粗包涵体进行洗涤操作以尽可能除去其中含有的少量菌体蛋白、膜蛋白等杂蛋白。洗涤过程中使用的缓冲液包括但不局限于Tris-HCl、PB，洗涤过程的pH值应控制在7.0-9.0之间。为了溶解较难溶解的疏水蛋白质杂质，可在洗涤缓冲液中加入一定量的盐，常用的为NaCl，浓度范围在0.05-0.5mol/L之间；为了溶解疏水性更强的膜蛋白，可在洗涤缓冲液中加入一定量的表面活性剂，常用的此类表面活性剂包括但不限于吐温-80、十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-100，浓度在0.01-5％之间。
[0021] 由于在破碎过程中菌体或细胞会释放出一些蛋白水解酶，从而有可能降解干扰素λ去半胱氨酸突变体，因此需要在破碎过程中及破碎后的洗涤过程中加入一些物质来抑制这些蛋白水解酶的活性，最直接的方法是加入蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂，间接的方法也可加入金属离子螯合剂，如EDTA，因为金属离子螯合剂可以螯合这些蛋白水解酶发挥水解作用所必须依靠的金属离子。
[0022] 洗涤得到的包涵体变性溶解可以使用7-10mol/L的尿素或5-8mol/L的盐酸胍，必要时还需要加入巯基试剂以提高变性剂的溶解效力，所述的巯基试剂包括但不局限于巯基乙醇、二硫苏糖醇。溶解所采用的包涵体/变性剂的质量/体积比(g/ml)可以在1:3到1:50之间，优选的在1:5到1:30之间，最佳的在1:7到1:20之间。变性溶解时间应该在2小时以上。
[0023] 包涵体复性可以采用稀释复性法、透析复性法或柱上复性法。稀释复性法是通过一步或多步稀释用复性液将变性剂的浓度稀释到0.5mol/L以下，以使蛋白质分子在摆脱变性剂影响的情况下逐渐复性；透析复性法是用10倍以上体积的复性液对变性液进行透析以使变性剂的浓度降低到0.5mol/L以下，同样起到复性的作用；柱上复性法是将变性液直接上离子交换、疏水分子排阻(凝胶)色谱柱，然后用含不断降低变性剂浓度的洗脱溶液进行梯度洗脱以同时实现目标蛋白的分离纯化与复性。
[0024] 复性液的基本组成是pH在5.0-10.0之间的缓冲溶液，以保证复性所需的基本碱性环境，可以满足这种要求的缓冲溶液包括但不局限于Tris-HCl、硼酸钠缓冲液。为了防止复性过程中复性速度过快形成二硫键错配，需要在复性液中加入一些氧化型和还原型巯基试剂对组成的氧化还原平衡体系物质，如氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽组成的氧化还原平衡体系。同时为了防止复性速度过快造成蛋白质折叠不完全、二硫键错配，可以在上述基本组成的复性液中添加一些其它物质，如精氨酸、EDTA、金属离子及各种分子伴侣物质等。这些物质的选择及加量在现有技术中有很多报道，本文不再赘述。
[0025] 上述稀释复性法和透析复性法得到的复性液，以及通过破碎直接得到的含有可溶性形式表达的干扰素λ去半胱氨酸突变体的离心上清，以及以可溶性形式表达的干扰素λ去半胱氨酸突变体的发酵培养液离心上清，都需进行进一步的色谱或层析(chromatography)分离纯化。利用干扰素λ去半胱氨酸突变体分子与杂质分子在电荷性质、疏水性质、亲和性质、分子量大小性质上的差异可以先后选择离子交换色谱(或离子交换层析，ion exchange chromatography，IEC)、疏水色谱(或疏水层析，hydrophobic interaction chromatography，HIC)、亲和色谱(或亲和层析，affinity chromatography，AF)、凝胶过滤色谱(或凝胶过滤层析，gel filtration chromatography，GFC)中的一种或几种的组合进行纯化。为了更好的达到分离作用，在色谱或层析分离纯化前可对待分离液进行浓缩处理，可以选择的方法包括但不局限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、聚乙二醇浓缩、超滤及色谱处理等。
[0026] 干扰素λ去半胱氨酸突变体蛋白如果为分泌型表达，则需要对发酵液进行固液分离后的浓缩处理，浓缩处理方法如前段最后部分所述。
[0027] 然后进行色谱或层析分离纯化。利用干扰素λ去半胱氨酸突变体与杂质分子在电荷性质、疏水性质、亲和性质、分子量大小性质上的差异可以先后选择离子交换色谱(或离子交换层析)、疏水色谱(或疏水层析)、亲和色谱(或亲和层析)、凝胶过滤色谱(或凝胶过滤层析)中的一种或几种的组合进行纯化。
[0029] 其中高效液相色谱纯度检测法可以采用反相高效液相色谱法或分子排阻高效液相色谱法，但优选分子排阻高效液相色谱法，因为此种方法更为方便、准确、快捷。采用分子排阻高效液相色谱法时要求色谱柱的理论板数大于10000，上样量在5-100μl之间，优选10-50μl之间，色谱分离时间为主峰出峰时间的3倍。
[0030] 色谱分离纯化获得的干扰素λ去半胱氨酸突变体分子可用本领域技术人员公知的SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法或质谱法确定分子量。
[0031] 色谱分离纯化获得的干扰素λ去半胱氨酸突变体分子的体外抗病毒活性可用干扰素α体外抗病毒活性检测的方法，即《中华人民共和国药典2010年版(三部)》附录X C的“干扰素生物学活性测定法”规定的WISH细胞/VSV病毒系统的检测方法，但更适宜采用如下灵敏度更高的HepG2细胞/脑心肌炎病毒(EMCV)系统的检测方法。
[0032] 1.培养基、消化液、染色液、脱色液的配制
[0033] DMEM基础培养基：取DMEM培养基粉末1袋倒入三角瓶中，加碳酸氢钠2.2g，加去离子水溶解，搅拌器搅拌均匀后(约4h)，定容至1000ml，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。
[0034] DMEM完全培养基：DMEM基础培养基添加8％FBS，4℃保存。
[0035] DMEM攻毒培养基：DMEM基础培养基添加2％FBS，4℃保存。
[0036] DMEM冻存培养基：DMEM基础培养基，添加10％的DMSO及30％的FBS。0.25％胰蛋白酶消化液：取胰蛋白酶0.25g，NaCl 0.9g，去离子水溶解定容至100ml，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。
[0037] 结晶紫染色液：取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加去离子水稀释至100ml，滤纸过滤。存在棕色试剂瓶中或避光保存。
[0038] 结晶紫脱色液：无水乙醇50ml，乙酸0.1ml，加去离子至100ml。
[0039] MTT染色液：取MTT 50mg，加PBS溶剂50ml，室温搅拌溶解，用滤纸过滤。保存在棕色试剂瓶中或避光保存。
[0040] 2.HepG2细胞的传代、冻存
[0041] 2.1HepG2细胞培养和传代
[0042] HepG2细胞用DMEM完全培养基进行培养和传代：细胞生长达到90％之后，去掉细胞培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入3-5ml 0.25％胰蛋白酶消化液，加盖，振荡培养瓶冲洗细胞单层，洗去培养瓶中细胞碎片、FBS、酚红等杂质后，弃去胰蛋白酶消化液。另添加1ml左右0.25％胰蛋白酶消化液，常温静置，显微镜下观察细胞状态，待细胞周边翘起，立即弃去消化液，加入DMEM完全培养基。将细胞从壁上小心吹打到培养基中后，小心吹打以使细胞形成单细胞悬液。以1:2-1:4比例进行传代。
[0043] 2.2HepG2细胞冻存
[0044] 将细胞制成单细胞悬液后，1000rpm×5min离心后弃上清，细胞沉淀使用DMEM冻存培养基混悬至终浓度为1×106-1×107个/ml的悬液，1ml/管加至细胞冻存管中。4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置过夜后移至液氮冻存。冻存后每次复苏细胞培养不超过30代。
[0045] 3.病毒的制备、保存和滴定测定
[0046] 3.1EMCV的制备及保存
[0047] 取Vero细胞贴壁生长的培养瓶，去掉培养基，每瓶接种2ml用完全DMEM培养基稀释8
为1-5×10PFU/ml的EMCV悬液。感染的病毒细胞比值(m.o.i.)为5-15PFU/cell。小心振荡单层细胞上的病毒悬液，将培养瓶放回孵箱孵育约0.5-2h。然后每瓶加入约40ml攻毒培养基，放回37℃孵箱孵育约10-20min。去掉培养液，放置于约40℃。再将培养基放置于-20℃使细胞单层冻结，在室温下解冻使细胞破裂，加入约5ml培养基，振荡细胞瓶使细胞层分散。将含有EMCV的培养液转移到50ml塑料离心管中，约500g离心10min以除去细胞碎片。将上清液分装到带有螺旋盖的玻璃瓶中冻存于-80℃冰箱。
为1-5×10PFU/ml的EMCV悬液。感染的病毒细胞比值(m.o.i.)为5-15PFU/cell。小心振荡单层细胞上的病毒悬液，将培养瓶放回孵箱孵育约0.5-2h。然后每瓶加入约40ml攻毒培养基，放回37℃孵箱孵育约10-20min。去掉培养液，放置于约40℃。再将培养基放置于-20℃使细胞单层冻结，在室温下解冻使细胞破裂，加入约5ml培养基，振荡细胞瓶使细胞层分散。将含有EMCV的培养液转移到50ml塑料离心管中，约500g离心10min以除去细胞碎片。将上清液分装到带有螺旋盖的玻璃瓶中冻存于-80℃冰箱。
[0048] 3.2EMCV活力滴定
[0049] 使用Reed-Muench法测定病毒TCID50，具体方法如下：
[0050] 1)将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液后，以1-2×105个/ml的细胞浓度接种[0051] 入96孔细胞板内，每孔100μl。
[0052] 2)使用DMEM攻毒培养基10倍系列稀释病毒。
[0053] 3)接种好的细胞板置于37℃恒温、5％CO2孵箱内培养24h后，将长成单层细胞的培养液倒掉，接种系列稀释的病毒液，每个稀释度设置副孔，每孔100μl。
[0054] 4)37℃恒温、5％CO2孵箱内培养24h后，弃去板内液体，每孔加入50μl结晶紫染色液染色30min，清水洗净，烘干后每孔加入100μl结晶紫脱色液脱色1-3min。
[0055] 5)置酶标仪570nm波长处测定吸光度，参比波长630nm，计算CPE的孔数。
[0056] 6)采用如下的Reed-Muench公式计算病毒滴度：
[0057] TCID50＝CPE>50％的病毒稀释度+(>50％的百分数-50)/(>50％的百分数-<50％的百分数)×lg10
[0058] 4.体外抗病毒活性测定
[0059] 4.1细胞铺板
[0060] HepG2细胞培养至密度约为90％时，消化吹散至单细胞悬液。经血细胞计数板计数后，以1-5×106个/ml细胞浓度，2倍梯度稀释，100μl/孔铺置96孔板。于37℃孵箱培养48h后，结晶紫染色，读数。绘制HepG2生长曲线。选取细胞生长状态良好，生长旺盛的密度点作为铺板密度。
[0061] 4.2试验对照及样品处理
[0062] 试验中通过设立细胞及病毒对照，取两者平均作为检测ED50值，用于试验结果的计算。另取IFN-λ1试验工作对照品，根据其标识的ED50值进行4倍梯度稀释，设置梯度范围，确定样品基本稀释值，以保证ED50值的可靠。
[0063] 4.3添加待测样品
[0064] 参照中国及欧洲药典干扰素体外抗病毒活性测定方法，分别于细胞铺板时及细胞铺板后静置培养4h后，加入4倍梯度稀释样品100μl/孔。37℃孵箱培养24h。
[0065] 4.4EMCV攻毒
[0066] 参照中国及欧洲药典，使用滴度为100TCID50的EMCV量。使用Reed-Muench法测定病毒滴度，确定病毒稀释倍数，使用攻毒培养基配置EMCV攻毒液。弃去96孔板内含测定样品的培养基，每孔添加100μl攻毒液，置于37℃孵箱培养。
[0067] 4.5染色：攻毒后24h进行
[0068] 1)结晶紫染色
[0069] 弃去96孔板中的上清液，每孔添加染色液50μl，室温放置30min后，小心洗去染色液，风干。每孔添加脱色液100μl，室温放置3-5min，用振荡仪混匀1min。用酶标仪在波长570nm处测定吸光度，以630nm为参比波长，记录测定结果。
[0070] 2)MTT染色
[0071] 取96孔板，每孔加入染色液25μl，2h后，每孔加入DMF溶剂100μl，于37℃、5％CO2条件下培养约10h。用酶标仪在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
[0074] 稳定性考察是将色谱分离纯化得到的干扰素λ去半胱氨酸突变体溶液在20-45℃的环境下长期存放3-6个月，在此过程中定期取样观察外观的变化，并检测纯度、体外抗病毒活性等主要质量控制指标的变化。
[0075] 色谱分离纯化获得的干扰素λ去半胱氨酸突变体分子还需进行动物药代动力学试验评价与动物急性毒性试验评价。
[0076] 本发明的第二个目的是提供如上所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰衍生物，以在尽可能高的保留干扰素λ的抗病毒活性的基础上进一步改善其稳定性，并延长其体内药代半衰期。
[0077] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明的干扰素λ去半胱氨酸突变体的聚乙二醇衍生物由所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体与聚乙二醇修饰剂连接得到，所述的聚乙二醇修饰剂的分子量在5KDa–40KDa之间。
[0078] 为获得所述的聚乙二醇衍生物进行的聚乙二醇修饰反应主要受聚乙二醇修饰剂的种类、温度、蛋白质浓度、pH、蛋白质/修饰剂质量/摩尔比、搅拌速度、添加剂及修饰反应时间等因素的影响。
[0079] 蛋白质聚乙二醇修饰剂的种类主要包括修饰蛋白质中N末端氨基酸残基上的游离氨基的N末端氨基聚乙二醇修饰剂，修饰蛋白质中N末端氨基酸残基上的游离氨基和非N末端赖氨酸(Lys，K)残基上的游离氨基的普通氨基聚乙二醇修饰剂，以及修饰蛋白质中未形成二硫键的半胱氨酸(Cys，C)残基上的游离巯基的巯基聚乙二醇修饰剂。由于干扰素λ去半胱氨酸突变体在理论上已经没有未形成二硫键的半胱氨酸残基，即没有游离巯基，所以修饰干扰素λ去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰剂的种类不包括巯基聚乙二醇修饰剂。而在N末端氨基聚乙二醇修饰剂和普通氨基聚乙二醇修饰剂中，由于N末端氨基聚乙二醇修饰剂修饰的氨基酸残基高度特异性的指向N末端的氨基酸残基，而不像普通氨基聚乙二醇修饰剂可修饰蛋白质中所有有游离氨基的氨基酸残基，所以优选用N末端氨基聚乙二醇修饰剂修饰本发明所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体。
[0080] 普通氨基聚乙二醇修饰剂可选择的范围包括但不局限于羧基聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Carboxyl，mPEG-COOH)、琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Succinimidyl Carbonate，mPEG-SC)、苯并三唑碳酸酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Benzotriazole Carbonate，mPEG-BTC)、琥珀酰亚胺聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Succinimidyl Succinate，mPEG-SS)、琥珀酰羧甲基酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Succinimidyl Carboxymethyl Ester，mPEG-SCM)、琥珀酰亚胺丁酸酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Succinimidyl Butanoate，mPEG-SBA)、琥珀酰亚胺己酸酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Succinimidyl Hexanoate，mPEG-SHA)、硝基苯碳酸酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Nitrophenyl Carbonate，mPEG-NPC)、琥珀酰亚胺戊二酯聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Succinimidyl Glutarate，mPEG-SG)、Y形NHS酯聚乙二醇修饰剂(Y-shape PEG NHS Ester，mPEG-Y-NHS)、Y形羧基聚乙二醇修饰剂(Y-shape PEG Carboxyl，mPEG-Y-COOH)。
[0081] N末端氨基聚乙二醇修饰剂可选择的范围包括但不局限于丙醛聚乙二醇修饰剂(Methoxy PEG Propionaldehyde，mPEG-PALD)、Y形丙醛聚乙二醇修饰剂(Y-shape PEG Propionaldehyde，mPEG-Y-PALD)、Y形乙醛聚乙二醇修饰剂(Y-shape PEG Acetaldehyde，mPEG-Y-AALD)。
[0082] 上述列举的各种聚乙二醇修饰剂的更具体的信息，尤其是化学结构式等信息，可参阅这些商品化修饰剂供应商的产品手册，例如北京键凯科技有限公司的“聚乙二醇衍生物产品目录”(可从其公司网站www.jenkem.com下载，最新为2013REV05版本)。
[0083] 上述聚乙二醇修饰剂的分子量可在5KDa–40KDa之间，但由于低分子量的聚乙二醇修饰剂对延长干扰素α半衰期的作用不明显，高分子量的聚乙二醇修饰剂修饰干扰素α后使其生物活性下降严重，因此优选的聚乙二醇修饰剂的分子量在10KDa-20KDa之间。
[0084] 修饰过程中提高温度可以提高修饰反应的速度，但同时也会加快修饰剂的水解或氧化速度，还不利于干扰素λ去半胱氨酸突变体的稳定，因此适宜的修饰反应温度为2-40℃，优选的修饰反应温度为2-25℃，最优的修饰反应温度为2-10℃。
[0085] 修饰过程中提高蛋白质浓度可以提高修饰反应的速度，但不利于蛋白质的稳定，因此适宜的干扰素λ去半胱氨酸突变体的浓度为2-20mg/ml，优选的浓度为1-10mg/ml，最优的浓度为2-5mg/ml。
[0086] 为了达到这一蛋白质浓度，需要对干扰素λ去半胱氨酸突变体进行浓缩，同时也可将pH和缓冲溶液转换到所需。常用的浓缩方法包括但不限于有机溶剂沉淀后反溶、盐析后反溶、超滤、聚乙二醇浓缩、色谱分离等。
[0087] 修饰过程中需要的pH与修饰反应的机理有关，也关系修饰反应速度和特异性。对于N末端氨基聚乙二醇修饰剂，修饰反应的pH应控制在4.0-7.0之间，优选5.0-6.0之间；对于普通氨基聚乙二醇修饰剂，修饰反应的pH应控制在7.0-10.0之间，优选8.0-9.0之间。
[0088] 修饰过程中提高或降低蛋白质/修饰剂质量或摩尔比均可以提高反应速度。从提高聚乙二醇修饰剂利用率的角度考虑应该增加投入反应的干扰素λ去半胱氨酸突变体的量，而从提高干扰素λ去半胱氨酸突变体转化率的角度考虑则应该增加投入反应的聚乙二醇修饰剂的量，具体如何处理应视具体情况决定(优先考虑修饰剂的利用率还是优先考虑蛋白质的利用率，很大程度上取决于两者的成本比)，但一般情况下适宜的比值应在1:8-8:1之间，优选的比值在1:4-4:1之间，最优的比值在1:2-2:1之间。
[0089] 修饰过程中增加搅拌可以提高修饰反应的速度，尤其是对于从修饰机理上来说反应速度较慢的修饰反应。但过快的搅拌对蛋白质的稳定不利，同时也无法进一步加速修饰反应的速度，因此适宜的修饰反应搅拌速度在0-40转/分之间，优选的速度在1-20转/分之间，最优的速度在2-10转/分之间。
[0090] 修饰过程中添加某些物质或在蛋白质缓冲溶液中存在某些物质也会影响修饰反应的速度，如添加某些类型的表面活性剂或在蛋白质缓冲溶液中存在高浓度的NaCl，但具体影响规律由于添加与存在物质种类众多，可选择浓度范围宽，所以不能一概加以论述，需要具体问题具体研究。
[0091] 修饰反应的时间与上述各影响因素均有关，一般来说延长修饰反应时间均可提高修饰反应得率，但时间超过某一临界值后这一规律会变得不明显，且还会对干扰素λ去半胱氨酸突变体的稳定不利，会降低反应过程的经济效益，因此适宜的修饰反应时间在1-48小时之间，优选的时间在2-24小时之间，最优的时间在5-20小时之间。
[0092] 从原理上讲修饰反应终止后修饰反应混合物中含有未参与修饰反应的聚乙二醇修饰剂、未被修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体、单位点修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体及少量多位点修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体，必须通过后续的分离纯化过程除去单位点聚乙二醇修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体以外的成分。
[0093] 利用目标单位点聚乙二醇修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体分子与杂质分子在分子量上有明显差异的特点，可以采用凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography,GFC)或分子排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)对它们进行分离，可以采用的填料包括但不限于Sephacryl S-100、Sephacryl S-200、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Superdex 75、TSKgel HW-50、TSKgel HW-55等。
[0094] 由于包括N末端氨基聚乙二醇修饰剂在内的氨基聚乙二醇修饰剂修饰的是蛋白质有游离氨基的氨基酸残基，修饰后会使蛋白质失去带正电的可解离基团，且有可能掩蔽蛋白质的其它带电基团，而连接分子量越大的修饰剂或连接较多个数的修饰剂分子的后一效应越明显。因此可以利用修饰前后蛋白质分子这一电荷性质的改变对目标单位点聚乙二醇修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体分子与杂质进行离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)分离，可以采用的填料包括但不限于DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose FF、DEAE Sepharose CL-6B、Source 15、Source 30、TSKgel CM-650、TSKgel DEAE-650、TSKgel QAE-550、TSKgel SP-650、TSKgel CM-5PW、TSKgel DEAE-5PW等。在这一纯化过程中，由于聚乙二醇修饰剂不带电荷，所以在上样过程中不会被吸附。
[0095] 由于聚乙二醇是一个既亲水又亲酯的分子，用于修饰蛋白质分子后会提高蛋白质分子的亲酯性能，且分子量越大，连接的分子个数越多这种提高越明显，因此可以利用修饰前后蛋白质分子这一疏水性能的改变对目标单位点聚乙二醇修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体分子与杂质进行疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography,HIC)分离，可以采用的填料包括但不限于Phenyl Sepharose 6FF、Butyl Sepharose 4FF、Source 15PHE、Source 15ETH、TSKgel Ether-5PW、TSKgel Phenyl-5PW等。
[0096] 纯化获得的干扰素λ去半胱氨酸突变体氨基聚乙二醇修饰剂修饰衍生物也需要进行纯度、分子量、体外抗病毒活性、稳定性、药代、安全性等评价，方法同前所述的未修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体。
[0097] 在一种优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂的分子量在10KDa-20KDa之间。
[0098] 在一种优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂是普通氨基聚乙二醇修饰剂。
[0099] 在一种更加优选的实施方案中，本发明的普通氨基聚乙二醇修饰剂选自羧基聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇修饰剂、苯并三唑碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺聚乙二醇修饰剂、琥珀酰羧甲基酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺丁酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺己酸酯聚乙二醇修饰剂、硝基苯碳酸酯聚乙二醇修饰剂、琥珀酰亚胺戊二酯聚乙二醇修饰剂、Y形NHS酯聚乙二醇修饰剂、Y形羧基聚乙二醇修饰剂中的一种。
[0100] 在一种优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇修饰剂是N末端氨基聚乙二醇修饰剂。
[0101] 在一种更加优选的实施方案中，本发明的N末端氨基聚乙二醇修饰剂选自丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形丙醛聚乙二醇修饰剂、Y形乙醛聚乙二醇修饰剂中的一种。
[0102] 本发明的第三个目的是提供上述干扰素λ去半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0103] 1)制备浓缩的所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体溶液，使其浓度达到2.0-20mg/ml，并使所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体所处的缓冲溶液体系转换为适宜进行聚乙二醇修饰反应的缓冲溶液体系；
[0104] 2)将上述得到的浓缩的干扰素λ去半胱氨酸突变体溶液与聚乙二醇修饰剂接触进行修饰反应；
[0105] 3)对修饰反应后得到的混合物进行色谱分离纯化，以除去其中未参与修饰反应的聚乙二醇修饰剂和未参与修饰反应的所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体，并除去连接有多个聚乙二醇分子的干扰素λ去半胱氨酸突变体聚乙二醇衍生物。
[0106] 本发明的第四个目的是提供上述干扰素λ去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物的药物组合物。
[0107] 在基础的实施方案中，本发明的组合物中含有治疗有效量的所述的干扰素λ去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物，以及适宜量的可药用载体。
[0108] 本发明的最后一个目的是提供上述干扰素λ去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的用途。
[0109] 本发明的干扰素λ去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇衍生物与未突变的干扰素λ具有相同的目标适应症，由于干扰素对病毒复制的广泛抑制作用，所以它们对几乎所有的病毒感染性疾病都有疗效，尤其是在治疗呼吸道病毒感染性疾病方面较天然干扰素λ分子具有相当或更好的体内或体外药效。
[0110] 本发明中使用的术语“λ干扰素”或“干扰素λ”包括人体或动物体中天然存在或在外界刺激下产生的干扰素λ，也包括通过基因工程方法选择适宜的表达载体表达的与上述天然序列完全相同的重组分子。
[0111] 本发明中使用的术语“聚乙二醇修饰剂”，也即“聚乙二醇修饰剂”是指单甲氧基聚乙二醇修饰剂，也即用甲氧基封闭聚乙二醇分子一端的一个羟基，而用适宜的活化方法活化另一端的一个羟基后所得的活化聚乙二醇。由于羟基自身的反应活性很低，所以经过活化后的聚乙二醇分子的反应活性有了很大的提高，才可被称为“聚乙二醇修饰剂”。关于活化基团的选择、活化的机理以及活化所得的聚乙二醇修饰剂的修饰反应机理在现有技术中有很多文献报道，如美国Nektar公司(原Shearwater公司)申请并获得授权了多篇有关聚乙二醇修饰剂的专利。聚乙二醇修饰剂可通过商业渠道获得或通过已知的活化机理活化制备，商业渠道获得方面例如从国外Nektar公司购买，从国内包括北京键凯科技有限公司、北京凯正生物工程发展有限责任公司在内的专业活化聚乙二醇修饰剂的公司购买。
[0112] 本发明中使用的术语“聚乙二醇修饰”是指将聚乙二醇修饰剂分子与蛋白质分子化学偶联到一起。参与偶联反应的聚乙二醇修饰剂的基团是其在活化过程中引入的活化基团，蛋白质的基团主要是其中游离的氨基基团、巯基基团、羧基基团或羟基基团。
[0113] 本发明中使用的术语“治疗有效量”表示当施用本发明的药物活性成分干扰素λ去半胱氨酸突变体或其聚乙二醇衍生物用于治疗或预防疾病时，药物活性成分的量足以实现对疾病的治疗或预防。治疗有效量将依药物活性成分、疾病和它的严重性，以及所治疗病人的年龄、体重等而异。
[0114] 本发明中使用的术语“可药用载体”是指在制剂处方设计时，为解决制剂的溶解性、有效性、稳定性、安全性等问题，加入到制剂处方中的除药物活性成分以外自身对人体或动物体安全的其他辅助成分。
具体实施方式
[0115] 通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
[0116] 实施例1：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的表达工程菌构建
[0117] 由上海生工生物工程有限公司合成SEQ ID No.2所示氨基酸序列的干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的基因序列，并将其连接到用Nde I/EcoR I双酶切后的pET-23b质粒载体上。连接反应条件为：2×Rapid buffer 4-5μl、T4DNA Lagase 1μl、目的基因序列1-2μl、载体3μl，4℃过夜连接。
[0118] 制备大肠杆菌JM109或DH5α感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37℃过夜培养。
[0119] 实施例2：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的发酵、纯化与检测
[0120] 将用实施例1的方法构建得到大肠杆菌工程菌，经涂平板活化后挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中(每升用蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g配制，调节pH为7.0)，37℃、230转/分摇床摇瓶培养至OD600nm为0.6-0.8。然后以5％的体积接种量接种于50L的LB培养基中在80L发酵罐中进行发酵培养(每升含0.1％的氨苄青霉素)，培养温度为37℃，培养过程中用氨水调节pH在6.5-7.5之间，用转速控制溶氧值在3-5％之间。在OD600nm达到1.0后按质量体积比1:5000的比例加入IPTG 10g继续诱导培养3小时，诱导培养温度为36℃，并在此过程中向发酵罐中适当的补加LB培养基。诱导培养时间到后放罐室温5000转/分离心20分钟收集菌体，所得菌体用TE缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH8.0溶液)洗涤离心两次以除去发酵液中的主要杂质。
[0121] 取上述处理得到的菌体40g以1:20的质量体积比加入800ml TE缓冲液置超声波破碎仪上进行超声破碎，条件为打5秒，歇5秒，共60分钟，所得破碎液室温6000转/分离心20分钟弃上清，沉淀以1:15的质量体积比加入TE缓冲液洗涤离心两次，得分离包涵体。
[0122] 所得10g包涵体以1:12的质量体积比加入120ml 7mol/L盐酸胍后在适度搅拌条件下变性处理2小时，待包涵体完全溶解后室温8000转/分离心20分钟弃沉淀，上清以稀释复性法进行复性处理，复性液组成为：0.15mol/L硼酸钠缓冲液，4mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，调节pH为9.5。复性过程在2-8℃低温冷库中进行，首先用复性液将上清稀释4倍，放置8小时后再用复性液稀释5倍继续复性6小时，然后再用复性液稀释5倍，最后复性6小时以达到最终的复性效果。复性完成后4℃8000转/分离心复性液30分钟，取上清按1:10的体积比对25mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液进行透析处理，透析时间为12-24小时，中间换透析液1-2次。
[0123] 透析后的复性液经4℃，8000转/分离心30分钟后上用25mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液平衡的DEAE Sepharose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱1-3个柱体积，然后以含有0.3mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液进行洗脱收集洗脱峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0124] DEAE Sepharose FF洗脱峰用50mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.0缓冲液以1:10的体积比稀释后上用同样缓冲液平衡的CM Sepharose FF色谱柱。上样完成后先用平衡缓冲液继续冲洗色谱柱1-3个柱体积，然后在用含有0.12-0.18mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.0缓冲液洗脱除去主要杂质峰后用含有0.5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.0缓冲液洗脱收集目标峰。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0125] 用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测上述CM Sepharose FF色谱柱分离得到的干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的纯度，结果均在97％以上。用MALDI-TOF质谱法检测其分子量为19989.01(还原状态)，与理论值偏差为-
0.58(还原状态下理论值为19989.59)。用前述发明内容部分所述的HepG2细胞/EMCV病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性ED50为0.086ng/ml，对照测定未突变干扰素λ1的体外抗病毒活性ED50为0.633ng/ml(其中HepG2细胞由北京肿瘤医院肿瘤所提供；EMCV为ATCC(Lot NO.VR-129B)；IFN-λ1试验工作对照品为由R&D Systems提供；DMEM培养基粉末由GIBCO公司提供；胰酶由Invitrogen公司提供；胎牛血清(FBS)由Hyclone公司提供；MTT、DMF、DMF溶剂、结晶紫均由Sigma公司提供。以下干扰素λ或其突变体或其聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性检测中相同。干扰素λ1的制备方法参照中国专利申请201110020949.4说明书实施例1-4公开的方法)。可见，本发明的干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的体外抗病毒活性是未突变干扰素λ1的7.36倍。
0.58(还原状态下理论值为19989.59)。用前述发明内容部分所述的HepG2细胞/EMCV病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性ED50为0.086ng/ml，对照测定未突变干扰素λ1的体外抗病毒活性ED50为0.633ng/ml(其中HepG2细胞由北京肿瘤医院肿瘤所提供；EMCV为ATCC(Lot NO.VR-129B)；IFN-λ1试验工作对照品为由R&D Systems提供；DMEM培养基粉末由GIBCO公司提供；胰酶由Invitrogen公司提供；胎牛血清(FBS)由Hyclone公司提供；MTT、DMF、DMF溶剂、结晶紫均由Sigma公司提供。以下干扰素λ或其突变体或其聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性检测中相同。干扰素λ1的制备方法参照中国专利申请201110020949.4说明书实施例1-4公开的方法)。可见，本发明的干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的体外抗病毒活性是未突变干扰素λ1的7.36倍。
[0126] 实施例3：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体与干扰素λ1的25℃稳定性试验结果
[0127] 表1干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体25℃稳定性试验结果
[0128]
[0129]
[0130] 表2干扰素λ1的25℃稳定性试验结果
[0131]
[0132] 实施例4：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰、产物纯化与初步检测
[0133] 1)分子量为20KDa的mPEG-PALD的修饰反应和修饰产物分离、检测
[0134] 将实施例2用CM Sepharose FF色谱柱分离得到的干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体用10倍体积的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.5缓冲液稀释后上用同样的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡的CM Sepharose FF色谱柱，用同样的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗色谱柱后用含0.5mol/L的NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH5.5缓冲液洗脱，得到浓度达3.0mg/ml的浓缩突变体溶液。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0135] 取上述浓缩后的突变体溶液5ml，在冰浴条件下添加硼氰化钠母液至其终浓度为20mmol/L，然后按1:2的质量比加入30mg平均分子量为20KDa的北京键凯科技有限公司商品化的mPEG-PALD，室温弱光反应14-18小时。
[0136] 反应时间到后用200ml 25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液稀释反应液以终止反应，然后上用同样缓冲液平衡的TSKgel CM650S填料柱，未修饰聚乙二醇修饰剂在上样过程中流穿。在用含70mmol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱修饰物杂质后用含0.18mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱目的修饰物，最后用含0.5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱未被修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体。该分离过程中的上样、冲洗与洗脱线性流速应控制在40-150cm/h之间。
[0137] 用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测分离得到的聚乙二醇衍生物的纯度，结果均在97％以上。用MALDI-TOF质谱法检测其分子量为39656.52。用前述发明内容部分所述的HepG2细胞/EMCV病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性ED50为0.235ng/ml。
[0138] 2)分子量为20KDa的mPEG-SBA的修饰反应和修饰产物分离、检测
[0139] 将实施例2用CM Sepharose FF色谱柱分离得到的干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体用10倍体积的25mmol/LTris-HCl，pH8.5缓冲液稀释后上用同样的Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE Sepharose FF色谱柱，用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗色谱柱后用含0.5mol/L的NaCl的25mmol/L Tris-HCl，pH8.5，pH8.5缓冲液洗脱，得到浓度达4.0mg/ml的浓缩突变体溶液。上述上样、冲洗与洗脱过程中的线性流速应控制在50-200cm/h之间。
[0140] 取上述浓缩后的突变体溶液5ml，按1:2的质量比加入40mg平均分子量为20KDa的北京键凯科技有限公司商品化的mPEG-SBA修饰剂，室温在水平摇床上以20转/分的速度震摇反应6小时。
[0141] 反应时间到后用100ml 25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液稀释反应液以终止反应，然后上用同样缓冲液平衡的TSKgel CM650S填料柱，未修饰聚乙二醇修饰剂在上样过程中流穿。在用含75mmol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱修饰物杂质后用含0.22mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱目的修饰物，最后用含0.5mol/L NaCl的25mmol/L醋酸-醋酸钠，pH4.5溶液洗脱未被修饰的干扰素λ去半胱氨酸突变体。该分离过程中的上样、冲洗与洗脱线性流速应控制在40-150cm/h之间。
[0142] 用SDS-PAGE电泳加考马斯亮蓝染色法和分子排阻HPLC法分别检测分离得到的聚乙二醇衍生物的纯度，结果均在97％以上。用MALDI-TOF质谱法检测其分子量为39713.44。用前述发明内容部分所述的HepG2细胞/EMCV病毒系统的检测方法测定其体外抗病毒活性ED50为0.291ng/ml。
[0143] 实施例5：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体的聚乙二醇修饰产物的25℃稳定性试验结果
[0144] 表3干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-PALD修饰产物25℃稳定性试验结果
[0145]
[0146] 表4干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-SBA修饰产物25℃稳定性试验结果[0147]
[0148] 实施例6：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物的药代动力学试验
[0149] 取体重为180g至220g的Wistar大鼠32只，均分为4组，每组8只，雌雄各半。组1至组4分别皮下单次注射干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体、干扰素λ1、干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-PALD(分子量20KDa，单链)修饰产物、干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-SBA(分子量20KDa，单链)修饰产物，分别于0，0.2，0.5，0.75，1，2，4，8，12，24，
48，72，96，168小时眼底取血，离心收集血清后测定其中干扰素λ或其突变体或其聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性。由测定结果平均值计算得到如下表5所示的主要药代动力学参数。
48，72，96，168小时眼底取血，离心收集血清后测定其中干扰素λ或其突变体或其聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性。由测定结果平均值计算得到如下表5所示的主要药代动力学参数。
[0150] 表5用SD大鼠单次测定得到的主要药代动力学参数
[0151]
[0152] 实施例7：干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物的小鼠急性毒性试验
[0153] 取体重为20g左右的小鼠48只，均分为4组，每组12只，雌雄各半。组1至组4分别皮下单次注射干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体、干扰素λ1、干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-PALD(分子量20KDa，单链)修饰产物、干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体mPEG-SBA(分子量20KDa，单链)修饰产物。注射后连续观察14天，除组2有1只小鼠活动略显减少，体重增长略显缓慢外，其他组未见任何异常表现，表明小鼠对干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物的最大耐受量均在6.4mg/Kg以上，相当于人临床用量的3840倍。干扰素λ第112位点去半胱氨酸突变体及其聚乙二醇修饰产物较干扰素λ1的安全性明显提高。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | 2020-05-14 | 857 |
| 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | 2020-05-15 | 526 |
| 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | 2020-05-15 | 754 |
| α干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物 | 2020-05-16 | 301 |
| 聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物 | 2020-05-16 | 398 |
| 聚乙二醇－干扰素α冻干制剂 | 2020-05-16 | 708 |
| 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | 2020-05-17 | 43 |
| 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 | 2020-05-11 | 580 |
| 一种聚乙二醇化干扰素稳定的水溶液 | 2020-05-12 | 217 |
| 改良型聚乙二醇化重组人干扰素α2b | 2020-05-17 | 907 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
聚乙二醇干扰素热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈