一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用
阅读：1029发布：2020-09-21
专利汇可以提供一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，具体涉及一种细菌源性抗生素在制备抗 肿瘤 药物中的应用。所述的细菌源性抗生素anisomycin，其结构式如式1所示；所述的anisomycin能明显抑制16种不同 组织学 类型的肿瘤细胞的增殖，显著促进肿瘤细胞凋亡，从而导致实体瘤的瘤体积明显缩小，荷瘤动物的存活时间显著延长，且anisomycin的使用剂量低，毒 副作用 也低于临床常用的 化疗药物 。同时本发明还提供了一种细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，该方法制备的细菌源性抗生素抗肿瘤药物能大大提高药物的 溶解度 至20mg/mL，又能避免常规需要用 乙醇 或二甲基亚砜等 溶剂 溶解，毒副作用小，用药途径简单，易操作。，下面是一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的细菌源性抗生素为anisomycin，其结构式如式1所示：
2.一种细菌源性抗生素抗肿瘤药物，其特征在于：含有权利要求1所述的细菌源性抗生素。
3.权利要求2所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将10～100mg权利要求1所述的细菌源性抗生素与0.5～3mL生理盐水或磷酸缓冲盐溶液混合；
(2)在步骤(1)得到的溶液中滴加HCl溶液，并轻轻反复抽吸或搅拌直至细菌源性吡咯烷类化合物完全溶解时停止滴加HCl溶液；
(3)在步骤(2)得到的溶液中滴加NaOH溶液，调整pH至7.0～7.2；再用生理盐水或磷酸缓冲盐溶液补足溶液总体积至1～5mL，得到浓度为10～20mg/mL的细菌源性抗生素抗肿瘤药物；
所述的细菌源性抗生素为权利要求1所述的anisomycin。
4.根据权利要求3所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)所述的HCl溶液的浓度为0.5～3.0mol/L。
5.根据权利要求4所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)所述的HCl溶液的浓度为1mol/L。
6.根据权利要求3所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的的NaOH溶液浓度为0.5～3.0mol/L。
7.根据权利要求6所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的的NaOH溶液浓度为1mol/L。
8.根据权利要求3所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)、(2)中所述的磷酸盐缓冲盐溶液的pH为7.2，其组成如下：NaCl8.0g，KCL0.20g，Na2HPO4·12H2O3.484g，NaH2PO4·12H2O0.20g，用三蒸水定容至1000mL。
9.根据权利要求3所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)、(2)和(3)在无菌条件下操作。
10.根据权利要求3所述的细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)和(3)中所述的生理盐水和磷酸缓冲盐溶液经过无菌处理；
步骤(2)中所述的HCl溶液经过无菌处理；
步骤(3)中所述的NaOH溶液经过无菌处理。
一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 肿瘤死亡率高居全世界第一或第二位，极大地威胁着人类的生存与健康。肿瘤治疗一直是医学界面临的难题，抗肿瘤化合物的不断涌现给患者带来了新的希望。抗肿瘤抗生素是由微生物产生的具有抗肿瘤活性的化合物，可分为(1)蒽环类，如阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌和吡喃阿霉素；(2)放线菌素类，如放线菌素D；(3)博莱霉素类，如博莱霉素和平阳霉素；(4)丝裂霉素类，如丝裂霉素A、丝裂霉素B和丝裂霉素C；(5)光辉霉素类，如光辉霉素和橄榄霉素；(6)其它，如链脲霉素。这些抗肿瘤药物的作用机制主要是能抑制DNA合成或抑制RNA合成，此外，链脲霉素还能抑制嘧啶核苷代谢和糖原异生的某些关键酶。由于这些化疗药物普遍存在用药剂量大、缺乏选择性、肿瘤耐药、对实体瘤的疗效差、抑制造血系统、消化系统、免疫系统、神经和内分泌系统的问题，使其临床应用受到极大的限制。因此，人们仍在为寻找高效低毒和选择性的化疗药物而不懈努力。
[0003] anisomycin是从链霉菌属Streptomyces的培养液中分离得到的细菌组份(分子式为C14-H19-N-O4，分子量265.3)，能够通过与60S核糖体亚单位结合、阻断肽键形成从而阻止肽链延长和导致多核糖体降解，最终抑制蛋白质合成，是一种可逆转的蛋白合成抑制剂。anisomycin最初被视为抗真菌和抗阿米巴原虫的抗生素，之后发现anisomycin能够激活丝裂原活化蛋白激酶家族成员p38和c-Jun氨基末端激酶，因而常被作为丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活剂(Tang ZL,Xing FY et al.In vivo toxicological evaluation of anisomycin.Toxicol Lett,2012,208(1):1-11)。国外学者近来发现它与健忘症、创伤后记忆恢复及学习等关系密切，又被广泛用于中枢神经记忆系统中的研究(Sharma AV,et al.Neurosilence:profound suppression of neural activity following intracerebral administration of the protein synthesis inhibitor anisomycin.J Neurosci,2012,32(7):2377-87；Guo X et al.Epigenetic mechanisms of amyloid-βproduction in anisomycin-treated SH-SY5Y cells.Neuroscience.2011,194:272-81)。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中临床上抗肿瘤药物的用药剂量高、药效不理想、缺乏选择性、产生耐药性以及抑制造血系统、消化系统、免疫系统、神经和内分泌系统的毒副作用的缺点和不足，提供一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005] 一种细菌源性抗生素在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的细菌源性抗生素为anisomycin，其结构式如式1所示：
[0006]
[0007] 所述的细菌源性抗生素anisomycin可作为新型的抗肿瘤药物，应用于肿瘤的治疗。
[0008] 一种细菌源性抗生素抗肿瘤药物，含有上述细菌源性抗生素；
[0009] 上述细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备方法，包含如下步骤：
[0011] (2)在步骤(1)得到的溶液中滴加HCl溶液，并轻轻反复抽吸或搅拌直至细菌源性吡咯烷类化合物完全溶解时停止滴加HCl溶液；
[0012] (3)在步骤(2)得到的溶液中滴加NaOH溶液，调整pH至7.0～7.2；再用生理盐水(NS)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)补足溶液总体积至1～5mL，得到浓度为10～20mg/mL的细菌源性抗生素抗肿瘤药物；
[0013] 所述的细菌源性抗生素为anisomycin；
[0014] 步骤(1)、(2)中所述的磷酸盐缓冲盐溶液的pH为7.2，其组成如下：NaCl8.0g，KCL0.20g，Na2HPO4·12H2O3.484g，NaH2PO4·12H2O0.20g，用三蒸水定容至1000mL；
[0015] 步骤(2)所述的HCl溶液的浓度为0.5～3.0mol/L；
[0016] 步骤(2)所述的HCl溶液的浓度优选为1mol/L；
[0017] 步骤(3)中所述的的NaOH溶液浓度0.5～3.0mol/L；
[0018] 步骤(3)中所述的的NaOH溶液浓度优选为1mol/L；
[0019] 步骤(1)、(2)和(3)优选在无菌条件下操作；
[0020] 步骤(1)和(3)中所述的生理盐水和磷酸缓冲盐溶液优选经过无菌处理；
[0021] 步骤(2)中所述的HCl溶液优选经过无菌处理；
[0022] 步骤(3)中所述的NaOH溶液优选经过无菌处理；
[0023] 本发明的原理：肿瘤细胞的本质特性是恶性增值，抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡是遏制肿瘤生长的关键环节。本发明发现和确证anisomycin能抑制16种不同组织学类型的肿瘤细胞的增殖，使某些肿瘤细胞主要停滞在G0/G1期，显著促进肿瘤细胞凋亡，从而导致实体瘤的瘤体积明显缩小，荷瘤动物的存活时间显著延长，且anisomycin的使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也低于临床常用的化疗药物adriamycin。
[0024] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0025] (1)本发明首次发现细菌源性抗生素anisomycin在体外能显著抑制不同组织学类型肿瘤细胞的增殖，尤其是抑制实体瘤的生长，延长荷瘤动物的存活时间，作用优于临床常用的化疗药物阿霉素(adriamycin)，从体内外证明了anisomycin可作为抗肿瘤药物的新用途。
[0026] (2)anisomycin主要阻断肿瘤细胞的蛋白质合成，而目前已发现的抗肿瘤抗生素主要干扰肿瘤细胞的DNA合成，因此，它们的作用机制明显不同。
[0027] (3)anisomycin的用药剂量明显低于现有临床上常用化疗药物阿霉素的使用剂量，且在有效用药剂量范围内毒性较低。
[0029] 图1anisomycin对HL60、Jurkat T、K562和B16肿瘤细胞生长抑制率影响的结果分析图。
[0030] 图2anisomycin对HeLa、U87、HepG2、A549和MG63肿瘤细胞生长抑制率影响的结果分析图。
[0031] 图3anisomycin对HT29、SGC7901、Eca109、Hep2和MDA-MB-231肿瘤细胞生长抑制率影响的结果分析图。
[0032] 图4anisomycin对EAC和CT26肿瘤细胞生长抑制率影响的结果分析图，A：EAC肿瘤细胞组，B：CT26肿瘤细胞组；其中，control：对照组；500ng/mLadriamycin：阳性对照组；*：与对照组比较，P<0.05；**：与对照组比较，P<0.01。
[0033] 图5anisomycin诱导EAC和CT26肿瘤细胞凋亡的流式图，A：EAC肿瘤细胞组，B：CT26肿瘤细胞组；其中，control：对照组；500ng/mL adriamycin：阳性对照组；C：CT26荷瘤小鼠瘤内注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治疗14d后，瘤组织内肿瘤细胞的凋亡情况。
[0034] 图6anisomycin对EAC荷瘤小鼠的体内治疗效果分析图，A：EAC荷瘤BALB/c小鼠瘤周多点注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治疗后实体瘤的瘤体积变化；B：EAC荷瘤BALB/c小鼠瘤周注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治疗后荷瘤小鼠的存活时间。
[0035] 图7anisomycin对CT26荷瘤小鼠的体内治疗效果分析图，A：给CT26荷瘤BALB/c小鼠瘤内注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治疗后实体瘤的瘤体积变化；B：给CT26荷瘤BALB/c小鼠瘤内注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治疗后荷瘤小鼠的存活时间；C：给CT26荷瘤BALB/c小鼠瘤内注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治疗后原位肿瘤变化。
具体实施方式
[0036] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0037] 实施例中所述的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)的pH为7.2，其组成如下：NaCl8.0g，KCL0.20g，Na2HPO4·12H2O3.484g，NaH2PO4·12H2O0.20g，用三蒸水定容至1000mL；
[0038] 实施例1细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备
[0039] (1)在无菌条件下，将100mg anisomycin(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)与3mL无菌PBS混合；
[0040] (2)在步骤(1)得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1mol/L HCl溶液，并用1mL移液器轻轻反复抽吸，至白色结晶完全溶解时停止滴加HCl溶液；
[0041] (3)在步骤(2)得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1mol/L NaOH溶液，pH试纸监测溶液pH值以调整pH至7.2，再用PBS补足溶液总体积至5mL，得到透明澄清的浓度为20mg/mL的细菌源性抗生素抗肿瘤药物，置-20℃下避光保存备用。
[0042] 实施例2细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备
[0043] (1)在无菌条件下，将10mg anisomycin与0.5mL无菌PBS混合；
[0044] (2)在步骤(1)得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1mol/L HCl溶液，并用200μL移液器轻轻反复抽吸，至白色结晶完全溶解时停止滴加HCl溶液；
[0045] (3)在步骤(2)得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1mol/L NaOH溶液，pH试纸监测溶液pH值以调整pH至7.0，再用PBS补足溶液总体积至1mL，得到透明澄清的浓度为10mg/mL的细菌源性抗生素抗肿瘤药物，置-20℃下避光保存备用。
[0046] 实施例3细菌源性抗生素抗肿瘤药物的制备
[0047] (1)在无菌条件下，将25mg anisomycin与1mL无菌PBS混合；
[0048] (2)在步骤(1)得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1mol/L HCl溶液，并用1mL移液器轻轻反复抽吸，至白色结晶完全溶解时停止滴加HCl溶液；
[0049] (3)在步骤(2)得到的溶液中缓慢滴加无菌双蒸水配制的1mol/L NaOH溶液，pH试纸监测溶液pH值以调整pH至7.1，再用PBS补足溶液总体积至2mL，得到透明澄清的浓度为12.5mg/mL的细菌源性抗生素抗肿瘤药物，置-20℃下避光保存备用。
[0050] 实施例4 anisomycin抑制不同组织学类型肿瘤细胞增殖
[0051] 分别取生长旺盛的人肝癌HepG2细胞、人食管癌Eca109细胞、人喉癌Hep2细胞、人肺癌A549细胞(人肝癌HepG2细胞、人食管癌Eca109细胞、人喉癌Hep2细胞、人肺癌A549细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)、人骨肉瘤MG63细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人胃癌SGC7901细胞、人结肠癌HT29细胞、人宫颈癌HeLa细胞(人骨肉瘤MG63细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人胃癌SGC7901细胞、人结肠癌HT29细胞、人宫颈癌HeLa细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心)、人脑胶质瘤U87细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞、人红白血病K562细胞、人急性T淋巴细胞白血病Jurkat T细胞、人粒细胞白血病HL60细胞、艾氏腹水癌EAC细胞和结肠癌CT26细胞(人脑胶质瘤U87细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞、人红白血病K562细胞、人急性T淋巴细胞白血病Jurkat T细胞、人粒细胞白血病HL60细胞、艾氏腹水癌EAC细胞和结肠癌CT26细胞购自长沙赢润生物技术有限公司)，1000～1500rpm离心3～5min，弃上清，用含质量分数为5～10％FBS的5
RPMI-1640培养基调整细胞数为2.5×10/mL，100μL接种于96孔培养板中，各组分别加入anisomycin(终浓度为1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL和160.0ng/mL)，另加等体积的PBS作为对照组。在37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中孵育4h，1500rpm离心3min之后弃上清，每孔加入
100μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率。
RPMI-1640培养基调整细胞数为2.5×10/mL，100μL接种于96孔培养板中，各组分别加入anisomycin(终浓度为1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL和160.0ng/mL)，另加等体积的PBS作为对照组。在37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中孵育4h，1500rpm离心3min之后弃上清，每孔加入
100μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率。
[0052] 与对照组比较，anisomycin对16种不同组织学类型的肿瘤细胞生长的抑制率随着浓度的增加而增高，20ng/mL anisomycin组细胞抑制率升高，以40～160ng/mL浓度范围内更为明显；对不同组织学类型肿瘤细胞的抑制强度各有不同，其中，对HL-60细胞和CT26细胞的抑制率最高，达80％左右，而HeLa细胞的抑制率最低，约30％；与adriamycin组比较，anisomycin对CT26细胞的抑制作用强于adriamycin(P<0.05)(图1～4)。
[0053] 实施例5 anisomycin体内外诱导肿瘤细胞凋亡
[0054] 分别取生长旺盛的EAC细胞和CT26细胞，1000～1500rpm离心3～5min，弃上清，6
用含质量分数为5～10％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞数为1×10/mL，接种于12孔培养板中，加入anisomycin(终浓度为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL和160ng/mL)，并设adriamycin(终浓度为500ng/mL)阳性对照组和等体积的PBS阴性对照组。置37℃、
5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞于流式管中，用PBS洗2次(1200rpm，3min)，按细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司产品)说明书操作：500μL Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL碘化丙啶(PI)工作液混匀，室温避光孵育15min；用流式细胞仪(FACscalibur，BD Biosciences)分析细胞的凋亡情况。
用含质量分数为5～10％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞数为1×10/mL，接种于12孔培养板中，加入anisomycin(终浓度为10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL和160ng/mL)，并设adriamycin(终浓度为500ng/mL)阳性对照组和等体积的PBS阴性对照组。置37℃、
5％CO2培养箱中培养24h，收集细胞于流式管中，用PBS洗2次(1200rpm，3min)，按细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司产品)说明书操作：500μL Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL碘化丙啶(PI)工作液混匀，室温避光孵育15min；用流式细胞仪(FACscalibur，BD Biosciences)分析细胞的凋亡情况。
[0055] 取生长旺盛的CT26细胞，1000～1500rpm离心3～5min，弃上清，用PBS调整细7
胞数为1×10/mL，每只BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心提供)背部右侧皮下接种
3
细胞悬液100μL。当实体瘤体积平均达到100mm 左右时，瘤内注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin，每天1次，共14次，治疗14d后，检测瘤组织内肿瘤细胞的凋亡情况：取小鼠体内治疗后实体瘤组织，剪碎研磨，加入终浓度0.25％的胰酶消化10min，过200目筛
6
网，制成单细胞悬液，收集细胞并调整密度为1×10/mL，转移至流式管中，用PBS洗涤2次(1200rpm，3min)，其后处理同上。
胞数为1×10/mL，每只BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心提供)背部右侧皮下接种
3
细胞悬液100μL。当实体瘤体积平均达到100mm 左右时，瘤内注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin，每天1次，共14次，治疗14d后，检测瘤组织内肿瘤细胞的凋亡情况：取小鼠体内治疗后实体瘤组织，剪碎研磨，加入终浓度0.25％的胰酶消化10min，过200目筛
6
网，制成单细胞悬液，收集细胞并调整密度为1×10/mL，转移至流式管中，用PBS洗涤2次(1200rpm，3min)，其后处理同上。
[0056] 与对照组比较，anisomycin能促进EAC细胞(图5A)和CT26细胞凋亡(图5B)，细胞凋亡率随着anisomycin浓度的增加而增高；160ng/mL ansiomycin诱导细胞的凋亡率高于500ng/mL adriamycin；CT26细胞对anisomycin诱导凋亡的作用较EAC细胞更敏感；与体外诱导CT26细胞凋亡的结果一致，与对照组比较，anisomycin在体内也能促进实体瘤组织内CT26细胞凋亡，作用优于adriamycin(图5C)。
[0057] 实施例6 anisomycin体内抑制艾氏腹水癌生长，提高荷瘤动物存活率[0058] 取生长旺盛的EAC细胞，1000～1500rpm离心3～5min，弃上清，用PBS调整细胞8
数为1×10/mL，每只BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心提供)背部右侧皮下接种细胞悬液100μL。将接种EAC细胞的BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只，共30只，分别为
3
对照组，adriamycin阳性对照组和anisomycin治疗组。当实体瘤体积达平均达到100mm左右时，瘤周多点注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin，隔天1次，共7次，对照组小鼠注射等体积的PBS。每天用电子游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，按如下公式计算其瘤体积和抑瘤率，并记录小鼠存活时间：
数为1×10/mL，每只BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心提供)背部右侧皮下接种细胞悬液100μL。将接种EAC细胞的BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只，共30只，分别为
3
对照组，adriamycin阳性对照组和anisomycin治疗组。当实体瘤体积达平均达到100mm左右时，瘤周多点注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin，隔天1次，共7次，对照组小鼠注射等体积的PBS。每天用电子游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，按如下公式计算其瘤体积和抑瘤率，并记录小鼠存活时间：
[0059]
[0060]
[0061] 如图6所示，与对照组比较，anisomycin或adriamycin治疗组的抑瘤率随时间的延长而升高；与adriamycin阳性对照组比较，anisomycin治疗组荷瘤小鼠的存活时间明显延长，在肿瘤接种后90d仍有60％的荷瘤小鼠存活，而对照组和adriamycin阳性对照组小鼠全部死亡(P<0.01)。同上方案，如果瘤周多点注射1mg/kg或2mg/kg的anisomycin，其疗效明显低于5mg/kg anisomycin。
[0062] 实施例7 anisomycin体内抑制结肠癌生长，提高荷瘤动物存活率[0063] 取生长旺盛的CT26细胞，1000～1500rpm离心3～5min，弃上清，用PBS调整细胞数为1×107/mL，每只BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心提供)背部右侧皮下接种细胞悬液100μL。将接种CT26细胞的BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只，共30只，分别为对照组，adriamycin阳性对照组和anisomycin治疗组。当实体瘤体积达平均达到100mm3左右时，瘤内注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin，每天1次，共14次，对照组小鼠注射等体积的PBS。每天用电子游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，按实施例6公式分别计算实体瘤瘤体积和抑瘤率，并记录小鼠存活时间。
[0064] 如图7所示，与对照组比较，anisomycin治疗组小鼠的肿瘤体积显著低于对照组(P<0.01)，与adriamycin阳性对照组比较没有明显的差异；anisomycin治疗组荷瘤小鼠的存活时间明显延长，在肿瘤接种后第33d，对照组小鼠存活率降至约40％，在肿瘤接种后第40d，adriamycin阳性对照组小鼠的存活率也降至40％左右，而anisomycin治疗组小鼠存活率仍高达80％左右(P<0.05)。同上方案，如果瘤内注射1mg/kg或2mg/kg的anisomycin，其疗效明显低于5mg/kg anisomycin。
[0065] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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