一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒
专利汇可以提供一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 肿瘤 化疗药物 敏感性检测 试剂 盒 ，包括组织细胞分散酶、抗生素溶液、两性霉素溶液、EGTA-Trypsin溶液、含血清培养基DF10、无血清培养基Kertin-SFM、标本保存液、标本清洗液、凝胶包被培养瓶、细胞固定液、细胞分散酶、细胞过滤膜、中性红 染色 液和胶原凝胶制备试剂；该试剂盒的检测操作流程包括原代细胞培养、胶原凝胶胶滴内的培养和化疗药物敏感性的分析。与 现有技术 相比，本发明的有益效果是：本发明试剂盒能最大程度的保护肿瘤细胞活性，缩短药敏检测时间，本发明试剂盒包含了肿瘤细胞原代培养与化疗药物检测所需的所有试剂，耗材都为一次性用品，减少了实验过程中细菌污染，使用方便。，下面是一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，包括(1)组织细胞分散酶：胶原酶95～105mg，溶于4.5～5.5ml PBS溶液中，过滤除菌，4℃冷藏；(2)2×抗生素溶液：青霉素1.9～2.1g，硫酸卡那霉素0.9～1.1g，溶于18～22ml PBS中，过滤除菌，4℃冷藏；
(3)两性霉素溶液：两性霉素B 24～26mg，溶于95～105ml 0.9％氯化钠注射液中，过滤除菌，4℃冷藏；(4)EGTA-Trypsin溶液：EGTA 36～40mg，Trypsin 28～32mg，溶于Hank’s液中，室温静置1h，过滤除菌，4℃冷藏；(5)含血清培养基DF10：FBS 45～55ml，2×抗生素溶液，溶于480～520ml DF培养基中，4℃冷藏；(6)无血清培养基Kertin-SFM，4℃冷藏；(7)标本保存液：FBS 48～52ml，2×抗生素溶液4.9～5.1ml，两性霉素溶液4.8～5.2ml，溶于480～520ml DF培养基中，分装于50ml离心管中，4℃冷藏；(8)标本清洗液：2×抗生素溶液4.9～5.1ml，两性霉素溶液4.9～5.1ml，溶于480～520ml生理盐水中，常温保存；
(9)凝胶包被培养瓶：鼠尾胶原凝胶包被的培养瓶常温保存备用；（10）细胞固定液：10％中性福尔马林液；（11）细胞分散酶：0.2％胰蛋白酶，4℃冷藏；（12）细胞过滤膜：一次性过滤尼龙膜250μm和300μm两种规格；（13）中性红染色液：4℃冷藏；（14）胶原凝胶制备试剂：将鼠尾胶原凝胶溶液、10×10F12液和缓冲液以8:1:1的比例按顺序充分混合均匀，4℃冷藏备用。
2.一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒的检测操作流程，其特征在于，具体步骤如下：
（1）原代细胞培养：①于手术台上取得新鲜肿瘤标本，用含有抗生素的生理盐水冲洗数遍后置于含有抗生素的保存液中；②超净台上用无菌器械将肿瘤标本上的坏死以及血块等杂质剔除，再次用含有抗生素的生理盐水冲洗数遍，置于平皿中；③用无菌剪刀将标本剪碎至1mm×1mm×1mm，呈米糊状；④将标本用不含血清的细胞培养液转移至离心管中，并加入细胞分散酶，离心管置于35～36℃水浴中消化1～2h；⑤组织消化呈匀浆状后，离心机以
1250～1350rpm的转速离心4～5min；⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液继续消化2～5min；
⑦用含血清的细胞培养液终止消化，并用300μm尼龙膜过滤；⑧过滤后将分散的细胞再次以1250～1350rpm的离心转速4～6min；⑨去除上清，加入DF10含血清细胞培养液，充分吹打；⑩将制备好的细胞悬液加入胶原凝胶包被的培养瓶中培养，并置于37℃且含5%CO2的培养箱培养24～48h；
（2）胶原凝胶胶滴内的培养：①显微镜观察肿瘤细胞大量贴壁后，弃去培养瓶中液体，用0.2%胰蛋白酶消化瓶内细胞，并轻轻吹打，以除血细胞、死细胞及杂质；②显微镜观察大量贴壁细胞自瓶壁脱落后用含血清细胞培养液终止胰蛋白酶消化，并冲洗培养瓶数遍，将含有活细胞的液体回收至离心管中；③离心管用1250～1350rpm的转速离心4～6min；④
5
去除上清，用微量移液器将细胞吹散，进行细胞计数，调整至最终的细胞浓度为1×10 个/ml；⑤于冰上配置胶原混合液，将A液（鼠尾胶原凝胶溶液）、B液（10×F12液）和C液（缓冲液）以8:1:1的比例按照顺序进行充分混匀；⑥用DF10细胞培养液终止消化，并用250μm尼龙膜过滤；⑦将细胞液以1250～1350rpm的转速离心4～6min，再按照细胞分散液：胶原混合液=1:10的比例制成含有细胞的胶原混合液；⑧在六孔板上按照每孔3滴，每滴30ul
3
（最终细胞数为3×10 每滴）进行种板；⑨将接种好的六孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养
30min待胶原凝固；⑩胶原胶滴凝固后，在每个孔中加入2～4ml含血清的细胞培养液，培养箱培养23～25h；�在每个孔中加入25～35ul配置好的化疗药物，并设置对照，继续于
37℃，5%CO2培养箱中培养23～25h；�去除六孔板中的细胞培养液，每孔加入4ml不含血清细胞培养液，震荡摇匀，置于36～38℃，5%CO2培养箱中14～16min，并重复2遍充分洗去化疗药物；�每孔加入4ml Kertin-SFM无血清细胞培养液，于培养箱中培养5～7天；
（3）化疗药物敏感性的分析：①在六孔板的每孔中加入35～45ul中性红染液，充分摇匀，置于培养箱中培养1～2h；②去除孔中液体，每孔加入3～5ml PBS液，室温震荡后去除PBS；③每孔加入10%中性福尔马林液，室温静置40～50min；④移除10%中性福尔马林液，将培养板置于清水中8～12min；⑤室温风干后用Image Pro Plus软件对每个胶原凝胶胶滴进行染色比色分析，并通过细胞形态学以及着色程度的差异区别肿瘤细胞以及非肿瘤细胞。
一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒
技术领域
背景技术
发明内容
2.1g，硫酸卡那霉素0.9～1.1g，溶于18～22ml PBS中，过滤除菌，4℃冷藏；(3)两性霉素溶液：两性霉素B 24～26mg，溶于95～105ml 0.9％氯化钠注射液中，过滤除菌，4℃冷藏；(4)EGTA-Trypsin溶液：EGTA 36～40mg，Trypsin 28～32mg，溶于Hank’s液中，室温静置1h，过滤除菌，4℃冷藏；(5)含血清培养基DF10：FBS 45～55ml，2×抗生素溶液，溶于480～520ml DF培养基中，4℃冷藏；(6)无血清培养基Kertin-SFM，4℃冷藏；(7)标本保存液：FBS 48～52ml，2×抗生素溶液4.9～5.1ml，两性霉素溶液4.8～5.2ml，溶于
480～520ml DF培养基中，分装于50ml离心管中，4℃冷藏；(8)标本清洗液：2×抗生素溶液4.9～5.1ml，两性霉素溶液4.9～5.1ml，溶于480～520ml生理盐水中，常温保存；(9)凝胶包被培养瓶：鼠尾胶原凝胶包被的培养瓶常温保存备用；（10）细胞固定液：10％中性福尔马林液；（11）细胞分散酶：0.2％胰蛋白酶，4℃冷藏；（12）细胞过滤膜：一次性过滤尼龙膜250μm和300μm两种规格；（13）中性红染色液：4℃冷藏；（14）胶原凝胶制备试剂：
将鼠尾胶原凝胶溶液、10×10F12液和缓冲液以8:1:1的比例按顺序充分混合均匀，4℃冷藏备用。
1250～1350rpm的转速离心4～5min；⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液继续消化2～5min；
⑦用含血清的细胞培养液终止消化，并用300μm尼龙膜过滤；⑧过滤后将分散的细胞再次以1250～1350rpm的离心转速4～6min；⑨去除上清，加入DF10含血清细胞培养液，充分吹打；⑩将制备好的细胞悬液加入胶原凝胶包被的培养瓶中培养，并置于37℃且含5%CO2的培养箱培养24～48h；
（2）胶原凝胶胶滴内的培养：①显微镜观察肿瘤细胞大量贴壁后，弃去培养瓶中液体，用0.2%胰蛋白酶消化瓶内细胞，并轻轻吹打，以除血细胞、死细胞及杂质；②显微镜观察大量贴壁细胞自瓶壁脱落后用含血清细胞培养液终止胰蛋白酶消化，并冲洗培养瓶数遍，将含有活细胞的液体回收至离心管中；③离心管用1250～1350rpm的转速离心4～6min；④
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去除上清，用微量移液器将细胞吹散，进行细胞计数，调整至最终的细胞浓度为1×10 个/ml；⑤于冰上配置胶原混合液，将A液（鼠尾胶原凝胶溶液）、B液（10×F12液）和C液（缓冲液）以8:1:1的比例按照顺序进行充分混匀；⑥用DF10细胞培养液终止消化，并用250μm尼龙膜过滤；⑦将细胞液以1250～1350rpm的转速离心4～6min，再按照细胞分散液：胶原混合液=1:10的比例制成含有细胞的胶原混合液；⑧在六孔板上按照每孔3滴，每滴30ul
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（最终细胞数为3×10 每滴）进行种板；⑨将接种好的六孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养30min待胶原凝固；⑩胶原胶滴凝固后，在每个孔中加入2～4ml含血清的细胞培养液，培养箱培养23～25h；在每个孔中加入25～35ul配置好的化疗药物，并设置对照，继续于
37℃，5%CO2培养箱中培养23～25h；去除六孔板中的细胞培养液，每孔加入4ml不含血清细胞培养液，震荡摇匀，置于36～38℃，5%CO2培养箱中14～16min，并重复2遍充分洗去化疗药物；每孔加入4ml Kertin-SFM无血清细胞培养液，于培养箱中培养5～7天；
（3）化疗药物敏感性的分析：①在六孔板的每孔中加入35～45ul中性红染液，充分摇匀，置于培养箱中培养1～2h；②去除孔中液体，每孔加入3～5ml PBS液，室温震荡后去除PBS；③每孔加入10%中性福尔马林液，室温静置40～50min；④移除10%中性福尔马林液，将培养板置于清水中8～12min；⑤室温风干后用Image Pro Plus软件对每个胶原凝胶胶滴进行染色比色分析，并通过细胞形态学以及着色程度的差异区别肿瘤细胞以及非肿瘤细胞。
具体实施方式
4℃冷藏，特殊的组织酶配方能快速的分散癌细胞团快，并最大限度的减少酶消化过程中对细胞的毒性；
(2)2×抗生素溶液：青霉素1.9～2.1g，硫酸卡那霉素0.9～1.1g，溶于18～22ml PBS中，过滤除菌，4℃冷藏；
(3)两性霉素溶液：两性霉素B 24～26mg，溶于95～105ml 0.9％氯化钠注射液中，过滤除菌，4℃冷藏；
(4)EGTA-Trypsin溶液：EGTA 36～40mg，Trypsin 28～32mg，溶于Hank’s液中，室温静置1h，过滤除菌，4℃冷藏；
(5)含血清培养基DF10：FBS 45～55ml，2×抗生素溶液，溶于480～520ml DF培养基中，4℃冷藏，肿瘤细胞专用培养基，能促进肿瘤细胞生长，保持良好细胞活力；
(6)无血清培养基Kertin-SFM，4℃冷藏，无血清培养基能保证肿瘤细胞的良好增殖，同时抑制成纤维细胞增殖；
(7)标本保存液：FBS 48～52ml，2×抗生素溶液4.9～5.1ml，两性霉素溶液4.8～
5.2ml，溶于480～520ml DF培养基中，分装于50ml离心管中，4℃冷藏；
(8)标本清洗液：2×抗生素溶液4.9～5.1ml，两性霉素溶液4.9～5.1ml，溶于480～
520ml生理盐水中，常温保存；
(9)凝胶包被培养瓶：鼠尾胶原凝胶包被的培养瓶常温保存备用，凝胶包被培养瓶培养能促进肿瘤细胞贴壁，去除血细胞、死细胞及杂质细胞干扰；
（10）细胞固定液：10％中性福尔马林液，将胶滴中的细胞进行固定；
（11）细胞分散酶：0.2％胰蛋白酶，4℃冷藏，能快速、有效的消化贴壁的细胞；
（12）细胞过滤膜：一次性过滤尼龙膜250μm和300μm两种规格，能有效除去未消化的组织块；
（13）中性红染色液：4℃冷藏，利用三维培养的肿瘤细胞与正常细胞的中性红染色特点不同，便于在定量时排除成纤维细胞的干扰；
（14）胶原凝胶制备试剂：将鼠尾胶原凝胶溶液、10×10F12液和缓冲液以8:1:1的比例按顺序充分混合均匀，4℃冷藏备用，胶原凝胶作为细胞外基质，能模拟癌细胞在体内的生长环境，癌细胞在胶原凝胶中立体生长，呈现与体内相似的增殖形态与功能特质。
5min；⑨去除上清，加入DF10含血清细胞培养液，充分吹打；⑩将制备好的细胞悬液加入胶原凝胶包被的培养瓶中培养，并置于37℃且含5%CO2的培养箱培养36h；
（2）胶原凝胶胶滴内的培养：①显微镜观察肿瘤细胞大量贴壁后，弃去培养瓶中液体，
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