治疗疼痛的方法
阅读：1041发布：2020-05-14
专利汇可以提供治疗疼痛的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供改进的 治疗 顽固性 疼痛 的方法。改进的方法是鞘内注射含有依降 钙 素和合适的药物载体的药物。鞘内注射依降钙素比经其它途径(如静脉内、肌内)给予依降钙素和/或经各种途径(包括硬膜外/鞘内)给予阿片类产生更强和更持久的 镇痛 作用。，下面是治疗疼痛的方法专利的具体信息内容。
1.治疗有效量的依降钙素和药学上可接受的赋形剂在配制用于鞘内给药以 治疗人的顽固性疼痛的药物上的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述药物的投与使依降钙素的剂量为每 kg体重约0.2IU至约15IU。
3.如权利要求1所述的应用，其中所述药物配制成鞘内注射的标准体积。
4.如权利要求1所述的应用，其中所述药学上可接受的赋形剂为灭菌等渗盐 水。
5.如权利要求1所述的应用，其中顽固性疼痛为癌症所伴有的。
6.如权利要求1所述的应用，其中所述药物通过单剂注射或重复推注经鞘内 途径给药。
7.如权利要求1所述的应用，其中所述药物按约24-48小时的间隔经鞘内途 径给药。
8.如权利要求1所述的应用，其中所述药物通过连续输注经鞘内给药。
9.如权利要求1所述的应用，其中所述药物进一步包含人血清白蛋白。
发明领域
发明领域是治疗人类疼痛，特别是顽固性疼痛。具体地说，本发明提供依降 钙素在经鞘内途径给药的药物制剂上的用途。
发明背景
已知降钙素在治疗人类疼痛上有效，这种疼痛起因于包括(但不限于)骨质疏 松症、变形性骨炎、幻觉性肢体疼痛、反射性交感神经性营养不良、骨折、关节 强硬性脊椎炎和恶性肿瘤骨转移等疾病(见例如，Gennari & Agnusdei(1988)： Current Therapeutic Research 44：712-721)。降钙素因其降血钙和降血磷酸盐效应 而被用于治疗组合物中。降钙素还被用于增加骨质。
麻醉药(如吗啡)也被用于治疗人类慢性疼痛，它有成瘾的缺点，对吗啡的非 中毒剂量会产生耐受性。
对不能依赖常规镇痛治疗的患者进行镇痛治疗，在技术上长期以来一直有需 求。这样的疼痛治疗不应有明显的副作用或毒性；而且，还要求不出现耐受性的 疼痛治疗。本发明提供对疼痛的有效治疗，特别是对罹患慢性和顽固性疼痛的患 者(如晚期癌症所伴顽固性疼痛的患者)的治疗。
发明概述
本发明提供治疗哺乳动物疼痛(特别是治疗人类顽固性疼痛)的改进的方法。 在本发明中，对患疼痛的患者经鞘内给药提供依降钙素。将依降钙素溶解于适于 鞘内注射的赋形剂(如灭菌生理盐水)中。较佳的为药物进一步包含浓度约0.03- 0.1％mg/ml的人血清白蛋白。剂量范围为约0.2-约15IU依降钙素/kg体重，较佳 的为约1.6-约6.4IU依降钙素/kg体重。给药剂量以配制成鞘内注射标准体积为 宜(较佳为单剂鞘内注射约0.5-约2.0ml)。依降钙素按本说明书所述剂量以单剂或 多剂经鞘内途径给药。多剂给药可间隔长达24-48小时。可采用鞘内途径通过推 注或用连续或脉冲式给药泵给药。
依降钙素鞘内给药产生强大、持久的镇痛效应，不伴有明显的不合要求的副 反应，如成瘾，没有明显的耐受性发生。本发明的疼痛治疗特别有助于罹患顽固 性和严重疼痛(如晚期癌症)的患者。
附图的简单描述
图1例示经鞘内途径给予依降钙素以剂量依赖性方式延长热板潜伏期。在依 降钙素给药后1小时测定热板潜伏期(秒)。
图2例示经鞘内给予剂量从0.2-3.6IU/kg体重的依降钙素延长大鼠热板潜伏 期的作用(-+-0.2IU/kg，-★-0.8IU/kg，-■-1.6IU/kg，-×-2.4IU/kg，-◆-3.6IU/kg，- □-生理盐水对照)。
图3A和3B提供鞘内给予依降钙素(a)剂量为2.4-6.0IU/kg及吗啡(b)剂量为 37.5-125.0mg/kg后大鼠热板潜伏期延长的比较。在这些研究中，最大潜伏期为40 秒。
图4提供经鞘内途径给予低剂量依降钙素(2.4IU/kg，-●-)、吗啡(37.5mg/kg， --)或生理盐水(-▲-)的热板潜伏期延长和作用时间的比较。
图5提供经鞘内途径给予中剂量依降钙素(4.4IU/kg，--)、吗啡(75.0mg/lg， -■-)或生理盐水(-▲-)的热板潜伏期延长和作用时间的比较。在这些研究中，最大 潜伏期为40秒。
图6提供经鞘内途径给予高剂量依降钙素(6.0IU/kg，--)、吗啡(125mg/kg， -●-)或生理盐水(-■-)的热板潜伏期延长和作用时间的比较。
图7例示在5天多次鞘内给予剂量为4.4IU/kg体重的依降钙素(-■-)或生理 盐水(-○-)或假注射(-◆-)后热板潜伏期的延长。垂直的箭头表示大鼠注射的时 间。在研究的第1、3和5天于注射后0、1、3和24小时测定热板潜伏期。
图8例示鞘内给予10个单剂(每天一次)剂量为4.4IU/kg依降钙素(-■-)或生 理盐水(-○-)或假注射 后热板潜伏期的延长，不处理的间隔为48小时。垂直 的箭头表示大鼠注射的时间。在研究的第1、3、5、7、9和ll天于注射后0、 1、3和24小时测定热板潜伏期。
图9例示在5天多次鞘内给予含HSA(0.1％)的依降钙素(剂量为4.4IU/kg)后 热板潜伏期的延长。在研究的第1、3和5天于注射后0、1、3和24小时测定 热板潜伏期。
发明的详述
美国专利No.4,086,22l(shumpei Sakakibara等1976年5月3日申请)所描述 的依降钙素具有如下结构：
依降钙素与鳗降钙素的不同在于N-末端半胱氨酸残基和第7个氨基酸的位 置被氨基辛二酸桥取代，它提供碳-碳桥以取代天然降钙素分子中半胱氨酸残基之 间的二硫键。其它含氨基辛二酸桥的分子在美国专利No.4,086,221中有描述，引 入本文作为参考。鳗、人、猪、鲑和大鼠降钙素的氨基酸序列分别为序列1、2、 3、4和5。序列2-5的降钙素中以氨基辛二酸桥取代N-末端和第7位半胱氨酸 也得到相当稳定、镇痛有效的多肽组合物。在本文中引为参考的美国专利No. 4,977,139(Yamada等，1989年10月25日申请)描述对光、热和振荡稳定性改善 的依降钙素水性组合物。
美国专利No.4,977,139(Yamada等，1989年10月25日申请)、No. 5,118,667(Adams等，1991年5月3日申请)和4,758,550(Cardineaux等，1986年 12月3日申请)似乎公开了降钙素和依降钙素组合物在治疗各种类型骨和/或疼痛 性疾病上的用途，但无一公开依降钙素鞘内注射用于治疗顽固性疼痛。
Miseria et a1.(1989)Tumori(Italy)75：183-184似乎公开了鲑降钙素硬膜外给 药用于治疗顽固性疼痛，但数据看来不支持其用作镇痛剂。
如本文所用的，镇痛效应指结果是对疼痛不敏感，或痛觉或疼痛性或损伤性 刺激的感觉降低，而不失去知觉。镇痛和抗伤害感觉在本申请中是作为同义词使 用的。
如本文所用的，顽固性疼痛是对常规镇痛剂不起反应的疼痛和/或对麻醉性镇 痛剂(如吗啡)产生耐受性而持续疼痛。顽固性疼痛可以是包括(但不限于)癌症、骨 折、骨质疏松症、切断术后疼痛及某些其它疾病所伴有的。
大鼠是经鞘内途径给药的受试化合物的较佳的动物模型，测量镇痛作用的大 鼠热板试验是潜在有效的疼痛治疗的可接受的模型系统。
如本文所揭示的(见实施例8、9；表1、2)，在大鼠热板量度镇痛的模型 系统中，所用的全部依降钙素剂量均产生强大、持久的抗伤害感觉作用，在注射 后15分钟显示作用，30-60分钟时达到峰值，至少持续到注射后6小时。采用热 板试验，所用的依降钙素剂量常产生可观察到的最大的镇痛作用，因此在用范围 从0.8-3.6IU/kg的依降钙素后所得的热板潜伏期无明显差异。在所用的最低剂量 (0.2IU/kg)，观察到略低的反应。然而，用较低剂量依降钙素甚至也能得到剂量 依赖方式的中等和最低限度的抗伤害觉反应。
表 1
大鼠单剂注射依降钙素后的镇痛活性(热板潜伏期)(均值±标准误) 剂量 IU/kg 大 鼠 数 热板潜伏期(秒) 给药后时间(小时) 0 0.25 0.5 1 3 6 24 0 21 11.2±0.5 11.7±0.9 11.5±0.6 12.2±0.8 11.8±1.1 11.1±0.7 11.5±0.5 0.2 11 10.6±0.8 13.0±1.1 12.9±0.7 12.7±0.9 13.1±0.7 12.1±0.5 10.8±0.7 0.8 13 9.8±0.8 15.1±1.5** 15.0±1.5** 15.2±1.3** 20.0±2.8** 12.3±1.0 11.7±1.0 1.6 13 9.2±0.5 16.4±1.2** 16.0±1.0** 16.4±1.1** 15.1±0.9** 13.6±0.8** 10.9±0.4* 2.4 13 9.2±0.7 20.0±1.5** 20.1±1.9** 19.5±1.8** 21.8±2.1** 12.6±1.2* 10.31±1.2 3.6 12 10.4±0.9** 19.4±1.6** 21.4±1.8** 23.5±2.5** 19.5±1.0** 15.7±1.3** 10.2±1.0 *P≤0.05 student’s t-测验 **P≤0.05 student’s t-测验
在本文所描述的大鼠热板量度镇痛作用的试验数据中，鞘内注射依降钙素与 静脉注射依降钙素相比，取得预想不到的抗伤害觉得到改善的结果(见本文实施例 7)。如实施例9和图6-8所示，在大鼠热板试验中，鞘内注射依降钙素与鞘内注 射吗啡相比，也产生惊人的疼痛改善。此外，在吗啡和依降钙素鞘内给药的镇痛 活性比较上，依降钙素在大鼠热板试验中显示出具有较大的镇痛活性，依降钙素 的镇痛效应也显示出大于吗啡的持续时间(见本文实施例9和图3-6)。
下面的实施例是为了阐述的目的而提供的，并不是为了限制本文所描述和要 求保护的发明的范围。所有研究均按照FDA GLP的法规(21 C.F.R.58)进行。对 熟练技术人员来说显而易见的从本文所揭示的发明实践进行的任何常规的程序 修改和衍生均在本发明的范围内。
实施例
实施例1：试验动物
大鼠是美国和国际药政机构关于用于试验化合物镇痛活性的优选物种之 一。关于Sprague-Dawley大鼠的历史信息可从公开的文献中得到。成年雄性 Sprague-Dawley大鼠购自Sasco Inc.(Oregon，WI)，在用于试验前使其有7天的 适应期。在收到大鼠后1天及7天后或分配到实验组之前将其称重。将大鼠随机 地分配到实验组中进行处理。体重明显不同于该组平均体重、在体重上显示异常 改变或显示躯体疾病的任何动物均不加以使用。试验大鼠在320-420g范围内。
实施例2：动物管理
动物管理按照美国农业部的准则和动物保护条例实验室动物资源保护及使 用指南(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animal Resoures，National Research Council，DHHS，Publication No.NIH 85-23，1986)。将大鼠放在环境控制 的室内，保持温度于18-26℃，通常18-20℃，相对湿度40-70％，每小时进行 10次以上室内空气交换。每天维持12小时昼夜周期。对动物任意供应自来水和 食物(Agway Rat Chow，Agway)。发明者未发现可能对试验有不良影响的食物或供 水上的任何污染。
每周两次(或更勤些，如果需要)从笼中除去排泄物。笼子和食具每两周消毒 一次，如需要可更勤些。
一旦插管，大鼠即单独关在不锈钢笼内以避免插管被同伴损坏。每只大鼠由 其笼子上的独特的编号加以区别。
实施例3：储备液的制备
依降钙素([Des-Cys1，ASU7]-降钙素，鳗；carbacalcitonin)得自Bachem，Inc. (Torrance，CA)，避光储存于-20℃。用于鞘内注射后镇痛活性试验的依降钙素的 储备液(1mg/ml，在灭菌等渗盐水中，美国药典)每天新鲜配制并保持在冰中。临 注射前进行适当的稀释。
灭菌等渗盐水(0.9％w/v NaCl，美国药典级)得自Sigma Chemical Co.(St. Louis，MO)。
人血清白蛋白得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。储备液为25％ (w/v)。
硫酸吗啡得自Mallinckrodt，Inc.(St.Louis，MO)。鞘内注射用吗啡储备液每 天配制(10mg/ml，在灭菌等渗盐水中)并保持于冰上。临注射前进行适当的稀释。
实施例4：用于鞘内给药的神经手术/插管术
试验前5～7天将大鼠麻醉(Nembutal，30mg/kg，腹腔注射)后手术植入鞘内插 管。各管(聚乙烯管，PE10)经寰枕膜裂隙插入，插管穿过蛛网膜下腔7.5cm，使 其未端位于腰膨大头侧缘。各管以氰基丙烯酸酯粘合剂固定在颅上，用创口夹关 闭颅。将各管的游离端热封；当准备经鞘内途径注射组合物时，用插入封闭插管 的Hamilton针头引入各组合物。插管植入后试验前有5-7天的时间使其完全从手 术过程中恢复过来。
实施例5：镇痛活性的评价
用标准的测量镇痛作用的热板试验(Woolfe and MacDonald(1944)J. Pharmacol.Exp.Ther.80：300)评价疼痛敏感性。热板反应系将大鼠放在封于有机 玻璃圆筒中的55℃铜制热板上进行测定。将放到热板上和舔后足或跳离热板之 间的间隔(以秒计)定义为“热板潜伏期”。如果动物不发生对热板起舔后足或跳 离热板的反应，在40秒后取出以避免足组织损伤，其热板潜伏期定为40秒。
由于这些实验的技术要求，给定的一天中试验不超过8-9个大鼠。每个实验 条件研究足够的动物以得到10-11个可评价的大鼠。在试验日，将动物进行基线 热板反应，然后接受受试镇痛剂或生理盐水(对照)的推注。受试化合物或赋形剂 对照物鞘内注射后15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时再评价 热板反应。
实施例6：给药剂量
所有剂量的依降钙素均以推注形式给药。在单剂给药研究中试验了如下依降 钙素鞘内剂量：0.2，0.8，1.6，2.4，3.6，4.4，5.2和6.0IU/kg或0.03，0.13，0.25，0.39， 0.58，0.71，0.84和0.97μg/kg。试验的依降钙素静脉注射剂量为10.0，30.0，100.0 和300.0IU/kg或1.61，4.83，16.1和48.3μg/kg。1μg依降钙素相当于约6.2 IU。
实施例7：给药体积
所有鞘内注射剂量均以37.5μl/kg的体积给予，然后用10μl/kg生理盐水 冲洗插管(单剂研究)或以10μl体积给药然后用8μl生理盐水冲洗插管(多剂研 究)。所有静脉注射剂量均以0.5ml/kg的体积给予。
实施例8：大鼠镇痛测定试验中对鞘内注射依降钙素的剂量反应
在此研究中，镇痛测定试验中试验了鞘内途径给予依降钙素的某一剂量范 围，以确定引起镇痛的最小和峰值有效剂量并确定剂量反应。受试剂量为0.2，0.8， 1.6，2.4和3.6IU/kg。经鞘内途径以37.5μl/kg体积注射所需的剂量并以10μl 盐水洗净插管。测定基线(给药前)和注射药物或赋形剂后15分钟、30分钟、1 小时、3小时、6小时和24小时时的反应。研究中每个剂量依降钙素用11-13只 动物，用21只对照赋形剂(盐水)动物。
使用体重为350-400g的成年雄性大鼠总数113只。如实施例4所述，手术植 入鞘内插管。手术植入鞘内插管后在给受试组合物前有3只大鼠死亡。在鞘内注 射0.8IU/kg依降钙素后24小时有第4只大鼠死亡。
本研究证明，经鞘内途径给予依降钙素以剂量依赖性方式增加热板潜伏期(见 表1、图1)。抗伤害觉作用在注射后15分钟内起效，0.25小时和3小时之间出 现潜伏期的统计学显著延长。在3个较高的剂量注射后6小时也有明显的抗伤害 觉作用。大多数试验中，注射后24小时动物的热板潜伏期回到基线(见表1、图 2)。
对数据作了显著性分析，用各点计数(均值和标准差)来分析每个剂量药物在 选定时间的镇痛活性。计算非参数统计值，给出对照组和试验组之间差异的显著 性水平。
最低试验剂量(0.2IU/kg依降钙素)不产生有统计学显著性的反应，但0.8和 1.6IU/kg剂量导致显著的抗伤害觉作用而2.4和3.6IU/kg剂量导致强大的抗伤害 觉效应(图2)。对照组只给盐水不改变基线反应。
实施例9：鞘内注射依降钙素及鞘内注射吗啡的镇痛活性比较
本研究比较吗啡和依降钙素的镇痛活性，每个药均在大鼠动物模型上经鞘内 途径给药。
本研究中用体重从320g至420g的96只大鼠。如上所述，植入插管并待其 恢复。依降钙素剂量为2.4，3.6，4.4，5.2和6.0IU/kg(分别为0.39，0.58，0.71，0.84 和0.97μg/kg)。硫酸吗啡以37.5，75.0和125.0μg/kg剂量给药。药物或盐水均 采用插入插管的Hamilton针头给予，剂量体积为37.5μl/kg，接着用10μl盐 水洗净插管。测定基线(给药前)和给药物或赋形剂后15分钟、30分钟、1小时、 3小时、6小时和24小时的反应。
依降钙素(图3A)和吗啡(图3B)均延长热板潜伏期，表明有镇痛效应(表2)。 所有受试剂量的依降钙素均产生强大和长时间的抗伤害觉作用，在注射后15分 钟内出现作用，注射后30-60分钟时达到高峰，持续至少6小时(表2、图3A)。 由于用热板试验，所用的依降钙素剂量常产生最大可检测的镇痛作用，所以给予 3.6-6.0IU/kg范围剂量的依降钙素所得的热板潜伏期无明显差异。使用最低剂量 依降钙素(2.4IU/kg或0.39μg/kg)时得到略小的反应。然而，实施例8的结果表 明，用较低剂量依降钙素可得到剂量依赖性方式的中等及最小限度的抗伤害觉反 应。
吗啡以剂量依赖性方式延长热板潜伏期，镇痛的发生出现在注射后15分钟 内(表2、图3A)。然而，镇痛的持续时间显得短于依降钙素，注射后3小时潜伏 期明显缩短，注射后约6小时回到基线热板潜伏期，较低剂量尤其是如此。而且， 在本研究所使用的剂量时，注射吗啡的动物所达到的镇痛峰水平一般低于注射依 降钙素动物的水平(表2、图3A、3B)。
为了比较依降钙素和吗啡的镇痛强度，将剂量转换成nmol/kg。在几个时间 点上对此二药作剂量反应曲线以评估等效剂量(表2)。依降钙素0.12nmol/kg(2.4 IU/kg或0.39μg/kg)注射后30分钟产生相当于硫酸吗啡98.84nmol/kg(75.0μ g/kg)的热板潜伏期，0.18nmol/kg依降钙素(3.6IU/kg或0.58μg/kg)约相当于硫 酸吗啡164.73nmol/kg(125.0μg/kg)。类似的强度见于注射后1小时(表2)。然 而，吗啡注射后6小时抗伤害觉活性比依降钙素降低，因此，在此时间点上，依 降钙素全部受试剂量(0.12-0.30nmol/kg)产生比硫酸吗啡全部受试剂量(49.42- 164.73nmol/kg)更强的热板镇痛作用(表2)。
表 2
大鼠单剂鞘内注射后依降钙素和吗啡的镇痛活性
(热板潜伏期)比较(均值±SEM) 组 大 鼠 数 剂 量 热板潜伏期(秒) IU/kg μg/kg nmol/kg 给药后时间(小时) 0 0.25 0.5 1 3 6 24 对照 赋形剂 15 12.51± 0.60 14.16± 0.64 14.32± 1.00 14.32± 1.02 13.16± 0.79 13.14± 0.74 12.85± 1.87 依降 钙素 9 2.4 0.39 0.12 13.54± 1.91 19.70± 1.75 23.90± 3.12 24.68± 1.80** 13.0± 0.7* 12.1± 0.5 10.8± 0.7 10 3.6 0.58 0.18 12.92± 1.4 21.04± 2.22** 26.03± 3.08** 26.08± 3.69** 23.14± 3.05** 20.37± 3.44 15.79± 2.40 9 4.4 0.71 0.22 13.68± 1.10 21.89± 3.12* 26.03± 3.36** 26.20± 2.37** 21.11± 2.18* 20.02± 3.26 11.78± 1.75 8 5.2 0.84 0.26 13.41± 0.92 27.89± 3.10** 31.55± 4.17** 25.82± 3.79** 28.81± 3.41** 22.97± 2.60** 12.36± 1.69 9 6.0 0.97 0.30 11.38± 0.89 25.22± 4.13** 28.91± 3.40** 28.48± 3.35** 26.60± 3.87** 24.69± 2.84** 11.17± 1.80 吗啡 9 - 37.5 49.42 12.81± 1.23 22.08± 2.68** 20.97± 2.56* 21.81± 2.46** ±19.97 ±2.05* 14.02± 1.24 11.33± 1.51 9 - 75.0 98.84 13.76± 1.27 22.76± 2.43** 21.86± 2.25** 19.88± 2.04* 17.42± 1.93 17.66± 1.71 12.60± 1.19 9 - 125.0 164.73 13.28± 1.35 19.4± 1.6** 2636± 4.20** 26.83± 3.04** 21.69± 3.62 15.86± 3.29 13.49± 1.63
为了比较镇痛活性的持续时间，对最低剂量依降钙素和吗啡(图4)、中等剂 量依降钙素和吗啡(图5)和高剂量依降钙素和吗啡(图6)进行抗伤害觉的时程比 较。显然，依降钙素一般比吗啡镇痛活性的持续时间长，在低剂量和中等剂量时 特别明显。赋形剂注射不产生可检出的热板潜伏期改变。
体重改变不明显，未观察到死亡例。在鞘内注射依降钙素后24小时观察时 间内未见临床或行为异常。两个动物(3.6和5.2IU/kg)出现短时间尾部(2)和后肢(1) 肌阵挛。在这些试验中，鞘内注射依降钙素后未见明显的病态或临床和行为异 常。
总之，这些结果表明，依降钙素经鞘内途径给药时，与鞘内给药的硫酸吗啡 相比，在约低于硫酸吗啡1000倍的摩尔浓度即产生强的镇痛作用，且依降钙素 所产生的镇痛作用持续时间长，至少达注射后6小时。
实施例10：静脉注射依降钙素的镇痛活性
本研究设法确定经静脉途径给药的依降钙素的镇痛有效剂量和确定剂量反 应关系。
本研究使用体重320-420g的大鼠共24只。每个剂量水平用4-8只大鼠。经 尾静脉注射依降钙素0.5ml/kg体重。所用的剂量为10、30、100和300IU/kg(分 别为1.61，4.83，16.1和48.3μg/kg)。用上面实施例5所述热板镇痛测定试验测定 基线热板反应和注射后15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时时 的反应。
本研究的结果表明，静脉注射依降钙素只略为延长热板潜伏期，表示仅有小 的镇痛效应(表3)。
表3
大鼠单剂静脉注射依降钙素的镇痛活性(热板潜伏期)
(均值±标准误) 组 剂 量 大 鼠 数 热板潜伏期(秒) IU/kg μg/kg 给药后时间(小时) 0 0.25 0.5 1 3 6 24 依降 钙素 10.0 1.61 8 12.03 ±1.02 11.95 ±1.40 15.64 ±2.39 14.95± 2.92 14.11± 0.94 10.45± 1.03 8.86± 1.23 30.0 4.83 8 10.71 ±1.02 10.04 ±0.96 12.18 ±1.22 14.14* ±1.02 14.26± 1.39 15.12± 2.20 10.76 ±1.25 100.0 16.1 4 13.53 ±1.63 11.05 ±1.99 9.63 ±1.21 11.20± 1.95 14.76± 1.19 14.00± 1.83 14.30 ±1.33 300.0 48.3 4 11.22 ±0.38 11.05 ±3.82 11.65 ±2.31 12.65± 2.09 17.37± 4.25 11.55± 2.80 10.52 ±1.74
较高剂量(100和300IU/kg)与较低剂量(10和30IU/kg)相比，未见明显的镇 痛效应增强，虽然30-300IU/kg剂量与10IU/kg剂量30分钟时相比峰效应出现 晚(3-6小时)并略为延长。大鼠静脉注射10-300IU/kg体重依降钙素未见明显的剂 量反应关系(表3)。
静脉注射和鞘内注射依降钙素后所得的热板潜伏期的比较分析表明，在0.5 小时时，静注最低剂量依降钙素(10.0IU/kg或1.61μg/kg)产生与经鞘内途径给 予依降钙素1.6IU/kg(0.25μg/kg)类似的热板潜伏期(见实施例8)。
在这些试验中，静脉注射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例 或临床和行为异常。
实施例11：多次依降钙素鞘内剂量的镇痛活性
本研究评估重复剂量鞘内注射依降钙素对镇痛的有效性。如上所述给大鼠植 入鞘内插管，此后经7-10天使其完全从手术过程中恢复过来。
18只大鼠分成3组，每组6只。研究以1周间隔进行2种处理。处理组I大 鼠不接受治疗。II组大鼠接受每天鞘内注射灭菌生理盐水(赋形剂对照)，连续5 天。III组大鼠每天接受依降钙素(4.4IU/kg体重)，连续5天。
每组按上文实施例5所述，在研究第1天、第3天和第5天的0分钟(给药前， 基线)、注射后1小时、3小时和24小时测定热板潜伏期。
图7的结果表明，重复鞘内剂量依降钙素能延长热板潜伏期，在每次连续注 射后24小时，热板潜伏期较长，有经时累积镇痛效应。在这些试验中，鞘内注 射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例或临床和行为异常。
实施例12：大鼠每天鞘内注射单剂依降钙素历时11天的镇痛活性
本研究评估对大鼠经鞘内途径给予重复剂量依降钙素的有效性，给药方案为 在间隔48小时不治疗间期的两个5天治疗期中每天给药，共10个连续单剂。
如上所述给大鼠植入鞘内插管，此后经7-10天使其完全从手术过程中恢复过 来。9只大鼠分成3组，每组3只。研究以间隔48小时不治疗间期的两个5天治 疗期进行。处理组I大鼠不接受治疗(假注射)。在每个治疗期，II组大鼠接受5 个连续的每天鞘内注射剂量灭菌生理盐水(赋形剂对照)，每次研究处理共10次注 射。在每个治疗期，III组大鼠接受5个连续的每天鞘内注射剂量依降钙素(4.4 IU/kg体重)，每次研究处理共注射10次(表4)。
每组按上文实施例5所述，在研究第1、3、5、7、9和11天的0分钟(给 药前，基线)、注射后1小时、3小时和24小时测定热板潜伏期(表4)。
图8的结果表明，重复鞘内剂量依降钙素能延长热板潜伏期并有经时累积镇 痛效应。
表4
研究设计 程序 研究日 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 第1期 注射 × × × × × 热板试验 × × × 代谢观察 × × × × × × 临床观察 × × × × × × 第2期 注射 × × × × × 热板试验 × × × 代谢观察 × × × × × 临床观察 × × × × × ×
在这些试验中，鞘内注射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例 或临床和行为异常。
实施例13：含人血清白蛋白的药物组合物
本研究评估作为含依降钙素镇痛组合物成分的人血清白蛋白的效应。人血清 白蛋白(HSA)是对病人或实验动物给药前防止依降钙素粘附于药瓶或管子等的候 选者。
在每个研究日，在无菌条件下用生理盐水(0.3％NaCl溶液，USP)稀释HSA 的标准25％(重量/体积)溶液，得到所需的0.2％(重量/体积)储备浓度。需要时将 依降钙素溶液的一份与等体积0.2％HSA混合，得到在待注射的含依降钙素组合 物中HSA终浓度为0.1％。
如上所述，取得32只雄性大鼠(320-420g)、使其适应、进行插管并使其恢复。 I组大鼠以10μl/kg体积鞘内注射4.4IU/kg剂量依降钙素(在生理盐水中)。II 组大鼠以10μl/kg体积鞘内注射4.4IU/kg剂量依降钙素(在含0.1％HSA的生理 盐水中)。III组大鼠注射含0.1％HSA的生理盐水10μl/kg。每次给药后均以8 μl生理盐水冲洗插管。
在每个研究周，在第1、3和5研究日的0分钟(基线，给药前)、鞘内注射 后1小时、3小时、6小时和24小时测定热板潜伏期。图9结果表明，在5天重 复剂量鞘内注射依降钙素(4.4IU/kg，在0.1％HSA中)后大鼠热板潜伏期延长。
在这些试验中，鞘内注射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例 或临床和行为异常。
实施例14：大鼠静脉和鞘内注射125I-依降钙素后的药物动力学
按照表5描述的设计方案在21只Sprague-Dawley大鼠上研究药物动力学/物 料平衡和在选定的组织内的分布。
将放射性碘化的依降钙素(125I-依降钙素)经颈静脉作静脉注射(IV)和经手术 插入的插管作鞘内注射(IT)。在单剂1μg/kgIT推注剂量或单剂50μg/kg IV推 注剂量后于规定的时间(表5)采集血液、血浆、尿、粪、组织和尸体样品。
表 5
研究设计和采样时间表 动物组 (n) 给药 途径 剂 量 用于总放射性测定的 生物样品 采样时间 1 (n＝4) IV (推注) 单剂： 50μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：1mL/kg 每个动物8个血浆样品， 从2个动物采集脑、脊 髓、肺、肝、甲状腺、肾、 血液和血浆样品 (共34份血浆、2份血液 和12份组织样品) 血液 给药后5分钟，0.5，1，2， 4，8，24和48小时 组织、血液和血浆 给药后120小时(n＝2只大 鼠) 2 (n＝4) 鞘内 单剂： 1μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：20μL/kg 每个动物8个血浆样品， 从2个动物采集脑、脊 髓、肺、肝、甲状腺、肾、 血液和血浆样品 (共34份血浆、2份血液 和12份组织样品) 血液 给药后0.5，1，2，4，6，8，24 和48小时 组织、血液和血浆 给药后120小时(n＝2只大 鼠) 3 (n＝4) IV (推注) 单剂： 50μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：1mL/kg 每个动物7份尿和5份粪 样 每个动物1个尸体样本 (总共4个尸体样本、28 份尿样和20份粪样) 洗笼水 尿 给药后0-6，6-12，12- 24，24-48，48-72， 72-96和96-120小时 粪 给药后0-24，24-48，48- 72，72-96和96-120小时 尸体 给药天120小时 4 (n＝4) IV (推注) 单剂： 50μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：1mL/kg 每个动物取脑、脊髓、肺、 肝、甲状腺、肾、血液和 血浆样品(共24份组织、 4份血液和4份血浆样品) 组织、血液和血浆 给药后1小时(n＝2只大鼠) 和给药后24小时(n＝2只 大鼠 (n＝4) 鞘内 单剂： 1μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：20μL/kg 每个动物取脑、脊髓、肺、 肝、甲状腺、肾、血液和 血浆样品(共24份组织、 4份血液和4份血浆样品) 组织、血液和血浆 给药后1小时(n＝2只大鼠) 和给药后24小时(n＝2只 大鼠 6 (n＝1) 不给 药 无 尿、粪、血浆、组织、尸 本样品和洗笼水 24小时收集试样用于背景 分析
用γ-计数仪测定总放射性。通过测定用三氯乙酸沉淀后血浆蛋白中的放射 性来评估血浆中蛋白结合的放射性。
血浆中总放射性(游离I2和碘化蛋白质)的终末半衰期(terminal phase half-life) 在静脉给药后为29小时，鞘内给药后为32小时。静脉给药和鞘内给药后TCA 可沉淀的放射性的终末半衰期相似(估计为40小时)。
鞘内给药后，药物衍生的放射性相当快地分布到组织中(1小时达最大浓度 Cmax)。浓度的排列顺序为：甲状腺＞脊髓＞脑＞肾＞血液＞肺＞肝脏。不希望被任何 特定的理论束缚，甲状腺中高浓度的放射性最象是给予的制剂中存在游离I2的结 果。鞘内注射后脑血浆放射性水平明显高于静脉注射后，表示难以通过血脑屏 障。IV给药后86％剂量被回收。所投与的放射性的约46％在最初24小时内被 回收。消除的主要途径是经尿排出(71％)。
序列表 (1)一般信息： (i)申请人： Noble，John F.
Abajian，Henry B. (ii)发明名称： 治疗疼痛的方法： (iii)序列数： 5 (iv)通讯地址：
(A)ADDRESSEE：Greenlee，Winner and Sullivan，P.C.
(B)STREET：5370 Manhattan Circle，Suite 201
(C)CITY：Boulder
(D)STATE：Colorado
(E)COUNTRY：US
(F)ZIP：80303 (v)计算机可读形式：
(A)工具类型：软盘
(B)计算机：兼容型IBM PC
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30 (vi)本申请资料：
(A)申请号：WO
(B)申请日：18-APR-1996
(C)CLASSIFICATION： (vii)在先申请资料
(A)申请号：US 08/424,866
(B)申请日：18-APR-1995
(viii)代理人信息：
(A)姓名：Ferber，Donna M.
(B)注册号：33,878
(C)案件号：1-95A WO
(ix)电信信息
(A)电话：(303)499-8080
(B)传真：(303)499-8089 2.SEQ ID NO：1的信息：
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(A)长度：32个氨基酸
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(iii)假设：否
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(A)生物体：鳗
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20 25 30 Pro 2.SEQ ID NO：3的信息：
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(A)生物体：鲑 (xi)序列描述：SEQ ID NO：4： Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu 1 5 10 15 His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro
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(A)长度：32个氨基酸
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20 25 30
麻醉药(如吗啡)也被用于治疗人类慢性疼痛，它有成瘾的缺点，对吗啡的非 中毒剂量会产生耐受性。
对不能依赖常规镇痛治疗的患者进行镇痛治疗，在技术上长期以来一直有需 求。这样的疼痛治疗不应有明显的副作用或毒性；而且，还要求不出现耐受性的 疼痛治疗。本发明提供对疼痛的有效治疗，特别是对罹患慢性和顽固性疼痛的患 者(如晚期癌症所伴顽固性疼痛的患者)的治疗。
发明概述
本发明提供治疗哺乳动物疼痛(特别是治疗人类顽固性疼痛)的改进的方法。 在本发明中，对患疼痛的患者经鞘内给药提供依降钙素。将依降钙素溶解于适于 鞘内注射的赋形剂(如灭菌生理盐水)中。较佳的为药物进一步包含浓度约0.03- 0.1％mg/ml的人血清白蛋白。剂量范围为约0.2-约15IU依降钙素/kg体重，较佳 的为约1.6-约6.4IU依降钙素/kg体重。给药剂量以配制成鞘内注射标准体积为 宜(较佳为单剂鞘内注射约0.5-约2.0ml)。依降钙素按本说明书所述剂量以单剂或 多剂经鞘内途径给药。多剂给药可间隔长达24-48小时。可采用鞘内途径通过推 注或用连续或脉冲式给药泵给药。
依降钙素鞘内给药产生强大、持久的镇痛效应，不伴有明显的不合要求的副 反应，如成瘾，没有明显的耐受性发生。本发明的疼痛治疗特别有助于罹患顽固 性和严重疼痛(如晚期癌症)的患者。
附图的简单描述
图1例示经鞘内途径给予依降钙素以剂量依赖性方式延长热板潜伏期。在依 降钙素给药后1小时测定热板潜伏期(秒)。
图2例示经鞘内给予剂量从0.2-3.6IU/kg体重的依降钙素延长大鼠热板潜伏 期的作用(-+-0.2IU/kg，-★-0.8IU/kg，-■-1.6IU/kg，-×-2.4IU/kg，-◆-3.6IU/kg，- □-生理盐水对照)。
图3A和3B提供鞘内给予依降钙素(a)剂量为2.4-6.0IU/kg及吗啡(b)剂量为 37.5-125.0mg/kg后大鼠热板潜伏期延长的比较。在这些研究中，最大潜伏期为40 秒。
图4提供经鞘内途径给予低剂量依降钙素(2.4IU/kg，-●-)、吗啡(37.5mg/kg， --)或生理盐水(-▲-)的热板潜伏期延长和作用时间的比较。
图5提供经鞘内途径给予中剂量依降钙素(4.4IU/kg，--)、吗啡(75.0mg/lg， -■-)或生理盐水(-▲-)的热板潜伏期延长和作用时间的比较。在这些研究中，最大 潜伏期为40秒。
图6提供经鞘内途径给予高剂量依降钙素(6.0IU/kg，--)、吗啡(125mg/kg， -●-)或生理盐水(-■-)的热板潜伏期延长和作用时间的比较。
图7例示在5天多次鞘内给予剂量为4.4IU/kg体重的依降钙素(-■-)或生理 盐水(-○-)或假注射(-◆-)后热板潜伏期的延长。垂直的箭头表示大鼠注射的时 间。在研究的第1、3和5天于注射后0、1、3和24小时测定热板潜伏期。
图8例示鞘内给予10个单剂(每天一次)剂量为4.4IU/kg依降钙素(-■-)或生 理盐水(-○-)或假注射 后热板潜伏期的延长，不处理的间隔为48小时。垂直 的箭头表示大鼠注射的时间。在研究的第1、3、5、7、9和ll天于注射后0、 1、3和24小时测定热板潜伏期。
图9例示在5天多次鞘内给予含HSA(0.1％)的依降钙素(剂量为4.4IU/kg)后 热板潜伏期的延长。在研究的第1、3和5天于注射后0、1、3和24小时测定 热板潜伏期。
发明的详述
美国专利No.4,086,22l(shumpei Sakakibara等1976年5月3日申请)所描述 的依降钙素具有如下结构：
依降钙素与鳗降钙素的不同在于N-末端半胱氨酸残基和第7个氨基酸的位 置被氨基辛二酸桥取代，它提供碳-碳桥以取代天然降钙素分子中半胱氨酸残基之 间的二硫键。其它含氨基辛二酸桥的分子在美国专利No.4,086,221中有描述，引 入本文作为参考。鳗、人、猪、鲑和大鼠降钙素的氨基酸序列分别为序列1、2、 3、4和5。序列2-5的降钙素中以氨基辛二酸桥取代N-末端和第7位半胱氨酸 也得到相当稳定、镇痛有效的多肽组合物。在本文中引为参考的美国专利No. 4,977,139(Yamada等，1989年10月25日申请)描述对光、热和振荡稳定性改善 的依降钙素水性组合物。
美国专利No.4,977,139(Yamada等，1989年10月25日申请)、No. 5,118,667(Adams等，1991年5月3日申请)和4,758,550(Cardineaux等，1986年 12月3日申请)似乎公开了降钙素和依降钙素组合物在治疗各种类型骨和/或疼痛 性疾病上的用途，但无一公开依降钙素鞘内注射用于治疗顽固性疼痛。
Miseria et a1.(1989)Tumori(Italy)75：183-184似乎公开了鲑降钙素硬膜外给 药用于治疗顽固性疼痛，但数据看来不支持其用作镇痛剂。
如本文所用的，镇痛效应指结果是对疼痛不敏感，或痛觉或疼痛性或损伤性 刺激的感觉降低，而不失去知觉。镇痛和抗伤害感觉在本申请中是作为同义词使 用的。
如本文所用的，顽固性疼痛是对常规镇痛剂不起反应的疼痛和/或对麻醉性镇 痛剂(如吗啡)产生耐受性而持续疼痛。顽固性疼痛可以是包括(但不限于)癌症、骨 折、骨质疏松症、切断术后疼痛及某些其它疾病所伴有的。
大鼠是经鞘内途径给药的受试化合物的较佳的动物模型，测量镇痛作用的大 鼠热板试验是潜在有效的疼痛治疗的可接受的模型系统。
如本文所揭示的(见实施例8、9；表1、2)，在大鼠热板量度镇痛的模型 系统中，所用的全部依降钙素剂量均产生强大、持久的抗伤害感觉作用，在注射 后15分钟显示作用，30-60分钟时达到峰值，至少持续到注射后6小时。采用热 板试验，所用的依降钙素剂量常产生可观察到的最大的镇痛作用，因此在用范围 从0.8-3.6IU/kg的依降钙素后所得的热板潜伏期无明显差异。在所用的最低剂量 (0.2IU/kg)，观察到略低的反应。然而，用较低剂量依降钙素甚至也能得到剂量 依赖方式的中等和最低限度的抗伤害觉反应。
表 1
大鼠单剂注射依降钙素后的镇痛活性(热板潜伏期)(均值±标准误) 剂量 IU/kg 大 鼠 数 热板潜伏期(秒) 给药后时间(小时) 0 0.25 0.5 1 3 6 24 0 21 11.2±0.5 11.7±0.9 11.5±0.6 12.2±0.8 11.8±1.1 11.1±0.7 11.5±0.5 0.2 11 10.6±0.8 13.0±1.1 12.9±0.7 12.7±0.9 13.1±0.7 12.1±0.5 10.8±0.7 0.8 13 9.8±0.8 15.1±1.5** 15.0±1.5** 15.2±1.3** 20.0±2.8** 12.3±1.0 11.7±1.0 1.6 13 9.2±0.5 16.4±1.2** 16.0±1.0** 16.4±1.1** 15.1±0.9** 13.6±0.8** 10.9±0.4* 2.4 13 9.2±0.7 20.0±1.5** 20.1±1.9** 19.5±1.8** 21.8±2.1** 12.6±1.2* 10.31±1.2 3.6 12 10.4±0.9** 19.4±1.6** 21.4±1.8** 23.5±2.5** 19.5±1.0** 15.7±1.3** 10.2±1.0 *P≤0.05 student’s t-测验 **P≤0.05 student’s t-测验
在本文所描述的大鼠热板量度镇痛作用的试验数据中，鞘内注射依降钙素与 静脉注射依降钙素相比，取得预想不到的抗伤害觉得到改善的结果(见本文实施例 7)。如实施例9和图6-8所示，在大鼠热板试验中，鞘内注射依降钙素与鞘内注 射吗啡相比，也产生惊人的疼痛改善。此外，在吗啡和依降钙素鞘内给药的镇痛 活性比较上，依降钙素在大鼠热板试验中显示出具有较大的镇痛活性，依降钙素 的镇痛效应也显示出大于吗啡的持续时间(见本文实施例9和图3-6)。
下面的实施例是为了阐述的目的而提供的，并不是为了限制本文所描述和要 求保护的发明的范围。所有研究均按照FDA GLP的法规(21 C.F.R.58)进行。对 熟练技术人员来说显而易见的从本文所揭示的发明实践进行的任何常规的程序 修改和衍生均在本发明的范围内。
实施例
实施例1：试验动物
大鼠是美国和国际药政机构关于用于试验化合物镇痛活性的优选物种之 一。关于Sprague-Dawley大鼠的历史信息可从公开的文献中得到。成年雄性 Sprague-Dawley大鼠购自Sasco Inc.(Oregon，WI)，在用于试验前使其有7天的 适应期。在收到大鼠后1天及7天后或分配到实验组之前将其称重。将大鼠随机 地分配到实验组中进行处理。体重明显不同于该组平均体重、在体重上显示异常 改变或显示躯体疾病的任何动物均不加以使用。试验大鼠在320-420g范围内。
实施例2：动物管理
动物管理按照美国农业部的准则和动物保护条例实验室动物资源保护及使 用指南(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animal Resoures，National Research Council，DHHS，Publication No.NIH 85-23，1986)。将大鼠放在环境控制 的室内，保持温度于18-26℃，通常18-20℃，相对湿度40-70％，每小时进行 10次以上室内空气交换。每天维持12小时昼夜周期。对动物任意供应自来水和 食物(Agway Rat Chow，Agway)。发明者未发现可能对试验有不良影响的食物或供 水上的任何污染。
每周两次(或更勤些，如果需要)从笼中除去排泄物。笼子和食具每两周消毒 一次，如需要可更勤些。
一旦插管，大鼠即单独关在不锈钢笼内以避免插管被同伴损坏。每只大鼠由 其笼子上的独特的编号加以区别。
实施例3：储备液的制备
依降钙素([Des-Cys1，ASU7]-降钙素，鳗；carbacalcitonin)得自Bachem，Inc. (Torrance，CA)，避光储存于-20℃。用于鞘内注射后镇痛活性试验的依降钙素的 储备液(1mg/ml，在灭菌等渗盐水中，美国药典)每天新鲜配制并保持在冰中。临 注射前进行适当的稀释。
灭菌等渗盐水(0.9％w/v NaCl，美国药典级)得自Sigma Chemical Co.(St. Louis，MO)。
人血清白蛋白得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。储备液为25％ (w/v)。
硫酸吗啡得自Mallinckrodt，Inc.(St.Louis，MO)。鞘内注射用吗啡储备液每 天配制(10mg/ml，在灭菌等渗盐水中)并保持于冰上。临注射前进行适当的稀释。
实施例4：用于鞘内给药的神经手术/插管术
试验前5～7天将大鼠麻醉(Nembutal，30mg/kg，腹腔注射)后手术植入鞘内插 管。各管(聚乙烯管，PE10)经寰枕膜裂隙插入，插管穿过蛛网膜下腔7.5cm，使 其未端位于腰膨大头侧缘。各管以氰基丙烯酸酯粘合剂固定在颅上，用创口夹关 闭颅。将各管的游离端热封；当准备经鞘内途径注射组合物时，用插入封闭插管 的Hamilton针头引入各组合物。插管植入后试验前有5-7天的时间使其完全从手 术过程中恢复过来。
实施例5：镇痛活性的评价
用标准的测量镇痛作用的热板试验(Woolfe and MacDonald(1944)J. Pharmacol.Exp.Ther.80：300)评价疼痛敏感性。热板反应系将大鼠放在封于有机 玻璃圆筒中的55℃铜制热板上进行测定。将放到热板上和舔后足或跳离热板之 间的间隔(以秒计)定义为“热板潜伏期”。如果动物不发生对热板起舔后足或跳 离热板的反应，在40秒后取出以避免足组织损伤，其热板潜伏期定为40秒。
由于这些实验的技术要求，给定的一天中试验不超过8-9个大鼠。每个实验 条件研究足够的动物以得到10-11个可评价的大鼠。在试验日，将动物进行基线 热板反应，然后接受受试镇痛剂或生理盐水(对照)的推注。受试化合物或赋形剂 对照物鞘内注射后15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时再评价 热板反应。
实施例6：给药剂量
所有剂量的依降钙素均以推注形式给药。在单剂给药研究中试验了如下依降 钙素鞘内剂量：0.2，0.8，1.6，2.4，3.6，4.4，5.2和6.0IU/kg或0.03，0.13，0.25，0.39， 0.58，0.71，0.84和0.97μg/kg。试验的依降钙素静脉注射剂量为10.0，30.0，100.0 和300.0IU/kg或1.61，4.83，16.1和48.3μg/kg。1μg依降钙素相当于约6.2 IU。
实施例7：给药体积
所有鞘内注射剂量均以37.5μl/kg的体积给予，然后用10μl/kg生理盐水 冲洗插管(单剂研究)或以10μl体积给药然后用8μl生理盐水冲洗插管(多剂研 究)。所有静脉注射剂量均以0.5ml/kg的体积给予。
实施例8：大鼠镇痛测定试验中对鞘内注射依降钙素的剂量反应
在此研究中，镇痛测定试验中试验了鞘内途径给予依降钙素的某一剂量范 围，以确定引起镇痛的最小和峰值有效剂量并确定剂量反应。受试剂量为0.2，0.8， 1.6，2.4和3.6IU/kg。经鞘内途径以37.5μl/kg体积注射所需的剂量并以10μl 盐水洗净插管。测定基线(给药前)和注射药物或赋形剂后15分钟、30分钟、1 小时、3小时、6小时和24小时时的反应。研究中每个剂量依降钙素用11-13只 动物，用21只对照赋形剂(盐水)动物。
使用体重为350-400g的成年雄性大鼠总数113只。如实施例4所述，手术植 入鞘内插管。手术植入鞘内插管后在给受试组合物前有3只大鼠死亡。在鞘内注 射0.8IU/kg依降钙素后24小时有第4只大鼠死亡。
本研究证明，经鞘内途径给予依降钙素以剂量依赖性方式增加热板潜伏期(见 表1、图1)。抗伤害觉作用在注射后15分钟内起效，0.25小时和3小时之间出 现潜伏期的统计学显著延长。在3个较高的剂量注射后6小时也有明显的抗伤害 觉作用。大多数试验中，注射后24小时动物的热板潜伏期回到基线(见表1、图 2)。
对数据作了显著性分析，用各点计数(均值和标准差)来分析每个剂量药物在 选定时间的镇痛活性。计算非参数统计值，给出对照组和试验组之间差异的显著 性水平。
最低试验剂量(0.2IU/kg依降钙素)不产生有统计学显著性的反应，但0.8和 1.6IU/kg剂量导致显著的抗伤害觉作用而2.4和3.6IU/kg剂量导致强大的抗伤害 觉效应(图2)。对照组只给盐水不改变基线反应。
实施例9：鞘内注射依降钙素及鞘内注射吗啡的镇痛活性比较
本研究比较吗啡和依降钙素的镇痛活性，每个药均在大鼠动物模型上经鞘内 途径给药。
本研究中用体重从320g至420g的96只大鼠。如上所述，植入插管并待其 恢复。依降钙素剂量为2.4，3.6，4.4，5.2和6.0IU/kg(分别为0.39，0.58，0.71，0.84 和0.97μg/kg)。硫酸吗啡以37.5，75.0和125.0μg/kg剂量给药。药物或盐水均 采用插入插管的Hamilton针头给予，剂量体积为37.5μl/kg，接着用10μl盐 水洗净插管。测定基线(给药前)和给药物或赋形剂后15分钟、30分钟、1小时、 3小时、6小时和24小时的反应。
依降钙素(图3A)和吗啡(图3B)均延长热板潜伏期，表明有镇痛效应(表2)。 所有受试剂量的依降钙素均产生强大和长时间的抗伤害觉作用，在注射后15分 钟内出现作用，注射后30-60分钟时达到高峰，持续至少6小时(表2、图3A)。 由于用热板试验，所用的依降钙素剂量常产生最大可检测的镇痛作用，所以给予 3.6-6.0IU/kg范围剂量的依降钙素所得的热板潜伏期无明显差异。使用最低剂量 依降钙素(2.4IU/kg或0.39μg/kg)时得到略小的反应。然而，实施例8的结果表 明，用较低剂量依降钙素可得到剂量依赖性方式的中等及最小限度的抗伤害觉反 应。
吗啡以剂量依赖性方式延长热板潜伏期，镇痛的发生出现在注射后15分钟 内(表2、图3A)。然而，镇痛的持续时间显得短于依降钙素，注射后3小时潜伏 期明显缩短，注射后约6小时回到基线热板潜伏期，较低剂量尤其是如此。而且， 在本研究所使用的剂量时，注射吗啡的动物所达到的镇痛峰水平一般低于注射依 降钙素动物的水平(表2、图3A、3B)。
为了比较依降钙素和吗啡的镇痛强度，将剂量转换成nmol/kg。在几个时间 点上对此二药作剂量反应曲线以评估等效剂量(表2)。依降钙素0.12nmol/kg(2.4 IU/kg或0.39μg/kg)注射后30分钟产生相当于硫酸吗啡98.84nmol/kg(75.0μ g/kg)的热板潜伏期，0.18nmol/kg依降钙素(3.6IU/kg或0.58μg/kg)约相当于硫 酸吗啡164.73nmol/kg(125.0μg/kg)。类似的强度见于注射后1小时(表2)。然 而，吗啡注射后6小时抗伤害觉活性比依降钙素降低，因此，在此时间点上，依 降钙素全部受试剂量(0.12-0.30nmol/kg)产生比硫酸吗啡全部受试剂量(49.42- 164.73nmol/kg)更强的热板镇痛作用(表2)。
表 2
大鼠单剂鞘内注射后依降钙素和吗啡的镇痛活性
(热板潜伏期)比较(均值±SEM) 组 大 鼠 数 剂 量 热板潜伏期(秒) IU/kg μg/kg nmol/kg 给药后时间(小时) 0 0.25 0.5 1 3 6 24 对照 赋形剂 15 12.51± 0.60 14.16± 0.64 14.32± 1.00 14.32± 1.02 13.16± 0.79 13.14± 0.74 12.85± 1.87 依降 钙素 9 2.4 0.39 0.12 13.54± 1.91 19.70± 1.75 23.90± 3.12 24.68± 1.80** 13.0± 0.7* 12.1± 0.5 10.8± 0.7 10 3.6 0.58 0.18 12.92± 1.4 21.04± 2.22** 26.03± 3.08** 26.08± 3.69** 23.14± 3.05** 20.37± 3.44 15.79± 2.40 9 4.4 0.71 0.22 13.68± 1.10 21.89± 3.12* 26.03± 3.36** 26.20± 2.37** 21.11± 2.18* 20.02± 3.26 11.78± 1.75 8 5.2 0.84 0.26 13.41± 0.92 27.89± 3.10** 31.55± 4.17** 25.82± 3.79** 28.81± 3.41** 22.97± 2.60** 12.36± 1.69 9 6.0 0.97 0.30 11.38± 0.89 25.22± 4.13** 28.91± 3.40** 28.48± 3.35** 26.60± 3.87** 24.69± 2.84** 11.17± 1.80 吗啡 9 - 37.5 49.42 12.81± 1.23 22.08± 2.68** 20.97± 2.56* 21.81± 2.46** ±19.97 ±2.05* 14.02± 1.24 11.33± 1.51 9 - 75.0 98.84 13.76± 1.27 22.76± 2.43** 21.86± 2.25** 19.88± 2.04* 17.42± 1.93 17.66± 1.71 12.60± 1.19 9 - 125.0 164.73 13.28± 1.35 19.4± 1.6** 2636± 4.20** 26.83± 3.04** 21.69± 3.62 15.86± 3.29 13.49± 1.63
为了比较镇痛活性的持续时间，对最低剂量依降钙素和吗啡(图4)、中等剂 量依降钙素和吗啡(图5)和高剂量依降钙素和吗啡(图6)进行抗伤害觉的时程比 较。显然，依降钙素一般比吗啡镇痛活性的持续时间长，在低剂量和中等剂量时 特别明显。赋形剂注射不产生可检出的热板潜伏期改变。
体重改变不明显，未观察到死亡例。在鞘内注射依降钙素后24小时观察时 间内未见临床或行为异常。两个动物(3.6和5.2IU/kg)出现短时间尾部(2)和后肢(1) 肌阵挛。在这些试验中，鞘内注射依降钙素后未见明显的病态或临床和行为异 常。
总之，这些结果表明，依降钙素经鞘内途径给药时，与鞘内给药的硫酸吗啡 相比，在约低于硫酸吗啡1000倍的摩尔浓度即产生强的镇痛作用，且依降钙素 所产生的镇痛作用持续时间长，至少达注射后6小时。
实施例10：静脉注射依降钙素的镇痛活性
本研究设法确定经静脉途径给药的依降钙素的镇痛有效剂量和确定剂量反 应关系。
本研究使用体重320-420g的大鼠共24只。每个剂量水平用4-8只大鼠。经 尾静脉注射依降钙素0.5ml/kg体重。所用的剂量为10、30、100和300IU/kg(分 别为1.61，4.83，16.1和48.3μg/kg)。用上面实施例5所述热板镇痛测定试验测定 基线热板反应和注射后15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时时 的反应。
本研究的结果表明，静脉注射依降钙素只略为延长热板潜伏期，表示仅有小 的镇痛效应(表3)。
表3
大鼠单剂静脉注射依降钙素的镇痛活性(热板潜伏期)
(均值±标准误) 组 剂 量 大 鼠 数 热板潜伏期(秒) IU/kg μg/kg 给药后时间(小时) 0 0.25 0.5 1 3 6 24 依降 钙素 10.0 1.61 8 12.03 ±1.02 11.95 ±1.40 15.64 ±2.39 14.95± 2.92 14.11± 0.94 10.45± 1.03 8.86± 1.23 30.0 4.83 8 10.71 ±1.02 10.04 ±0.96 12.18 ±1.22 14.14* ±1.02 14.26± 1.39 15.12± 2.20 10.76 ±1.25 100.0 16.1 4 13.53 ±1.63 11.05 ±1.99 9.63 ±1.21 11.20± 1.95 14.76± 1.19 14.00± 1.83 14.30 ±1.33 300.0 48.3 4 11.22 ±0.38 11.05 ±3.82 11.65 ±2.31 12.65± 2.09 17.37± 4.25 11.55± 2.80 10.52 ±1.74
较高剂量(100和300IU/kg)与较低剂量(10和30IU/kg)相比，未见明显的镇 痛效应增强，虽然30-300IU/kg剂量与10IU/kg剂量30分钟时相比峰效应出现 晚(3-6小时)并略为延长。大鼠静脉注射10-300IU/kg体重依降钙素未见明显的剂 量反应关系(表3)。
静脉注射和鞘内注射依降钙素后所得的热板潜伏期的比较分析表明，在0.5 小时时，静注最低剂量依降钙素(10.0IU/kg或1.61μg/kg)产生与经鞘内途径给 予依降钙素1.6IU/kg(0.25μg/kg)类似的热板潜伏期(见实施例8)。
在这些试验中，静脉注射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例 或临床和行为异常。
实施例11：多次依降钙素鞘内剂量的镇痛活性
本研究评估重复剂量鞘内注射依降钙素对镇痛的有效性。如上所述给大鼠植 入鞘内插管，此后经7-10天使其完全从手术过程中恢复过来。
18只大鼠分成3组，每组6只。研究以1周间隔进行2种处理。处理组I大 鼠不接受治疗。II组大鼠接受每天鞘内注射灭菌生理盐水(赋形剂对照)，连续5 天。III组大鼠每天接受依降钙素(4.4IU/kg体重)，连续5天。
每组按上文实施例5所述，在研究第1天、第3天和第5天的0分钟(给药前， 基线)、注射后1小时、3小时和24小时测定热板潜伏期。
图7的结果表明，重复鞘内剂量依降钙素能延长热板潜伏期，在每次连续注 射后24小时，热板潜伏期较长，有经时累积镇痛效应。在这些试验中，鞘内注 射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例或临床和行为异常。
实施例12：大鼠每天鞘内注射单剂依降钙素历时11天的镇痛活性
本研究评估对大鼠经鞘内途径给予重复剂量依降钙素的有效性，给药方案为 在间隔48小时不治疗间期的两个5天治疗期中每天给药，共10个连续单剂。
如上所述给大鼠植入鞘内插管，此后经7-10天使其完全从手术过程中恢复过 来。9只大鼠分成3组，每组3只。研究以间隔48小时不治疗间期的两个5天治 疗期进行。处理组I大鼠不接受治疗(假注射)。在每个治疗期，II组大鼠接受5 个连续的每天鞘内注射剂量灭菌生理盐水(赋形剂对照)，每次研究处理共10次注 射。在每个治疗期，III组大鼠接受5个连续的每天鞘内注射剂量依降钙素(4.4 IU/kg体重)，每次研究处理共注射10次(表4)。
每组按上文实施例5所述，在研究第1、3、5、7、9和11天的0分钟(给 药前，基线)、注射后1小时、3小时和24小时测定热板潜伏期(表4)。
图8的结果表明，重复鞘内剂量依降钙素能延长热板潜伏期并有经时累积镇 痛效应。
表4
研究设计 程序 研究日 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 第1期 注射 × × × × × 热板试验 × × × 代谢观察 × × × × × × 临床观察 × × × × × × 第2期 注射 × × × × × 热板试验 × × × 代谢观察 × × × × × 临床观察 × × × × × ×
在这些试验中，鞘内注射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例 或临床和行为异常。
实施例13：含人血清白蛋白的药物组合物
本研究评估作为含依降钙素镇痛组合物成分的人血清白蛋白的效应。人血清 白蛋白(HSA)是对病人或实验动物给药前防止依降钙素粘附于药瓶或管子等的候 选者。
在每个研究日，在无菌条件下用生理盐水(0.3％NaCl溶液，USP)稀释HSA 的标准25％(重量/体积)溶液，得到所需的0.2％(重量/体积)储备浓度。需要时将 依降钙素溶液的一份与等体积0.2％HSA混合，得到在待注射的含依降钙素组合 物中HSA终浓度为0.1％。
如上所述，取得32只雄性大鼠(320-420g)、使其适应、进行插管并使其恢复。 I组大鼠以10μl/kg体积鞘内注射4.4IU/kg剂量依降钙素(在生理盐水中)。II 组大鼠以10μl/kg体积鞘内注射4.4IU/kg剂量依降钙素(在含0.1％HSA的生理 盐水中)。III组大鼠注射含0.1％HSA的生理盐水10μl/kg。每次给药后均以8 μl生理盐水冲洗插管。
在每个研究周，在第1、3和5研究日的0分钟(基线，给药前)、鞘内注射 后1小时、3小时、6小时和24小时测定热板潜伏期。图9结果表明，在5天重 复剂量鞘内注射依降钙素(4.4IU/kg，在0.1％HSA中)后大鼠热板潜伏期延长。
在这些试验中，鞘内注射依降钙素后未见明显的体重改变、发病例、死亡例 或临床和行为异常。
实施例14：大鼠静脉和鞘内注射125I-依降钙素后的药物动力学
按照表5描述的设计方案在21只Sprague-Dawley大鼠上研究药物动力学/物 料平衡和在选定的组织内的分布。
将放射性碘化的依降钙素(125I-依降钙素)经颈静脉作静脉注射(IV)和经手术 插入的插管作鞘内注射(IT)。在单剂1μg/kgIT推注剂量或单剂50μg/kg IV推 注剂量后于规定的时间(表5)采集血液、血浆、尿、粪、组织和尸体样品。
表 5
研究设计和采样时间表 动物组 (n) 给药 途径 剂 量 用于总放射性测定的 生物样品 采样时间 1 (n＝4) IV (推注) 单剂： 50μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：1mL/kg 每个动物8个血浆样品， 从2个动物采集脑、脊 髓、肺、肝、甲状腺、肾、 血液和血浆样品 (共34份血浆、2份血液 和12份组织样品) 血液 给药后5分钟，0.5，1，2， 4，8，24和48小时 组织、血液和血浆 给药后120小时(n＝2只大 鼠) 2 (n＝4) 鞘内 单剂： 1μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：20μL/kg 每个动物8个血浆样品， 从2个动物采集脑、脊 髓、肺、肝、甲状腺、肾、 血液和血浆样品 (共34份血浆、2份血液 和12份组织样品) 血液 给药后0.5，1，2，4，6，8，24 和48小时 组织、血液和血浆 给药后120小时(n＝2只大 鼠) 3 (n＝4) IV (推注) 单剂： 50μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：1mL/kg 每个动物7份尿和5份粪 样 每个动物1个尸体样本 (总共4个尸体样本、28 份尿样和20份粪样) 洗笼水 尿 给药后0-6，6-12，12- 24，24-48，48-72， 72-96和96-120小时 粪 给药后0-24，24-48，48- 72，72-96和96-120小时 尸体 给药天120小时 4 (n＝4) IV (推注) 单剂： 50μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：1mL/kg 每个动物取脑、脊髓、肺、 肝、甲状腺、肾、血液和 血浆样品(共24份组织、 4份血液和4份血浆样品) 组织、血液和血浆 给药后1小时(n＝2只大鼠) 和给药后24小时(n＝2只 大鼠 (n＝4) 鞘内 单剂： 1μg/kg125I-依降钙素 (20μci/μg) 注射体积：20μL/kg 每个动物取脑、脊髓、肺、 肝、甲状腺、肾、血液和 血浆样品(共24份组织、 4份血液和4份血浆样品) 组织、血液和血浆 给药后1小时(n＝2只大鼠) 和给药后24小时(n＝2只 大鼠 6 (n＝1) 不给 药 无 尿、粪、血浆、组织、尸 本样品和洗笼水 24小时收集试样用于背景 分析
用γ-计数仪测定总放射性。通过测定用三氯乙酸沉淀后血浆蛋白中的放射 性来评估血浆中蛋白结合的放射性。
血浆中总放射性(游离I2和碘化蛋白质)的终末半衰期(terminal phase half-life) 在静脉给药后为29小时，鞘内给药后为32小时。静脉给药和鞘内给药后TCA 可沉淀的放射性的终末半衰期相似(估计为40小时)。
鞘内给药后，药物衍生的放射性相当快地分布到组织中(1小时达最大浓度 Cmax)。浓度的排列顺序为：甲状腺＞脊髓＞脑＞肾＞血液＞肺＞肝脏。不希望被任何 特定的理论束缚，甲状腺中高浓度的放射性最象是给予的制剂中存在游离I2的结 果。鞘内注射后脑血浆放射性水平明显高于静脉注射后，表示难以通过血脑屏 障。IV给药后86％剂量被回收。所投与的放射性的约46％在最初24小时内被 回收。消除的主要途径是经尿排出(71％)。
序列表 (1)一般信息： (i)申请人： Noble，John F.
Abajian，Henry B. (ii)发明名称： 治疗疼痛的方法： (iii)序列数： 5 (iv)通讯地址：
(A)ADDRESSEE：Greenlee，Winner and Sullivan，P.C.
(B)STREET：5370 Manhattan Circle，Suite 201
(C)CITY：Boulder
(D)STATE：Colorado
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(A)工具类型：软盘
(B)计算机：兼容型IBM PC
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(viii)代理人信息：
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