用于治疗呼吸道疾病的干扰素λ疗法
阅读：1031发布：2020-05-21
专利汇可以提供用于治疗呼吸道疾病的干扰素λ疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种或多种也叫作IL－29和IL28a/b的干扰素λ(IFN－λs)用于减轻或 预防 病毒诱导的 呼吸道 疾病 的恶化，特别地例如由 病毒感染 ，最常见的鼻病毒感染而引起的哮喘恶化的应用。，下面是用于治疗呼吸道疾病的干扰素λ疗法专利的具体信息内容。
1.选自下列各项的试剂在制备用于施用以治疗病毒诱导的呼吸道疾 病的恶化的药物中的应用：
(a)一种或多种干扰素λ(IFN-λ)多肽或
(b)能够在靶支气管上皮细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一 种多核苷酸或多种多核苷酸。
2.权利要求1的应用，其中所述呼吸道疾病是哮喘。
3.权利要求1或权利要求2的应用，其中所述病毒诱导的恶化是由 选自由鼻病毒、RSV和流感病毒组成的组的病毒感染引起的。
4.权利要求1到3中任一项的应用，其中应用选自由IFNλ1、IFNλ2 和IFNλ3组成的组的一种或多种IFNλ多肽。
5.权利要求1到3中任一项的应用，其中一种或多种IFN-λ多肽的施 用是通过从一种或多种多核苷酸表达进行的。
6.前述权利要求中任一项的应用，其中所述一种或多种IFN-λ多肽或 所述一种或多种多核苷酸的施用是通过呼吸道递送的。
7.一种包含药物组合物的装置，所述药物组合物包含一种治疗剂， 其为(i)一种或多种IFN-λ多肽或(ii)能够在靶支气管上皮细胞中表达一 种或多种IFN-λ多肽的一种或多种多核苷酸，所述装置适于呼吸道递送所 述组合物。
8.一种用于同时、分开或顺序施用第一种治疗剂和另一种治疗剂的 产品，其中所述第一种治疗剂是(i)一种或多种IFN-λ多肽或(ii)能够在靶 支气管上皮细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一种或多种多核苷酸。
9.权利要求8中所述的产品，其中所述另一种治疗剂是吸入的皮质 类固醇。
10.一种治疗患有、或处于发展病毒诱导的呼吸道疾病的恶化的危险 的患者的方法，其包括，给所述患者施用治疗有效量的选自下列各项的试 剂：
(a)一种或多种IFNλ多肽或
(b)能够在靶支气管上皮细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一 种多核苷酸或多种多核苷酸。
11.选自下列各项的试剂在制备用于施用给患有或处于发展变应性疾 病的危险的患者的药物中的应用：
(a)一种或多种IFN-λ多肽或
(b)能够在靶细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一种多核苷酸 或多种多核苷酸。
12.一种治疗患有或者处于发展变应性疾病的危险的患者的方法，其 包括，给所述患者施用治疗有效量的选自下列各项的试剂：
(a)一种或多种IFN-λ多肽或
(b)能够在靶细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一种多核苷酸 或多种多核苷酸。
发明领域
本发明涉及干扰素λ(IFN-λ)的医学应用。更特别地，例如，本发明涉 及IFN-λ用于治疗病毒诱导的呼吸道疾病的恶化，特别地，例如，由病毒 如鼻病毒(RV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和流感病毒病毒诱导的哮喘的恶 化的应用。
发明背景
大部分的哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的急性恶化是由呼吸道病毒 感染引起。在成年人和儿童中，呼吸道病毒感染是哮喘恶化的主要起因。 它参与大约80％的儿科哮喘发作(Johnston等BMJ(1995)310，1225-1229) 和75％的成年人哮喘发作(Wark等Eur.Resp.J(欧洲呼吸杂志)2002 19，68-75)。它是哮喘发病率和死亡率的重要原因(Campbell等，BMJ(1997)， 1012)。本发明起源于对干扰素在应答病毒感染的哮喘症状的支气管上皮 细胞和支气管肺泡灌洗细胞中的产生的研究。
I型干扰素是一种最相关的糖蛋白家族，其包括13种IFN-α亚型以及 IFN-β，IFN-κ，IFN-τ和IFN-ω。不同的人IFN-α亚型已经通过分析人cDNA 文库和通过对由刺激的类淋巴母细胞细胞产生的IFNs的蛋白质分析而鉴 定；它们异质性的原因尚不清楚。早期的研究表明所有的亚型结合相同的 受体，从中推论认为它们一定激发相同的应答。后来，纯化的和重组的亚 型的比较研究揭示了许多抗病毒、抗增殖和免疫调节反应。
存在一种II型干扰素INF-γ，其结合不同的受体，并且具有与1型IFNs 在很大程度上不同的功能。
I型干扰素是对呼吸道病毒感染的内在免疫应答的非常重要的成分。 保护方法包括干扰素-β的初始释放，其然后刺激干扰素-β和各种干扰素-α 在通过1型干扰素受体介导的级联中的进一步释放。
各种干扰素-λ是3种最近发现的紧密相关的蛋白(Kotenko S.V.等， Nature Immunology(自然免疫学)2003；卷4，69-77；Sheppard P等，Nature Immunology(自然免疫学)2003；卷4，63-88)。干扰素λ-1还已知为IL-29， 而干扰素λ-2和3已知为IL-28a/b。这些干扰素结合与I型或II型干扰素 的那些不同的第三种受体。因此，现在它们叫作III型干扰素。这些干扰 素已经在体外细胞研究中表现出抗病毒活性(参见，例如，Zymogenetics 公司的WO 2004/037995)。然而，先前并没有确定它们在人类中保护抗任 何天然呼吸道病毒感染的用途。
在这种联系中值得注意的是，尽管它先前报道的抗病毒活性，已经证 明IFN-β-ser在预防自然感冒的试验中无效(Sperber等，J.Infect.Dis(传 染病杂志)(1989)160，700-705)。这可能是由于正常细胞应答鼻病毒感染 产生IFN-β的先天能力。同等地，从使用表现出抗病毒活性的IFN-λ的体 外研究不可能外推出同样的干扰素类型将具有抗体内天然呼吸道病毒感 染的任何治疗价值。
有趣地，关于由人哮喘症支气管上皮细胞应答鼻病毒感染生产干扰素 的研究最先表明，与来自健康对照的RV-感染的支气管上皮细胞相比，这 样的细胞在保持对早期细胞程序性死亡和增加的病毒体生产中观察到的 抗性中具有不足的I型干扰素反应。此外，表明向培养物中的RV-感染的 哮喘症支气管上皮细胞中提供IFN-β引起传染性病毒体生产的显著减少。 这些结果为提议IFN-β在治疗鼻病毒-诱导的哮喘恶化中的新的治疗用途 建立了基础(Wark等J.Exp.Med.(实验医学杂志)(2005年3月21日)201， 937-947)。
进一步的结果已经表明IFN-β用途的外推同等地用于治疗RV-诱导的 COPD的恶化，其包括一定范围的病况，包括慢性支气管炎和肺气肿。 COPD是进展性的呼吸道疾病，其特征在于逐渐失去肺功能。COPD的症 状包括慢性咳嗽和痰液产生以及呼吸急促。吸烟是COPD的最普遍的起 因。
现在已经确定IFN-λ多肽是由呼吸道病毒感染包括鼻病毒(最常见的) 和呼吸道合胞病毒(RSV)在人细胞中强烈诱导的。实施例4和附图23 到26举例说明在支气管上皮细胞中的这样的诱导。此外，各种干扰素-λ 诱导β，并且β也诱导λ。
通过分析来自哮喘症和正常志愿者患者的支气管上皮细胞和支气管 肺泡灌洗细胞，现在还表明，当感染鼻病毒时，哮喘症支气管上皮细胞另 外缺失IFN-λ基因表达和蛋白质生产。这样的发现在本发明之前先前没有 表示或者考虑，并且导致这样的提议，即，施用一种或多种IFN-λ多肽还 将为病毒诱导的哮喘恶化的治疗贡献有效的治疗。
此外，表明，同等地，IFN-λ多肽可以有益于其它呼吸道疾病诸如 COPD的病毒诱导的恶化的治疗。“呼吸道疾病”，除了哮喘和COPD之外， 我们包括变应性支气管肺曲霉病，嗜酸细胞性肺炎，变应性支气管炎支气 管扩张，职业性哮喘，反应性呼吸道疾病综合征(recative airayd syndrome)， 间隙性肺病(intersitial lung disease)，嗜酸细胞过多综合征 (hyperosinophilic syndrome)和寄生虫肺病。
发明概述
在一个方面，本发明因此提供治疗患有或者处于病毒诱导的呼吸道疾 病的恶化的危险中的患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的一 种或多种IFN-λ多肽，优选地通过呼吸道递送。如上文显示，这样的治疗 性治疗是特别令人感兴趣的，例如，在减轻或者预防病毒诱导的哮喘恶化、 最常见的RV-诱导的哮喘恶化、以及例如由RSV或流感病毒引起的这样 的恶化的问题中。一种或多种IFN-λ多肽的施用可以直接以多肽或者通过 从一种或多种多核苷酸表达而进行。
本发明还提供选自下列各项的试剂在制备施用以治疗病毒诱导的呼 吸道疾病恶化的药物中的应用：
(a)一种或多种IFN-λ多肽或
(b)能够在靶支气管上皮细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一种或 多种多核苷酸，
优选地通过呼吸道递送所述药物，例如，通过使用气雾剂喷雾器递送。 治疗的个体可以是任何动物，但是优选地治疗的个体是人，例如，优选地 是患哮喘症的人。
在另一个方面，本发明还提供含有药物组合物的装置，所述药物组合 物包含治疗剂，其为(i)一种或多种IFN-λ多肽或(ii)如上文所述能够表达 一种或多种IFN-λ多肽的一种或多种多核苷酸，所述装置适用于呼吸道递 送所述组合物。这样的组合物可以通过同时、分开或顺序的施用而补充用 于治疗呼吸道疾病的其它治疗剂。因此，所述其它的治疗剂可以配制成提 供单一的组合物或者以分开的组合物提供。适用于这样的施用方案的产品 构成本发明的另一个方面。
作为一个优选的实施方案，提供用于治疗病毒诱导的哮喘恶化的产 品，其包括同时、分开或顺序的呼吸道施用(a)至少一种IFN-λ多肽或能 够在要靶向的支气管上皮细胞中表达至少一种IFN-λ多肽的多核苷酸和(b) 吸入的皮质甾类。
作为本文报道的研究结果，还假定IFN-λ多肽可以有益于变应性疾病 如哮喘，不依赖于任何病毒性恶化。充分确定哮喘的流行逐渐增加，因为 变应性疾病的流行也普遍增加。这种流行的增加已经表明与传染病的不存 在有关，原因在于在生命的早期高度暴露于传染病的那些人在以后的生命 中有非常低的患有哮喘和变态反应的危险。推论认为各种IFN-λ和IFN-β 都可以通过模拟感染的保护作用而用作预防性治疗。
认为变应性疾病，包括哮喘、鼻炎、湿疹、食物过敏和过敏反应与减 弱的TH1免疫应答有关，减弱的TH1免疫应答本身是减弱的I型干扰素 反应的结果，它们二者都是在生命早期没有充分暴露于传染病的结果。本 文所述的数据表明，在生命的早期施用各种IFN-λ可以模拟传染病的保护 作用，促进I型干扰素和TH1免疫应答，并且预防TH2推动的变应性疾 病的发展。这种预防性治疗可以在生命的早期施加，但是各种IFN-λ也可 以在生命的后期施用，以治疗/治愈变应性疾病，换言之，以逆转TH2推 动的致敏作用和对过敏原的免疫应答。
发明详述
如上文所示，然而，现在所述的IFN-λ多肽的优选的应用是减轻或者 预防病毒诱导的哮喘恶化，特别是在人中。这样的病毒诱导的恶化应该最 普遍地是RV感染的结果。然而，本发明相等地适用于由其它病毒感染包 括RSV感染和流感感染引起的哮喘恶化。
诊断患者是否患有或者正受呼吸道疾病的折磨的方法是本领域内公 知的。例如，关于诊断哮喘症的指导由哮喘的全球提案(Global Initiative for Asthma，GINA)作为题目为“Pocket guide for asthma prevention and management(哮喘预防和管理的便携指南)”的公布的部分提供，其可从 www.ginasthma.com获得。类似地，关于诊断COPD的指导由阻塞性肺病 的全球提案(Global Initiative for Obstructive Lung Disease，GOLD)作为 题目为“Pocket guide to COPD diagnosis，management and prevention：a guide for heath care professionals(COPD诊断、管理和预防的便携指南： 健康护理专家的指导)”的公布内容的部分提供，其可从www. goldcopd.com获得。来自这两个文献的相关摘录在后附的实施例中提供。
本发明的方法可以包括施用一种IFNλ多肽，或者可以给患者施用 IFNλ-1和IFNλ-2的混合物，或IFNλ-1和IFNλ-3的混合物，或IFNλ-2和 IFNλ-3的混合物，或IFNλ-1、IFNλ-2和IFNλ-3的混合物。
所谓“IFNλ多肽”我们包括在GenBank登记号Q8IU54，Q8IZJ0，Q8IZI9 中公开的那些多肽，并且列出如下：
maaawtvvlv tlvlglavag pvptskpttt gkgchigrfk slspqelasf kkardalees
lklknwscss pvfpgnwdlr llqvrerpva leaelaltlk vleaaagpal edvldqplht
lhhilsqlqa ciqpqptagp rprgrlhhwl hrlqeapkke sagcleasvt fnlfrlltrd
lkyvadgnlc lrtsthpest
(IFNλ-1)
mkldmtgdct pvlvlmaavl tvtgavpvar lhgalpdarg chiaqfksls pqelqafkra
kdaleeslll kdcrchsrlf prtwdlrqlq vrerpmalea elaltlkvle atadtdpalv
dvldqplhtl hhilsqfrac iqpqptagpr trgrlhhwly rlqeapkkes pgcleasvtf
nlfrlltrdl ncvasgdlcv
(IFNλ-2)
mkldmtgdcm pvlvlmaavl tvtgavpvar lrgalpdarg chiaqfksls pqelqafkra
kdaleeslll kdckcrsrlf prtwdlrqlq vrerpvalea elaltlkvle atadtdpalg
dvldqplhtl hhilsqlrac iqpqptagpr trgrlhhwlh rlqeapkkes pgcleasvtf
nlfrlltrdl ncvasgdlcv
(IFNλ-3)
“IFNλ多肽”包括任何全长的天然存在的IFNλ多肽或其片段，或其 任何变体。
IFNλ多肽的“片段”或“变体”是具有与IFNλ多肽基本上相同或更 多的生物活性的那些，以用作本发明的方法中的治疗剂。这样的变体和片 段将有用地包含至少一个至少有5个连续的氨基酸的区域，其与所述多肽 的最相同的5个或多个连续氨基酸区域具有至少90％的同源性。片段小于 完整多肽的100％。
IFNλ多肽的“片段”或“变体”的生物活性可以通过，例如，测量 这样的多肽在支气管上皮细胞中抗RV感染的抗病毒活性而确定，如在下 述实施例1中所述。通过“基本上相同或更多”我们包括IFNλ多肽的“片 段”或“变体”具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％或更多的 IFNλ多肽的生物活性的情形。
本领域的那些技术人员应该意识到，所述IFNλ多肽可以通过已知的 多肽修饰技术进行修饰。这些包括在于1981年11月24日授予Stevens 的美国专利号4,302,386中公开的技术，所述专利通过引用结合于此。这 样的修饰可以增强用作治疗剂的生物活性。例如，可以改变一些氨基酸残 基。不需要的序列可以通过本领域公知的技术去除。例如，所述序列可以 通过使用酶诸如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或相关的蛋白水解酶的有限的蛋 白水解消化而去除。
因此，用于本发明的方法中的IFNλ多肽包括修饰的多肽，其包括合 成来源的多肽或原始多肽的片段。
所述IFNλ多肽可以从许多不同的来源制备。例如，重组的IFNλ多肽 可以使用许多不同的表达系统(原核的或真核的)在细胞中表达和分离， 任选地具有蛋白标记。重组的IFNλ多肽可以分泌到上清中，并且然后可 以从上清中纯化所述重组的多肽。
重组多肽可以从细胞中表达和纯化的方法是本领域公知的，并且是可 以由技术人员进行的常规技术。例如，这样的方法在例如Sambrook等， Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，2001.第 3版中公开和提供。
通常，编码需要的IFNλ多肽的DNA在适当的微生物宿主细胞中表 达。因此，编码IFNλ多肽的DNA可以按照已知的技术使用，根据本文 包含的教导适当的修饰，以构建表达载体，然后将其用于转化适当的宿主 细胞，用来表达和生产IFNλ多肽。这样的技术包括在下列各项中公开的 那些：于1984年4月3日授予Rutter等的美国专利号4,440,859，于1985 年7月23日授予Weissman的4,530,901，于1986年4月15日授予Crowl 的4,582,800，于1987年6月30日授予Mark等的4,677,063，于1987年 7月7日授予Goeddel的4,678,751，于1987年11月3日授予Itakura等 的4,704,362，于1987年12月1日授予Murray的4,710,463，于1988年 7月12日授予Toole，Jr.等的4,757,006，于1988年8月23日授予Goeddel 等的4,766,075，和于1989年3月7日授予Stalker的4,810,648，所有这 些通过引用结合于此。
编码IFNλ多肽的DNA可以连接到宽泛种类的其它DNA序列上，以 引入适当的宿主中。伴随DNA取决于宿主的性质，将DNA引入到宿主 中的方式，以及是否需要保持游离性或整合。
通常，将所述DNA以适当的方向和正确的表达阅读框插入到表达载 体中，诸如质粒中。如果需要，所述DNA可以连接到由需要的宿主识别 的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列上，尽管这样的控制通常可以在 所述表达载体中获得。因此，DNA插入物可以可操作地连接到适当的启 动子上。细菌启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacI和lacZ启动子，T3和 T7启动子，gpt启动子，噬菌体λPR和PL启动子，phoA启动子和trp 启动子。真核启动子包括CMV即时早期启动子，HSV胸苷激酶启动子， 早期和晚期SV40启动子和反转录病毒LTRs的启动子。其它适当的启动 子是技术人员已知的。所述表达构建体还将理想地包含转录起始和终止的 位点，并且在转录的区域包含用于翻译的核糖体结合位点。(Hastings等， 国际专利号WO 98/16643，于1998年4月23日公布)。
然后将所述载体通过标准的技术引入到宿主中。通常，并不是所有的 宿主都将被所述载体转化，因此需要选择转化了的宿主细胞。一种选择技 术包括在包含任何需要的控制元件的表达载体中结合DNA序列标记，其 在转化的细胞中编码可选择的特点。这些标记包括用于真核细胞培养的二 氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中 培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。所述选择标记还可以是 补充宿主的营养缺陷型的那些。备选地，关于这样的可选择特点的基因可 以是另一种载体，其用于共同转化需要的宿主细胞。
然后，将已经转化了编码IFNλ多肽的DNA的宿主细胞培养足够的 时间，并且依据本文公开的教导在本领域的技术人员已知的适当的条件下 培养，以允许干扰素多肽的表达。
许多微生物表达系统是已知的，包括应用下列各项的系统：例如，用 重组噬菌体、质粒或粘端质粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆 菌和枯草芽胞杆菌(B.subtilis))；例如，用酵母表达载体转化的酵母(例 如，酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))；例如，用病毒表达载体(例如， 杆状病毒)转化的昆虫细胞系统。
所述载体可以包括原核复制子，诸如Col E1 ori，用于在原核生物中 增殖。所述载体还可以包含适当的启动子，诸如能够指导所述基因在用其 转化的细菌宿主细胞如大肠杆菌中表达(转录)的原核启动子，和翻译起 始序列，诸如通常与启动子序列相邻的SD共有核糖体结合序列，其形成 获得的转录体的一部分，并且由其可以开始克隆的基因转录体的翻译。
启动子是由允许RNA聚合酶结合和转录发生的DNA序列形成的表 达控制元件。在包含用于插入本发明的DNA片段的便利的限制性位点的 质粒载体中典型地提供与代表性细菌宿主相容的启动子序列。
典型的原核载体质粒为：可从Biorad实验室(Richmond，CA，美国)获 得的pUC18，pUC19，pBR322和pBR329；可从法玛西亚(Pharmacia) (Piscataway，NJ，美国)获得的pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540和 pRIT5；可从Stratagene克隆系统(Stratagene Cloning Systems)(La Jolla，CA 92037，美国)获得的pBS载体，噬菌体形式(Phagescript)载体，Bluescript 载体，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A。优选的原核载体质粒包括 pET26b(Novagen，Nottingham，英国)。
有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，并且通常可从 Stratagene克隆系统(La Jolla，CA 92037，美国)获得。质粒pRS403，pRS404， pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIps)，并且结合酵母选择标记HIS3， TRP1，LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCps)。
本领域的技术人员公知的方法可以用来构建包含所述编码序列和例 如，适当的转录或翻译控制的表达载体。一种这样的方法包括通过均聚物 尾连接。将均聚物聚dA(或聚dC)尾添加到DNA片段的暴露的3′OH基 团上，以通过末端脱氧核苷酸转移酶克隆。然后，所述片段能够与添加到 线性质粒载体的末端的聚dT(或聚dG)尾退火。退火后留下的缺口可以 通过DNA聚合酶填补，并且游离末端通过DNA连接酶连接。
另一种方法包括通过黏性末端连接。相容的黏性末端可以通过适当的 限制性酶的作用而在DNA片段和载体上产生。这些末端将通过互补碱基 配对迅速退火，并且残留的缺口可以通过DNA连接酶的作用闭合。
另一种方法使用叫作接头和衔接头的合成分子。具有平端的DNA片 段通过噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I产生，所述聚合 酶去除突出的3′端并且填补凹进的3′端。合成的接头，包含确定的限制性 酶的识别序列的平端双链DNA片段，可以通过T4 DNA连接酶连接到平 端DNA片段上。然后，将它们用适当的限制性酶消化，以产生黏端，并 且连接到具有相容的末端的表达载体上。衔接头还是化学合成的DNA片 段，其包含一个用于连接的平端，但是其还具有一个预先形成的黏端。
含有各种限制性核酸内切酶位点的合成的接头是可以从许多来源商 购的，包括美国CN纽黑文(New Haven)的国际生物技术公司 (International Biotechnologies Inc)。
修饰编码IFNλ多肽的DNA的理想的方法是应用由Saiki等(1988) Science(科学)249，487-491公开的聚合酶链式反应。在这种方法中，待 酶促扩增的DNA通过两种特异的寡核苷酸引物侧连，所述引物本身结合 到扩增的DNA中。所述特异的引物可以包含限制性核酸内切酶识别位点， 其可以用于使用本领域已知的方法克隆到表达载体中。
因此，上文概括的方法可以用来制备用于制备IFNλ多肽的微生物表 达系统。
所述IFNλ多肽可以使用许多不同的公知方法从微生物表达系统回 收，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、 磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、凝集素 层析、染料-配体层析和反相高效液相色谱(＂HPLC＂)。
这样的方法可以包括裂解微生物宿主细胞的步骤(除非所述表达系统 指导所述IFNλ多肽从细胞分泌出来)。
备选地，IFN-λ多肽可以通过由Lu等(1981)J.Org.Chem(有机化学 杂志)46，3433及其中的参考文献公开的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式 合成。临时的N-氨基保护由9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团提供。这种高 度碱性-易分解的保护基团的重复性裂解通过使用在N，N-二甲基甲酰胺 的20％的哌啶而实现。侧链官能度可以被保护为它们的丁醚(在丝氨酸苏 氨酸和酪氨酸的情形中)、丁酯(在谷氨酸和天冬氨酸的情形中)、丁氧基 羰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸的情形中)、三苯甲基衍生物(在半胱氨 酸的情形中)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰衍生物(在精氨酸的情形中)。 在谷氨酰胺或天冬酰胺是C端残基的情形中，利用4，4′-二甲氧基二苯甲 基基团保护侧链氨基官能度。固相支持物是基于聚二甲基-丙烯酰胺聚合 物，其由三种单体：二甲基丙烯酰胺(主链单体)、双丙烯酰乙烯二胺(交 联接头)和丙烯酰肌氨酸甲酯(官能化剂)组成。所用的肽-与-树脂可分 裂的连接剂是酸-易分解的的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺 和谷氨酰胺以外，所有的氨基酸衍生物以它们预先形成的对称的酐衍生物 添加，天冬酰胺和谷氨酰胺使用反向N，N-二环己基-碳二亚胺/1-羟基苯 并三唑介导的偶联方法添加。所有的偶联和去保护反应都使用茚三酮、三 硝基苯磺酸或isotin检测方法进行监测。当合成完成时，通过用含有50％ 的清除剂混合物的95％的三氟乙酸处理，伴随着侧链保护基团的去除而将 肽从树脂支持物上裂解下来。通常所用的清除剂是乙二硫醇、苯酚、苯甲 醚和水，正确的选择取决于合成的肽的组成氨基酸。三氟乙酸通过在真空 中蒸发而去除，随后用二乙醚研碎，提供粗肽。任何存在的清除剂通过简 单的萃取方法而去除，其在水相冻干后中提供不含清除剂的粗肽。用于肽 合成的试剂通常可从英国诺丁汉NG7 2QJ的Calbiochem-Novabiochem(英 国)有限公司获得。纯化可以通过任何一种或下列技术的组合而实现：诸 如大小排阻层析、离子交换层析和(主要地)反相高效液相色谱。肽的分 析可以使用薄层层析、反相高效液相色谱、在酸水解后的氨基酸分析和通 过快原子轰击(FAB)质谱分析而进行。
如上文所示，一种或多种IFNλ多肽可以直接或者通过从一种或多种 多核苷酸表达而施用。这样的多核苷酸可以优选地以能够指导IFNλ在支 气管上皮细胞中表达的载体的形式存在。这样的表达载体可以是常规考虑 用于基因治疗的任何类型。它们可以是作为裸DNA或与一种或多种阳离 子两亲性分子例如一种或多种阳离子脂质，例如以DNA/脂质体形式复合 进行施用的质粒表达载体。备选地可以使用病毒载体。先前已经描述了用 于在人肺部呼吸道中表达治疗蛋白的载体。例如，公布的国际申请WO 01/91800(Isis innovation Limied)描述了包含人泛蛋白C启动子的这样目 的的表达载体。用于指导转基因在呼吸道上皮中表达的表达载体的实例还 在Chow等，Proc，Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)(1997)94， 14695-14700中描述。
IFN-λ多肽可以与一种或多种可接受的载体一起配制，以提供用于治 疗用途的药物组合物。在与化合物相容并且对其受体无害的意义上，所述 载体必须是“可接受的”。这样的载体是制药领域公知的。为了按照本发 明治疗病毒诱导的呼吸道疾病恶化的目的，特别优选地配制所述IFNλ多 肽用于呼吸道施用。
对于这样的施用，所述IFNλ多肽便利地以从使用适当的推进剂如二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟-乙烷、氢氟烷如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)、二氧化碳或其它适合的气 体的加压容器、泵、雾化器或喷雾器喷出的气雾剂喷雾的形式递送。在加 压气雾剂的情形中，剂型可以通过提供阀而确定，以递送计量的量。加压 的容器、泵、雾化器或喷雾器可以包含活性化合物的溶液或混悬液，例如， 使用乙醇和推进剂作为溶剂的混合物，其可以另外包含润滑剂，例如三油 酸山梨坦。所述制剂还可以使用超声喷雾技术递送。
因此，如上文所示，在本发明的另一个方面，提供包含含有治疗剂的 药物组合物并且适用于呼吸道递送所述组合物的装置，所述治疗剂是(i) 一种或多种IFN-λ多肽或(ii)一种或多种能够表达上文讨论的一种或多种 IFN-λ多肽的多核苷酸。这样的组合物可以以同时、分开或顺序施用的方 式补充用于治疗呼吸道疾病的其它治疗剂。因此，所述其它治疗剂可以配 制成提供单一组合物或者以分开的组合物提供。适用于这样的施用方案的 产品构成本发明的另一个方面。
因此，先前已经提及上述产品用于治疗病毒诱导的哮喘恶化，其包括 同时、分开或顺序施用下列各项：(a)至少一种IFN-λ多肽或能够在要靶 向的支气管上皮细胞中表达至少一种IFN-λ多肽的多核苷酸和(b)吸入的 皮质甾类，诸如例如氟替卡松、倍氯米松(beclomethasone)和布地奈德。 这样的产品可以以适用于气雾剂递送到呼吸道的单一药物组合物的形式 存在。
应该理解，使用气雾剂的全部每日剂量将随患者和患者而不同，并且 可以以单一剂量或以一天内分开的剂量进行施用。
被施用用于本发明的方法的IFNλ多肽可以衍生以改善所述多肽的药 物代谢动力学或免疫原性特征。例如，IFN-λ多肽可以是PEG化的和/或 缀合到白蛋白或其它物质上，以增加所述IFN-λ多肽的稳定性。
PEG化是本领域的技术人员公知的方法，其中多肽或拟肽 (peptidomimetic)化合物被修饰，以致一个或多个聚乙二醇(PEG)分子共 价附着到一个或多个氨基酸或其衍生物的侧链上。它是一种最重要的分子 改变结构化学技术(MASC)。可以使用其它MASC技术；这样的技术可以 改善所述分子的药效特征，例如延长它的体内半衰期。PEG-蛋白缀合物 通过首先活化PEG部分，以致它将与本发明的蛋白质或拟肽化合物反应 和偶联而形成。PEG部分在分子量和构象上有相当大的变化，早期部分(单 官能PEGs；mPEGs)是线性的，具有12kDa或更少的分子量，并且晚期 部分具有增加的分子量。PEG2，PEG技术的最近的新技术，包括将30kDa (或更少的)mPEG偶联到赖氨酸氨基酸上(尽管PEG化可以延长以将PEG 添加到其它氨基酸上)，其进一步反应以形成如同具有大得多的分子量的 线性mPEG作用的支链结构(Kozlowski等，(2001)，Biodrugs(生物药物) 15，419-429)。在Roberts等，(2002)Adv.Drug Deliv Rev(高级药物递送综 述)54，459-476，Bhadra等，(2002)Pharmazie 57，5-29，Kozlowski等， (2001)J Control Release(控制释放杂志)72，217-224，和Veronese(2001) Biomaterials(生物材料)，22，405-417以及它们中引用的参考文献中进 一步描述了可以用于将PEG分子共价附着到本发明的多肽或拟肽化合物 上的方法。
为了提高药物动力学特征和/或稳定性，可以另外或者备选地选择用 非天然存在的氨基酸残基取代天然IFN-λ多肽的天然存在的氨基酸残基。 治疗蛋白质如干扰素和生长激素，在它们的天然状态或当重组产生时，可 以是表现出短的保存寿命的易分解的分子，特别当在水溶液中配制时。当 配制用于施用时这些分子的不稳定性表明，所述分子可以必须冻干并且在 保存过程中的所有时间冷冻，因此使得所述分子难于运输和/或保存。当 药物制剂必须在医院环境之外进行保存和分发时，保存问题特别紧急。许 多蛋白质和肽药物还需要加入高浓度的其它蛋白质如白蛋白，以减少或防 止由于与容器结合引起的蛋白质损失。这是关于蛋白质如干扰素的主要考 虑。
白蛋白作为载体分子的作用及其惰性的性质是在体内用作多肽的载 体和转运蛋白的理想特征。白蛋白与治疗蛋白质的融合可以通过遗传操作 实现，以致编码白蛋白或其片段的DNA连接到编码所述治疗蛋白质的 DNA上。然后将适当的宿主用融合的核苷酸序列转化或转染，所述融合 的核苷酸序列排列在适当的质粒上，以表达融合多肽。表达可以在体外例 如从原核或真核细胞实现，或者在体内例如从转基因生物体实现。
本发明可以用于预防或治疗目的。可以认为一个人处于患有呼吸道病 毒感染的季节性危险下。因此，在冬季，存在大量的鼻病毒感染以及流感 和RSV的明显的冬季流行。当暴露于患有明显临床感冒的人时，预计患 有哮喘或COPD的人就可能发展病毒恶化的症状。在这种情形中，按照 本发明在这样的暴露之后，可以施用一种或多种IFN-λ多肽，以预防或者 至少减少呼吸道疾病的病毒恶化的发展。
应该理解本发明适用于引起呼吸道疾病的病毒诱导的恶化的任何病 毒感染，或者适用于预防这样的恶化，所述恶化与在支气管上皮细胞中的 不足的IFN-λ生产相关。例如，所述病毒感染可以是由任何鼻病毒、RSV 或流感病毒引起的感染。所述病毒感染可以由其它呼吸道病毒引起。然而， 本发明特别优选地用于治疗或预防鼻病毒诱导的呼吸道疾病恶化，特别是 鼻病毒诱导的哮喘恶化。
如上文所讨论，现在另外提议干扰素-λ可以有益于预防变应性疾病如 哮喘，而不依赖它们抗病毒感染的作用。我们已经生成的数据表明，在生 命早期施用干扰素-λ将模拟传染病的保护作用，促进TH1免疫应答，并 且防止TH2推动的变应性致敏作用和变应性疾病的发展。这种预防性治 疗可以在生命的早期施加，但是干扰素-λ还可以在生命晚期施用，以治疗 /治愈变应性疾病，换言之，以逆转TH2推动的致敏作用和对过敏原的免 疫应答。
“变应性疾病”是与T辅助淋巴细胞-2(Th-2)型免疫应答相关的病 况。在变应反应中，发生高IgE水平，并且Th-2免疫应答与Th-1应答相 比占优势，导致炎性反应。
所谓“变应性疾病”我们包括变应性致敏作用、变应性鼻炎、湿疹、 食物过敏、过敏性反应、皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、变应性呼吸 道疾病、嗜酸细胞过多综合征、接触皮炎以及特征为嗜酸性细胞呼吸道炎 症和呼吸道超反应性的呼吸道疾病如变应性哮喘、先天性哮喘、变应性支 气管肺曲霉病、嗜酸细胞性肺炎、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮 喘、反应性呼吸道疾病综合征、间隙性肺病、嗜酸细胞过多综合征 (hyperosinophilic syndrome)或寄生虫肺病。在本发明这一方面的一个实 施方案中，所述变应性疾病是变应性致敏作用、变应性鼻炎、湿疹、食物 过敏、过敏性反应、皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、嗜酸细胞过多综 合征或接触皮炎。
本发明这一方面的另一个实施方案是其中所述呼吸道疾病是哮喘(变 应性或先天性的)、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性支气管肺曲霉病、肺 嗜酸性细胞增多症、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性呼 吸道疾病综合征、间隙性肺病、嗜酸细胞过多综合征或寄生虫肺病。优选 地，所述呼吸道疾病是哮喘和/或COPD。
本发明的另一个方面是IFNλ多肽在制备用于预防或治疗变应性疾病 的药物中的应用。
优选地，所述变应性疾病是变应性致敏作用、哮喘、变应性鼻炎、湿 疹、食物过敏、变应性反应、变应性鼻炎、湿疹、食物过敏、过敏反应、 皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、变应性呼吸道疾病、嗜酸细胞过多综 合征、接触皮炎以及特征为嗜酸性细胞呼吸道炎症和呼吸道超反应性的呼 吸道疾病如变应性哮喘、先天性哮喘、变应性支气管肺曲霉病、嗜酸细胞 性肺炎、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性呼吸道疾病综 合征、间隙性肺病、嗜酸细胞过多综合征或寄生虫肺病。
现在将通过参考下述非限制性实施例和附图描述本发明。
附图简述
图1.鼻病毒和RSV都强烈地诱导干扰素λmRNA在人支气管上皮细 胞系BEAS2B中的表达。
图2.鼻病毒和RSV都强烈地诱导干扰素λmRNA在人支气管上皮细 胞系BEAS2B中的表达。与图1相同的数据。
图3.如所述的剂量反应，其表明鼻病毒对IFNλ-1和IFNλ-2/3的诱导 都是剂量反应性的。
图4.主要和次要组的多种鼻病毒血清型诱导IFNλ。由于使用UV灭 活的病毒没有观察到所述诱导，所以所述诱导是复制依赖性的。
图5.来自健康志愿者的外周血单核细胞应答鼻病毒感染诱导IFNλ， 诱导在8小时达到最高，但是在24小时仍然显著。
图6.由鼻病毒和RSV从人巨噬细胞诱导IFNλ。
图7.鼻病毒感染对STAT1激活的生物活性。在这一实验中，将来自 鼻病毒感染的BEAS2B细胞的上清接种到表达重组λ受体的报道细胞系 上，并且通过凝胶移位测定评估STAT1激活。使用来自病毒感染的支气 管上皮细胞的上清观察到STAT1激活的明显的诱导，而对照细胞没有。
图8.IFNλ-1具有剂量反应方式的抗病毒活性，当通过Hela细胞滴定 测定测量时，其减少鼻病毒16病毒RNA在BEAS2B细胞中的表达，以 及减少病毒在BEAS2B细胞上清中的释放。病毒RNA拷贝数通过定量 PCR评估。
图9.Hela细胞滴定测定中的抗病毒活性表明病毒诱导的细胞病理效 应受到IFNλ-1抑制，程度与使用干扰素β观察到的相似。
图10.IFNλ-1在BEAS2B细胞中诱导自身以及IFNλ2-3和干扰素β。 类似地，干扰素β诱导自身以及诱导IFNλ-1和IFNλ2-3。因此在1型和 III型干扰素亚型之间存在正向反馈。
图11.IFNλ通过自身以剂量反应方式诱导促炎性细胞因子，并且同样 以剂量反应方式应答鼻病毒16的表达而显著提高促炎性细胞因子的诱 导。这些特征在BEAS2B细胞中观察到，并且表明IFNλ增强可能补充其 它炎性细胞成为病毒感染的上皮细胞的反应。右面的版表明对于干扰素β 是相同的。
图12.BEAS2B细胞的RSV感染导致以时间反应方式向上清中增加的 IFNλ蛋白释放，在24小时达到峰值。
图13.BEAS2B细胞的鼻病毒感染还以剂量反应方式诱导向BEAS2B 细胞的上清中的IFNλ蛋白释放。
图14.鼻病毒的多种血清型导致IFNλ蛋白释放到BEAS2B细胞的上 清中。此外，主要和次要的血清型都导致并且同样以复制依赖性方式。
图15.来自健康供体的外周血单核细胞的鼻病毒感染导致以时间依 赖方式的IFNλ蛋白向上清中分泌的增加。
图16.人巨噬细胞的鼻病毒和RSV感染都导致IFNλ向上清中的释 放。
图17.来源于哮喘症和健康供体的原代支气管上皮细胞表明，与正常 的上皮细胞相比较，哮喘症上皮细胞具有显著增加的病毒复制。病毒RNA 拷贝数的差别通过定量PCR评估。哮喘症上皮细胞产生比正常的上皮细 胞多于一个对数更多的病毒RNA负荷。
图18.在健康和哮喘症上皮细胞中应答鼻病毒感染诱导了IFNλ mRNA表达。然而，相对于正常细胞，在哮喘症中对IFNλs的诱导是不足 的。IFNλmRNA表达通过定量PCR定量。IFNλ的诱导是复制依赖性的。 正常的志愿者比哮喘症受试者产生多于一个对数更多量的IFNλmRNA。
图19.在正常和哮喘症支气管上皮细胞中鼻病毒感染诱导IFNλ蛋 白。由正常上皮细胞产生的水平再一次大于由哮喘症上皮细胞产生的水 平。
图20.IFNλ mRNA在原代人支气管上皮细胞中的表达与病毒负荷强 烈相关。IFNλ表达越多，发生的病毒复制越少。这一数据表明，在原代 人支气管上皮细胞中IFNλ与抗病毒活性相关。
图21.相对于正常的个体，在哮喘症个体中，应答鼻病毒感染和在支 气管肺泡灌洗细胞沉淀的LPS刺激二者的IFNλ生产是不足的。通常，多 于80％的支气管肺泡灌洗细胞是巨噬细胞。这一数据以及先前来自上皮细 胞的数据表明哮喘症缺少来自巨噬细胞的IFNλ生产。
图22.来自用鼻病毒离体刺激的支气管肺泡细胞上清的IFNλ产生。 应答支气管肺泡灌洗细胞沉淀的鼻病毒感染的IFNλ生产与临床感冒的严 重性、肺功能减少的严重性和在体内试验性感染鼻病毒的哮喘症和正常受 试者中的病毒负荷强相关。在这些实验中，IFNλ从在体外应答鼻病毒感 染的支气管肺泡灌洗细胞沉淀的生产在基线确定，然后2周后将受试者在 体内用鼻病毒感染。在这种体内感染过程中，感冒症状、肺功能减少和更 低的呼吸道病毒负荷都受到评估，以监测在体内感染过程中临床疾病的严 重性。在体内感染过程中，在基线的IFNλ生产与感冒的严重性、由肺功 能减少确定的哮喘恶化的严重性和与支气管肺泡灌洗液病毒负荷强烈相 关。这些数据清楚地表明，IFNλ生产是在体内呼吸道病毒感染过程中临 床疾病严重性的主要确定因素，并且表明在哮喘受试者的呼吸道病毒感染 过程中，IFNλ施用应该减少肺功能减少的症状、病毒负荷和严重性。
图23.在BEAS-2B细胞中应答鼻病毒16感染诱导I型和III型干扰 素的时间过程。
(a)通过Taqman PCR研究不同α干扰素亚型的mRNA表达。为了检 测各种α干扰素亚型，选择两对Taqman PCR引物和探针。第一引物和探 针组检测亚型1，6和13，第二引物和探针组检测亚型4，5，8，10，14，17，21。 1型干扰素的表达通过第一引物对-IFNA.1检测，但是没有发现鼻病毒16 对这些1型干扰素的mRNA表达的显著诱导。使用第二引物对-IFNA.2， 与培养基比较，观察到1型干扰素mRNA表达的统计学显著增加，但是 只是在感染后的8小时(p<0.001)。
(b)在相同实验中，通过Taqman PCR研究IL-29和β干扰素mRNA 的表达。鼻病毒16对IL-29mRNA表达的诱导在8小时的时间点统计学 显著地增加，并且我们在24小时检测到甚至更高的诱导(p<0.001)。在24 小时，IFN β mRNA表达也受到鼻病毒16的诱导(p<0.001)。因此，IFNλ mRNA生产比β发生更早，比α更加稳定，并且与α或βIFN生产相比， 被诱导至更大程度。
(c)在相同实验中，干扰素-β的生产通过ELISA测量。经过24小时， 在鼻病毒16感染的BEAS-2B细胞中检测到干扰素-β蛋白的统计学显著的 诱导(p<0.01)。
(d)在相同实验中，IL-29的生产通过ELISA测量。经过24小时，在 鼻病毒16感染的BEAS-2B细胞中检测到IL-29蛋白的统计学显著的诱导 (p<0.001)。因此，与mRNA数据一致，IFNλ蛋白的生产比β IFN的生产 高5倍。在这些实验中，αIFN蛋白是不可检测的。
图24.在原代人支气管上皮细胞中应答鼻病毒16感染的IFN产生的 时间过程。
(a)在人支气管上皮细胞中在鼻病毒16的时间过程中在0，4，8和 24小时的时间点，通过Taqman PCR评估不同α干扰素类型的mRNA表 达。通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素没有受到鼻病毒16的诱导，而 通过IFNA.2检测的那些在8小时与培养基相比受到显著地诱导(p<0.01)， 但是在24小时没有统计学显著的诱导。
(b)在相同的实验中，通过Taqman PCR研究在感染鼻病毒16的人支 气管上皮细胞中的IL-29和β干扰素mRNA的表达。在24小时IL-29 mRNA表达受到显著诱导(p<0.001)。干扰素-β在任何时间点都没有表现 出显著的诱导。
图25.在人支气管上皮细胞中应答鼻病毒1B感染的IFN产生的时间 过程。
在鼻病毒1B时间过程中，在0，4，8和24小时的时间点，也通过 Taqman PCR评估IFNα，IFNβ和IL-29mRNA表达。
(a)通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素没有受到鼻病毒16的诱导。 通过第二引物对IFNA.2检测的α-干扰素的mRNA在8和24小时受到鼻 病毒1B的诱导(p<0.05)。
(b)使用IL-29，在24小时检测到非常高的诱导水平(比通过IFNA.2 引物对检测的那些高2个对数)(p<0.001)。在24小时也检测到干扰素-β mRNA的诱导(p<0.01)，尽管这一诱导比关于IL-29观察到的低1个对数。
图26.在人支气管上皮细胞中应答流感病毒感染的IFN产生的时间 过程。
(a)在人支气管上皮细胞中，在流感病毒时间过程中在0，4，8和24 小时的时间点，通过Taqman PCR评估不同α干扰素类型mRNA的表达。 在任何时间点，通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素和通过IFNA.2引物 对检测的那些都没有受到流感病毒的显著诱导。
(b)在相同的实验中，在感染流感病毒的人支气管上皮细胞中通过 Taqman PCR研究IL-29和β-干扰素mRNA的表达。在感染后8小时IL-29 受到流感病毒的显著诱导(p<0.001)，并且在24小时进一步增加。干扰素-β mRNA诱导在任何时间点都没有显著诱导，尽管在8小时和24小时观察 到增加。在全部时间点，IL-29 mRNA表达比α和β IFNs的表达都高。
实施例1：在支气管上皮细胞中，鼻病毒诱导IFN-λ。
目的：研究RV是否在体外诱导IFN-λs，并且IFN-λs是否在支气管上 皮细胞中诱导针对RV感染的抗病毒活性。
方法概述：将人支气管上皮细胞系BEAS2B用RV感染。使用 PCR鉴定IFN-λs mRNA表达，并且将生物测定用于相对应的蛋 白生产。在用RV感染前，将BEAS2B细胞用不同剂量的IFN-λ1处理24 小时。进行在细胞裂解物中关于病毒RNA的PCR和在BEAS2B 上清中的病毒滴定，以研究抗病毒作用。
结果：IFN-λ1，IFN-λ2和IFN-λ3 mRNA在感染后4小时增加(p<0.05)， 并且在感染后8小时达到峰值(p<0.001)。在感染后24小时所述增加表现 出对RV-16是剂量反应性的(p<0.001)。用RV-9和RV-1B感染表明所述反 应是血清型和受体不依赖性的。RV-16的UV-灭活完全抑制了上调，这表 明需要活性病毒复制。EMSA测定检测在感染后24小时IFN-λs蛋白在 BEAS2B上清中的存在。最后，在细胞裂解物中关于病毒RNA的 PCR(p<0.001)和病毒滴定(p<0.001)都表现出IFN-λ1对RV16感染的剂量 依赖性抗病毒作用。
结论：本研究表明支气管上皮细胞系的RV感染导致IFN-λs的产生， 并且这些蛋白可能在针对RV的抗病毒反应中起重要作用。
实施例2：在哮喘恶化中的病毒感染：干扰素λ的作用
目的：研究RV16是否诱导IFN-λs，并且这种生产是否与在哮喘症中 对鼻病毒感染的增加的易感性有关。
方法：将人支气管上皮细胞系BEAS2B和来自哮喘症(6)和正常患者 (5)的支气管原代细胞用RV16感染。使用用于IFN-λmRNA表达的 PCR。在感染RV16之前，将BEAS2B细胞用IFN-λ1处理。进 行在细胞裂解物中关于病毒RNA的 PCR和在BEAS2B上清中 的病毒滴定，以研究抗病毒作用。关于在原代细胞的细胞裂解物中的病毒 RNA的 PCR还用于检测RV16感染性是否在哮喘症和正常人的 原代细胞之间不同。
在哮喘症中增加的对鼻病毒感染的易感性中的IFN-λs。结果：在 BEAS2B和原代细胞中IFN-λs mRNA都增加，在8小时的感染达到峰值。 在BEAS2B中，关于病毒RNA的 PCR和病毒滴定都表明IFN-λ1 对RV16感染的剂量依赖性抗病毒作用。与正常对照相比较，在RV16感 染后原代支气管上皮细胞产生显著更低量的IFN-λ(p<0.05)。相反，在来 自哮喘症受试者的支气管上皮细胞中RV16的复制更高(p<0.05)。
结论：支气管上皮细胞的RV16感染导致IFN-λs的产生。在哮喘症受 试者中这种生产是不足的，并且因此可能是在哮喘症中对鼻病毒感染的增 加的易感性的因素。
其它材料和方法
获得原代支气管上皮细胞
所有的受试者都是不吸烟的人，在过去的4周内没有恶化或呼吸道感 染。变应性皮肤检测使用一组常见的空气源性变应原，并且如果疱疹反应 比阴性对照>3mm，就认为是阳性的。肺功能通过肺活量测定法和由组胺 激发的支气管超反应性而评估。哮喘在具有支气管超反应性(由PC20组 胺<8mg/ml定义)的一致的病史和迹象的遗传性过敏性个体中诊断，并 且按照GINA指南(National Heart，Lung and Blood Institute(国家心脏、肺 和血液研究所)，1995.Global Strategy for Asthma Management and Prevention(哮喘管理和预防的国际策略)，96-369)分类。健康对照先前 没有肺病病史，具有正常的肺功能，没有支气管超反应性的迹象，并且不 是遗传性过敏性的。本研究由南安普敦大学医院伦理委员会(Southampton University Hospital Ethics Committee)核准。所有的受试者都提供书面告 知的同意书。
支气管上皮细胞组织培养
原代BECs从支气管刷洗液(>95％的上皮细胞)生长，支气管刷洗 液按照标准指南(Hurd，S.Z.1991.J.Allergy Clin.Immunol(过敏症临床免 疫学杂志)88：808-814)通过光纤-光学支气管镜检查而获得；在从正常或 哮喘症供体分离的柱细胞和基细胞的比例中没有显著区别。细胞培养和特 征化描述如先前所述进行(Bucchieri，F.，J.Lordon，A.Richter，D.Buchanan， R.Djukanovic，S.T.Holgate，和D.E.Davies.2001.Am.J.Respir.Cell Mol. Biol.(美国呼吸细胞分子生物学杂志)27：179-185；Lordan，J.L.，F.Bucchieri， A.Richter，A.Konstantinidis，J.W.Holloway，M.Thornber，S.M.Puddicombe， D.Buchanan，S.J.Wilson，R.Djukanovic，等.2002.J.Immunol(免疫学杂 志)169：407-414)。所培养的细胞都是细胞角蛋白阳性的，并且表现出基 细胞表型，如细胞角蛋白13的表达所表明的，而与原始刷洗液的供体的 类型无关。原代培养物通过将新鲜刷洗的BECs接种到补充激素的含有50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的支气管上皮细胞生长培养基(Clonetics) 中而建立。在第二次传代时，将细胞接种到12孔托盘上并且在暴露于 RV-16之前培养至80％汇合(Bucchieri等，如前所述)。
RV的产生和滴定
按照先前所述(Papi，A.，和S.L.Johnston.1999 J.Biol.Chem.(生物的 化学杂志)274：9707-9720)，从俄亥俄(ohio)HeLa细胞的感染培养物产生 并且滴定RV-16储液。细胞以2的感染复数进行感染。感染的证实和病毒 生产的定量通过HeLa滴定测定(Papi，A.，和S.L.Johnston，如前所述)和反 转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)进行评估，如下文所述。作为阴性对 照，将细胞只用培养基和UV灭活的RV-16处理(Papi，A.，和S.L.Johnston， 如前所述)。
RT-qPCR和ELISA
在从用TRIzol(生命技术(Life Technologies))从BECs提取的DNA 酶处理的RNA上进行IFNλ mRNA和RV-16病毒RNA(vRNA)基因表达的 RT-qPCR分析。将总RNA(1μg)用禽类成髓细胞血症病毒转录酶(普洛麦 格(Promega))和用于IFNλ mRNA和18S rRNA分析的随机六聚体或用于 RV-16 vRNA的寡(dT)15进行反转录。实时检测使用iCyclerIQ检测系统， 其使用PCR流程如下：42个循环，在95℃15秒，60℃1分钟和72℃15 秒。将IFNλ信号相对18S rRNA标准化，并且使用△△CT方法进行相对 定量。在感染后8小时进行比较。RV-16的定量使用位于5′UTR的TAQman 测定联合标准曲线方法而实现。标准曲线使用克隆到PCR 2.1 TOPO (Invitrogen)的RV-165′NTR cDNA的10倍连续稀释液而构建。RV检测的 相对值通过相对起始细胞数目标准化而计算。探针：FAM/TAMRA 6-FAMTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATG，正向引物(RVTM-1) 5′-GTGAAGAGCCSCRTGTGCT-3′，反向引物(RVTM-2) 5′-GCTSCAGGG-TTAAGGTTAGCC-3′。
统计学分析
当数据正常分布时，已经使用平均数和SD，使用斯氏t检验分析组 间差异，当不正常分布的数据使用非参量等价物分析并且使用中值和IQR 总结时，多重比较首先通过Kruskal Wallis检验进行分析，然后如果显著 的话，通过个体检验进行分析。通过Spearman′s检验分析相关性。<0.05 的p值被认为是显著的。
哮喘和COPD的诊断
(i)诊断COPD
下述信息获自题目为“Pocket guide to COPD diagnosis，management and prevention：a guide for heath care professionals(COPD诊断、管理和预 防的便携指南：健康护理专家的指导)”的公布，其可从www.goldcopd.com 上获得。
应该在表现出特征性症状和暴露于关于所述疾病的危险因素，特别是 吸烟的任何个体中考虑COPD的诊断。
考虑COPD诊断的关键指征
·慢性咳嗽：间歇或每日表现。经常整天表现；很少只在夜间表现。
·慢性痰液产生：任何模式的慢性痰液产生可以指示COPD。
·急性支气管炎：反复发生。
·呼吸困难，即：进展性的(随时间加重)。顽固性的(每天表现)。 训练加重。在呼吸道感染时加重。
·暴露于危险因素的历史：烟草吸烟(包括受欢迎的当地制品)。职 业性灰尘和化学品。来自家庭烹饪和加热燃料的烟雾。
诊断应该通过肺活量测定而证实。在肺活量测定难以获得的情形中， 应该使用所有可用的工具进行COPD诊断。临床症状和迹象(呼吸的异 常短缺和增加的被迫呼气时间)可以用来辅助诊断。低峰值流动与COPD 一致，但是由于它可以是由其它肺病和由不良表现引起，所以具有低特异 性。在提高COPD诊断的准确性的目标中，应该进行任何努力以提供标 准化肺活量测定的方法。
当进行肺活量测定时，测量：
·用力肺活量(forced vital capacity，FVC)和
·一秒钟内的用力呼气量(FEV1)。
计算FEV1/FVC比例。肺活量测定结果表示为使用关于个体的性别、 年龄和身高的适当的正常值预测的％。
患有COPD的患者典型地表现出在FEV1和FEV1/FVC的减小。肺活 量测定的异常的程度通常反映COPD的严重性。然而，当针对每名患者 研发个体化的管理策略时，应该考虑症状和肺活量测定。 通过严重性对COPD分类
阶段0：危险-慢性咳嗽和痰液产生；肺功能仍然正常。
阶段I：轻度COPD-轻度气流限制(FEV1/FVC<70％但是FEV1≥ 80％预测)，并且经常而不是总是，慢性咳嗽和产生痰液。
·在这一阶段，个体可能没有意识到他或她的肺功能异常。
阶段II：中度COPD-加重的气流限制(50％≤FEV1<80％预测)， 并且症状经常发展，具有典型地在用力时发展的呼吸急促。
阶段III：严重的COPD-进一步加重的气流限制(30％≤FEV1< 50％预测)，增加的呼吸急促，和反复的恶化，其对患者的生活质量有影 响。
·症状恶化，其对患者的生活质量和预后有影响，特别是在具有 FEV1<50％预测的患者中观察到。
阶段IV：非常严重的COPD-严重的气流限制(FEV1<30％预测)或 者FEV1<50％预测加上慢性呼吸衰竭。只要存在这些并发症时，即使 FEV1>30％预测，患者仍可能患有非常严重的(阶段IV)COPD。
·在这一阶段，生活质量非常明显地被损害，并且恶化可能是威胁 生命的。
鉴别诊断
主要的鉴别诊断是哮喘。在一些患有慢性哮喘的患者中，使用目前的 成像和生理学检测技术，与COPD的清楚的区分是不可能的。在这些患 者中，目前的管理与哮喘的管理相似。其它潜在的诊断通常更容易地区分 COPD：
下文列出可以用于区分许多不同的疾病的提示特征。这些特征倾向于 是各个疾病的特征，但不是在每个病例中都发生。例如，从来不吸烟的人 可能发展COPD(特别是在发展中国家，在发展中国家其它的危险因素可 能比吸烟更重要)；哮喘可能在成年人并且甚至年纪更大的患者中发展。
COPD的鉴别诊断
COPD： 在中年发作。症状缓慢进展。
长期吸烟史。
在锻炼过程中呼吸困难。
很大程度上不可逆转的气流限制。
哮喘： 在生命早期(经常在儿童期)发作。
症状每天与每天不同。
症状在夜晚/清早出现。
还表现出过敏、鼻炎和/或湿疹。
哮喘家族病史。
很大程度上可逆转的气流限制。
充血性心力衰竭： 听诊时细碎的基底捻发音(crackles)。
胸部X射线显现膨胀的心脏、肺部水肿。
肺功能检测表明体积受限，无气流限制。
支气管扩张： 大体积的脓性痰液。
通常与细菌感染相关。
听诊时粗糙的捻发音/杵状变(clubbing)。
胸部X-射线/CT显现支气管扩张、支气管壁增厚。
肺结核： 在所有年龄都发作。
胸部X射线显现肺浸润或结节损伤。
微生物学证实。
肺结核的高地域性流行。
(ii)诊断哮喘
下述信息获自题目为“Pocket guide for asthma prevention and management(哮喘预防和管理的便携指南)”的公布，其可从www. ginasthma.com上获得。
哮喘通常可以基于症状进行诊断。然而，肺功能的测量，并且特别是 肺功能异常的可逆性，极大地提高了诊断的可信性。
这是哮喘吗？
如果显现下述迹象或症状的任一种，那么认为是哮喘，
·当呼吸时----特别是儿童，高调喘息喘鸣声。(正常的胸部检查不排 除哮喘)。
·任何下述病史：
咳嗽，特别是在夜间加重
周期发生的喘息
周期发生的呼吸困难
周期发生的胸部紧迫感(chest tightness)。
(注意：哮喘通常与湿疹，花草气喘，或哮喘或遗传性过敏病的家 族史相关。)
·症状在夜间发生或加重，使患者睡不着。
·存在下列各项时症状发生或加重：
带毛的动物
锻炼
气雾剂化学品
花粉
温度变化
呼吸道(病毒)感染
房尘螨(house dust mite)
烟
药物(阿司匹林，β阻断剂)
强烈的情绪表达
·可逆的和可变的气流限制----其通过使用肺活量计(FEV1和FVC) 或呼气峰流量(peak expiratory flow，PEF)计测量。当使用最大气流计时， 如果下述则认为是哮喘：
-在吸入快速作用的2-激动剂后15到20分钟，PEF增加大于15％， 或者
-在服用支气管扩张药的患者中，在发生测量12小时后，PEF从早 晨测量变化大于20％(在未服用支气管扩张药的患者中大于10％)，或者
-在持续跑步或锻炼6分钟后，PEF减少大于15％。
最大气流计：应用和技术
·肺功能测量评估气流限制，并且辅助诊断和监测哮喘病程。
·为了评估气流限制的水平，使用两种方法。最大气流计测量呼气峰 流量(PEF)，并且肺活量计测量1秒钟内的用力呼气量(FEV1)及其伴随的 用力肺活量(FVC)。所有肺功能测量的准确性取决于患者的努力和正确的 技术。
·可以使用各种最大气流计和肺活量计，并且对于所有的使用技术是 相似的。使用最大气流计：
-站立并且握住最大气流计，不限制标记的移动。确定标记是在 刻度的底部。
-深呼吸，将最大气流计放入你的嘴中，沿着吹嘴紧闭嘴唇，并 且尽可能努力和快速地呼出。不要将舌头置于吹嘴中。
-记录结果。将标记返回到零处。
-再重复两次。选择三次读数的最高值。
·当可用时，每天PEF监测持续2到3周用于确立诊断和治疗。如果 在2到3周期间，患者不能获得80％的预测PEF(对于所有最大气流计提 供预测值)，可以必要地确定患者的个人最好值，例如，通过口服糖皮质 类固醇的疗程。
·与观察的症状一起，长期的PEF监测用于评估患者对治疗的反应。 PEF监测还可以帮助在症状发生之前检测加重的早期迹象。
注意：可用的最大气流计的实例和关于吸入器和间隔物(spacer)的 使用说明可以在www.ginasthma.org上找到。
诊断挑战包括下述：
·其初级症状复发或者持续咳嗽或者患有呼吸道感染喘息的年幼儿 童经常误诊为患有支气管炎或肺炎(包括急性呼吸道感染-ARI)，并且 因此使用抗生素或咳嗽抑制剂无效地治疗。使用哮喘药物的治疗可以是有 利的和对症的。
·患有病毒呼吸道感染喘息的许多婴儿和年幼的儿童不可能发展持 续整个儿童期的哮喘。但是他们可以在他们的喘息期间受益于哮喘药物。 不存在特定的方法预测哪些儿童将患有顽固性哮喘，但是过敏、过敏或哮 喘的家族病史以及在围产期暴露于被动吸烟和过敏原与持续的哮喘更强 烈地相关。
·如果患者的感冒反复地“到达胸部”或者持续10天以上才消除， 或者如果当给与哮喘药物时患者改善，那么应该认为是哮喘。
·烟草吸烟者和年纪大的患者通常患有慢性阻塞性肺病(COPD)，其 具有与哮喘类似的症状。然而他们也可能患有哮喘并且从治疗中受益。在 哮喘治疗后在PEF的提高是诊断性的。
·在工作地点暴露于吸入的化学品或过敏原的工人可能患有哮喘，并 且可能被误诊患有慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病。早识别(在工作和家 里的PEF测量)、严格避免进一步暴露，和早治疗是重要的。
·哮喘发作可以是难以诊断的。例如，急性呼吸急促，胸部紧迫感和 喘息也可以由哮吼、支气管炎、心脏病发作和声带功能障碍引起。使用肺 活量计，使用支气管扩张药确定症状的可逆性，并且评估发作的病史(例 如，它是否与通常加重哮喘的暴露相关)辅助诊断。胸部X射线可以帮 助排除感染、大的呼吸道损伤、充血性心力衰竭或外来物体的吸入。
实施例3：在呼吸道病毒感染后α-干扰素、β-干扰素和λ-干扰素在上皮细 胞和PBMCs中的表达。
在本研究中，研究在感染呼吸道病毒时表达并且产生各种1型和III 型干扰素的不同的细胞类型如BEAS-2B、人支气管上皮细胞(HBEC)和 PBMC(作为巨噬细胞的模型)的潜力。设计引物和探针组用于各种1型 和III型干扰素的定量PCR。在BEAS-2B细胞中，检测从0时间点直到8 小时的IFN-α mRNA表达的诱导，检测从0时间点直到8小时的IL-29 mRNA的诱导，在24小时具有峰值，并且检测从0时间点直到24小时的 IFN-β的诱导。通过ELISA，我们还观察到IL-29和IFN-β蛋白在24小时 的产生。在HBEC中，检测从0时间点直到8小时的IFNA mRNA表达的 诱导和从0时间点直到24小时的IL-29 mRNA的诱导。在PBMC中，表 现出从0时间点直到8小时的IFNA，IL-29和IFNB mRNA表达的诱导。 通过ELISA另外表现出IFN-α、IFN-β和IL-29蛋白的诱导。
关于鼻病毒的其它信息
鼻病毒是小RNA病毒。它们属于小RNA病毒家族。已经鉴定了多 于100种血清型的鼻病毒。按照用于结合的受体的类型，鼻病毒分成两组。 主要组大约90％的全部RV血清型使用ICAM-1分子，并且次要组大约 10％的全部RV血清型使用低密度脂蛋白受体(N.G.Papadopoulos， S.L.Johnston：RhinovirusPrinciples and practice of clinical virology(鼻病毒. 临床病毒学原理和实践).第5版，2004，361-377)。
最近的工作表明，由于下呼吸道的症状和在PEF中的变化更严重并 且更长久，哮喘症个体比正常个体更容易感染天然存在的鼻病毒(RV)感染 (Corne等，Lancet(2002)359，831-834)。因此主要问题是，在RV感染过程 中与正常受试者比较在哮喘症的下呼吸道中发生什么差异，并且导致哮喘 恶化。
表明在哮喘症中，RV诱导下呼吸道症状的更大的严重性，其伴随更 高浓度的炎性细胞：淋巴细胞，NK细胞，嗜酸性细胞和嗜中性细胞，在 BALRV感染中，RV在支气管上皮细胞中诱导炎性反应(IL-6，IL-8， RANTES，IL-16和ICAM-1的上调)(N.G.Papadopoulos，PJ.Bates，P.G. Bardin等.J Infect Dis(传染病杂志)181(2000)，第1875-1884页；S.L. Johnston，A.Papi，P.J.Bates，J.G.Mastronarde，M.M.Monick和G.W. Hunninghake，.J Immunol(免疫学杂志)160(1998)，第6172-6181页)。当 与正常相比时，离体暴露于RV的来自于哮喘症的PBMCs表现出减少的 I型细胞因子水平和减少的2型细胞因子水平(Papadopoulos等.Thorax 57 (2002))。此外，如上文已经提示的，最近，当与正常相比时，观察到离体 暴露于RV的来自于哮喘症的原代上皮支气管细胞表现出减少的IFN-β水 平(Wark等J.Exp.Med.(实验医学杂志)(2005年3月21日)201，937-947)。
还如上文先前所讨论，1型干扰素诸如IFN-α、IFN-β和最近发现的 III型干扰素(IFN-λs)在针对病毒的先天性免疫应答中起重要作用。它们 诱导许多具有抗病毒特征的IFN-可诱导的基因，并且如最近所表明的， 它们在病毒感染的细胞中诱导程序性细胞死亡(Takaoka A，Hayakawa S， Yanai H，等，Nature(自然)2003；424(6948)：516-523)。
由于不存在用于鼻病毒感染的小动物模型，所以使用感染鼻病毒的适 当的细胞培养物是非常重要的。已知鼻病毒在下呼吸道的呼吸上皮细胞中 感染和复制(N.G.Papadopoulos等J Med Virol(医学病毒学杂志)58(1999)， 第100-104页)。由于对1型和III型干扰素在上皮细胞中的诱导了解不是 很多，所以在本研究中，我们尝试表明，当不同的呼吸道病毒感染时，不 同的细胞类型如原代支气管上皮细胞、BEAS-2B和PBMC(作为用于巨 噬细胞的模型)怎样表达和产生各种1型和III型干扰素。
材料和方法
人支气管上皮细胞组织培养
人支气管上皮细胞(HBECs)购自美国的Cambrex。原代培养物通过 将支气管上皮细胞接种到补充激素的支气管上皮细胞生长培养基(BEBM； Cambrex，美国)中而建立，所述培养基含有2ml BPE，0.5ml胰岛素，HC0.5 ml，GA-10000，5ml，视黄酸0.5ml，运铁蛋白0.5ml，三碘甲腺原氨酸0.5 ml，肾上腺素0.5ml，hEGF 0.5ml(Cambrex，美国)。在第一次传代，将细 胞接种到12孔托盘上，并且在暴露于RV-16、RV-1B和流感病毒之前培 养到80％汇合(Bucchieri等，Asthamatic bronchil epithelium is more susceptible to oxidant-induced apoptoisis(哮喘症支气管上皮细胞对氧化剂 诱导的程序性细胞死亡更敏感).Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(美国呼吸 细胞分子生物学杂志)27，179)。
细胞和病毒培养
将人支气管上皮细胞系BEAS-2B在补充10％FCS(Invitrogen)的 RPMI-1640中培养。将RV血清型16和1B生长在HeLa细胞中，并且如 先前所述制备(Papi和Johnston(1999)Rhinovirus infection induces expression of its own receptor intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)via increased NF-kB-mediated transcription(鼻病毒感染通过NF-kB介导的转 录而诱导它自身的受体细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达)，J.Biol.Chem. (生物的化学杂志)274，9707-9720)。病毒在HeLa细胞上滴定，以确保 它们的TCID50/ml(Johnston和Tyrell(1995)Rhinoviruses(鼻病毒)，第 253-263页，在Diagnostic procedures for viral，rickettsial and Chlamydial infections(病毒、立克次氏体和衣原体感染的诊断方法)中，Lennette和 Schmidt编，American Public helath Association(美国公共健康协会)，华盛 顿，D.C)。所有RV的身份通过在HeLa细胞上滴定并且使用血清型特异 的抗体中和而证实。按照先前所述进行UV灭活(Johnston等.(1998)Low grade rhinovirus infection indcuces a prolonged release of IL-8in pulmonary epithelium(在肺上皮细胞中低等鼻病毒感染诱导延长的IL-8释放).J. Immunol.(免疫学杂志)160，6172-6181)，并且将RV储液在10000g流过 30kDa的膜(Millipore(密里博))5分钟而产生滤过的病毒。
用RV感染细胞
将BEAS-2B细胞在12孔组织培养平板上(Nalge Nunc)培养24小时， 然后涂布到2％FCS RPMI培养基上再培养24小时。在摇动和室温下将细 胞用RV感染1小时，然后将病毒去除，并且用1ml2％FCS RPMI培养 基替换。在指定的时间收集细胞上清和RNA裂解物。在需要之前将上清 和裂解物保存在-80℃。
PMBC分离和鼻病毒16感染
使用梯度密度离心(希格玛(Sigma))，从全血分离PBMCs。将4x10(6) 个细胞/2ml暴露于鼻病毒161小时。在暴露时间末期，清洗细胞并且更 换培养基。
RNA提取、反转录和实时PCR
使用RNeasy方法按照供应商的说明，从细胞中提取RNA，包括用任 选的DNA酶I消化污染的DNA(Qiagen)。使用Omniscript RT和成分按照 供应商的指导(Qiagen)合成cDNA。
引物购自Invitrogen，并且探针购自Qiagen(快而精公司)。α-干扰素、 IL-29和IFNB mRNA的分析参考18s rRNA标准化。为了检测1、 6和13型α-干扰素，使用IFNα.1组引物和探针(IFNA.1正向-5’-CAG AGT CAC CCA TCT CAG CA-3’，IFNA.1反向-5’-CAC CAC CAG GAC CAT CAG TA-3’和5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-ATC TGC AAT ATC TAC GAT GGC CTC gCC-3’)。为了检测2，4，5，8，10，14，17，21型α-干扰素， 使用IFNα.2组引物和探针(IFNα.2正向-5’-CTG GCA CAA ATG GGA AGA AT-3’，IFNA.2反向-5’-CTT GAG CCT TCT GGA ACT GG-3’和 5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-TTT CTC CTG CCT GAA GGA CAG ACA Tga-3’)。对于IL-29检测，我们使用正向引物-5’GGA CGC CTT GGA AGA GTC ACT-3’，反向-5’-AGA AGC CTC AGG TCC CAA TTC-3’和 5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-AGT TGC AGC TCT CCT GTC TTC CCC G-3’。对于干扰素-β检测，我们使用正向引物-5’-CGC CGC ATT GAC CAT CTA-3’反向-5’-GAC ATT AGC CAG GAG GTT CTC A-3’和 5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-TCA GAC AAG ATT CAT CTA GCA CTG GCT GGA-3’。对于18s，每个反应包含18STM.1(CGC CGC TAG AGG TGA AAT TCT)，18STM.2(CAT TCT TGG CAA ATG CTT TCG)， 5′-FAM-TAMRA标记的探针(5′-ACC GGC GCA AGA CGG ACC AGA) 和2μl1/100稀释在1x Quantitect探针PCR Master混合物(Qiagen)中的 cDNA。使用ABI7000自动TaqMan(Applied Biosystems(应用生物系统)) 分析反应。扩增循环由50℃ 2分钟，94℃ 10分钟和40个循环的94℃ 15 秒，60℃ 15秒组成。
评估IFN-A，IL-29和IFNB释放的酶联免疫吸附测定
使用商购的匹配抗体和标准物，按照供应商的用法说明，在来自收集 并且保存在-80℃的未处理的和感染的细胞培养物的上清中，通过ELISA 定量干扰素-α、干扰素-β和IL-29蛋白。Amersham Biosciences(安玛西亚 生物科学)的高灵敏性干扰素-α人Biotrak ELISA系统用于干扰素-α。人 干扰素-βELISA试剂盒购自Fujirebio公司。所有的测量都按照供应商的 用法说明进行。对于所述测定的检测限制是对于干扰素-α0.63pg/ml，干 扰素-β2.5UI/ml，和IL-290.01。
用于IFNλs的定量ELISA
将ELISA96孔板(Nunc Maxisorp)用检测抗体(每孔100μl稀释在PBS 中的单克隆抗人IL-29/IFN-λ1抗体，所述抗体购自R&D系统，目录号 MAB 15981，浓度1μg/ml)包被，并且置于室温下过夜。次日早上将板 在具有0.1％吐温20的PBS中洗涤两次，然后在室温下每孔用220μl 2％ BSA溶液封闭。2小时后，将板洗涤两次，并且将100μl未稀释的样品和 100μl标准样品加入到孔中。样品和标准物都一式两份进行检测。使用来 自R&D系统的重组人IL-29/IFN-λ1，将标准物置于在稀释缓冲液(具有 1％BSA和0.1％吐温20的PBS)中，从3ng/ml起始下降到大约10pg/ml。 将100mcl的稀释缓冲液加入到相同的孔中作为阴性对照。2小时后，将 板洗涤两次并且加入100μl二抗(来自R&D系统的抗人IL-29/IFN-λ1抗 体，目录号AF1598，在PBS中重构，并且稀释在稀释缓冲液中，浓度1 μg/ml)。按照供应商的用法说明，这些抗体分别具有与IFN-λ2和IFN-λ3 的5％单克隆和25％多克隆的交叉反应性。2小时后，将板洗涤，并且向 每个孔中加入100μl生物素酰化的抗体持续2小时，所述生物素酰化的抗 体来自AutogenBioclear，目录号ABN022B，1：5000稀释在稀释缓冲液 中。将板洗涤两次，并且在每个孔中加入100μl 1：5000稀释在稀释缓冲 液中的链霉抗生物素-HRP(streptavidene-HRP)缀合物持续15分钟。将 板洗涤三次，并且加入100μl TMB底物溶液，并且反应用50μl1.8M oh H2SO4溶液终止。
统计学分析
数据表示为平均数±SEM。所有的数据使用单向ANOVA和在此之后 的Bonferroni′s多重比较检验进行分析。当p<0.05时，接受数据是显著 不同的。
结果
在BEAS-2B细胞中1型和III型干扰素mRNA表达的时间过程
通过Taqman PCR研究在用RV16感染BEAS-2B细胞的时间过程中1 型和III型干扰素的表达。为了检测各种α-干扰素亚型，选择两对Taqman PCR引物和探针。第一引物和探针组检测亚型1，6和13，第二引物和探 针组检测亚型4，5，8，10，14，17，21。还设计了检测IL-29(IFN-λ)和干扰 素-β的引物和探针组。图23a显示通过IFNα.1检测的1型干扰素的表达， 但是鼻病毒16对这些1型干扰素mRNA没有显著的诱导。使用IFNα.2， 与培养基相比，在与0小时时间点比较的第8小时，发生统计学显著增加 的1型干扰素表达。在第0、4和24时间点没有发现诱导。在第8小时的 时间点，IL-29 mRNA的表达也是统计学显著增加的，并且我们在第24 小时检测到甚至更高的诱导(p<0.05)，见图23b。干扰素-β mRNA表达 只在24小时被鼻病毒16诱导一次(p<0.05)。与培养基相比，检测到1000 倍的诱导。全部结果都是从0小时时间点统计学显著的(p<0.05)。
在RV感染的BEAS-2B细胞中检测干扰素-α、干扰素-β和IL-29蛋白
在鼻病毒16感染过程中在BEAS-2B细胞中没有检测到显著的干扰素 -α蛋白诱导。只有从约0.3到0.5pg/ml的痕量的IFNA蛋白通过具有从 0.63到20pg/ml的检测范围的ELISA检测到。在24小时观察到IFNβ蛋 白生产的诱导(图23c)。与未感染的细胞相比，在鼻病毒16感染的 BEAS-2B细胞中，在IFNβ蛋白生产的水平是统计学显著(p<0.05)增加的。 用鼻病毒16感染的BEAS-2B细胞在24小时产生高水平的IL-29蛋白 (p<0.05)(图23d)。
在鼻病毒16感染过程中，在原代支气管上皮细胞中，1型和III型干扰素 mRNA表达的时间过程
在鼻病毒16时间过程中，在第0，4，8和24小时的时间点，评估IFNα、 IFNβ和IL-29 mRNA的表达。通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素在所有 时间点都表达，但是没有受到鼻病毒16的上调。使用IFNA.2，我们在4 小时没有观察到诱导，在8小时观察到比培养基统计学显著的10000倍的 诱导(p<0.05)，其在24小时仍然升高(图24a)。关于IL-29 mRNA，我们 在4和8小时观察到微小的诱导，并且在24小时观察到峰值----是培养基 1000000倍的诱导(p<0.05)。在第0、4和8小时的时间点，干扰素-β没有 表现出诱导，但是在8和24小时受到鼻病毒16的诱导-与培养基相比 100000倍的诱导(图24b)。
在鼻病毒1B感染过程中，在人支气管上皮细胞中，1型和III型干扰素 mRNA表达的时间过程
在鼻病毒1B感染时间过程中，在第0、4、8和24小时的时间点，还 观察到α-干扰素、干扰素-β和IL-29mRNA的表达。通过IFNα.1引物对 检测的α-干扰素在所有时间点都表达，但是没有受到鼻病毒16的诱导。 但是，通过第二引物对IFNα.2检测的α-干扰素的mRNA在0和4小时没 有受到鼻病毒1B的诱导，并且在8和24小时达到峰值----是培养基的 10000倍诱导。这些结果达到统计学显著性(p<0.05)(图25a)。在0和4小 时，IL-29 mRNA没有受到鼻病毒1B的诱导。但是在8小时观察到一些 诱导(是培养基的1000倍诱导)，并且在24小时检测到非常高的诱导水 平----是培养基的1000000倍诱导(p<0.05)。在4小时没有观察到干扰素-β 的诱导，在8小时观察到是培养基100倍的诱导(不是统计学显著地)， 并且在24小时达到峰值----是培养基的100000倍诱导(p<0.05)(图25b)。 在流感感染过程中在人支气管上皮细胞中，1型和III型干扰素mRNA表 达的时间过程
在流感病毒时间过程中，在第0、4、8和24小时的时间点，还观察 到IFNα、IFNβ和IL-29 mRNA的表达。通过IFNA.1引物对检测的α-干 扰素同样在所有时间点都表达，但是没有受到流感病毒的诱导。在0和4 小时，通过IFNα2检测的α-干扰素没有上调。在8小时观察到微小的10 倍诱导，并且在24小时观察到100倍的诱导(图26a)。在4和8小时的 时间点，IL-29受到流感病毒的诱导(是培养基的1000倍诱导)，并且在 24小时达到峰值(是培养基的1000000倍诱导)。在4和8小时没有观察 到IFNβ mRNA的诱导。但是在8小时检测到100倍的诱导，并且在24 小时达到峰值----是培养基的105倍诱导(图26b)。
在HBEC细胞中检测干扰素-α、干扰素-β和IL-29蛋白
在用鼻病毒16、1B和流感病毒感染的HBEC细胞中没有检测到干扰 素-α、干扰素-β和IL-29的产生。
讨论
如已经所述，通过第一引物对检测的α-干扰素类型(1、6和13型) 的表达在用所用的每种呼吸道病毒感染的上皮细胞培养物(BEAS-2B和 HBEC)中都检测到。但是有趣地，没有观察到这些干扰素类型的上调。 因此，可能地，这些α-干扰素类型在上皮细胞培养物中是组成型表达的， 但是不受所用的呼吸道病毒的诱导。并且按照ELISA数据，没有一种这 些α-干扰素类型由上皮细胞系产生。
使用第二引物(2，4，5，8，10，14，17，21型)对的α-干扰素检测的水平 非常不同。它最经常的在感染后8小时在上皮细胞系中诱导。这一引物对 检测干扰素-α4，其可能是这一诱导的原因。但是关于蛋白的经历是相同 的----它不在上皮细胞中产生。
还有趣地，在HBEC中，当所述细胞用流感病毒感染时，通过第二引 物对检测的α-干扰素的诱导水平比当它们用鼻病毒16和1B感染时低。 这表明，流感病毒下调α干扰素在上皮细胞中的诱导。
因此，在呼吸道病毒感染后，α-干扰素在上皮细胞中被表达、诱导但 是没有产生。
在本研究中，干扰素-β比通过所用的呼吸道病毒对IFNα.2α-干扰素 诱导得晚。
有趣地，干扰素-β在各种上皮细胞系中差异产生。在BEAS-2B细胞 中，它在鼻病毒感染后24小时产生，因此，在HBEC中，在未用鼻病毒 16和鼻病毒1B和流感病毒感染后它都不产生。
在8和24小时，在两种上皮细胞系中都诱导IL-29 mRNA。
在上皮细胞中，IFNα.1型α-干扰素的mRNA表达，但是不被诱导， 也不产生。在研究的上皮细胞系中，IFNα.2(其包含干扰素α-4)型干扰 素-α的mRNA受到各种鼻病毒的诱导，但是上皮细胞系没有产生干扰素 -α。
因此，在上皮细胞中，可以观察到1型和III型干扰素的动力学差异。 在鼻病毒16感染后的BEAS-2B细胞中，α-干扰素在8小时表达，然后下 降。而干扰素-β只在24小时达到峰值。在BEAS-2B细胞中，IL-29 mRNA 在8小时的时间点开始上升，并且在24小时的时间点变得甚至更高。
在鼻病毒16感染的HBEC中，α-干扰素在8小时上调，并且在24小 时的时间点保持相同。干扰素-β以及IL-29在24小时上调。
感染鼻病毒1B的HBEC具有相同的1型和III型干扰素表达的动力 学。它们在相同的时间点上调，这表明鼻病毒上调的动力学不依赖鼻病毒 类型，并且可能表明它们具有相同的诱导途径。
尽管与鼻病毒感染相比，流感病毒对1型和III型干扰素的诱导水平 更低，但是它具有几乎相同的动力学：α-干扰素也在8和24小时上升，β- 干扰素和IL-29在24小时达到峰值。这对于用鼻病毒感染获得的数据也 是不变的。
UV-数据
已经证明，α-干扰素在上皮细胞中表达。并且，它们中的一些受到各 种呼吸道病毒的诱导。但是在两种所研究的呼吸道上皮细胞培养物中，它 们没有生产。由于它们诱导数百种具有抗病毒特性的干扰素诱导基因，所 以α-干扰素是重要的抗病毒因子。一些上皮细胞系能够在特定的条件和刺 激下产生α-干扰素，但是似乎呼吸道上皮不能产生α-干扰素，或者呼吸 道病毒不是α-干扰素在呼吸道上皮细胞中生产的有力的诱导因素。并且似 乎在呼吸道病毒感染过程中α-干扰素最重要的生产者是类浆细胞树突细 胞(plasmacytoid dendritic cells)(Cella，M.，D.Jarrossay，F.Facchetti，O. Alebardi，H.Nakajima，A.Lanzavecchia，和M.Colonna.1999.Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon(类浆细胞单核细胞迁移到炎症淋巴结中并且产生大量的 I型干扰素).Nat.Med.(自然医学)5：919-923.)和巨噬细胞。
有趣地，β-干扰素在一些上皮细胞系如BEAS-2B中诱导和产生。
对于IL-29观察到相同的结果，但是这种III型干扰素的诱导比I型干 扰素的诱导更早，达到更高的水平并且更稳定。
实施例4：其它实验方法
我们在下文提供用于获得本文所述的数据的其它实验方法。
实验设计和技术概述
在RV16血清阴性哮喘症和正常受试者中诱导RV16试验性感染。基 线、急性感染和康复期(6周)血液、鼻、痰液和支气管肺泡取样用来研 究基线状态，疾病的急性阶段和持续的程度。召集17名正常的、非遗传 过敏性的和11名遗传过敏性的、轻度哮喘症成年人。通过问卷、皮肤刺 痛检测、血清IgE和肺功能检测包括组胺PC20，定义临床和遗传过敏性 状况。哮喘症组需要具有组胺PC20<8mg/ml，正常组>8mg/ml。排除服用 吸入的/口服的类固醇的个体。在开始研究之前，受试者没有普通感冒的 症状，持续6周。按照在先前的研究中开发的确定的流程，采集样品。这 些包括血液、鼻灌洗液(NL)和支气管肺泡灌洗液(BAL)。基线样品在感 染之前2周采集。在第0天接种后，志愿者在3、4和7天(感冒症状的 高峰期)参与，进行其它取样和肺功能检测。志愿者还从第0天(接种之 前)到第8天每日参与，并且在第11天获得NL，以确定病毒负荷。第三 组取样和肺功能检测在第6周进行。
用RV16试验性感染
试验性病毒感染的流程已经在先前的研究中描述(Bardin等，(1996) European Respiratory Journal(欧洲呼吸杂志)9，2250-2255；Fraenkel等， (1995)Am.J.Respir.& Crit.Care Med.(美国呼吸和危急护理医学杂志)15， 879-886；Bardin等，(1994)Clin Exp.Allergy(临床和试验性过敏)24， 457-464)。关于RV16接种物的制备和安全性检测的详情已经公布(Bardin 等(1996)如前所述)。在第0天，通过用DeVillbiss 286喷雾器进行鼻喷 雾，使用10000 TCID50RV16诱导试验性感染。将两份500μl(2500 TCID50) 的等分试样用于每个鼻孔。接种在临床日结束时在专门的临床室进行。受 试者避免患有呼吸道感染的个体，以在整个研究过程中将非-RV16感染的 危险减少到最小。感染通过将NL在HeLa细胞中培养RV或者通过阳性 血清学而证实。从NL和BAL细胞沉淀提取RNA，并且通过PCR分析 RV。Taqman PCR用于定量病毒RNA。包括备选的RV血清型的其它呼吸 道病毒的共同感染通过关于其它病毒的PCR和通过用RV16特异性抗血 清中和培养的鼻病毒而排除。
RV感染的病毒学证实的标准
成功的试验性RV16感染通过至少一种下述病毒学检测而证实：用于 来自上(鼻灌洗液)和/或下(诱导的痰液、支气管肺泡灌洗液)呼吸道 样品的RV的阳性标准物或Taqman RT-PCR；在接种后6周血清中针对 RV16的中和抗体升高至少4倍(在本研究中在基线血清阴性的受试者的 情形中，认为至少1：4的滴度是令人满意的)；在HeLa细胞中来自鼻灌 洗液的RV的阳性培养物，在病毒重复传代后，以获得通过滴定测定确定 的满意的浓度，通过豚鼠特异性RV16抗血清的中和作用，其对HeLa细 胞单层的清楚的RV细胞病变作用。在具有峰值Taqman RT-PCR病毒负荷 的那一天收集的鼻灌洗液上进行标准的小RNA病毒RT-PCR。接着进行 限制性酶分析，以证实阳性小RNA病毒的身份为RV而不是肠道病毒。 类似地，基于Taqman结果，使用来自峰值日的鼻灌洗液进行病毒培养。 临床数据收集
在初始筛选阶段过程中并且从基线，受试者每日记录感冒和胸部症状 得分，在基线支气管镜检前2周开始直到恢复期，在试验性RV16感染后 6周进行的恢复期的支气管镜检后2周完成。除了症状得分外，受试者记 录药物的时间和量，如所需要的吸入的支气管扩张药。肺功能通过两种方 法评估。首先，受试者使用便携式手持肺活量计在家进行肺活量检测，每 天两次，在刚刚睡醒的早上和在夜晚最后的事情时进行。其次，组胺PC20 检测用来评估在筛选时，在基线，在接种后第6天和在恢复期的支气管超 反应性。
用于症状得分/药物使用/肺活量测定记录的每日卡片
在感染前2周、感染过程中和感染后6周，通过问卷进行症状评估。 感冒得分是基于更早的普通感冒研究(Jackson等(1958)Arch Int Med(国 际医学档案)101：267-278)。症状(打喷嚏、头痛、不适、畏寒、流鼻涕、 鼻塞、嗓子痛、咳嗽、发烧)分为0-3个等级。临床感冒通过在6天内最 低累计得分14(>20＝重感冒)加上感冒或鼻漏的主观印象而定义。胸部 得分症状包括：睡醒时咳嗽；睡醒时喘鸣；白天咳嗽；白天喘鸣；白天呼 吸急促；夜晚咳嗽、喘鸣或呼吸急促。
临床症状得分的分析
为了促进临床数据的分析，将试验性感染流程分成独立的阶段。除了 计算关于个体症状的每日得分和总的感冒或胸部得分之外，计算2周的得 分，以允许统计学分析RV感染对症状的影响。由于在RV接种后大量症 状持续多达2周，所以决定检查2周的时期。基线前或筛选阶段是2周直 到基线阶段开始，恢复期前阶段是紧接在恢复期支气管镜检之前的2周。 这两个阶段都不包括支气管镜检。基线、急性感染和恢复期阶段都在2周 区间的第4天包括支气管镜检。为了检验RV16感染对症状的影响，通过 将在基线阶段过程中获得的得分从急性感染阶段的相对应日的得分中减 去，而计算每日和2周大量症状得分，以校正进行支气管镜检的作用，其 本身可以导致感冒和胸部症状，和肺功能的短期改变。
肺功能检测
按照BTS/ARTP指南(Anonymous.(1994).Guidelines for the measurement of respiratory function.Recommendations of the British Thoracic Society and the Association of Respiratory Technicians and Physiologists(关于测量呼吸道功能的指南。英国胸学协会和呼吸师和生 理学者协会的建议).Respiratory Medicine(呼吸医学)88：165-194)进行肺 功能检测。受试者早晚在家使用便携式肺活量计，microDL (MicroMedical)。使用Spida软件分析数据。在肺功能实验室中，并且对 于支气管扩张药的可逆性、痰液诱导和组胺激发，受试者使用Vitalograph Dry Wedge Bellows肺活量计。为了促进在试验性感染过程中对在2组中 的变化的比较，首先，对于每名受试者，在RV16接种后的日子里，计算 FEV1从在筛选阶段获得的平均数的％变化，并且其次，将这关于在相应 的基线日期中支气管镜检后观察到的变化进行校正。
组胺激发
按照ERS指南(Sterk等，(1993)Airway responsiveness.Standardized challenge testing with pharmacological，physical and sensitizing stimuli in adults(呼吸道反应性。在成年人中使用药物、物理和致敏刺激检测标准 化的激发).Report Working Party Standardization of Lung Function Tests， European Community for Steel and Coal(欧洲钢铁和煤委员会的肺功能检 测标准化工党报告).Official Statement of the European Respiratory Society (欧洲呼吸协会官方陈述).[综述]European Respiratory Journal(欧洲呼 吸杂志)-增刊16：53-83)使用2分钟潮式呼吸法进行组胺激发。支气管 超反应性在基线、在感染后第6天和在6周进行评估。
皮肤刺痛检测
通过针对普通空气源性变应原的皮肤刺痛检测而确定遗传性过敏症， 所述普通空气源性变应原：草粉；房尘螨；猫的毛屑；狗的毛发；烟曲霉 (aspergillus fumigatus)；多主枝孢(cladosporium herbarum)；链格孢 (alternaria alternata)；白桦树(silver birch)；3trees；荨麻粉。包括阳性 组胺/阴性稀释剂对照。1例阳性反应(比阴性对照大3mm的疱疹)认为 是遗传性过敏症的诊断。
鼻灌洗
进行NL：关于RV病毒负荷的标准物和Taqman RT-PCR；以通过对 HeLa细胞培养物的影响证实感染。使用软塑料移液器，将2.5ml无菌普 通盐水滴注到每个鼻孔中。将灌洗液收集到无菌培养皿中，匀浆，然后等 分保存在-80℃。
外周血分析
将50ml血液收集在肝素化的管中，用PBS1：1稀释，然后层铺在淋 巴制备物上。在2500rpm离心30分钟后，将单核细胞转移到单一聚丙烯 管中，并且在RPMI-1640 10％FCS中清洗。将细胞混悬液1：10稀释在 0.1％锥虫蓝中，用于通过血细胞计数器计数并且评估存活能力。将细胞以 需要的细胞密度重悬在适当的培养基中用于后续实验。
血清分离
将10ml血液收集在无色真空容器管(plain vacutainer tube)中，在37 ℃放置4小时进行凝结，然后在2000rpm离心15分钟。将血清等分，保 存在-80℃，用于存在RV16中和抗体的后续分析。
支气管镜检
在圣玛丽医院(St Marys Hospital)内窥镜检查单位，按照BTS指南 (British Thoracic society Bronchoscopy Guidelines Committee(英国胸学学 会支气管镜检指导委员会).2001.British Thoracic Society guidelines on diagnostic flexible bromnchoscopy(英国胸学学会关于诊断性灵活支气管镜 检的指南).Thorax 56：i1-i21)进行支气管镜检。受试者由单独的医生或 护士监测。在支气管镜检之前和之后记录FEV1。Keymed P100支气管镜 与有孔镊子(Keymed FB-19C-1)和3mm有套刷子(sheathed brushes) (Keymed BC-16C)一起使用。通过将无菌普通盐水(室温)以8×30ml等 分试样10秒的停留时间，滴注到右中叶支气管中，进行BAL，目的是80％ 复苏。在基线和6周时，BAL从中段右中叶获得，在第4天从侧段获得， 以将先前BAL的作用最小化。将BAL收集在单一塑料室中，并且立即转 移到置于冰上的聚丙烯管中运输到实验室。
RV16血清学
在96孔板中，使用HeLa细胞单层，在筛选时、基线、第0天和感 染后6周，通过关于针对RV16的中和抗体的微量中和检测而进行RV16 血清学。从1:2到1:128制备血清(50μl)的双重稀释液。加入50μl含有 100TCID50的稀释的病毒储液，并且将板在室温下摇动1小时。加入100μl 新鲜剥离的HeLa细胞2x105个细胞/ml，并且将板在37℃温育。包括血清 (细胞+血清以1:2稀释)，细胞(细胞，无血清，无病毒)和病毒(细胞，无 血清，病毒储液)对照。在2-3天后读取细胞病变作用(CPE)。抗体滴度定 义为完全中和病毒CPE的最大血清稀释。血清转变在血清反应阴性的受 试者中定义为1：4或更大的RV16中和抗体的恢复期滴度。
来自临床样品的病毒培养物
RV在鼻灌洗液中的存在通过培养而确定。这首先在37℃进行，如果 是阴性的，在33℃重复。通过将样品加入到含有抗生素的小体积的培养 基中，并且在T25烧瓶中覆盖半汇合的HeLa细胞，在室温下摇动1小时， 然后加入额外的培养基并且观察CPE来培养病毒。如果在第5天没有细 胞通过2个冷冻/解冻循环而裂解，那么将透明的上清加入到新鲜HeLa 细胞中。如果在5次传代后，没有观察到CPE，那么认为不存在病毒。由 于RV16参与使用RV16特异性血清(ATCC-滴度1:600)的微量中和测定， 所以证实培养的病毒。在培养物上清中的RV滴度通过滴定测定而估计。 然后，在96孔板中，将50μl含有100TCID50的病毒的稀释的上清加入到 等体积的培养基中，所述培养基含有从1：20到1：1280的特异性RV16 抗血清的2-倍连续稀释液。所述测定包括阳性(RV16储液)和细胞(无 病毒)对照。
从保存的临床样品提取RNA和使用随机六聚体引物的反转录
使用QIAamp病毒RNA小量试剂盒(Qiagen)从样品中提取RNA，并 且使用omniscript RT试剂盒(Qiagen)和随机六聚体引物，按照供应商的使 用说明，进行反转录。
关于小RNA病毒的标准PCR
RV RT-PCR从通过使用随机六聚体引物的RT产生的cDNA而进行。 使用公布的方法(Johnston等(1993)Journal of Clinical Microbiology(临床 微生物学杂志)31：111-117)，使用OL26/OL27引物对，应用Perkin Elmer 9600 GeneAmp PCR系统进行PCR。产生的380bp的小RNA病毒特异性 扩增子在2％琼脂糖凝胶上电泳后通过溴化乙锭染色而显现，并且通过偏 振照相机拍照。通过使用Bgl I限制性消化而将RV扩增子从肠道病毒的 那些中区分出来(Papadopoulos等(1999)Journal of Virological Methods(病 毒学方法杂志)80：179-185)。
用于其它呼吸道病毒的PCR
除RV之外的呼吸道病毒的存在通过用于下列各项的PCR而排除：支 原体(Mycoplasma)和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，腺病毒，呼 吸道合胞病毒，流感病毒AH1/AH3/B，副流感病毒1-3，冠状病毒229E 和OC43。用于这些PCR的cDNA通过随机六聚体RT而产生。用于这些 其它PCR的方法是先前公布的(Seemungal等(2001)American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine(美国呼吸和危急护理医学杂志) 164：1618-1623)。
用于小RNA病毒的Taqman RT-PCR
Taqman RT-PCR用来检测在取样后未经处理而保存在-80℃的NL和 BAL中的小RNA病毒。使用QIAamp病毒RNA小量试剂盒(Qiagen)从样 品中提取RNA，并且使用omniscript RT试剂盒(Qiagen)和随机六聚体引 物，按照供应商的用法说明，进行反转录。使用AmplitaqGold DNA聚合 酶，小RNA病毒特异性引物对(正向寡聚物5′-GTG AAG AGC CSC RTG TGC T-3′，反向寡聚物5′-GCT SCA GGG TTA AGG TTA GCC-3′)和 FAM/TAMRA标记的小RNA病毒探针(FAM-TGA GTC CTC CGG CCC CTG AAT G-TAMRA)，应用PE生物系统ABI Prism 7700序列检测系统， 进行PCR。
主要的混合物由Qiagen quantitect探针混合物，正向引物(50nM)反向 引物(300nM)，探针(100nM)和RNA酶抑制剂组成。在96孔Taqman板的 每个管中，向2μl cDNA中加入23μl PCR主要的混合物。使用PE生物 系统ABI Prism 7700序列检测系统进行热循环和荧光PCR产物的检测。 所用的热循环条件为：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；然后45个循环x95℃ 15秒/55℃ 20秒/72℃ 40秒。Taqman RT-PCR方法已经由Viropharma 的合作者最优化(Pevear等(1999)Antimicrobial Agents & Chemotherapy (抗微生物剂和化学治疗)43：2109-2115)。为每个循环收集荧光数据，并 且确定荧光升高高于阈值的循环数(Ct)。包括阴性提取物(水)，阴性PCR (只有模板)和阳性提取物(RV16储液)。通过在Taqman板管中包含从 108到100拷贝/2μl连续10倍稀释的2μl RV质粒，而生成标准曲线。在 PCR后，每个质粒产生1个拷贝的dsDNA。通过参考标准曲线，并且考 虑在加工成RNA和cDNA中固有的稀释因素和由每个拷贝的dsDNA质 粒产生的“双倍荧光”，而将每份样品的结果表示为关于NL和BAL的拷 贝/ml。
统计学分析
在受试者内比较症状得分、肺功能、PC20值、病毒负荷、细胞因子和 趋化因子浓度和白细胞数目，以确定在基线和急性感冒之间诱导的差别， 和到恢复期变化的持续时间。使用Wilcoxon′s检验分析受试者内部的差 别。在研究的每个阶段使用Mann Whitney′s检验，分析正常和哮喘症组之 间的差别。使用Spearman′s排列校正检验在临床疾病严重性、病毒负荷、 白细胞计数和细胞因子/趋化因子浓度之间的相互关系，以研究关于调节 哮喘中的改变的反应的这些因子的可能的因果关系。
BAL离体培养
在收集用于细胞因子生产的上清和用于RNA的细胞之前，将来自在 试验性感染前在基线进行的支气管镜检的BAL细胞在聚丙烯管中离体培 养48小时，培养条件包括下述：只有培养基，培养基+RV16 5MOI，培 养基+RV16过滤对照，培养基+LPS 0.1μg/ml，培养基+PHA 1μg/ml，培 养基+变应原5000 ISQ。在收集时，在1500rpm离心10分钟之前，将 细胞简短振荡。将上清等分并且保存在-80℃，用于通过ELISA的后续分 析。在保存在-80℃之前，加入1ml trizol以将细胞裂解，以用于通过 RT-PCR的后续分析。
实施例5：IFNλ蛋白水平与感染的临床指征之间的关联
进一步研究在IFNλ蛋白水平和呼吸道感染的临床指征之间的关联。 数据在图22中显示。所用的方法在上述实施例4中概括。
图22显示在用鼻病毒离体刺激的支气管肺泡细胞上清中的IFNλ水 平。
图22(a)显示IFNλ蛋白在来自正常和哮喘症受试者的离体RV-刺激的 支气管肺泡细胞的上清中的定量。从这一数据清楚地看出，与从非哮喘症 受试者分离的细胞相比，从哮喘症受试者分离的细胞产生低得多的量的 IFNλ蛋白。因此，当感染RV时，来自哮喘症受试者的支气管肺泡细胞 不能产生与来自正常受试者的支气管肺泡细胞同样多的IFNλ蛋白。
图22(b)显示在感染RV的患者的IFNλ蛋白水平和在体内感染鼻病毒 2周后的患者的“感冒得分”之间的关系。“感冒得分”是呼吸道病毒感 染的严重性的临床测量，如在实施例5中所讨论。清楚看出，具有更低IFNλ 蛋白水平的患者具有比具有更多IFNλ蛋白的患者更高的“感冒得分”。因 此，所述数据表明IFNλ蛋白水平和呼吸道病毒感染的临床指征的严重性 之间的相关性。因此，IFNλ蛋白可以用于治疗呼吸道疾病。
图22(c)显示在感染RV的患者中的肺功能(使用FEV1值测量)和IFNλ 蛋白水平之间的关系。清楚看出，在患者中FEV1减少和IFNλ蛋白的水 平之间存在相关性。因此，当感染鼻病毒2周后，在基线具有更低IFNλ 产量的患者患有更严重的呼吸道阻塞，因此IFNλ可以用于减少哮喘恶化 的严重性。
图22(d)显示在体内感染鼻病毒过程中采集的BAL细胞(因此更低的 呼吸道病毒负荷)中的RV16 RNA的量，其与在基线体内感染前2周在 基线采集的BAL细胞中的IFNλ蛋白产量相关。此外，在RV16 RNA水 平和IFNλ蛋白水平的量之间存在相关性：IFNλ蛋白越多，越少RV16 RNA 存在。因此，IFNλ可以用来减少下呼吸道中的病毒负荷，由此预防/减轻 病毒诱导的哮喘恶化。
在图22中显示的数据提供在λ生产和病毒负荷、肺功能和结果的其 它临床指征之间的相关性。这一数据清楚表明IFNλ在保护病毒诱导的恶 化中的重要的生物作用。
I型干扰素是一种最相关的糖蛋白家族，其包括13种IFN-α亚型以及 IFN-β，IFN-κ，IFN-τ和IFN-ω。不同的人IFN-α亚型已经通过分析人cDNA 文库和通过对由刺激的类淋巴母细胞细胞产生的IFNs的蛋白质分析而鉴 定；它们异质性的原因尚不清楚。早期的研究表明所有的亚型结合相同的 受体，从中推论认为它们一定激发相同的应答。后来，纯化的和重组的亚 型的比较研究揭示了许多抗病毒、抗增殖和免疫调节反应。
存在一种II型干扰素INF-γ，其结合不同的受体，并且具有与1型IFNs 在很大程度上不同的功能。
I型干扰素是对呼吸道病毒感染的内在免疫应答的非常重要的成分。 保护方法包括干扰素-β的初始释放，其然后刺激干扰素-β和各种干扰素-α 在通过1型干扰素受体介导的级联中的进一步释放。
各种干扰素-λ是3种最近发现的紧密相关的蛋白(Kotenko S.V.等， Nature Immunology(自然免疫学)2003；卷4，69-77；Sheppard P等，Nature Immunology(自然免疫学)2003；卷4，63-88)。干扰素λ-1还已知为IL-29， 而干扰素λ-2和3已知为IL-28a/b。这些干扰素结合与I型或II型干扰素 的那些不同的第三种受体。因此，现在它们叫作III型干扰素。这些干扰 素已经在体外细胞研究中表现出抗病毒活性(参见，例如，Zymogenetics 公司的WO 2004/037995)。然而，先前并没有确定它们在人类中保护抗任 何天然呼吸道病毒感染的用途。
在这种联系中值得注意的是，尽管它先前报道的抗病毒活性，已经证 明IFN-β-ser在预防自然感冒的试验中无效(Sperber等，J.Infect.Dis(传 染病杂志)(1989)160，700-705)。这可能是由于正常细胞应答鼻病毒感染 产生IFN-β的先天能力。同等地，从使用表现出抗病毒活性的IFN-λ的体 外研究不可能外推出同样的干扰素类型将具有抗体内天然呼吸道病毒感 染的任何治疗价值。
有趣地，关于由人哮喘症支气管上皮细胞应答鼻病毒感染生产干扰素 的研究最先表明，与来自健康对照的RV-感染的支气管上皮细胞相比，这 样的细胞在保持对早期细胞程序性死亡和增加的病毒体生产中观察到的 抗性中具有不足的I型干扰素反应。此外，表明向培养物中的RV-感染的 哮喘症支气管上皮细胞中提供IFN-β引起传染性病毒体生产的显著减少。 这些结果为提议IFN-β在治疗鼻病毒-诱导的哮喘恶化中的新的治疗用途 建立了基础(Wark等J.Exp.Med.(实验医学杂志)(2005年3月21日)201， 937-947)。
进一步的结果已经表明IFN-β用途的外推同等地用于治疗RV-诱导的 COPD的恶化，其包括一定范围的病况，包括慢性支气管炎和肺气肿。 COPD是进展性的呼吸道疾病，其特征在于逐渐失去肺功能。COPD的症 状包括慢性咳嗽和痰液产生以及呼吸急促。吸烟是COPD的最普遍的起 因。
现在已经确定IFN-λ多肽是由呼吸道病毒感染包括鼻病毒(最常见的) 和呼吸道合胞病毒(RSV)在人细胞中强烈诱导的。实施例4和附图23 到26举例说明在支气管上皮细胞中的这样的诱导。此外，各种干扰素-λ 诱导β，并且β也诱导λ。
通过分析来自哮喘症和正常志愿者患者的支气管上皮细胞和支气管 肺泡灌洗细胞，现在还表明，当感染鼻病毒时，哮喘症支气管上皮细胞另 外缺失IFN-λ基因表达和蛋白质生产。这样的发现在本发明之前先前没有 表示或者考虑，并且导致这样的提议，即，施用一种或多种IFN-λ多肽还 将为病毒诱导的哮喘恶化的治疗贡献有效的治疗。
此外，表明，同等地，IFN-λ多肽可以有益于其它呼吸道疾病诸如 COPD的病毒诱导的恶化的治疗。“呼吸道疾病”，除了哮喘和COPD之外， 我们包括变应性支气管肺曲霉病，嗜酸细胞性肺炎，变应性支气管炎支气 管扩张，职业性哮喘，反应性呼吸道疾病综合征(recative airayd syndrome)， 间隙性肺病(intersitial lung disease)，嗜酸细胞过多综合征 (hyperosinophilic syndrome)和寄生虫肺病。
发明概述
在一个方面，本发明因此提供治疗患有或者处于病毒诱导的呼吸道疾 病的恶化的危险中的患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的一 种或多种IFN-λ多肽，优选地通过呼吸道递送。如上文显示，这样的治疗 性治疗是特别令人感兴趣的，例如，在减轻或者预防病毒诱导的哮喘恶化、 最常见的RV-诱导的哮喘恶化、以及例如由RSV或流感病毒引起的这样 的恶化的问题中。一种或多种IFN-λ多肽的施用可以直接以多肽或者通过 从一种或多种多核苷酸表达而进行。
本发明还提供选自下列各项的试剂在制备施用以治疗病毒诱导的呼 吸道疾病恶化的药物中的应用：
(a)一种或多种IFN-λ多肽或
(b)能够在靶支气管上皮细胞中表达一种或多种IFN-λ多肽的一种或 多种多核苷酸，
优选地通过呼吸道递送所述药物，例如，通过使用气雾剂喷雾器递送。 治疗的个体可以是任何动物，但是优选地治疗的个体是人，例如，优选地 是患哮喘症的人。
在另一个方面，本发明还提供含有药物组合物的装置，所述药物组合 物包含治疗剂，其为(i)一种或多种IFN-λ多肽或(ii)如上文所述能够表达 一种或多种IFN-λ多肽的一种或多种多核苷酸，所述装置适用于呼吸道递 送所述组合物。这样的组合物可以通过同时、分开或顺序的施用而补充用 于治疗呼吸道疾病的其它治疗剂。因此，所述其它的治疗剂可以配制成提 供单一的组合物或者以分开的组合物提供。适用于这样的施用方案的产品 构成本发明的另一个方面。
作为一个优选的实施方案，提供用于治疗病毒诱导的哮喘恶化的产 品，其包括同时、分开或顺序的呼吸道施用(a)至少一种IFN-λ多肽或能 够在要靶向的支气管上皮细胞中表达至少一种IFN-λ多肽的多核苷酸和(b) 吸入的皮质甾类。
作为本文报道的研究结果，还假定IFN-λ多肽可以有益于变应性疾病 如哮喘，不依赖于任何病毒性恶化。充分确定哮喘的流行逐渐增加，因为 变应性疾病的流行也普遍增加。这种流行的增加已经表明与传染病的不存 在有关，原因在于在生命的早期高度暴露于传染病的那些人在以后的生命 中有非常低的患有哮喘和变态反应的危险。推论认为各种IFN-λ和IFN-β 都可以通过模拟感染的保护作用而用作预防性治疗。
认为变应性疾病，包括哮喘、鼻炎、湿疹、食物过敏和过敏反应与减 弱的TH1免疫应答有关，减弱的TH1免疫应答本身是减弱的I型干扰素 反应的结果，它们二者都是在生命早期没有充分暴露于传染病的结果。本 文所述的数据表明，在生命的早期施用各种IFN-λ可以模拟传染病的保护 作用，促进I型干扰素和TH1免疫应答，并且预防TH2推动的变应性疾 病的发展。这种预防性治疗可以在生命的早期施加，但是各种IFN-λ也可 以在生命的后期施用，以治疗/治愈变应性疾病，换言之，以逆转TH2推 动的致敏作用和对过敏原的免疫应答。
发明详述
如上文所示，然而，现在所述的IFN-λ多肽的优选的应用是减轻或者 预防病毒诱导的哮喘恶化，特别是在人中。这样的病毒诱导的恶化应该最 普遍地是RV感染的结果。然而，本发明相等地适用于由其它病毒感染包 括RSV感染和流感感染引起的哮喘恶化。
诊断患者是否患有或者正受呼吸道疾病的折磨的方法是本领域内公 知的。例如，关于诊断哮喘症的指导由哮喘的全球提案(Global Initiative for Asthma，GINA)作为题目为“Pocket guide for asthma prevention and management(哮喘预防和管理的便携指南)”的公布的部分提供，其可从 www.ginasthma.com获得。类似地，关于诊断COPD的指导由阻塞性肺病 的全球提案(Global Initiative for Obstructive Lung Disease，GOLD)作为 题目为“Pocket guide to COPD diagnosis，management and prevention：a guide for heath care professionals(COPD诊断、管理和预防的便携指南： 健康护理专家的指导)”的公布内容的部分提供，其可从www. goldcopd.com获得。来自这两个文献的相关摘录在后附的实施例中提供。
本发明的方法可以包括施用一种IFNλ多肽，或者可以给患者施用 IFNλ-1和IFNλ-2的混合物，或IFNλ-1和IFNλ-3的混合物，或IFNλ-2和 IFNλ-3的混合物，或IFNλ-1、IFNλ-2和IFNλ-3的混合物。
所谓“IFNλ多肽”我们包括在GenBank登记号Q8IU54，Q8IZJ0，Q8IZI9 中公开的那些多肽，并且列出如下：
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(IFNλ-1)
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(IFNλ-2)
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(IFNλ-3)
“IFNλ多肽”包括任何全长的天然存在的IFNλ多肽或其片段，或其 任何变体。
IFNλ多肽的“片段”或“变体”是具有与IFNλ多肽基本上相同或更 多的生物活性的那些，以用作本发明的方法中的治疗剂。这样的变体和片 段将有用地包含至少一个至少有5个连续的氨基酸的区域，其与所述多肽 的最相同的5个或多个连续氨基酸区域具有至少90％的同源性。片段小于 完整多肽的100％。
IFNλ多肽的“片段”或“变体”的生物活性可以通过，例如，测量 这样的多肽在支气管上皮细胞中抗RV感染的抗病毒活性而确定，如在下 述实施例1中所述。通过“基本上相同或更多”我们包括IFNλ多肽的“片 段”或“变体”具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％或更多的 IFNλ多肽的生物活性的情形。
本领域的那些技术人员应该意识到，所述IFNλ多肽可以通过已知的 多肽修饰技术进行修饰。这些包括在于1981年11月24日授予Stevens 的美国专利号4,302,386中公开的技术，所述专利通过引用结合于此。这 样的修饰可以增强用作治疗剂的生物活性。例如，可以改变一些氨基酸残 基。不需要的序列可以通过本领域公知的技术去除。例如，所述序列可以 通过使用酶诸如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或相关的蛋白水解酶的有限的蛋 白水解消化而去除。
因此，用于本发明的方法中的IFNλ多肽包括修饰的多肽，其包括合 成来源的多肽或原始多肽的片段。
所述IFNλ多肽可以从许多不同的来源制备。例如，重组的IFNλ多肽 可以使用许多不同的表达系统(原核的或真核的)在细胞中表达和分离， 任选地具有蛋白标记。重组的IFNλ多肽可以分泌到上清中，并且然后可 以从上清中纯化所述重组的多肽。
重组多肽可以从细胞中表达和纯化的方法是本领域公知的，并且是可 以由技术人员进行的常规技术。例如，这样的方法在例如Sambrook等， Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，2001.第 3版中公开和提供。
通常，编码需要的IFNλ多肽的DNA在适当的微生物宿主细胞中表 达。因此，编码IFNλ多肽的DNA可以按照已知的技术使用，根据本文 包含的教导适当的修饰，以构建表达载体，然后将其用于转化适当的宿主 细胞，用来表达和生产IFNλ多肽。这样的技术包括在下列各项中公开的 那些：于1984年4月3日授予Rutter等的美国专利号4,440,859，于1985 年7月23日授予Weissman的4,530,901，于1986年4月15日授予Crowl 的4,582,800，于1987年6月30日授予Mark等的4,677,063，于1987年 7月7日授予Goeddel的4,678,751，于1987年11月3日授予Itakura等 的4,704,362，于1987年12月1日授予Murray的4,710,463，于1988年 7月12日授予Toole，Jr.等的4,757,006，于1988年8月23日授予Goeddel 等的4,766,075，和于1989年3月7日授予Stalker的4,810,648，所有这 些通过引用结合于此。
编码IFNλ多肽的DNA可以连接到宽泛种类的其它DNA序列上，以 引入适当的宿主中。伴随DNA取决于宿主的性质，将DNA引入到宿主 中的方式，以及是否需要保持游离性或整合。
通常，将所述DNA以适当的方向和正确的表达阅读框插入到表达载 体中，诸如质粒中。如果需要，所述DNA可以连接到由需要的宿主识别 的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列上，尽管这样的控制通常可以在 所述表达载体中获得。因此，DNA插入物可以可操作地连接到适当的启 动子上。细菌启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacI和lacZ启动子，T3和 T7启动子，gpt启动子，噬菌体λPR和PL启动子，phoA启动子和trp 启动子。真核启动子包括CMV即时早期启动子，HSV胸苷激酶启动子， 早期和晚期SV40启动子和反转录病毒LTRs的启动子。其它适当的启动 子是技术人员已知的。所述表达构建体还将理想地包含转录起始和终止的 位点，并且在转录的区域包含用于翻译的核糖体结合位点。(Hastings等， 国际专利号WO 98/16643，于1998年4月23日公布)。
然后将所述载体通过标准的技术引入到宿主中。通常，并不是所有的 宿主都将被所述载体转化，因此需要选择转化了的宿主细胞。一种选择技 术包括在包含任何需要的控制元件的表达载体中结合DNA序列标记，其 在转化的细胞中编码可选择的特点。这些标记包括用于真核细胞培养的二 氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中 培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。所述选择标记还可以是 补充宿主的营养缺陷型的那些。备选地，关于这样的可选择特点的基因可 以是另一种载体，其用于共同转化需要的宿主细胞。
然后，将已经转化了编码IFNλ多肽的DNA的宿主细胞培养足够的 时间，并且依据本文公开的教导在本领域的技术人员已知的适当的条件下 培养，以允许干扰素多肽的表达。
许多微生物表达系统是已知的，包括应用下列各项的系统：例如，用 重组噬菌体、质粒或粘端质粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆 菌和枯草芽胞杆菌(B.subtilis))；例如，用酵母表达载体转化的酵母(例 如，酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))；例如，用病毒表达载体(例如， 杆状病毒)转化的昆虫细胞系统。
所述载体可以包括原核复制子，诸如Col E1 ori，用于在原核生物中 增殖。所述载体还可以包含适当的启动子，诸如能够指导所述基因在用其 转化的细菌宿主细胞如大肠杆菌中表达(转录)的原核启动子，和翻译起 始序列，诸如通常与启动子序列相邻的SD共有核糖体结合序列，其形成 获得的转录体的一部分，并且由其可以开始克隆的基因转录体的翻译。
启动子是由允许RNA聚合酶结合和转录发生的DNA序列形成的表 达控制元件。在包含用于插入本发明的DNA片段的便利的限制性位点的 质粒载体中典型地提供与代表性细菌宿主相容的启动子序列。
典型的原核载体质粒为：可从Biorad实验室(Richmond，CA，美国)获 得的pUC18，pUC19，pBR322和pBR329；可从法玛西亚(Pharmacia) (Piscataway，NJ，美国)获得的pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540和 pRIT5；可从Stratagene克隆系统(Stratagene Cloning Systems)(La Jolla，CA 92037，美国)获得的pBS载体，噬菌体形式(Phagescript)载体，Bluescript 载体，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A。优选的原核载体质粒包括 pET26b(Novagen，Nottingham，英国)。
有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，并且通常可从 Stratagene克隆系统(La Jolla，CA 92037，美国)获得。质粒pRS403，pRS404， pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIps)，并且结合酵母选择标记HIS3， TRP1，LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCps)。
本领域的技术人员公知的方法可以用来构建包含所述编码序列和例 如，适当的转录或翻译控制的表达载体。一种这样的方法包括通过均聚物 尾连接。将均聚物聚dA(或聚dC)尾添加到DNA片段的暴露的3′OH基 团上，以通过末端脱氧核苷酸转移酶克隆。然后，所述片段能够与添加到 线性质粒载体的末端的聚dT(或聚dG)尾退火。退火后留下的缺口可以 通过DNA聚合酶填补，并且游离末端通过DNA连接酶连接。
另一种方法包括通过黏性末端连接。相容的黏性末端可以通过适当的 限制性酶的作用而在DNA片段和载体上产生。这些末端将通过互补碱基 配对迅速退火，并且残留的缺口可以通过DNA连接酶的作用闭合。
另一种方法使用叫作接头和衔接头的合成分子。具有平端的DNA片 段通过噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I产生，所述聚合 酶去除突出的3′端并且填补凹进的3′端。合成的接头，包含确定的限制性 酶的识别序列的平端双链DNA片段，可以通过T4 DNA连接酶连接到平 端DNA片段上。然后，将它们用适当的限制性酶消化，以产生黏端，并 且连接到具有相容的末端的表达载体上。衔接头还是化学合成的DNA片 段，其包含一个用于连接的平端，但是其还具有一个预先形成的黏端。
含有各种限制性核酸内切酶位点的合成的接头是可以从许多来源商 购的，包括美国CN纽黑文(New Haven)的国际生物技术公司 (International Biotechnologies Inc)。
修饰编码IFNλ多肽的DNA的理想的方法是应用由Saiki等(1988) Science(科学)249，487-491公开的聚合酶链式反应。在这种方法中，待 酶促扩增的DNA通过两种特异的寡核苷酸引物侧连，所述引物本身结合 到扩增的DNA中。所述特异的引物可以包含限制性核酸内切酶识别位点， 其可以用于使用本领域已知的方法克隆到表达载体中。
因此，上文概括的方法可以用来制备用于制备IFNλ多肽的微生物表 达系统。
所述IFNλ多肽可以使用许多不同的公知方法从微生物表达系统回 收，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、 磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、凝集素 层析、染料-配体层析和反相高效液相色谱(＂HPLC＂)。
这样的方法可以包括裂解微生物宿主细胞的步骤(除非所述表达系统 指导所述IFNλ多肽从细胞分泌出来)。
备选地，IFN-λ多肽可以通过由Lu等(1981)J.Org.Chem(有机化学 杂志)46，3433及其中的参考文献公开的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式 合成。临时的N-氨基保护由9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团提供。这种高 度碱性-易分解的保护基团的重复性裂解通过使用在N，N-二甲基甲酰胺 的20％的哌啶而实现。侧链官能度可以被保护为它们的丁醚(在丝氨酸苏 氨酸和酪氨酸的情形中)、丁酯(在谷氨酸和天冬氨酸的情形中)、丁氧基 羰基衍生物(在赖氨酸和组氨酸的情形中)、三苯甲基衍生物(在半胱氨 酸的情形中)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰衍生物(在精氨酸的情形中)。 在谷氨酰胺或天冬酰胺是C端残基的情形中，利用4，4′-二甲氧基二苯甲 基基团保护侧链氨基官能度。固相支持物是基于聚二甲基-丙烯酰胺聚合 物，其由三种单体：二甲基丙烯酰胺(主链单体)、双丙烯酰乙烯二胺(交 联接头)和丙烯酰肌氨酸甲酯(官能化剂)组成。所用的肽-与-树脂可分 裂的连接剂是酸-易分解的的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺 和谷氨酰胺以外，所有的氨基酸衍生物以它们预先形成的对称的酐衍生物 添加，天冬酰胺和谷氨酰胺使用反向N，N-二环己基-碳二亚胺/1-羟基苯 并三唑介导的偶联方法添加。所有的偶联和去保护反应都使用茚三酮、三 硝基苯磺酸或isotin检测方法进行监测。当合成完成时，通过用含有50％ 的清除剂混合物的95％的三氟乙酸处理，伴随着侧链保护基团的去除而将 肽从树脂支持物上裂解下来。通常所用的清除剂是乙二硫醇、苯酚、苯甲 醚和水，正确的选择取决于合成的肽的组成氨基酸。三氟乙酸通过在真空 中蒸发而去除，随后用二乙醚研碎，提供粗肽。任何存在的清除剂通过简 单的萃取方法而去除，其在水相冻干后中提供不含清除剂的粗肽。用于肽 合成的试剂通常可从英国诺丁汉NG7 2QJ的Calbiochem-Novabiochem(英 国)有限公司获得。纯化可以通过任何一种或下列技术的组合而实现：诸 如大小排阻层析、离子交换层析和(主要地)反相高效液相色谱。肽的分 析可以使用薄层层析、反相高效液相色谱、在酸水解后的氨基酸分析和通 过快原子轰击(FAB)质谱分析而进行。
如上文所示，一种或多种IFNλ多肽可以直接或者通过从一种或多种 多核苷酸表达而施用。这样的多核苷酸可以优选地以能够指导IFNλ在支 气管上皮细胞中表达的载体的形式存在。这样的表达载体可以是常规考虑 用于基因治疗的任何类型。它们可以是作为裸DNA或与一种或多种阳离 子两亲性分子例如一种或多种阳离子脂质，例如以DNA/脂质体形式复合 进行施用的质粒表达载体。备选地可以使用病毒载体。先前已经描述了用 于在人肺部呼吸道中表达治疗蛋白的载体。例如，公布的国际申请WO 01/91800(Isis innovation Limied)描述了包含人泛蛋白C启动子的这样目 的的表达载体。用于指导转基因在呼吸道上皮中表达的表达载体的实例还 在Chow等，Proc，Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)(1997)94， 14695-14700中描述。
IFN-λ多肽可以与一种或多种可接受的载体一起配制，以提供用于治 疗用途的药物组合物。在与化合物相容并且对其受体无害的意义上，所述 载体必须是“可接受的”。这样的载体是制药领域公知的。为了按照本发 明治疗病毒诱导的呼吸道疾病恶化的目的，特别优选地配制所述IFNλ多 肽用于呼吸道施用。
对于这样的施用，所述IFNλ多肽便利地以从使用适当的推进剂如二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟-乙烷、氢氟烷如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)、二氧化碳或其它适合的气 体的加压容器、泵、雾化器或喷雾器喷出的气雾剂喷雾的形式递送。在加 压气雾剂的情形中，剂型可以通过提供阀而确定，以递送计量的量。加压 的容器、泵、雾化器或喷雾器可以包含活性化合物的溶液或混悬液，例如， 使用乙醇和推进剂作为溶剂的混合物，其可以另外包含润滑剂，例如三油 酸山梨坦。所述制剂还可以使用超声喷雾技术递送。
因此，如上文所示，在本发明的另一个方面，提供包含含有治疗剂的 药物组合物并且适用于呼吸道递送所述组合物的装置，所述治疗剂是(i) 一种或多种IFN-λ多肽或(ii)一种或多种能够表达上文讨论的一种或多种 IFN-λ多肽的多核苷酸。这样的组合物可以以同时、分开或顺序施用的方 式补充用于治疗呼吸道疾病的其它治疗剂。因此，所述其它治疗剂可以配 制成提供单一组合物或者以分开的组合物提供。适用于这样的施用方案的 产品构成本发明的另一个方面。
因此，先前已经提及上述产品用于治疗病毒诱导的哮喘恶化，其包括 同时、分开或顺序施用下列各项：(a)至少一种IFN-λ多肽或能够在要靶 向的支气管上皮细胞中表达至少一种IFN-λ多肽的多核苷酸和(b)吸入的 皮质甾类，诸如例如氟替卡松、倍氯米松(beclomethasone)和布地奈德。 这样的产品可以以适用于气雾剂递送到呼吸道的单一药物组合物的形式 存在。
应该理解，使用气雾剂的全部每日剂量将随患者和患者而不同，并且 可以以单一剂量或以一天内分开的剂量进行施用。
被施用用于本发明的方法的IFNλ多肽可以衍生以改善所述多肽的药 物代谢动力学或免疫原性特征。例如，IFN-λ多肽可以是PEG化的和/或 缀合到白蛋白或其它物质上，以增加所述IFN-λ多肽的稳定性。
PEG化是本领域的技术人员公知的方法，其中多肽或拟肽 (peptidomimetic)化合物被修饰，以致一个或多个聚乙二醇(PEG)分子共 价附着到一个或多个氨基酸或其衍生物的侧链上。它是一种最重要的分子 改变结构化学技术(MASC)。可以使用其它MASC技术；这样的技术可以 改善所述分子的药效特征，例如延长它的体内半衰期。PEG-蛋白缀合物 通过首先活化PEG部分，以致它将与本发明的蛋白质或拟肽化合物反应 和偶联而形成。PEG部分在分子量和构象上有相当大的变化，早期部分(单 官能PEGs；mPEGs)是线性的，具有12kDa或更少的分子量，并且晚期 部分具有增加的分子量。PEG2，PEG技术的最近的新技术，包括将30kDa (或更少的)mPEG偶联到赖氨酸氨基酸上(尽管PEG化可以延长以将PEG 添加到其它氨基酸上)，其进一步反应以形成如同具有大得多的分子量的 线性mPEG作用的支链结构(Kozlowski等，(2001)，Biodrugs(生物药物) 15，419-429)。在Roberts等，(2002)Adv.Drug Deliv Rev(高级药物递送综 述)54，459-476，Bhadra等，(2002)Pharmazie 57，5-29，Kozlowski等， (2001)J Control Release(控制释放杂志)72，217-224，和Veronese(2001) Biomaterials(生物材料)，22，405-417以及它们中引用的参考文献中进 一步描述了可以用于将PEG分子共价附着到本发明的多肽或拟肽化合物 上的方法。
为了提高药物动力学特征和/或稳定性，可以另外或者备选地选择用 非天然存在的氨基酸残基取代天然IFN-λ多肽的天然存在的氨基酸残基。 治疗蛋白质如干扰素和生长激素，在它们的天然状态或当重组产生时，可 以是表现出短的保存寿命的易分解的分子，特别当在水溶液中配制时。当 配制用于施用时这些分子的不稳定性表明，所述分子可以必须冻干并且在 保存过程中的所有时间冷冻，因此使得所述分子难于运输和/或保存。当 药物制剂必须在医院环境之外进行保存和分发时，保存问题特别紧急。许 多蛋白质和肽药物还需要加入高浓度的其它蛋白质如白蛋白，以减少或防 止由于与容器结合引起的蛋白质损失。这是关于蛋白质如干扰素的主要考 虑。
白蛋白作为载体分子的作用及其惰性的性质是在体内用作多肽的载 体和转运蛋白的理想特征。白蛋白与治疗蛋白质的融合可以通过遗传操作 实现，以致编码白蛋白或其片段的DNA连接到编码所述治疗蛋白质的 DNA上。然后将适当的宿主用融合的核苷酸序列转化或转染，所述融合 的核苷酸序列排列在适当的质粒上，以表达融合多肽。表达可以在体外例 如从原核或真核细胞实现，或者在体内例如从转基因生物体实现。
本发明可以用于预防或治疗目的。可以认为一个人处于患有呼吸道病 毒感染的季节性危险下。因此，在冬季，存在大量的鼻病毒感染以及流感 和RSV的明显的冬季流行。当暴露于患有明显临床感冒的人时，预计患 有哮喘或COPD的人就可能发展病毒恶化的症状。在这种情形中，按照 本发明在这样的暴露之后，可以施用一种或多种IFN-λ多肽，以预防或者 至少减少呼吸道疾病的病毒恶化的发展。
应该理解本发明适用于引起呼吸道疾病的病毒诱导的恶化的任何病 毒感染，或者适用于预防这样的恶化，所述恶化与在支气管上皮细胞中的 不足的IFN-λ生产相关。例如，所述病毒感染可以是由任何鼻病毒、RSV 或流感病毒引起的感染。所述病毒感染可以由其它呼吸道病毒引起。然而， 本发明特别优选地用于治疗或预防鼻病毒诱导的呼吸道疾病恶化，特别是 鼻病毒诱导的哮喘恶化。
如上文所讨论，现在另外提议干扰素-λ可以有益于预防变应性疾病如 哮喘，而不依赖它们抗病毒感染的作用。我们已经生成的数据表明，在生 命早期施用干扰素-λ将模拟传染病的保护作用，促进TH1免疫应答，并 且防止TH2推动的变应性致敏作用和变应性疾病的发展。这种预防性治 疗可以在生命的早期施加，但是干扰素-λ还可以在生命晚期施用，以治疗 /治愈变应性疾病，换言之，以逆转TH2推动的致敏作用和对过敏原的免 疫应答。
“变应性疾病”是与T辅助淋巴细胞-2(Th-2)型免疫应答相关的病 况。在变应反应中，发生高IgE水平，并且Th-2免疫应答与Th-1应答相 比占优势，导致炎性反应。
所谓“变应性疾病”我们包括变应性致敏作用、变应性鼻炎、湿疹、 食物过敏、过敏性反应、皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、变应性呼吸 道疾病、嗜酸细胞过多综合征、接触皮炎以及特征为嗜酸性细胞呼吸道炎 症和呼吸道超反应性的呼吸道疾病如变应性哮喘、先天性哮喘、变应性支 气管肺曲霉病、嗜酸细胞性肺炎、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮 喘、反应性呼吸道疾病综合征、间隙性肺病、嗜酸细胞过多综合征 (hyperosinophilic syndrome)或寄生虫肺病。在本发明这一方面的一个实 施方案中，所述变应性疾病是变应性致敏作用、变应性鼻炎、湿疹、食物 过敏、过敏性反应、皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、嗜酸细胞过多综 合征或接触皮炎。
本发明这一方面的另一个实施方案是其中所述呼吸道疾病是哮喘(变 应性或先天性的)、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性支气管肺曲霉病、肺 嗜酸性细胞增多症、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性呼 吸道疾病综合征、间隙性肺病、嗜酸细胞过多综合征或寄生虫肺病。优选 地，所述呼吸道疾病是哮喘和/或COPD。
本发明的另一个方面是IFNλ多肽在制备用于预防或治疗变应性疾病 的药物中的应用。
优选地，所述变应性疾病是变应性致敏作用、哮喘、变应性鼻炎、湿 疹、食物过敏、变应性反应、变应性鼻炎、湿疹、食物过敏、过敏反应、 皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、变应性呼吸道疾病、嗜酸细胞过多综 合征、接触皮炎以及特征为嗜酸性细胞呼吸道炎症和呼吸道超反应性的呼 吸道疾病如变应性哮喘、先天性哮喘、变应性支气管肺曲霉病、嗜酸细胞 性肺炎、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性呼吸道疾病综 合征、间隙性肺病、嗜酸细胞过多综合征或寄生虫肺病。
现在将通过参考下述非限制性实施例和附图描述本发明。
附图简述
图1.鼻病毒和RSV都强烈地诱导干扰素λmRNA在人支气管上皮细 胞系BEAS2B中的表达。
图2.鼻病毒和RSV都强烈地诱导干扰素λmRNA在人支气管上皮细 胞系BEAS2B中的表达。与图1相同的数据。
图3.如所述的剂量反应，其表明鼻病毒对IFNλ-1和IFNλ-2/3的诱导 都是剂量反应性的。
图4.主要和次要组的多种鼻病毒血清型诱导IFNλ。由于使用UV灭 活的病毒没有观察到所述诱导，所以所述诱导是复制依赖性的。
图5.来自健康志愿者的外周血单核细胞应答鼻病毒感染诱导IFNλ， 诱导在8小时达到最高，但是在24小时仍然显著。
图6.由鼻病毒和RSV从人巨噬细胞诱导IFNλ。
图7.鼻病毒感染对STAT1激活的生物活性。在这一实验中，将来自 鼻病毒感染的BEAS2B细胞的上清接种到表达重组λ受体的报道细胞系 上，并且通过凝胶移位测定评估STAT1激活。使用来自病毒感染的支气 管上皮细胞的上清观察到STAT1激活的明显的诱导，而对照细胞没有。
图8.IFNλ-1具有剂量反应方式的抗病毒活性，当通过Hela细胞滴定 测定测量时，其减少鼻病毒16病毒RNA在BEAS2B细胞中的表达，以 及减少病毒在BEAS2B细胞上清中的释放。病毒RNA拷贝数通过定量 PCR评估。
图9.Hela细胞滴定测定中的抗病毒活性表明病毒诱导的细胞病理效 应受到IFNλ-1抑制，程度与使用干扰素β观察到的相似。
图10.IFNλ-1在BEAS2B细胞中诱导自身以及IFNλ2-3和干扰素β。 类似地，干扰素β诱导自身以及诱导IFNλ-1和IFNλ2-3。因此在1型和 III型干扰素亚型之间存在正向反馈。
图11.IFNλ通过自身以剂量反应方式诱导促炎性细胞因子，并且同样 以剂量反应方式应答鼻病毒16的表达而显著提高促炎性细胞因子的诱 导。这些特征在BEAS2B细胞中观察到，并且表明IFNλ增强可能补充其 它炎性细胞成为病毒感染的上皮细胞的反应。右面的版表明对于干扰素β 是相同的。
图12.BEAS2B细胞的RSV感染导致以时间反应方式向上清中增加的 IFNλ蛋白释放，在24小时达到峰值。
图13.BEAS2B细胞的鼻病毒感染还以剂量反应方式诱导向BEAS2B 细胞的上清中的IFNλ蛋白释放。
图14.鼻病毒的多种血清型导致IFNλ蛋白释放到BEAS2B细胞的上 清中。此外，主要和次要的血清型都导致并且同样以复制依赖性方式。
图15.来自健康供体的外周血单核细胞的鼻病毒感染导致以时间依 赖方式的IFNλ蛋白向上清中分泌的增加。
图16.人巨噬细胞的鼻病毒和RSV感染都导致IFNλ向上清中的释 放。
图17.来源于哮喘症和健康供体的原代支气管上皮细胞表明，与正常 的上皮细胞相比较，哮喘症上皮细胞具有显著增加的病毒复制。病毒RNA 拷贝数的差别通过定量PCR评估。哮喘症上皮细胞产生比正常的上皮细 胞多于一个对数更多的病毒RNA负荷。
图18.在健康和哮喘症上皮细胞中应答鼻病毒感染诱导了IFNλ mRNA表达。然而，相对于正常细胞，在哮喘症中对IFNλs的诱导是不足 的。IFNλmRNA表达通过定量PCR定量。IFNλ的诱导是复制依赖性的。 正常的志愿者比哮喘症受试者产生多于一个对数更多量的IFNλmRNA。
图19.在正常和哮喘症支气管上皮细胞中鼻病毒感染诱导IFNλ蛋 白。由正常上皮细胞产生的水平再一次大于由哮喘症上皮细胞产生的水 平。
图20.IFNλ mRNA在原代人支气管上皮细胞中的表达与病毒负荷强 烈相关。IFNλ表达越多，发生的病毒复制越少。这一数据表明，在原代 人支气管上皮细胞中IFNλ与抗病毒活性相关。
图21.相对于正常的个体，在哮喘症个体中，应答鼻病毒感染和在支 气管肺泡灌洗细胞沉淀的LPS刺激二者的IFNλ生产是不足的。通常，多 于80％的支气管肺泡灌洗细胞是巨噬细胞。这一数据以及先前来自上皮细 胞的数据表明哮喘症缺少来自巨噬细胞的IFNλ生产。
图22.来自用鼻病毒离体刺激的支气管肺泡细胞上清的IFNλ产生。 应答支气管肺泡灌洗细胞沉淀的鼻病毒感染的IFNλ生产与临床感冒的严 重性、肺功能减少的严重性和在体内试验性感染鼻病毒的哮喘症和正常受 试者中的病毒负荷强相关。在这些实验中，IFNλ从在体外应答鼻病毒感 染的支气管肺泡灌洗细胞沉淀的生产在基线确定，然后2周后将受试者在 体内用鼻病毒感染。在这种体内感染过程中，感冒症状、肺功能减少和更 低的呼吸道病毒负荷都受到评估，以监测在体内感染过程中临床疾病的严 重性。在体内感染过程中，在基线的IFNλ生产与感冒的严重性、由肺功 能减少确定的哮喘恶化的严重性和与支气管肺泡灌洗液病毒负荷强烈相 关。这些数据清楚地表明，IFNλ生产是在体内呼吸道病毒感染过程中临 床疾病严重性的主要确定因素，并且表明在哮喘受试者的呼吸道病毒感染 过程中，IFNλ施用应该减少肺功能减少的症状、病毒负荷和严重性。
图23.在BEAS-2B细胞中应答鼻病毒16感染诱导I型和III型干扰 素的时间过程。
(a)通过Taqman PCR研究不同α干扰素亚型的mRNA表达。为了检 测各种α干扰素亚型，选择两对Taqman PCR引物和探针。第一引物和探 针组检测亚型1，6和13，第二引物和探针组检测亚型4，5，8，10，14，17，21。 1型干扰素的表达通过第一引物对-IFNA.1检测，但是没有发现鼻病毒16 对这些1型干扰素的mRNA表达的显著诱导。使用第二引物对-IFNA.2， 与培养基比较，观察到1型干扰素mRNA表达的统计学显著增加，但是 只是在感染后的8小时(p<0.001)。
(b)在相同实验中，通过Taqman PCR研究IL-29和β干扰素mRNA 的表达。鼻病毒16对IL-29mRNA表达的诱导在8小时的时间点统计学 显著地增加，并且我们在24小时检测到甚至更高的诱导(p<0.001)。在24 小时，IFN β mRNA表达也受到鼻病毒16的诱导(p<0.001)。因此，IFNλ mRNA生产比β发生更早，比α更加稳定，并且与α或βIFN生产相比， 被诱导至更大程度。
(c)在相同实验中，干扰素-β的生产通过ELISA测量。经过24小时， 在鼻病毒16感染的BEAS-2B细胞中检测到干扰素-β蛋白的统计学显著的 诱导(p<0.01)。
(d)在相同实验中，IL-29的生产通过ELISA测量。经过24小时，在 鼻病毒16感染的BEAS-2B细胞中检测到IL-29蛋白的统计学显著的诱导 (p<0.001)。因此，与mRNA数据一致，IFNλ蛋白的生产比β IFN的生产 高5倍。在这些实验中，αIFN蛋白是不可检测的。
图24.在原代人支气管上皮细胞中应答鼻病毒16感染的IFN产生的 时间过程。
(a)在人支气管上皮细胞中在鼻病毒16的时间过程中在0，4，8和 24小时的时间点，通过Taqman PCR评估不同α干扰素类型的mRNA表 达。通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素没有受到鼻病毒16的诱导，而 通过IFNA.2检测的那些在8小时与培养基相比受到显著地诱导(p<0.01)， 但是在24小时没有统计学显著的诱导。
(b)在相同的实验中，通过Taqman PCR研究在感染鼻病毒16的人支 气管上皮细胞中的IL-29和β干扰素mRNA的表达。在24小时IL-29 mRNA表达受到显著诱导(p<0.001)。干扰素-β在任何时间点都没有表现 出显著的诱导。
图25.在人支气管上皮细胞中应答鼻病毒1B感染的IFN产生的时间 过程。
在鼻病毒1B时间过程中，在0，4，8和24小时的时间点，也通过 Taqman PCR评估IFNα，IFNβ和IL-29mRNA表达。
(a)通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素没有受到鼻病毒16的诱导。 通过第二引物对IFNA.2检测的α-干扰素的mRNA在8和24小时受到鼻 病毒1B的诱导(p<0.05)。
(b)使用IL-29，在24小时检测到非常高的诱导水平(比通过IFNA.2 引物对检测的那些高2个对数)(p<0.001)。在24小时也检测到干扰素-β mRNA的诱导(p<0.01)，尽管这一诱导比关于IL-29观察到的低1个对数。
图26.在人支气管上皮细胞中应答流感病毒感染的IFN产生的时间 过程。
(a)在人支气管上皮细胞中，在流感病毒时间过程中在0，4，8和24 小时的时间点，通过Taqman PCR评估不同α干扰素类型mRNA的表达。 在任何时间点，通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素和通过IFNA.2引物 对检测的那些都没有受到流感病毒的显著诱导。
(b)在相同的实验中，在感染流感病毒的人支气管上皮细胞中通过 Taqman PCR研究IL-29和β-干扰素mRNA的表达。在感染后8小时IL-29 受到流感病毒的显著诱导(p<0.001)，并且在24小时进一步增加。干扰素-β mRNA诱导在任何时间点都没有显著诱导，尽管在8小时和24小时观察 到增加。在全部时间点，IL-29 mRNA表达比α和β IFNs的表达都高。
实施例1：在支气管上皮细胞中，鼻病毒诱导IFN-λ。
目的：研究RV是否在体外诱导IFN-λs，并且IFN-λs是否在支气管上 皮细胞中诱导针对RV感染的抗病毒活性。
方法概述：将人支气管上皮细胞系BEAS2B用RV感染。使用 PCR鉴定IFN-λs mRNA表达，并且将生物测定用于相对应的蛋 白生产。在用RV感染前，将BEAS2B细胞用不同剂量的IFN-λ1处理24 小时。进行在细胞裂解物中关于病毒RNA的PCR和在BEAS2B 上清中的病毒滴定，以研究抗病毒作用。
结果：IFN-λ1，IFN-λ2和IFN-λ3 mRNA在感染后4小时增加(p<0.05)， 并且在感染后8小时达到峰值(p<0.001)。在感染后24小时所述增加表现 出对RV-16是剂量反应性的(p<0.001)。用RV-9和RV-1B感染表明所述反 应是血清型和受体不依赖性的。RV-16的UV-灭活完全抑制了上调，这表 明需要活性病毒复制。EMSA测定检测在感染后24小时IFN-λs蛋白在 BEAS2B上清中的存在。最后，在细胞裂解物中关于病毒RNA的 PCR(p<0.001)和病毒滴定(p<0.001)都表现出IFN-λ1对RV16感染的剂量 依赖性抗病毒作用。
结论：本研究表明支气管上皮细胞系的RV感染导致IFN-λs的产生， 并且这些蛋白可能在针对RV的抗病毒反应中起重要作用。
实施例2：在哮喘恶化中的病毒感染：干扰素λ的作用
目的：研究RV16是否诱导IFN-λs，并且这种生产是否与在哮喘症中 对鼻病毒感染的增加的易感性有关。
方法：将人支气管上皮细胞系BEAS2B和来自哮喘症(6)和正常患者 (5)的支气管原代细胞用RV16感染。使用用于IFN-λmRNA表达的 PCR。在感染RV16之前，将BEAS2B细胞用IFN-λ1处理。进 行在细胞裂解物中关于病毒RNA的 PCR和在BEAS2B上清中 的病毒滴定，以研究抗病毒作用。关于在原代细胞的细胞裂解物中的病毒 RNA的 PCR还用于检测RV16感染性是否在哮喘症和正常人的 原代细胞之间不同。
在哮喘症中增加的对鼻病毒感染的易感性中的IFN-λs。结果：在 BEAS2B和原代细胞中IFN-λs mRNA都增加，在8小时的感染达到峰值。 在BEAS2B中，关于病毒RNA的 PCR和病毒滴定都表明IFN-λ1 对RV16感染的剂量依赖性抗病毒作用。与正常对照相比较，在RV16感 染后原代支气管上皮细胞产生显著更低量的IFN-λ(p<0.05)。相反，在来 自哮喘症受试者的支气管上皮细胞中RV16的复制更高(p<0.05)。
结论：支气管上皮细胞的RV16感染导致IFN-λs的产生。在哮喘症受 试者中这种生产是不足的，并且因此可能是在哮喘症中对鼻病毒感染的增 加的易感性的因素。
其它材料和方法
获得原代支气管上皮细胞
所有的受试者都是不吸烟的人，在过去的4周内没有恶化或呼吸道感 染。变应性皮肤检测使用一组常见的空气源性变应原，并且如果疱疹反应 比阴性对照>3mm，就认为是阳性的。肺功能通过肺活量测定法和由组胺 激发的支气管超反应性而评估。哮喘在具有支气管超反应性(由PC20组 胺<8mg/ml定义)的一致的病史和迹象的遗传性过敏性个体中诊断，并 且按照GINA指南(National Heart，Lung and Blood Institute(国家心脏、肺 和血液研究所)，1995.Global Strategy for Asthma Management and Prevention(哮喘管理和预防的国际策略)，96-369)分类。健康对照先前 没有肺病病史，具有正常的肺功能，没有支气管超反应性的迹象，并且不 是遗传性过敏性的。本研究由南安普敦大学医院伦理委员会(Southampton University Hospital Ethics Committee)核准。所有的受试者都提供书面告 知的同意书。
支气管上皮细胞组织培养
原代BECs从支气管刷洗液(>95％的上皮细胞)生长，支气管刷洗 液按照标准指南(Hurd，S.Z.1991.J.Allergy Clin.Immunol(过敏症临床免 疫学杂志)88：808-814)通过光纤-光学支气管镜检查而获得；在从正常或 哮喘症供体分离的柱细胞和基细胞的比例中没有显著区别。细胞培养和特 征化描述如先前所述进行(Bucchieri，F.，J.Lordon，A.Richter，D.Buchanan， R.Djukanovic，S.T.Holgate，和D.E.Davies.2001.Am.J.Respir.Cell Mol. Biol.(美国呼吸细胞分子生物学杂志)27：179-185；Lordan，J.L.，F.Bucchieri， A.Richter，A.Konstantinidis，J.W.Holloway，M.Thornber，S.M.Puddicombe， D.Buchanan，S.J.Wilson，R.Djukanovic，等.2002.J.Immunol(免疫学杂 志)169：407-414)。所培养的细胞都是细胞角蛋白阳性的，并且表现出基 细胞表型，如细胞角蛋白13的表达所表明的，而与原始刷洗液的供体的 类型无关。原代培养物通过将新鲜刷洗的BECs接种到补充激素的含有50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的支气管上皮细胞生长培养基(Clonetics) 中而建立。在第二次传代时，将细胞接种到12孔托盘上并且在暴露于 RV-16之前培养至80％汇合(Bucchieri等，如前所述)。
RV的产生和滴定
按照先前所述(Papi，A.，和S.L.Johnston.1999 J.Biol.Chem.(生物的 化学杂志)274：9707-9720)，从俄亥俄(ohio)HeLa细胞的感染培养物产生 并且滴定RV-16储液。细胞以2的感染复数进行感染。感染的证实和病毒 生产的定量通过HeLa滴定测定(Papi，A.，和S.L.Johnston，如前所述)和反 转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)进行评估，如下文所述。作为阴性对 照，将细胞只用培养基和UV灭活的RV-16处理(Papi，A.，和S.L.Johnston， 如前所述)。
RT-qPCR和ELISA
在从用TRIzol(生命技术(Life Technologies))从BECs提取的DNA 酶处理的RNA上进行IFNλ mRNA和RV-16病毒RNA(vRNA)基因表达的 RT-qPCR分析。将总RNA(1μg)用禽类成髓细胞血症病毒转录酶(普洛麦 格(Promega))和用于IFNλ mRNA和18S rRNA分析的随机六聚体或用于 RV-16 vRNA的寡(dT)15进行反转录。实时检测使用iCyclerIQ检测系统， 其使用PCR流程如下：42个循环，在95℃15秒，60℃1分钟和72℃15 秒。将IFNλ信号相对18S rRNA标准化，并且使用△△CT方法进行相对 定量。在感染后8小时进行比较。RV-16的定量使用位于5′UTR的TAQman 测定联合标准曲线方法而实现。标准曲线使用克隆到PCR 2.1 TOPO (Invitrogen)的RV-165′NTR cDNA的10倍连续稀释液而构建。RV检测的 相对值通过相对起始细胞数目标准化而计算。探针：FAM/TAMRA 6-FAMTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATG，正向引物(RVTM-1) 5′-GTGAAGAGCCSCRTGTGCT-3′，反向引物(RVTM-2) 5′-GCTSCAGGG-TTAAGGTTAGCC-3′。
统计学分析
当数据正常分布时，已经使用平均数和SD，使用斯氏t检验分析组 间差异，当不正常分布的数据使用非参量等价物分析并且使用中值和IQR 总结时，多重比较首先通过Kruskal Wallis检验进行分析，然后如果显著 的话，通过个体检验进行分析。通过Spearman′s检验分析相关性。<0.05 的p值被认为是显著的。
哮喘和COPD的诊断
(i)诊断COPD
下述信息获自题目为“Pocket guide to COPD diagnosis，management and prevention：a guide for heath care professionals(COPD诊断、管理和预 防的便携指南：健康护理专家的指导)”的公布，其可从www.goldcopd.com 上获得。
应该在表现出特征性症状和暴露于关于所述疾病的危险因素，特别是 吸烟的任何个体中考虑COPD的诊断。
考虑COPD诊断的关键指征
·慢性咳嗽：间歇或每日表现。经常整天表现；很少只在夜间表现。
·慢性痰液产生：任何模式的慢性痰液产生可以指示COPD。
·急性支气管炎：反复发生。
·呼吸困难，即：进展性的(随时间加重)。顽固性的(每天表现)。 训练加重。在呼吸道感染时加重。
·暴露于危险因素的历史：烟草吸烟(包括受欢迎的当地制品)。职 业性灰尘和化学品。来自家庭烹饪和加热燃料的烟雾。
诊断应该通过肺活量测定而证实。在肺活量测定难以获得的情形中， 应该使用所有可用的工具进行COPD诊断。临床症状和迹象(呼吸的异 常短缺和增加的被迫呼气时间)可以用来辅助诊断。低峰值流动与COPD 一致，但是由于它可以是由其它肺病和由不良表现引起，所以具有低特异 性。在提高COPD诊断的准确性的目标中，应该进行任何努力以提供标 准化肺活量测定的方法。
当进行肺活量测定时，测量：
·用力肺活量(forced vital capacity，FVC)和
·一秒钟内的用力呼气量(FEV1)。
计算FEV1/FVC比例。肺活量测定结果表示为使用关于个体的性别、 年龄和身高的适当的正常值预测的％。
患有COPD的患者典型地表现出在FEV1和FEV1/FVC的减小。肺活 量测定的异常的程度通常反映COPD的严重性。然而，当针对每名患者 研发个体化的管理策略时，应该考虑症状和肺活量测定。 通过严重性对COPD分类
阶段0：危险-慢性咳嗽和痰液产生；肺功能仍然正常。
阶段I：轻度COPD-轻度气流限制(FEV1/FVC<70％但是FEV1≥ 80％预测)，并且经常而不是总是，慢性咳嗽和产生痰液。
·在这一阶段，个体可能没有意识到他或她的肺功能异常。
阶段II：中度COPD-加重的气流限制(50％≤FEV1<80％预测)， 并且症状经常发展，具有典型地在用力时发展的呼吸急促。
阶段III：严重的COPD-进一步加重的气流限制(30％≤FEV1< 50％预测)，增加的呼吸急促，和反复的恶化，其对患者的生活质量有影 响。
·症状恶化，其对患者的生活质量和预后有影响，特别是在具有 FEV1<50％预测的患者中观察到。
阶段IV：非常严重的COPD-严重的气流限制(FEV1<30％预测)或 者FEV1<50％预测加上慢性呼吸衰竭。只要存在这些并发症时，即使 FEV1>30％预测，患者仍可能患有非常严重的(阶段IV)COPD。
·在这一阶段，生活质量非常明显地被损害，并且恶化可能是威胁 生命的。
鉴别诊断
主要的鉴别诊断是哮喘。在一些患有慢性哮喘的患者中，使用目前的 成像和生理学检测技术，与COPD的清楚的区分是不可能的。在这些患 者中，目前的管理与哮喘的管理相似。其它潜在的诊断通常更容易地区分 COPD：
下文列出可以用于区分许多不同的疾病的提示特征。这些特征倾向于 是各个疾病的特征，但不是在每个病例中都发生。例如，从来不吸烟的人 可能发展COPD(特别是在发展中国家，在发展中国家其它的危险因素可 能比吸烟更重要)；哮喘可能在成年人并且甚至年纪更大的患者中发展。
COPD的鉴别诊断
COPD： 在中年发作。症状缓慢进展。
长期吸烟史。
在锻炼过程中呼吸困难。
很大程度上不可逆转的气流限制。
哮喘： 在生命早期(经常在儿童期)发作。
症状每天与每天不同。
症状在夜晚/清早出现。
还表现出过敏、鼻炎和/或湿疹。
哮喘家族病史。
很大程度上可逆转的气流限制。
充血性心力衰竭： 听诊时细碎的基底捻发音(crackles)。
胸部X射线显现膨胀的心脏、肺部水肿。
肺功能检测表明体积受限，无气流限制。
支气管扩张： 大体积的脓性痰液。
通常与细菌感染相关。
听诊时粗糙的捻发音/杵状变(clubbing)。
胸部X-射线/CT显现支气管扩张、支气管壁增厚。
肺结核： 在所有年龄都发作。
胸部X射线显现肺浸润或结节损伤。
微生物学证实。
肺结核的高地域性流行。
(ii)诊断哮喘
下述信息获自题目为“Pocket guide for asthma prevention and management(哮喘预防和管理的便携指南)”的公布，其可从www. ginasthma.com上获得。
哮喘通常可以基于症状进行诊断。然而，肺功能的测量，并且特别是 肺功能异常的可逆性，极大地提高了诊断的可信性。
这是哮喘吗？
如果显现下述迹象或症状的任一种，那么认为是哮喘，
·当呼吸时----特别是儿童，高调喘息喘鸣声。(正常的胸部检查不排 除哮喘)。
·任何下述病史：
咳嗽，特别是在夜间加重
周期发生的喘息
周期发生的呼吸困难
周期发生的胸部紧迫感(chest tightness)。
(注意：哮喘通常与湿疹，花草气喘，或哮喘或遗传性过敏病的家 族史相关。)
·症状在夜间发生或加重，使患者睡不着。
·存在下列各项时症状发生或加重：
带毛的动物
锻炼
气雾剂化学品
花粉
温度变化
呼吸道(病毒)感染
房尘螨(house dust mite)
烟
药物(阿司匹林，β阻断剂)
强烈的情绪表达
·可逆的和可变的气流限制----其通过使用肺活量计(FEV1和FVC) 或呼气峰流量(peak expiratory flow，PEF)计测量。当使用最大气流计时， 如果下述则认为是哮喘：
-在吸入快速作用的2-激动剂后15到20分钟，PEF增加大于15％， 或者
-在服用支气管扩张药的患者中，在发生测量12小时后，PEF从早 晨测量变化大于20％(在未服用支气管扩张药的患者中大于10％)，或者
-在持续跑步或锻炼6分钟后，PEF减少大于15％。
最大气流计：应用和技术
·肺功能测量评估气流限制，并且辅助诊断和监测哮喘病程。
·为了评估气流限制的水平，使用两种方法。最大气流计测量呼气峰 流量(PEF)，并且肺活量计测量1秒钟内的用力呼气量(FEV1)及其伴随的 用力肺活量(FVC)。所有肺功能测量的准确性取决于患者的努力和正确的 技术。
·可以使用各种最大气流计和肺活量计，并且对于所有的使用技术是 相似的。使用最大气流计：
-站立并且握住最大气流计，不限制标记的移动。确定标记是在 刻度的底部。
-深呼吸，将最大气流计放入你的嘴中，沿着吹嘴紧闭嘴唇，并 且尽可能努力和快速地呼出。不要将舌头置于吹嘴中。
-记录结果。将标记返回到零处。
-再重复两次。选择三次读数的最高值。
·当可用时，每天PEF监测持续2到3周用于确立诊断和治疗。如果 在2到3周期间，患者不能获得80％的预测PEF(对于所有最大气流计提 供预测值)，可以必要地确定患者的个人最好值，例如，通过口服糖皮质 类固醇的疗程。
·与观察的症状一起，长期的PEF监测用于评估患者对治疗的反应。 PEF监测还可以帮助在症状发生之前检测加重的早期迹象。
注意：可用的最大气流计的实例和关于吸入器和间隔物(spacer)的 使用说明可以在www.ginasthma.org上找到。
诊断挑战包括下述：
·其初级症状复发或者持续咳嗽或者患有呼吸道感染喘息的年幼儿 童经常误诊为患有支气管炎或肺炎(包括急性呼吸道感染-ARI)，并且 因此使用抗生素或咳嗽抑制剂无效地治疗。使用哮喘药物的治疗可以是有 利的和对症的。
·患有病毒呼吸道感染喘息的许多婴儿和年幼的儿童不可能发展持 续整个儿童期的哮喘。但是他们可以在他们的喘息期间受益于哮喘药物。 不存在特定的方法预测哪些儿童将患有顽固性哮喘，但是过敏、过敏或哮 喘的家族病史以及在围产期暴露于被动吸烟和过敏原与持续的哮喘更强 烈地相关。
·如果患者的感冒反复地“到达胸部”或者持续10天以上才消除， 或者如果当给与哮喘药物时患者改善，那么应该认为是哮喘。
·烟草吸烟者和年纪大的患者通常患有慢性阻塞性肺病(COPD)，其 具有与哮喘类似的症状。然而他们也可能患有哮喘并且从治疗中受益。在 哮喘治疗后在PEF的提高是诊断性的。
·在工作地点暴露于吸入的化学品或过敏原的工人可能患有哮喘，并 且可能被误诊患有慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病。早识别(在工作和家 里的PEF测量)、严格避免进一步暴露，和早治疗是重要的。
·哮喘发作可以是难以诊断的。例如，急性呼吸急促，胸部紧迫感和 喘息也可以由哮吼、支气管炎、心脏病发作和声带功能障碍引起。使用肺 活量计，使用支气管扩张药确定症状的可逆性，并且评估发作的病史(例 如，它是否与通常加重哮喘的暴露相关)辅助诊断。胸部X射线可以帮 助排除感染、大的呼吸道损伤、充血性心力衰竭或外来物体的吸入。
实施例3：在呼吸道病毒感染后α-干扰素、β-干扰素和λ-干扰素在上皮细 胞和PBMCs中的表达。
在本研究中，研究在感染呼吸道病毒时表达并且产生各种1型和III 型干扰素的不同的细胞类型如BEAS-2B、人支气管上皮细胞(HBEC)和 PBMC(作为巨噬细胞的模型)的潜力。设计引物和探针组用于各种1型 和III型干扰素的定量PCR。在BEAS-2B细胞中，检测从0时间点直到8 小时的IFN-α mRNA表达的诱导，检测从0时间点直到8小时的IL-29 mRNA的诱导，在24小时具有峰值，并且检测从0时间点直到24小时的 IFN-β的诱导。通过ELISA，我们还观察到IL-29和IFN-β蛋白在24小时 的产生。在HBEC中，检测从0时间点直到8小时的IFNA mRNA表达的 诱导和从0时间点直到24小时的IL-29 mRNA的诱导。在PBMC中，表 现出从0时间点直到8小时的IFNA，IL-29和IFNB mRNA表达的诱导。 通过ELISA另外表现出IFN-α、IFN-β和IL-29蛋白的诱导。
关于鼻病毒的其它信息
鼻病毒是小RNA病毒。它们属于小RNA病毒家族。已经鉴定了多 于100种血清型的鼻病毒。按照用于结合的受体的类型，鼻病毒分成两组。 主要组大约90％的全部RV血清型使用ICAM-1分子，并且次要组大约 10％的全部RV血清型使用低密度脂蛋白受体(N.G.Papadopoulos， S.L.Johnston：RhinovirusPrinciples and practice of clinical virology(鼻病毒. 临床病毒学原理和实践).第5版，2004，361-377)。
最近的工作表明，由于下呼吸道的症状和在PEF中的变化更严重并 且更长久，哮喘症个体比正常个体更容易感染天然存在的鼻病毒(RV)感染 (Corne等，Lancet(2002)359，831-834)。因此主要问题是，在RV感染过程 中与正常受试者比较在哮喘症的下呼吸道中发生什么差异，并且导致哮喘 恶化。
表明在哮喘症中，RV诱导下呼吸道症状的更大的严重性，其伴随更 高浓度的炎性细胞：淋巴细胞，NK细胞，嗜酸性细胞和嗜中性细胞，在 BALRV感染中，RV在支气管上皮细胞中诱导炎性反应(IL-6，IL-8， RANTES，IL-16和ICAM-1的上调)(N.G.Papadopoulos，PJ.Bates，P.G. Bardin等.J Infect Dis(传染病杂志)181(2000)，第1875-1884页；S.L. Johnston，A.Papi，P.J.Bates，J.G.Mastronarde，M.M.Monick和G.W. Hunninghake，.J Immunol(免疫学杂志)160(1998)，第6172-6181页)。当 与正常相比时，离体暴露于RV的来自于哮喘症的PBMCs表现出减少的 I型细胞因子水平和减少的2型细胞因子水平(Papadopoulos等.Thorax 57 (2002))。此外，如上文已经提示的，最近，当与正常相比时，观察到离体 暴露于RV的来自于哮喘症的原代上皮支气管细胞表现出减少的IFN-β水 平(Wark等J.Exp.Med.(实验医学杂志)(2005年3月21日)201，937-947)。
还如上文先前所讨论，1型干扰素诸如IFN-α、IFN-β和最近发现的 III型干扰素(IFN-λs)在针对病毒的先天性免疫应答中起重要作用。它们 诱导许多具有抗病毒特征的IFN-可诱导的基因，并且如最近所表明的， 它们在病毒感染的细胞中诱导程序性细胞死亡(Takaoka A，Hayakawa S， Yanai H，等，Nature(自然)2003；424(6948)：516-523)。
由于不存在用于鼻病毒感染的小动物模型，所以使用感染鼻病毒的适 当的细胞培养物是非常重要的。已知鼻病毒在下呼吸道的呼吸上皮细胞中 感染和复制(N.G.Papadopoulos等J Med Virol(医学病毒学杂志)58(1999)， 第100-104页)。由于对1型和III型干扰素在上皮细胞中的诱导了解不是 很多，所以在本研究中，我们尝试表明，当不同的呼吸道病毒感染时，不 同的细胞类型如原代支气管上皮细胞、BEAS-2B和PBMC(作为用于巨 噬细胞的模型)怎样表达和产生各种1型和III型干扰素。
材料和方法
人支气管上皮细胞组织培养
人支气管上皮细胞(HBECs)购自美国的Cambrex。原代培养物通过 将支气管上皮细胞接种到补充激素的支气管上皮细胞生长培养基(BEBM； Cambrex，美国)中而建立，所述培养基含有2ml BPE，0.5ml胰岛素，HC0.5 ml，GA-10000，5ml，视黄酸0.5ml，运铁蛋白0.5ml，三碘甲腺原氨酸0.5 ml，肾上腺素0.5ml，hEGF 0.5ml(Cambrex，美国)。在第一次传代，将细 胞接种到12孔托盘上，并且在暴露于RV-16、RV-1B和流感病毒之前培 养到80％汇合(Bucchieri等，Asthamatic bronchil epithelium is more susceptible to oxidant-induced apoptoisis(哮喘症支气管上皮细胞对氧化剂 诱导的程序性细胞死亡更敏感).Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(美国呼吸 细胞分子生物学杂志)27，179)。
细胞和病毒培养
将人支气管上皮细胞系BEAS-2B在补充10％FCS(Invitrogen)的 RPMI-1640中培养。将RV血清型16和1B生长在HeLa细胞中，并且如 先前所述制备(Papi和Johnston(1999)Rhinovirus infection induces expression of its own receptor intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)via increased NF-kB-mediated transcription(鼻病毒感染通过NF-kB介导的转 录而诱导它自身的受体细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达)，J.Biol.Chem. (生物的化学杂志)274，9707-9720)。病毒在HeLa细胞上滴定，以确保 它们的TCID50/ml(Johnston和Tyrell(1995)Rhinoviruses(鼻病毒)，第 253-263页，在Diagnostic procedures for viral，rickettsial and Chlamydial infections(病毒、立克次氏体和衣原体感染的诊断方法)中，Lennette和 Schmidt编，American Public helath Association(美国公共健康协会)，华盛 顿，D.C)。所有RV的身份通过在HeLa细胞上滴定并且使用血清型特异 的抗体中和而证实。按照先前所述进行UV灭活(Johnston等.(1998)Low grade rhinovirus infection indcuces a prolonged release of IL-8in pulmonary epithelium(在肺上皮细胞中低等鼻病毒感染诱导延长的IL-8释放).J. Immunol.(免疫学杂志)160，6172-6181)，并且将RV储液在10000g流过 30kDa的膜(Millipore(密里博))5分钟而产生滤过的病毒。
用RV感染细胞
将BEAS-2B细胞在12孔组织培养平板上(Nalge Nunc)培养24小时， 然后涂布到2％FCS RPMI培养基上再培养24小时。在摇动和室温下将细 胞用RV感染1小时，然后将病毒去除，并且用1ml2％FCS RPMI培养 基替换。在指定的时间收集细胞上清和RNA裂解物。在需要之前将上清 和裂解物保存在-80℃。
PMBC分离和鼻病毒16感染
使用梯度密度离心(希格玛(Sigma))，从全血分离PBMCs。将4x10(6) 个细胞/2ml暴露于鼻病毒161小时。在暴露时间末期，清洗细胞并且更 换培养基。
RNA提取、反转录和实时PCR
使用RNeasy方法按照供应商的说明，从细胞中提取RNA，包括用任 选的DNA酶I消化污染的DNA(Qiagen)。使用Omniscript RT和成分按照 供应商的指导(Qiagen)合成cDNA。
引物购自Invitrogen，并且探针购自Qiagen(快而精公司)。α-干扰素、 IL-29和IFNB mRNA的分析参考18s rRNA标准化。为了检测1、 6和13型α-干扰素，使用IFNα.1组引物和探针(IFNA.1正向-5’-CAG AGT CAC CCA TCT CAG CA-3’，IFNA.1反向-5’-CAC CAC CAG GAC CAT CAG TA-3’和5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-ATC TGC AAT ATC TAC GAT GGC CTC gCC-3’)。为了检测2，4，5，8，10，14，17，21型α-干扰素， 使用IFNα.2组引物和探针(IFNα.2正向-5’-CTG GCA CAA ATG GGA AGA AT-3’，IFNA.2反向-5’-CTT GAG CCT TCT GGA ACT GG-3’和 5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-TTT CTC CTG CCT GAA GGA CAG ACA Tga-3’)。对于IL-29检测，我们使用正向引物-5’GGA CGC CTT GGA AGA GTC ACT-3’，反向-5’-AGA AGC CTC AGG TCC CAA TTC-3’和 5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-AGT TGC AGC TCT CCT GTC TTC CCC G-3’。对于干扰素-β检测，我们使用正向引物-5’-CGC CGC ATT GAC CAT CTA-3’反向-5’-GAC ATT AGC CAG GAG GTT CTC A-3’和 5′-FAM-TAMRA标记的探针-5’-TCA GAC AAG ATT CAT CTA GCA CTG GCT GGA-3’。对于18s，每个反应包含18STM.1(CGC CGC TAG AGG TGA AAT TCT)，18STM.2(CAT TCT TGG CAA ATG CTT TCG)， 5′-FAM-TAMRA标记的探针(5′-ACC GGC GCA AGA CGG ACC AGA) 和2μl1/100稀释在1x Quantitect探针PCR Master混合物(Qiagen)中的 cDNA。使用ABI7000自动TaqMan(Applied Biosystems(应用生物系统)) 分析反应。扩增循环由50℃ 2分钟，94℃ 10分钟和40个循环的94℃ 15 秒，60℃ 15秒组成。
评估IFN-A，IL-29和IFNB释放的酶联免疫吸附测定
使用商购的匹配抗体和标准物，按照供应商的用法说明，在来自收集 并且保存在-80℃的未处理的和感染的细胞培养物的上清中，通过ELISA 定量干扰素-α、干扰素-β和IL-29蛋白。Amersham Biosciences(安玛西亚 生物科学)的高灵敏性干扰素-α人Biotrak ELISA系统用于干扰素-α。人 干扰素-βELISA试剂盒购自Fujirebio公司。所有的测量都按照供应商的 用法说明进行。对于所述测定的检测限制是对于干扰素-α0.63pg/ml，干 扰素-β2.5UI/ml，和IL-290.01。
用于IFNλs的定量ELISA
将ELISA96孔板(Nunc Maxisorp)用检测抗体(每孔100μl稀释在PBS 中的单克隆抗人IL-29/IFN-λ1抗体，所述抗体购自R&D系统，目录号 MAB 15981，浓度1μg/ml)包被，并且置于室温下过夜。次日早上将板 在具有0.1％吐温20的PBS中洗涤两次，然后在室温下每孔用220μl 2％ BSA溶液封闭。2小时后，将板洗涤两次，并且将100μl未稀释的样品和 100μl标准样品加入到孔中。样品和标准物都一式两份进行检测。使用来 自R&D系统的重组人IL-29/IFN-λ1，将标准物置于在稀释缓冲液(具有 1％BSA和0.1％吐温20的PBS)中，从3ng/ml起始下降到大约10pg/ml。 将100mcl的稀释缓冲液加入到相同的孔中作为阴性对照。2小时后，将 板洗涤两次并且加入100μl二抗(来自R&D系统的抗人IL-29/IFN-λ1抗 体，目录号AF1598，在PBS中重构，并且稀释在稀释缓冲液中，浓度1 μg/ml)。按照供应商的用法说明，这些抗体分别具有与IFN-λ2和IFN-λ3 的5％单克隆和25％多克隆的交叉反应性。2小时后，将板洗涤，并且向 每个孔中加入100μl生物素酰化的抗体持续2小时，所述生物素酰化的抗 体来自AutogenBioclear，目录号ABN022B，1：5000稀释在稀释缓冲液 中。将板洗涤两次，并且在每个孔中加入100μl 1：5000稀释在稀释缓冲 液中的链霉抗生物素-HRP(streptavidene-HRP)缀合物持续15分钟。将 板洗涤三次，并且加入100μl TMB底物溶液，并且反应用50μl1.8M oh H2SO4溶液终止。
统计学分析
数据表示为平均数±SEM。所有的数据使用单向ANOVA和在此之后 的Bonferroni′s多重比较检验进行分析。当p<0.05时，接受数据是显著 不同的。
结果
在BEAS-2B细胞中1型和III型干扰素mRNA表达的时间过程
通过Taqman PCR研究在用RV16感染BEAS-2B细胞的时间过程中1 型和III型干扰素的表达。为了检测各种α-干扰素亚型，选择两对Taqman PCR引物和探针。第一引物和探针组检测亚型1，6和13，第二引物和探 针组检测亚型4，5，8，10，14，17，21。还设计了检测IL-29(IFN-λ)和干扰 素-β的引物和探针组。图23a显示通过IFNα.1检测的1型干扰素的表达， 但是鼻病毒16对这些1型干扰素mRNA没有显著的诱导。使用IFNα.2， 与培养基相比，在与0小时时间点比较的第8小时，发生统计学显著增加 的1型干扰素表达。在第0、4和24时间点没有发现诱导。在第8小时的 时间点，IL-29 mRNA的表达也是统计学显著增加的，并且我们在第24 小时检测到甚至更高的诱导(p<0.05)，见图23b。干扰素-β mRNA表达 只在24小时被鼻病毒16诱导一次(p<0.05)。与培养基相比，检测到1000 倍的诱导。全部结果都是从0小时时间点统计学显著的(p<0.05)。
在RV感染的BEAS-2B细胞中检测干扰素-α、干扰素-β和IL-29蛋白
在鼻病毒16感染过程中在BEAS-2B细胞中没有检测到显著的干扰素 -α蛋白诱导。只有从约0.3到0.5pg/ml的痕量的IFNA蛋白通过具有从 0.63到20pg/ml的检测范围的ELISA检测到。在24小时观察到IFNβ蛋 白生产的诱导(图23c)。与未感染的细胞相比，在鼻病毒16感染的 BEAS-2B细胞中，在IFNβ蛋白生产的水平是统计学显著(p<0.05)增加的。 用鼻病毒16感染的BEAS-2B细胞在24小时产生高水平的IL-29蛋白 (p<0.05)(图23d)。
在鼻病毒16感染过程中，在原代支气管上皮细胞中，1型和III型干扰素 mRNA表达的时间过程
在鼻病毒16时间过程中，在第0，4，8和24小时的时间点，评估IFNα、 IFNβ和IL-29 mRNA的表达。通过IFNA.1引物对检测的α-干扰素在所有 时间点都表达，但是没有受到鼻病毒16的上调。使用IFNA.2，我们在4 小时没有观察到诱导，在8小时观察到比培养基统计学显著的10000倍的 诱导(p<0.05)，其在24小时仍然升高(图24a)。关于IL-29 mRNA，我们 在4和8小时观察到微小的诱导，并且在24小时观察到峰值----是培养基 1000000倍的诱导(p<0.05)。在第0、4和8小时的时间点，干扰素-β没有 表现出诱导，但是在8和24小时受到鼻病毒16的诱导-与培养基相比 100000倍的诱导(图24b)。
在鼻病毒1B感染过程中，在人支气管上皮细胞中，1型和III型干扰素 mRNA表达的时间过程
在鼻病毒1B感染时间过程中，在第0、4、8和24小时的时间点，还 观察到α-干扰素、干扰素-β和IL-29mRNA的表达。通过IFNα.1引物对 检测的α-干扰素在所有时间点都表达，但是没有受到鼻病毒16的诱导。 但是，通过第二引物对IFNα.2检测的α-干扰素的mRNA在0和4小时没 有受到鼻病毒1B的诱导，并且在8和24小时达到峰值----是培养基的 10000倍诱导。这些结果达到统计学显著性(p<0.05)(图25a)。在0和4小 时，IL-29 mRNA没有受到鼻病毒1B的诱导。但是在8小时观察到一些 诱导(是培养基的1000倍诱导)，并且在24小时检测到非常高的诱导水 平----是培养基的1000000倍诱导(p<0.05)。在4小时没有观察到干扰素-β 的诱导，在8小时观察到是培养基100倍的诱导(不是统计学显著地)， 并且在24小时达到峰值----是培养基的100000倍诱导(p<0.05)(图25b)。 在流感感染过程中在人支气管上皮细胞中，1型和III型干扰素mRNA表 达的时间过程
在流感病毒时间过程中，在第0、4、8和24小时的时间点，还观察 到IFNα、IFNβ和IL-29 mRNA的表达。通过IFNA.1引物对检测的α-干 扰素同样在所有时间点都表达，但是没有受到流感病毒的诱导。在0和4 小时，通过IFNα2检测的α-干扰素没有上调。在8小时观察到微小的10 倍诱导，并且在24小时观察到100倍的诱导(图26a)。在4和8小时的 时间点，IL-29受到流感病毒的诱导(是培养基的1000倍诱导)，并且在 24小时达到峰值(是培养基的1000000倍诱导)。在4和8小时没有观察 到IFNβ mRNA的诱导。但是在8小时检测到100倍的诱导，并且在24 小时达到峰值----是培养基的105倍诱导(图26b)。
在HBEC细胞中检测干扰素-α、干扰素-β和IL-29蛋白
在用鼻病毒16、1B和流感病毒感染的HBEC细胞中没有检测到干扰 素-α、干扰素-β和IL-29的产生。
讨论
如已经所述，通过第一引物对检测的α-干扰素类型(1、6和13型) 的表达在用所用的每种呼吸道病毒感染的上皮细胞培养物(BEAS-2B和 HBEC)中都检测到。但是有趣地，没有观察到这些干扰素类型的上调。 因此，可能地，这些α-干扰素类型在上皮细胞培养物中是组成型表达的， 但是不受所用的呼吸道病毒的诱导。并且按照ELISA数据，没有一种这 些α-干扰素类型由上皮细胞系产生。
使用第二引物(2，4，5，8，10，14，17，21型)对的α-干扰素检测的水平 非常不同。它最经常的在感染后8小时在上皮细胞系中诱导。这一引物对 检测干扰素-α4，其可能是这一诱导的原因。但是关于蛋白的经历是相同 的----它不在上皮细胞中产生。
还有趣地，在HBEC中，当所述细胞用流感病毒感染时，通过第二引 物对检测的α-干扰素的诱导水平比当它们用鼻病毒16和1B感染时低。 这表明，流感病毒下调α干扰素在上皮细胞中的诱导。
因此，在呼吸道病毒感染后，α-干扰素在上皮细胞中被表达、诱导但 是没有产生。
在本研究中，干扰素-β比通过所用的呼吸道病毒对IFNα.2α-干扰素 诱导得晚。
有趣地，干扰素-β在各种上皮细胞系中差异产生。在BEAS-2B细胞 中，它在鼻病毒感染后24小时产生，因此，在HBEC中，在未用鼻病毒 16和鼻病毒1B和流感病毒感染后它都不产生。
在8和24小时，在两种上皮细胞系中都诱导IL-29 mRNA。
在上皮细胞中，IFNα.1型α-干扰素的mRNA表达，但是不被诱导， 也不产生。在研究的上皮细胞系中，IFNα.2(其包含干扰素α-4)型干扰 素-α的mRNA受到各种鼻病毒的诱导，但是上皮细胞系没有产生干扰素 -α。
因此，在上皮细胞中，可以观察到1型和III型干扰素的动力学差异。 在鼻病毒16感染后的BEAS-2B细胞中，α-干扰素在8小时表达，然后下 降。而干扰素-β只在24小时达到峰值。在BEAS-2B细胞中，IL-29 mRNA 在8小时的时间点开始上升，并且在24小时的时间点变得甚至更高。
在鼻病毒16感染的HBEC中，α-干扰素在8小时上调，并且在24小 时的时间点保持相同。干扰素-β以及IL-29在24小时上调。
感染鼻病毒1B的HBEC具有相同的1型和III型干扰素表达的动力 学。它们在相同的时间点上调，这表明鼻病毒上调的动力学不依赖鼻病毒 类型，并且可能表明它们具有相同的诱导途径。
尽管与鼻病毒感染相比，流感病毒对1型和III型干扰素的诱导水平 更低，但是它具有几乎相同的动力学：α-干扰素也在8和24小时上升，β- 干扰素和IL-29在24小时达到峰值。这对于用鼻病毒感染获得的数据也 是不变的。
UV-数据
已经证明，α-干扰素在上皮细胞中表达。并且，它们中的一些受到各 种呼吸道病毒的诱导。但是在两种所研究的呼吸道上皮细胞培养物中，它 们没有生产。由于它们诱导数百种具有抗病毒特性的干扰素诱导基因，所 以α-干扰素是重要的抗病毒因子。一些上皮细胞系能够在特定的条件和刺 激下产生α-干扰素，但是似乎呼吸道上皮不能产生α-干扰素，或者呼吸 道病毒不是α-干扰素在呼吸道上皮细胞中生产的有力的诱导因素。并且似 乎在呼吸道病毒感染过程中α-干扰素最重要的生产者是类浆细胞树突细 胞(plasmacytoid dendritic cells)(Cella，M.，D.Jarrossay，F.Facchetti，O. Alebardi，H.Nakajima，A.Lanzavecchia，和M.Colonna.1999.Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon(类浆细胞单核细胞迁移到炎症淋巴结中并且产生大量的 I型干扰素).Nat.Med.(自然医学)5：919-923.)和巨噬细胞。
有趣地，β-干扰素在一些上皮细胞系如BEAS-2B中诱导和产生。
对于IL-29观察到相同的结果，但是这种III型干扰素的诱导比I型干 扰素的诱导更早，达到更高的水平并且更稳定。
实施例4：其它实验方法
我们在下文提供用于获得本文所述的数据的其它实验方法。
实验设计和技术概述
在RV16血清阴性哮喘症和正常受试者中诱导RV16试验性感染。基 线、急性感染和康复期(6周)血液、鼻、痰液和支气管肺泡取样用来研 究基线状态，疾病的急性阶段和持续的程度。召集17名正常的、非遗传 过敏性的和11名遗传过敏性的、轻度哮喘症成年人。通过问卷、皮肤刺 痛检测、血清IgE和肺功能检测包括组胺PC20，定义临床和遗传过敏性 状况。哮喘症组需要具有组胺PC20<8mg/ml，正常组>8mg/ml。排除服用 吸入的/口服的类固醇的个体。在开始研究之前，受试者没有普通感冒的 症状，持续6周。按照在先前的研究中开发的确定的流程，采集样品。这 些包括血液、鼻灌洗液(NL)和支气管肺泡灌洗液(BAL)。基线样品在感 染之前2周采集。在第0天接种后，志愿者在3、4和7天(感冒症状的 高峰期)参与，进行其它取样和肺功能检测。志愿者还从第0天(接种之 前)到第8天每日参与，并且在第11天获得NL，以确定病毒负荷。第三 组取样和肺功能检测在第6周进行。
用RV16试验性感染
试验性病毒感染的流程已经在先前的研究中描述(Bardin等，(1996) European Respiratory Journal(欧洲呼吸杂志)9，2250-2255；Fraenkel等， (1995)Am.J.Respir.& Crit.Care Med.(美国呼吸和危急护理医学杂志)15， 879-886；Bardin等，(1994)Clin Exp.Allergy(临床和试验性过敏)24， 457-464)。关于RV16接种物的制备和安全性检测的详情已经公布(Bardin 等(1996)如前所述)。在第0天，通过用DeVillbiss 286喷雾器进行鼻喷 雾，使用10000 TCID50RV16诱导试验性感染。将两份500μl(2500 TCID50) 的等分试样用于每个鼻孔。接种在临床日结束时在专门的临床室进行。受 试者避免患有呼吸道感染的个体，以在整个研究过程中将非-RV16感染的 危险减少到最小。感染通过将NL在HeLa细胞中培养RV或者通过阳性 血清学而证实。从NL和BAL细胞沉淀提取RNA，并且通过PCR分析 RV。Taqman PCR用于定量病毒RNA。包括备选的RV血清型的其它呼吸 道病毒的共同感染通过关于其它病毒的PCR和通过用RV16特异性抗血 清中和培养的鼻病毒而排除。
RV感染的病毒学证实的标准
成功的试验性RV16感染通过至少一种下述病毒学检测而证实：用于 来自上(鼻灌洗液)和/或下(诱导的痰液、支气管肺泡灌洗液)呼吸道 样品的RV的阳性标准物或Taqman RT-PCR；在接种后6周血清中针对 RV16的中和抗体升高至少4倍(在本研究中在基线血清阴性的受试者的 情形中，认为至少1：4的滴度是令人满意的)；在HeLa细胞中来自鼻灌 洗液的RV的阳性培养物，在病毒重复传代后，以获得通过滴定测定确定 的满意的浓度，通过豚鼠特异性RV16抗血清的中和作用，其对HeLa细 胞单层的清楚的RV细胞病变作用。在具有峰值Taqman RT-PCR病毒负荷 的那一天收集的鼻灌洗液上进行标准的小RNA病毒RT-PCR。接着进行 限制性酶分析，以证实阳性小RNA病毒的身份为RV而不是肠道病毒。 类似地，基于Taqman结果，使用来自峰值日的鼻灌洗液进行病毒培养。 临床数据收集
在初始筛选阶段过程中并且从基线，受试者每日记录感冒和胸部症状 得分，在基线支气管镜检前2周开始直到恢复期，在试验性RV16感染后 6周进行的恢复期的支气管镜检后2周完成。除了症状得分外，受试者记 录药物的时间和量，如所需要的吸入的支气管扩张药。肺功能通过两种方 法评估。首先，受试者使用便携式手持肺活量计在家进行肺活量检测，每 天两次，在刚刚睡醒的早上和在夜晚最后的事情时进行。其次，组胺PC20 检测用来评估在筛选时，在基线，在接种后第6天和在恢复期的支气管超 反应性。
用于症状得分/药物使用/肺活量测定记录的每日卡片
在感染前2周、感染过程中和感染后6周，通过问卷进行症状评估。 感冒得分是基于更早的普通感冒研究(Jackson等(1958)Arch Int Med(国 际医学档案)101：267-278)。症状(打喷嚏、头痛、不适、畏寒、流鼻涕、 鼻塞、嗓子痛、咳嗽、发烧)分为0-3个等级。临床感冒通过在6天内最 低累计得分14(>20＝重感冒)加上感冒或鼻漏的主观印象而定义。胸部 得分症状包括：睡醒时咳嗽；睡醒时喘鸣；白天咳嗽；白天喘鸣；白天呼 吸急促；夜晚咳嗽、喘鸣或呼吸急促。
临床症状得分的分析
为了促进临床数据的分析，将试验性感染流程分成独立的阶段。除了 计算关于个体症状的每日得分和总的感冒或胸部得分之外，计算2周的得 分，以允许统计学分析RV感染对症状的影响。由于在RV接种后大量症 状持续多达2周，所以决定检查2周的时期。基线前或筛选阶段是2周直 到基线阶段开始，恢复期前阶段是紧接在恢复期支气管镜检之前的2周。 这两个阶段都不包括支气管镜检。基线、急性感染和恢复期阶段都在2周 区间的第4天包括支气管镜检。为了检验RV16感染对症状的影响，通过 将在基线阶段过程中获得的得分从急性感染阶段的相对应日的得分中减 去，而计算每日和2周大量症状得分，以校正进行支气管镜检的作用，其 本身可以导致感冒和胸部症状，和肺功能的短期改变。
肺功能检测
按照BTS/ARTP指南(Anonymous.(1994).Guidelines for the measurement of respiratory function.Recommendations of the British Thoracic Society and the Association of Respiratory Technicians and Physiologists(关于测量呼吸道功能的指南。英国胸学协会和呼吸师和生 理学者协会的建议).Respiratory Medicine(呼吸医学)88：165-194)进行肺 功能检测。受试者早晚在家使用便携式肺活量计，microDL (MicroMedical)。使用Spida软件分析数据。在肺功能实验室中，并且对 于支气管扩张药的可逆性、痰液诱导和组胺激发，受试者使用Vitalograph Dry Wedge Bellows肺活量计。为了促进在试验性感染过程中对在2组中 的变化的比较，首先，对于每名受试者，在RV16接种后的日子里，计算 FEV1从在筛选阶段获得的平均数的％变化，并且其次，将这关于在相应 的基线日期中支气管镜检后观察到的变化进行校正。
组胺激发
按照ERS指南(Sterk等，(1993)Airway responsiveness.Standardized challenge testing with pharmacological，physical and sensitizing stimuli in adults(呼吸道反应性。在成年人中使用药物、物理和致敏刺激检测标准 化的激发).Report Working Party Standardization of Lung Function Tests， European Community for Steel and Coal(欧洲钢铁和煤委员会的肺功能检 测标准化工党报告).Official Statement of the European Respiratory Society (欧洲呼吸协会官方陈述).[综述]European Respiratory Journal(欧洲呼 吸杂志)-增刊16：53-83)使用2分钟潮式呼吸法进行组胺激发。支气管 超反应性在基线、在感染后第6天和在6周进行评估。
皮肤刺痛检测
通过针对普通空气源性变应原的皮肤刺痛检测而确定遗传性过敏症， 所述普通空气源性变应原：草粉；房尘螨；猫的毛屑；狗的毛发；烟曲霉 (aspergillus fumigatus)；多主枝孢(cladosporium herbarum)；链格孢 (alternaria alternata)；白桦树(silver birch)；3trees；荨麻粉。包括阳性 组胺/阴性稀释剂对照。1例阳性反应(比阴性对照大3mm的疱疹)认为 是遗传性过敏症的诊断。
鼻灌洗
进行NL：关于RV病毒负荷的标准物和Taqman RT-PCR；以通过对 HeLa细胞培养物的影响证实感染。使用软塑料移液器，将2.5ml无菌普 通盐水滴注到每个鼻孔中。将灌洗液收集到无菌培养皿中，匀浆，然后等 分保存在-80℃。
外周血分析
将50ml血液收集在肝素化的管中，用PBS1：1稀释，然后层铺在淋 巴制备物上。在2500rpm离心30分钟后，将单核细胞转移到单一聚丙烯 管中，并且在RPMI-1640 10％FCS中清洗。将细胞混悬液1：10稀释在 0.1％锥虫蓝中，用于通过血细胞计数器计数并且评估存活能力。将细胞以 需要的细胞密度重悬在适当的培养基中用于后续实验。
血清分离
将10ml血液收集在无色真空容器管(plain vacutainer tube)中，在37 ℃放置4小时进行凝结，然后在2000rpm离心15分钟。将血清等分，保 存在-80℃，用于存在RV16中和抗体的后续分析。
支气管镜检
在圣玛丽医院(St Marys Hospital)内窥镜检查单位，按照BTS指南 (British Thoracic society Bronchoscopy Guidelines Committee(英国胸学学 会支气管镜检指导委员会).2001.British Thoracic Society guidelines on diagnostic flexible bromnchoscopy(英国胸学学会关于诊断性灵活支气管镜 检的指南).Thorax 56：i1-i21)进行支气管镜检。受试者由单独的医生或 护士监测。在支气管镜检之前和之后记录FEV1。Keymed P100支气管镜 与有孔镊子(Keymed FB-19C-1)和3mm有套刷子(sheathed brushes) (Keymed BC-16C)一起使用。通过将无菌普通盐水(室温)以8×30ml等 分试样10秒的停留时间，滴注到右中叶支气管中，进行BAL，目的是80％ 复苏。在基线和6周时，BAL从中段右中叶获得，在第4天从侧段获得， 以将先前BAL的作用最小化。将BAL收集在单一塑料室中，并且立即转 移到置于冰上的聚丙烯管中运输到实验室。
RV16血清学
在96孔板中，使用HeLa细胞单层，在筛选时、基线、第0天和感 染后6周，通过关于针对RV16的中和抗体的微量中和检测而进行RV16 血清学。从1:2到1:128制备血清(50μl)的双重稀释液。加入50μl含有 100TCID50的稀释的病毒储液，并且将板在室温下摇动1小时。加入100μl 新鲜剥离的HeLa细胞2x105个细胞/ml，并且将板在37℃温育。包括血清 (细胞+血清以1:2稀释)，细胞(细胞，无血清，无病毒)和病毒(细胞，无 血清，病毒储液)对照。在2-3天后读取细胞病变作用(CPE)。抗体滴度定 义为完全中和病毒CPE的最大血清稀释。血清转变在血清反应阴性的受 试者中定义为1：4或更大的RV16中和抗体的恢复期滴度。
来自临床样品的病毒培养物
RV在鼻灌洗液中的存在通过培养而确定。这首先在37℃进行，如果 是阴性的，在33℃重复。通过将样品加入到含有抗生素的小体积的培养 基中，并且在T25烧瓶中覆盖半汇合的HeLa细胞，在室温下摇动1小时， 然后加入额外的培养基并且观察CPE来培养病毒。如果在第5天没有细 胞通过2个冷冻/解冻循环而裂解，那么将透明的上清加入到新鲜HeLa 细胞中。如果在5次传代后，没有观察到CPE，那么认为不存在病毒。由 于RV16参与使用RV16特异性血清(ATCC-滴度1:600)的微量中和测定， 所以证实培养的病毒。在培养物上清中的RV滴度通过滴定测定而估计。 然后，在96孔板中，将50μl含有100TCID50的病毒的稀释的上清加入到 等体积的培养基中，所述培养基含有从1：20到1：1280的特异性RV16 抗血清的2-倍连续稀释液。所述测定包括阳性(RV16储液)和细胞(无 病毒)对照。
从保存的临床样品提取RNA和使用随机六聚体引物的反转录
使用QIAamp病毒RNA小量试剂盒(Qiagen)从样品中提取RNA，并 且使用omniscript RT试剂盒(Qiagen)和随机六聚体引物，按照供应商的使 用说明，进行反转录。
关于小RNA病毒的标准PCR
RV RT-PCR从通过使用随机六聚体引物的RT产生的cDNA而进行。 使用公布的方法(Johnston等(1993)Journal of Clinical Microbiology(临床 微生物学杂志)31：111-117)，使用OL26/OL27引物对，应用Perkin Elmer 9600 GeneAmp PCR系统进行PCR。产生的380bp的小RNA病毒特异性 扩增子在2％琼脂糖凝胶上电泳后通过溴化乙锭染色而显现，并且通过偏 振照相机拍照。通过使用Bgl I限制性消化而将RV扩增子从肠道病毒的 那些中区分出来(Papadopoulos等(1999)Journal of Virological Methods(病 毒学方法杂志)80：179-185)。
用于其它呼吸道病毒的PCR
除RV之外的呼吸道病毒的存在通过用于下列各项的PCR而排除：支 原体(Mycoplasma)和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，腺病毒，呼 吸道合胞病毒，流感病毒AH1/AH3/B，副流感病毒1-3，冠状病毒229E 和OC43。用于这些PCR的cDNA通过随机六聚体RT而产生。用于这些 其它PCR的方法是先前公布的(Seemungal等(2001)American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine(美国呼吸和危急护理医学杂志) 164：1618-1623)。
用于小RNA病毒的Taqman RT-PCR
Taqman RT-PCR用来检测在取样后未经处理而保存在-80℃的NL和 BAL中的小RNA病毒。使用QIAamp病毒RNA小量试剂盒(Qiagen)从样 品中提取RNA，并且使用omniscript RT试剂盒(Qiagen)和随机六聚体引 物，按照供应商的用法说明，进行反转录。使用AmplitaqGold DNA聚合 酶，小RNA病毒特异性引物对(正向寡聚物5′-GTG AAG AGC CSC RTG TGC T-3′，反向寡聚物5′-GCT SCA GGG TTA AGG TTA GCC-3′)和 FAM/TAMRA标记的小RNA病毒探针(FAM-TGA GTC CTC CGG CCC CTG AAT G-TAMRA)，应用PE生物系统ABI Prism 7700序列检测系统， 进行PCR。
主要的混合物由Qiagen quantitect探针混合物，正向引物(50nM)反向 引物(300nM)，探针(100nM)和RNA酶抑制剂组成。在96孔Taqman板的 每个管中，向2μl cDNA中加入23μl PCR主要的混合物。使用PE生物 系统ABI Prism 7700序列检测系统进行热循环和荧光PCR产物的检测。 所用的热循环条件为：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；然后45个循环x95℃ 15秒/55℃ 20秒/72℃ 40秒。Taqman RT-PCR方法已经由Viropharma 的合作者最优化(Pevear等(1999)Antimicrobial Agents & Chemotherapy (抗微生物剂和化学治疗)43：2109-2115)。为每个循环收集荧光数据，并 且确定荧光升高高于阈值的循环数(Ct)。包括阴性提取物(水)，阴性PCR (只有模板)和阳性提取物(RV16储液)。通过在Taqman板管中包含从 108到100拷贝/2μl连续10倍稀释的2μl RV质粒，而生成标准曲线。在 PCR后，每个质粒产生1个拷贝的dsDNA。通过参考标准曲线，并且考 虑在加工成RNA和cDNA中固有的稀释因素和由每个拷贝的dsDNA质 粒产生的“双倍荧光”，而将每份样品的结果表示为关于NL和BAL的拷 贝/ml。
统计学分析
在受试者内比较症状得分、肺功能、PC20值、病毒负荷、细胞因子和 趋化因子浓度和白细胞数目，以确定在基线和急性感冒之间诱导的差别， 和到恢复期变化的持续时间。使用Wilcoxon′s检验分析受试者内部的差 别。在研究的每个阶段使用Mann Whitney′s检验，分析正常和哮喘症组之 间的差别。使用Spearman′s排列校正检验在临床疾病严重性、病毒负荷、 白细胞计数和细胞因子/趋化因子浓度之间的相互关系，以研究关于调节 哮喘中的改变的反应的这些因子的可能的因果关系。
BAL离体培养
在收集用于细胞因子生产的上清和用于RNA的细胞之前，将来自在 试验性感染前在基线进行的支气管镜检的BAL细胞在聚丙烯管中离体培 养48小时，培养条件包括下述：只有培养基，培养基+RV16 5MOI，培 养基+RV16过滤对照，培养基+LPS 0.1μg/ml，培养基+PHA 1μg/ml，培 养基+变应原5000 ISQ。在收集时，在1500rpm离心10分钟之前，将 细胞简短振荡。将上清等分并且保存在-80℃，用于通过ELISA的后续分 析。在保存在-80℃之前，加入1ml trizol以将细胞裂解，以用于通过 RT-PCR的后续分析。
实施例5：IFNλ蛋白水平与感染的临床指征之间的关联
进一步研究在IFNλ蛋白水平和呼吸道感染的临床指征之间的关联。 数据在图22中显示。所用的方法在上述实施例4中概括。
图22显示在用鼻病毒离体刺激的支气管肺泡细胞上清中的IFNλ水 平。
图22(a)显示IFNλ蛋白在来自正常和哮喘症受试者的离体RV-刺激的 支气管肺泡细胞的上清中的定量。从这一数据清楚地看出，与从非哮喘症 受试者分离的细胞相比，从哮喘症受试者分离的细胞产生低得多的量的 IFNλ蛋白。因此，当感染RV时，来自哮喘症受试者的支气管肺泡细胞 不能产生与来自正常受试者的支气管肺泡细胞同样多的IFNλ蛋白。
图22(b)显示在感染RV的患者的IFNλ蛋白水平和在体内感染鼻病毒 2周后的患者的“感冒得分”之间的关系。“感冒得分”是呼吸道病毒感 染的严重性的临床测量，如在实施例5中所讨论。清楚看出，具有更低IFNλ 蛋白水平的患者具有比具有更多IFNλ蛋白的患者更高的“感冒得分”。因 此，所述数据表明IFNλ蛋白水平和呼吸道病毒感染的临床指征的严重性 之间的相关性。因此，IFNλ蛋白可以用于治疗呼吸道疾病。
图22(c)显示在感染RV的患者中的肺功能(使用FEV1值测量)和IFNλ 蛋白水平之间的关系。清楚看出，在患者中FEV1减少和IFNλ蛋白的水 平之间存在相关性。因此，当感染鼻病毒2周后，在基线具有更低IFNλ 产量的患者患有更严重的呼吸道阻塞，因此IFNλ可以用于减少哮喘恶化 的严重性。
图22(d)显示在体内感染鼻病毒过程中采集的BAL细胞(因此更低的 呼吸道病毒负荷)中的RV16 RNA的量，其与在基线体内感染前2周在 基线采集的BAL细胞中的IFNλ蛋白产量相关。此外，在RV16 RNA水 平和IFNλ蛋白水平的量之间存在相关性：IFNλ蛋白越多，越少RV16 RNA 存在。因此，IFNλ可以用来减少下呼吸道中的病毒负荷，由此预防/减轻 病毒诱导的哮喘恶化。
在图22中显示的数据提供在λ生产和病毒负荷、肺功能和结果的其 它临床指征之间的相关性。这一数据清楚表明IFNλ在保护病毒诱导的恶 化中的重要的生物作用。
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