一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒
阅读：602发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的 试剂 盒 ，试剂盒包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测 抗体 孔、 荧光 素孔、洗涤孔、读数孔，本发明试剂盒包含了完成免疫检测所需要的全部试剂成分，试剂盒里装载的固相载体的端部包被了捕获抗体，通过固相载体浸入试剂盒内的各个孔，即可以完成被测样本中目标 抗原 的结合以及后续检测步骤，极大降低了制造和维护的成本；本试剂盒检测结果准确度高、线性关系良好、特异性强，对于唐氏综合征的早期筛查和动脉粥样硬化斑 块 破裂的早期预测可以提供可靠的临床参考价值。，下面是一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，其特征在于，包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，所述固相载体孔内部为T形结构，固相载体孔上方设有保护盖，保护盖与固相载体孔通过螺纹连接，保护盖下端部内侧设有内螺纹，固相载体孔上端部设有外螺纹，外螺纹与内螺纹相匹配，固相载体孔内设有固相载体，所述样本孔内装有血清样本，所述检测抗体孔内装有生物素标记的检测抗体，所述荧光素孔内装有荧光素标记的链霉亲和素，所述洗涤孔共有8个，洗涤孔内装有洗涤缓冲液，所述读数孔的底部透明，所述密封盖完全覆盖样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔的孔口。
2.如权利要求1所述的一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为石英针。
3.如权利要求1所述的一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，其特征在于，所述保护盖为保护铝箔。
4.如权利要求1所述的一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，其特征在于，所述固相载体的下端部涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～
0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。
5.如权利要求1所述的一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。
6.如权利要求1所述的一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，其特征在于，所述样本孔、检测抗体孔、荧光素孔的直径均为d1，所述洗涤孔的直径为d2，读数孔的直径为d3，固相载体孔的直径为d4，固相载体的最大直径为d5，d5＞d3＞d1＝d4＞d2。
一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒。
背景技术
[0002] 妊娠相关蛋白A(PAPP-A)是由胎盘衍生出来的一种大分子糖蛋白，由胎盘合体滋养层细胞，蜕膜细胞及正常月经周期子宫内膜间质细胞合成并分泌到血清中，浓度随着孕周增加而升高，直至足月。已经证明在孕早期怀有唐氏综合症(DS)胎儿的孕妇血清中PAPP-A浓度显著下降，因此PAPP-A被广泛认可为DS筛查的有效指标，它的浓度降低提示新生儿患唐氏综合征风险增高。
[0003] 目前有资料表明另外一种形式的PAPP-A蛋白大量存在于不稳定冠状动脉粥样硬化斑块中。同时，PAPP-A在心血管疾病的诊断和急性冠脉综合症(ACS)患者预后判断方面也具有一定价值。研究显示PAPP-A参与血管的修复过程及动脉粥样硬化损伤的进展,并与斑块的不稳定性和破裂密切相关。因此患者血液中PAPP-A的检测将可能对动脉粥样硬化斑块破裂的早期预测非常有帮助。
[0004] 目前临床上PAPP-A的检测方法有放射免疫检测(RIA)、酶联免疫法(ELISA)和化学发光法等，这些方法都有各自的优点和不足。放射免疫检测灵敏度高、特异性强，但该方法对人体有放射性损伤，目前在临床应用已较少。ELISA法检测步骤多、耗时长，操作过程的影响因素较多，易造成假阳性和假阴性结果。因此目前逐步被化学发光法替代，但这类方法为全封闭系统，价格昂贵，需要专门培训仪器使用人员，维修及检测成本高，并且不适合单人份和小批量检测用，目前不利于PAPP-A检测在国内的广泛开展。
[0005] 鉴于目前尚无快速、准确的定量检测PAPP-A的方法，本发明的目的是提供一种可用于快速定量检测PAPP-A的免疫层析试纸条，用于评估和监测体内妊娠相关蛋白A的水平，所述试剂具有操作简单、方便快捷、经济、准确定量等优点，更适用于在各医疗机构广泛开展。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，能够有效提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，所述固相载体孔内部为T形结构，固相载体孔上方设有保护盖，保护盖与固相载体孔通过螺纹连接，保护盖下端部内侧设有内螺纹，固相载体孔上端部设有外螺纹，外螺纹与内螺纹相匹配，固相载体孔内设有固相载体，所述样本孔内装有血清样本，所述检测抗体孔内装有生物素标记的检测抗体，所述荧光素孔内装有荧光素标记的链霉亲和素，所述洗涤孔共有8个，洗涤孔内装有洗涤缓冲液，所述读数孔的底部透明，所述密封盖完全覆盖样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔的孔口。
[0008] 优选的，所述固相载体为石英针。
[0010] 优选的，所述固相载体的下端部涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。
[0011] 优选的，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。
[0012] 优选的，所述样本孔、检测抗体孔、荧光素孔的直径均为d1，所述洗涤孔的直径为d2，读数孔的直径为d3，固相载体孔的直径为d4，固相载体的最大直径为d5，d5＞d3＞d1＝d4＞d2。
[0013] 一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将妊娠相关蛋白A捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于妊娠相关蛋白A捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；
[0015] (2)生物素标记的检测抗体：将妊娠相关蛋白A检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；
[0016] (3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解，并混合均匀，即得洗涤缓冲液。
[0017] 本发明具有有益效果：本发明石英针表面覆有具有生物相容性的多糖复合物，多糖复合物可与蛋白质分子形成氢键弱相互作用，减少非特异性吸附，多糖复合物可有效增强特异性的免疫信号，检测信号的放大是通过在多糖复合物表面形成多层荧光素-链霉亲和素分子层而实现的；本试剂盒检测结果准确度高、线性关系良好、特异性强，对于唐氏综合征的早期筛查和动脉粥样硬化斑块破裂的早期预测可以提供可靠的临床参考价值。附图说明
[0018] 图1为本发明试剂盒结构示意图；
[0019] 图2为本发明试剂盒结构另一示意图；
[0020] 图3为本发明试剂盒检测不同标准品的标准曲线图。
[0021] 图中：1-固相载体孔，2-保护盖，3-固相载体，4-样本孔，5-检测抗体孔，6-荧光素孔，7-第一洗涤孔，8-第二洗涤孔，9-第三洗涤孔，10-第四洗涤孔，11-第五洗涤孔，12-第六洗涤孔，13-第七洗涤孔，14-第八洗涤孔，15-读数孔，16-密封盖。
具体实施方式
[0022] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0023] 荧光素标记链霉亲和素购自Solarbio，货号为SF068-0.1ml。
[0024] 实施例1
[0025] 一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，包括试剂盒主体、密封盖、保护盖、试剂，试剂盒主体上依次设有固相载体孔、样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔，所述固相载体孔内部为T形结构，固相载体孔上方设有保护盖，保护盖与固相载体孔通过螺纹连接，保护盖下端部内侧设有内螺纹，固相载体孔上端部设有外螺纹，外螺纹与内螺纹相匹配，固相载体孔内设有固相载体，所述样本孔内装有血清样本，所述检测抗体孔内装有生物素标记的检测抗体，所述荧光素孔内装有荧光素标记的链霉亲和素，所述洗涤孔共有8个，洗涤孔内装有洗涤缓冲液，所述读数孔的底部透明，所述密封盖完全覆盖样本孔、检测抗体孔、荧光素孔、洗涤孔、读数孔的孔口。
[0026] 优选的，所述固相载体为石英针。
[0027] 优选的，所述保护盖为保护铝箔。
[0028] 优选的，所述固相载体的下端部涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。
[0029] 优选的，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。
[0030] 优选的，所述样本孔、检测抗体孔、荧光素孔的直径均为d1，所述洗涤孔的直径为d2，读数孔的直径为d3，固相载体孔的直径为d4，固相载体的最大直径为d5，d5＞d3＞d1＝d4＞d2。
[0031] 本发明试剂盒包含了完成免疫检测所需要的全部试剂成分，试剂盒里装载的固相载体的端部包被了捕获抗体，通过固相载体浸入试剂盒内的各个孔，即可以完成被测样本中目标抗原的结合以及后续检测步骤，极大降低了制造和维护的成本。
[0032] 实施例2
[0033] 一种定量检测妊娠相关蛋白A含量的试剂盒，包括如下步骤：
[0034] (1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将妊娠相关蛋白A捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于妊娠相关蛋白A捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-HCL缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；
[0035] (2)生物素标记的检测抗体：将妊娠相关蛋白A检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；
[0036] (3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解并混合均匀，即得洗涤缓冲液。
[0037] 实施例3
[0038] 一、试剂盒的使用方法
[0039] 将包被捕获抗体的固相载体放入样本孔中，10-60s后取出在第一洗涤孔、第二洗涤孔、第三洗涤孔依次震荡清洗，清洗后放入检测抗体孔中，10-60s后取出在第四洗涤孔、第五洗涤孔依次震荡清洗，清洗后放入荧光素标记链霉亲和素中10-60s后取出在第六洗涤孔、第七洗涤孔、第八洗涤孔依次震荡清洗，晾干后放入读数孔中，即可采用荧光分析检测仪检测。
[0040] 本发明样本中的目标抗原首先与固相载体表面的捕获抗体结合，该固相载体随后依次浸入含有生物素标记的检测抗体中以及荧光素标记链霉亲和素中进行结合反应，固相载体表面涂敷了具有生物相容性的多糖复合物，可有效抵抗非特异性结合，信号的放大是通过在惰性的多糖基质表面形成层层叠叠的Cy5-SA分子层而实现的。这种循环标记反应可不断重复而进一步放大信号。
[0041] 二、检测结果分析
[0042] 1.线性：本试剂盒以标准品浓度值(标准品分别为0ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL)为X轴，以标准品信号值为Y轴，建立定标曲线，根据待测样本的信号值强度回算相应的浓度值，如图3所示，线性方程为y＝0.1891x-0.1223，R2＝0.9812，最低检测限为5ng/mL。
[0043] 取浓度为50ng/ml的妊娠相关蛋白A标准品进行10次试验，利用线性方程y＝0.1924x-5.0966，计算检测浓度值；检测结果如表1所示，测定的平均值分别为50.087pg/ml，标准偏差为0.124，批内变异系数为0.2％。
[0044] 表1
[0045] 妊娠相关蛋白A标准品(50ng/ml)第一次 50.18
第二次 50.11
第三次 50.12
第四次 49.91
第五次 50.08
第六次 49.96
第七次 50.08
第八次 50.21
第九次 50.31
第十次 49.91
平均值 50.087
标准偏差 0.124
批内变异系数 0.2％
第二次 50.11
第三次 50.12
第四次 49.91
第五次 50.08
第六次 49.96
第七次 50.08
第八次 50.21
第九次 50.31
第十次 49.91
平均值 50.087
标准偏差 0.124
批内变异系数 0.2％
[0046] 2.稳定性：取妊娠相关蛋白A检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、24天、30天、35天、45天、60天进行测定。结果显示妊娠相关蛋白A检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为50天。
[0047] 3.特异性检测
[0048] 1)在所示浓度检测以下内源性物质，检测结果如下表2，没有发现显著的干扰性。
[0049] 表2
[0050] 干扰物 添加最高浓度甘油三酯 1000mg/dl
血红蛋白 50mg/dl
肝素钠 40U/ml
EDTA.K2 600μg/ml
生物素 20ng/ml
胆红素 50mg/dl
血红蛋白 50mg/dl
肝素钠 40U/ml
EDTA.K2 600μg/ml
生物素 20ng/ml
胆红素 50mg/dl
[0051] 本试剂盒检测结果准确度高、线性关系良好、稳定性好、特异性强，对于唐氏综合征的早期筛查和动脉粥样硬化斑块破裂的早期预测可以提供可靠的临床参考价值。
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