一种硬脑膜补片、制备方法及在硬脑膜损伤修复中的应用
阅读：185发布：2024-02-25
专利汇可以提供一种硬脑膜补片、制备方法及在硬脑膜损伤修复中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种硬脑膜 补片 及其制备方法。所述硬脑膜补片是由脱细胞异体真皮基质制成的。所述脱细胞异体真皮基质是由异体皮经过交联处理、蛋白酶溶液消化处理、含 表面活性剂 的高渗盐溶液脱细胞处理、DNA降解处理、 氨 基酸营养处理、 冷冻干燥 获得。本发明还提供所述硬脑膜补片在制备 治疗 硬脑膜损伤的修复材料中的应用。本发明的脱细胞异体真皮基质取材于人体 皮肤 组织，经特殊的理化、生化处理，去除了可能引起免疫排异反应的所有成份，完整地保留了原有组织的 纤维 立体 支架 结构，植入后很快有新生血管和 成纤维细胞 长入，取得了良好的临床效果。，下面是一种硬脑膜补片、制备方法及在硬脑膜损伤修复中的应用专利的具体信息内容。
1.一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将异体皮原料投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡；
步骤二，将浸泡原料取出，投入盛有生理盐水溶液容器中浸泡，得半成品A；
步骤三，将半成品A投入盛有蛋白酶溶液的容器中，浸泡振荡处理，得半成品B；
步骤四，将半成品B投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡处理；
更换表面活性剂和高渗盐溶液，超声浸泡处理；重复该操作多次，得半成品C；
步骤五，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；
步骤六，将半成品D投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，浸泡处理，得半成品E；
步骤七，将半成品E用生理盐水浸泡振荡处理，得半成品F；
步骤八，将半成品F取出，用氨基酸溶液浸泡后，投入盛有生理盐水溶液容器中，静置，得半成品G；
步骤九，将半成品G取出，置于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得半成品H；
步骤十，将半成品H取出，包装，灭菌，得成品I；
其中交联剂溶液的配方是用京尼平与选自戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、一水吗啉乙磺酸任一作为交联剂，其中，京尼平与另一交联剂的质量比为1-6:1，交联剂与异体皮原料质量比为0.1-4:1；
所述蛋白酶溶液为0.1-0.3w/v％胰蛋白酶-dispase酶溶液，其中，胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2-3:0.1-1.8，溶液pH值为7.0-8.0；或所述蛋白酶溶液为0.1-0.4w/v％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液，其中，胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为2-3:0.1-1.8，溶液pH值为
6.0-8.0；或所述蛋白酶溶液为0.1-0.3w/v％胰蛋白酶-菠萝蛋白酶溶液，其中，胰蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为2-3:0.1-1.8，溶液pH值为7.0-8.0；
其中表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.1-0.3g/L聚乙二醇与SDS，或含有0.1-
0.3g/L聚乙二醇与Triton X-100的高渗盐溶液，其中，聚乙二醇选择分子量400-2000，聚乙二醇与SDS或Triton X-100的质量比为40-60:60-40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，
10mM EDTA；
其中DNA水解酶溶液的配方是DNA水解酶浓度为2-10g/L，pH7.0-8.0；
其中氨基酸溶液的浓度为0.5-2g/L；由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照
3-4:1.1-1.3:1.0-1.6:0.96-1.16:0.07-0.08质量比配制；
其中步骤一中浸泡时间为3-6h；
其中步骤二中浸泡时间为8小时，浸泡次数为6-9次，浸泡温度为5-10℃；
其中步骤三中的浸泡振荡为浸泡3-6小时，振荡转速为50-200rpm，重复操作1-3次；
步骤四中的超声浸泡条件为：30-60KHz，100-400W，超声5-10分钟，浸泡2-4小时，重复
2-4次；
步骤五中的振荡处理条件为振荡2小时，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次；
其中步骤七的条件为生理盐水浸泡10-12小时，振荡处理；更换生理盐水，振荡处理，重复该操作2-4次；
步骤五、七中振荡转速为50-200rpm；
其中步骤九的冷冻干燥步骤具体为将半成品G在零下20℃至零下40℃条件下，真空度不高于10Pa条件下，真空干燥20-60h；
所述真皮基质来源于自愿捐献者的皮肤、羊膜。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱细胞异体真皮基质的顶破强度≥
20kPa、缝合强度≥18N、拉伸强度为4.0MPa-6.5MPa、拉伸伸长率为10％-15％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2:1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，聚乙二醇与SDS或与Triton X-100的质量比为50-60:50-40。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，DNA水解酶浓度为3-8g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3.3:1.1:1.3:0.96:0.07质量比配制，氨基酸浓度为0.6-1.6g/L。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，其中步骤十的包装为将半成品H装入包装袋中，封口包装完毕；所述灭菌为钴-60照射，照射剂量为20-30kGy。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备得到的脱细胞异体真皮基质。
9.一种硬脑膜补片的制备方法，其特征在于，将权利要求8所述的脱细胞异体真皮基质按实际需要制备成硬脑膜补片。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，硬脑膜补片的尺寸为宽1-20cm，长1-20cm。
11.由权利要求9或10所述的方法制备获得的硬脑膜补片。
12.一种用于硬脑膜损伤修复的试剂盒，其特征在于，包含权利要求8所述的脱细胞异体真皮基质或权利要求11所述的硬脑膜补片。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中进一步包含手术刀、手术剪、止血钳、镊子、缝合针、含注射用水的安瓿瓶、注射器。
14.权利要求8所述的脱细胞异体真皮基质在制备治疗硬脑膜损伤的修复材料中的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述硬脑膜损伤为开放性颅脑损伤或肿瘤侵蚀造成的脑损伤或先天性疾病造成的硬脑膜缺损。
16.如权利要求14或15所述的用途，其特征在于，所述脱细胞异体真皮基质在使用前需先进行如下操作：20℃-35℃生理盐水中完全浸泡复水15分钟。
一种硬脑膜补片、制备方法及在硬脑膜损伤修复中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 人的硬脑膜是脑组织表面一厚而坚韧的双层膜性组织，紧贴颅骨内侧，是保护脑和防止脑脊液与外界交通的重要屏障。开放性颅脑损伤(工业、交通、战争等)，肿瘤的侵蚀，炎症的破坏及先天性疾病等会造成硬脑膜缺损，产生脑脊液外溢、颅内感染等并发症。当脑失去硬脑膜覆盖时，必将与周围的组织发生粘连，周围的新生的血管将会长入脑组织内而形成瘢痕，这就是临床上产生头痛、脑功能障碍等症状的病理基础。为防治脑脊液漏和颅内感染，预防脑、脊髓与周围组织粘连，并为神经组织提供容纳和保护作用，须及时行硬脑膜修补术，因此，硬膜修补或硬脑膜损伤修复在神经外科临床治疗中是重要课题。
[0003] 人工硬脑膜(Artificial Dura Mater)是用生物材料制成人体脑膜的替代物，用于因颅脑、脊髓损伤、肿瘤及其他颅脑疾病引起的硬脑膜或脊膜缺损的修补，防止脑脊液外漏、颅内感染、脑膨出、脑粘连和疤痕等严重并发症，以恢复其完整性。将人工硬脑膜缝合到缺损部位，用封闭剂将人工硬脑膜边缘封闭防止脑积液从切口缝线处漏出；如采用不缝合，而是将较硬脑膜窗稍大之人工硬脑膜铺于缺损处，将其边缘放置于硬脑膜下，在两者的交界缘涂一层粘合剂，如氰基丙烯酸正丁酯等，将可能得到更好的效果且明显缩短手术时间。
[0004] 临床对人工硬脑膜的要求是：①无毒，对机体和脑组织无不良反应；②表面光滑,与蛛网膜和脑组织不粘连；③具有一定的强度、弹性和伸长性；④便于消毒和保存。因此，理想的硬脑膜修补材料需具备以下特点:①材料来源充足，制备工艺简便；②化学性质稳定，无急性炎症反应，不发生脑膜-脑粘连；③组织相容性好，无毒副作用，不产生免疫反应；④安全性好，无致癌性物质，不传播病毒性疾病；⑤韧性好；⑥致密性好，无渗漏性。
[0005] 目前临床上应用较广的主要有四大类即同种异体的硬脑膜、天然的生物膜类如牛心包膜/羊心包膜、合成材料如ePTEE(膨聚四氟乙烯)以及一些天然材料如Vicryl等，这些修补材料具有取材方便、易于制备以及较好的生物相容性等优点，在较长时期内受到神经外科工作者的青睐。然而通过观察远期效果发现，这些修补材料均存在不同程度的缺陷，很容易造成修补术后颅内外感染、出血、脑脊液漏以及克罗伊茨费尔特-雅各布病(creutzfeldt-jakob disease，CJD)等多种并发症。具体而言，自体筋膜等自体材料虽然具有不发生排斥反应、组织相容性佳的特点，但存在自体膜的提取需另行手术、取材来源有限，且与脑存在一定程度的粘连而易引发癫痫等缺陷；冻干人硬脑膜等同种异体组织的优点是具有正常人体脑膜的超微结构，能够起到一定的支撑及保护脑组织的作用，但存在材料来源有限、受到伦理道德的限制、且具有潜在感染病毒性疾病的缺陷；牛心包、猪腹膜等异体生物材料的优点是组织炎症反应轻微，修补后脑膜完整性好，能有效防止脑脊液漏，具有一定的伸展性和弹性，表面光滑，不易与周围组织产生粘连，但在去除异种蛋白抗原性时运用的戊二醛会在材料中残留部分醛基，因此存在不易彻底清除从而阻碍细胞侵入植入组织、具有一定毒性、存在异物反应可能的缺陷；TachoComb、Vicryl等人工合成修补材料的优点是取材方便、价格低廉，但缺陷是作为永久性异物，排斥反应很难避免，易致无菌性炎症反应及刺激肉芽组织生成。这使得寻找一种新的硬膜修补材料成为领域中共同关注的问题。
[0006] 伴随着免疫学和组织工程技术的发展，脱细胞异体真皮基质逐渐发展成为一种新型的组织修复材料。脱细胞异体真皮基质取材于人体皮肤组织，经特殊的理化、生化处理，去除了可能引起免疫排异反应的所有成份，但完整地保留了原有组织的纤维立体支架结构，植入后很快有新生血管和成纤维细胞长入，取得了良好的临床效果。
[0007] 近年来已有多项报道将脱细胞异体真皮基质应用于硬脑膜损伤的治疗，且取得了较好的治疗效果。Chaplin是最早将脱细胞异体真皮基质应用于硬脑膜损伤的治疗，结果显示术后动物存活良好，未见明显炎症反应，与周围硬脑膜愈合良好。Warren等也在2000年报道了使用脱细胞异体真皮基质对200例硬脑膜缺损患者进行修补治疗，经过1年的随访，结果显示没有一例出现炎症反应，且脱细胞异体真皮基质周边及其下面均未出现粘连和瘢痕形成。
[0008] 目前脱细胞异体真皮基质主要通过Dispase-Triton法和NaCl-SDS法制备。前者通过化学除垢剂联合其他辅助试剂去除皮肤组织内的细胞和抗原成分，如在含有EDTA和胰蛋白酶或DispaseII酶的溶液中脱除细胞，后在TritonX-100中孵育制得；后者通过高渗氯化钠和SDS制备，但会残留较多抗原成分。除此之外，还有胰蛋白酶消化法、反复冻融法、NaOH销蚀法、平衡盐孵育法等制备方法，但较前两种应用较少。上述制备方法是制备脱细胞异体真皮基质的通用方法，并未考虑硬脑膜损伤对补片强度、弹性、伸长性的特殊需要，尤其是颅内高压对硬脑膜损伤补片顶破强度的要求，在应用于硬脑膜损伤的治疗时，可能存在顶破强度较低、柔软性较高而出现鼓胀、漏液等现象。
[0009] CN103263694A使用脱细胞猪真皮制备了一种胶原基硬脑膜，为了提高硬脑膜补片的强度，改善其力学强度，该发明在脱细胞真皮制备时增加了纳米静电纺丝技术，使硬脑膜具备双层复合结构或三层复合结构。CN104888273A为了解决脱细胞真皮基质耐受高颅内压、防止脑脊液渗漏等问题，在脱细胞真皮制备中引入了防渗层涂覆的方法，构建了双层复合型硬脑膜修补材料。本发明针对上述问题提出新的解决方案。
发明内容
[0010] 本发明为解决上述技术问题，提供了一种具备较高的韧性、顶破强度和拉伸强度等生理特征、且更易于硬脑膜损伤患者修补硬脑膜使用的脱细胞异体真皮基质及其相关产品。
[0011] 为克服以上现有技术中硬脑膜缺损修复材料和方法的不足，本发明汲取生物蛋白胶和Lynn Oconnor的生物材料经验，通过先交联再脱细胞，并引入蛋白酶消化处理和表面活性剂高渗溶液联合处理、氨基酸溶液营养等多步骤协同操作，发明制备了一种新的脱细胞异体真皮基质材料，并将其制作成硬脑膜损伤修复补片，用于硬脑膜损伤的修复治疗。
[0012] 本发明提供一种脱细胞异体真皮基质，其特征在于其是由异体皮经过交联处理、蛋白酶溶液消化处理、含表面活性剂的高渗盐溶液脱细胞处理、DNA降解处理、氨基酸营养处理、冷冻干燥获得。
[0013] 本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，包括如下步骤：
[0014] 步骤一，将异体皮原料投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡；
[0015] 步骤二，将浸泡原料取出，投入盛有生理盐水溶液容器中浸泡，得半成品A；
[0016] 步骤三，将半成品A投入盛有蛋白酶溶液的容器中，浸泡振荡处理，得半成品B；
[0017] 步骤四，将半成品B投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡处理；更换表面活性剂和高渗盐溶液，超声浸泡处理；重复该操作多次，得半成品C。
[0018] 步骤五，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；
[0020] 步骤七，将半成品E用生理盐水浸泡振荡处理，得半成品F；
[0021] 步骤八，将半成品F取出，用氨基酸溶液浸泡后，投入盛有生理盐水溶液容器中，静置，得半成品G；
[0022] 步骤九，将半成品G取出，置于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得半成品H；
[0023] 步骤十，将半成品H取出，包装，灭菌，得成品I。
[0024] 本发明制备的脱细胞异体真皮基质的顶破强度≥20kPa、缝合强度≥18N、拉伸强度为4.0MPa-6.5MPa、拉伸伸长率为10％-15％。
[0025] 在某些实施方式中，前述步骤一中使用的交联剂溶液的配方是用京尼平、戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、一水吗啉乙磺酸中的一种或多种作为交联剂，交联剂与异体皮原料质量比为0.5-6：1；优选交联剂溶液的配方是用京尼平与选自戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、一水吗啉乙磺酸任一作为交联剂，其中，京尼平与另一交联剂的质量比为1-6:1，交联剂与异体皮原料质量比为0.1-4:1.
[0026] 在某些实施方式中，前述步骤三使用的蛋白酶选自胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或其组合；优选地，所述蛋白酶溶液为0.1-0.3％胰蛋白酶-dispase酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2-3:0.1-1.8，溶液pH值为7.0-8.0；最优选胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2:1；或所述蛋白酶溶液为0.1-0.4％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为2-3:0.1-1.8，溶液pH值为6.0-8.0；或所述蛋白酶溶液为0.1％-0.3％胰蛋白酶-菠萝蛋白酶溶液(w/v)，其中，胰蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为2-3:0.1-1.8，溶液pH值为7.0-8.0。
[0027] 在某些实施方式中，前述步骤四所述表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.1-0.3g/L聚乙二醇与SDS，或含有0.1-0.3g/L聚乙二醇与Triton X-100的高渗盐溶液，其中，聚乙二醇选择分子量400-2000，聚乙二醇与SDS或Triton X-100的质量比为40-60:60-40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA；优选聚乙二醇与SDS或与Triton X-100的质量比为50-60:50-40。
[0028] 在某些实施方式中，前述步骤六中DNA水解酶溶液的配方是DNA水解酶浓度为2-10g/L，pH7.0-8.0；优选浓度为3-8g/L。
[0029] 在某些实施方式中，前述步骤八中氨基酸溶液选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸、或其组合配制而成，氨基酸浓度为0.5-2g/L；优选由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3-4:1.1-1.3:1.0-1.6：0.96-1.16:0.07-0.08质量比配制；更优选所述比例为3.3:1.1:1.3:0.96:0.07，氨基酸浓度为0.6-1.6g/L。
[0030] 在某些实施方式中，前述步骤一中浸泡时间为3-6h。
[0031] 在某些实施方式中，前述步骤二中浸泡时间为8小时，浸泡次数为6-9次，浸泡温度为5-10℃。
[0032] 在某些实施方式中，前述步骤三中的浸泡振荡为浸泡3-6小时，振荡转速为50-200rpm，重复操作1-3次。
[0033] 在某些实施方式中，前述步骤四中的超声浸泡条件为：30-60KHz，100-400W，超声5-10分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。
[0034] 在某些实施方式中，前述步骤五中的振荡处理条件为振荡2小时，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次。
[0035] 在某些实施方式中，前述步骤七的条件为生理盐水浸泡10-12小时，振荡处理；更换生理盐水，振荡处理，重复该操作2-4次。
[0036] 在某些实施方式中，前述步骤五、七中振荡转速为50-200rpm。
[0037] 在某些实施方式中，前述步骤九的冷冻干燥步骤具体为将半成品G在零下20℃至零下40℃条件下，真空度不高于10Pa条件下，真空干燥20-60h。
[0038] 在某些实施方式中，前述步骤十的包装为将半成品H装入包装袋中，封口包装完毕；所述灭菌为钴-60照射，照射剂量为20-30kGy。
[0039] 本发明另一方面提供一种硬脑膜补片的制备方法，其是将前述脱细胞异体真皮基质，或前述方法得到的脱细胞异体真皮基质按照实际需要制备成硬脑膜补片；优选地，硬脑膜补片的尺寸为宽1-20cm，长1-20cm。
[0040] 本发明另一方面提供一种脱细胞异体真皮基质或硬脑膜补片，其通过前述方法制备获得。
[0041] 本发明另一方面提供一种用于硬脑膜损伤修复的试剂盒，其特征在于，包含前述的脱细胞异体真皮基质或硬脑膜补片。所述试剂盒，可以进一步包含手术刀、手术剪、止血钳、镊子、缝合针、含注射用水的安瓿瓶、注射器。
[0042] 本发明另一方面提供使用前述脱细胞异体真皮基质制备治疗硬脑膜损伤的修复材料中的用途。所述硬脑膜损伤可以是开放性颅脑损伤或肿瘤侵蚀造成的脑损伤或先天性疾病造成的硬脑膜缺损。所述脱细胞异体真皮基质或补片在使用前需先进行如下操作：20℃-35℃生理盐水中完全浸泡复水15分钟。
[0043] 本发明真皮基质来源于自愿捐献者的皮肤、羊膜。本发明脱细胞异体真皮基质的保存条件为阴凉干燥处，相对湿度小于等于45％。
[0044] 本发明根据硬脑膜损伤修补治疗的需要，改进和优化了脱细胞异体真皮基质的制备工艺。本领域使用脱细胞异体真皮基质对硬脑膜损伤进行修复时，可采用不缝合和缝合两种方式，当选择不缝合时，将较硬脑膜窗稍大之脱细胞异体真皮基质铺于缺损处，将其边缘放置于硬脑膜下，在两者的交界缘涂一层粘合剂；当选择缝合时，需要将脱细胞异体真皮基质补片与硬脑膜缺损部位进行缝合，而为了避免脑积液从切口缝线处漏出，需要提高缝合密度，必要时还需要联合使用封闭剂，此时，硬脑膜缺损修复需要脱细胞异体真皮基质补片具有较高的缝合强度。本发明脱细胞异体真皮基质能够同时满足上述两种修复手术需求。本发明通过蛋白酶处理组织产品能够提高组织产品机械性能，获得较好的弹性和韧性，提高组织的撕裂、缝合强度，将蛋白酶处理与表面活性剂高渗盐溶液联合进行脱细胞，还能够达到很好的脱细胞效果，降低了细胞毒性和排斥反应。
[0045] 进一步的，由于硬脑膜损伤修复后，修复材料需要能够耐受颅内高压，避免出现脑积液渗漏，修补片鼓胀等状况，不同于使用脱细胞异体真皮基质覆盖烧烫创伤、填塞治疗肛瘘等方面的应用，硬脑膜损伤的修复需要对修补材料的韧性、拉伸延长率、致密性和顶破强度有着特殊的要求。本发明发现在脱细胞处理之前引入交联剂处理的操作能够进一步提高前述脱细胞异体真皮基质材料致密性和顶破强度，控制拉伸延长率。交联剂一方面增强胶原的强度，力学性能更适于硬脑膜损伤修补手术，另一方面通过交联可以延长在体内的降解或消化，有利于血管化和组织转轨；同时对制备获得的脱细胞异体真皮基质材料进行冻干处理，也能够协同增加材料的顶破强度。
[0046] 进一步的，本发明将提高组织产品机械性能的方法与脱细胞异体真皮制备方法进行融合，并进行工艺的调整和改进，如将酶处理步骤与表面活性剂高渗溶液处理步骤进行顺序调整将会影响终产品的性能，在脱细胞处理中使用超声浸泡以及氨基酸溶液浸泡有利于改善终产品的性能等。经过对工艺操作的不断筛选和优化，最终获得了本发明制备脱细胞异体真皮基质的方法。通过本发明制备获得的脱细胞异体真皮基质的顶破强度≥20kPa、缝合强度≥18N、拉伸强度为4.0MPa-6.5MPa、拉伸伸长率为10％-15％；在某些实施方式中，脱细胞异体真皮基质的顶破强度范围为20-25kPa、缝合强度范围为18-25N、拉伸强度为4.0MPa-6.5MPa、拉伸伸长率为10％-15％。均能够满足硬脑膜损伤修复对于补片材料的强度等机械性能的需要。
[0047] 本发明优选地实施方式中采用低毒性的交联剂，如京尼平、戊二醛、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、一水吗啉乙磺酸中的一种或多种作为混合交联剂，在提高交联度的同时，降低了产品的细胞毒性；同时利用表面活性剂和高渗盐在超声条件下进行脱细胞处理，脱细胞效果更好，并与下一步生理盐水协同，进一步脱除细胞。
[0048] 通过与现有技术文献对比，本发明对工艺步骤的选择和优化给脱细胞异体真皮基质的生理特性带来了协同效果。ZL96104550.7(母案)或ZL00120211.1(分案)公开了一种制备脱细胞异体皮肤移植体(即本公司J-1型产品)的方法，该方法亦采用先将生物组织置于含戊二醛等固定剂的固定液处理(类似于本发明的交联处理)，再通过碱溶液脱细胞处理、氨基酸孵育等，通过对该发明制备产品与本发明产品机械性能的对照测试发现，本发明产品的机械性能进一步提高(结果参见本发明实施例4)，更加适宜用于硬脑膜损伤的修复治疗。
[0049] 本发明的脱细胞异体真皮基质较之市场同类产品(对照组：来源于猪心包膜或胸膜的生物型硬脑膜补片)展现出的有益效果包括：术后长周期上(三月及六月)，本发明的脱细胞异体真皮基质与脑皮层的粘连情况好于对照组；炎症及排异由重到轻依次为对照组、本发明的脱细胞异体真皮基质组、空白组，并随时间延长，炎症及排异反应逐渐减轻，即本发明的脱细胞异体真皮基质在手术部位造成的炎性细胞浸润变化不明显，发生炎症(I型变态反应)的程度较市场中同类产品轻。可见，本发明的脱细胞异体真皮基质能够有效修复硬脑膜缺损部位，各项观察指标与对照产品相当或好于对照产品。
[0050] 综上，本发明的脱细胞异体真皮基质作为硬脑膜缺损修复材料具有以下优点：(1)就产品性能来说，本发明的脱细胞异体真皮基质是经过工艺改进的产品，产品的机械性能得到提高，如相对于本公司的J-1型产品，产品指标增加的顶破强度≥20kPa、缝合强度≥18N、拉伸强度为4.0MPa-6.5MPa、拉伸伸长率为10％-15％，较之市场上的其他同类产品具有更适于硬脑膜缺损修复的机械性能；(2)就产品效果来说，动物实验中显示，本发明的脱细胞异体真皮基质无脑皮层血管破裂出血、脑组织肿胀；无深层白质的水肿、胶质细胞和神经元肿胀、胞浆和胞核染色变淡、细胞间隙增宽等现象；胶质细胞无明显增生，神经元数目无明显减少；出现术后胶原纤维生长明显；脱细胞异体真皮基质与脑膜粘合良好，与脑皮层无粘连、能够轻易分离，脑皮层与人工材料接触的部分色泽正常，发生炎症的程度较轻，有更多的胶原增生，较之市场上的其他同类产品更接近于正常组织、效果更好；(3)具有良好的安全性，无细胞毒性和排斥反应，成功率高。
[0051] 本发明脱细胞异体真皮基质可用于治疗脑损伤或硬脑膜缺损。特别可以用于硬脑膜损伤修复，尤其适合以下情况：(1)开放性颅脑损伤；(2)肿瘤侵蚀造成的脑损伤；(3)先天性疾病会造成硬脑膜缺损。附图说明
[0052] 图1是本发明实施例5中脱细胞异体真皮基质(TP组)及对照组(NC组)、空白组的HE染色结果。图1A是手术后一周HE染色结果，图1B是手术后一个月HE染色结果，图1C是手术后三个月HE染色结果，图1D是手术后六个月HE染色结果。
[0053] 图2是本发明实施例5中脱细胞异体真皮基质(TP组)及对照组(NC组)、空白组的AB染色结果。图2A是手术后一周HE染色结果，图2B是手术后一个月HE染色结果，图2C是手术后三个月HE染色结果，图2D是手术后六个月HE染色结果。
[0054] 图3是本发明实施例5中AB染色结果汇总曲线图。根据切片染色情况，将着色最重定为5分，无着色定为0分，着色从深到浅依次为4分、3分、2分、1分，按各组切片的时间顺序。可以看出，炎症及排异由重到轻依次为NC组、TP组、空白组，并随时间延长，炎症及排异反应逐渐减轻。
具体实施方式
[0055] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0056] 实施例1 脱细胞异体真皮基质的制备方法
[0057] 本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，优选制备实施例包括按顺序进行下列步骤：
[0058] 将原料投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡4小时，交联剂为京尼平与N-羟基丁二酰亚胺，交联剂为京尼平与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为6:1，交联剂与异体皮原料质量比为1.2：1，浸泡8小时。将原料取出，投入另一盛有生理盐水溶液容器中5℃浸泡56小时，每隔8小时换一次生理盐水溶液，即得半成品A。
[0059] 将半成品A投入到0.2％胰蛋白酶-dispase酶溶液(w/v)浸泡振荡，其中，胰蛋白酶与dispase酶的质量比是2:1，用PBS缓冲溶液调pH值至7.4，振荡转速为100rpm,浸泡4小时，即得半成品B。
[0060] 将半成品B投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡，得半成品C。超声浸泡条件为：50KHz，220W，超声6分钟，浸泡3小时，重复3次；含有表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇与SDS其中，聚乙二醇选择分子量为1500，聚乙二醇与SDS的质量比为60:40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA。
[0061] 将半成品C取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡4次，振荡转速为100rpm,得半成品D。
[0062] 将半成品D取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，25℃浸泡4小时，得半成品E，DNA水解酶溶液的浓度是5g/L，用PBS缓冲溶液调pH至7.2。
[0063] 将半成品E取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡3次，振荡转速为100rpm,得半成品F。
[0064] 将半成品F取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃条件下浸泡3次，每次浸泡2.5小时，将处理后的半成品F取出，投入生理盐水溶液中，即得半成品G，氨基酸溶液的浓度为1.5g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3.3:1.1:
1.3：0.96:0.07质量比配制。
1.3：0.96:0.07质量比配制。
[0065] 将半成品G取出，置于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得半成品H，冻干条件为：
[0066] 将半成品G在零下35℃条件下，真空度低于10Pa条件下，真空干燥50h；
[0067] 将半成品H取出装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品I。
[0068] 实施例2 脱细胞异体真皮基质的制备方法
[0069] 本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，优选制备实施例包括按顺序进行下列步骤：
[0070] 将原料投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡4小时，交联剂为京尼平与N-羟基丁二酰亚胺，京尼平与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为4:1，交联剂与异体皮原料质量比为1.4：1，浸泡8小时。将原料取出，投入另一盛有生理盐水溶液容器中5℃浸泡64小时，每隔8小时换一次生理盐水溶液，即得半成品A。
[0071] 将半成品A投入到0.3％胰蛋白酶-木瓜蛋白酶溶液(w/v)，浸泡振荡，其中，胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比是2.5:1，用PBS缓冲溶液调pH值至7.2，振荡转速为100rpm,浸泡4小时，即得半成品B。
[0072] 将半成品B投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡，得半成品C。超声浸泡条件为：60KHz，220W，超声6分钟，浸泡3小时，重复3次；含有表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.3g/L聚乙二醇与Triton X-100,其中，聚乙二醇选择分子量为1000，聚乙二醇与Triton X-100的质量比为50:50，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA。
[0073] 将半成品C取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡4次，振荡转速为100rpm,得半成品D。
[0074] 将半成品D取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，25℃浸泡4小时，得半成品E，DNA水解酶溶液的浓度是6g/L，用PBS缓冲溶液调pH至7.2。
[0075] 将半成品E取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡3次，振荡转速为100rpm,得半成品F。
[0076] 将半成品F取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃条件下浸泡3次，每次浸泡2.5小时，将处理后的半成品F取出，投入生理盐水溶液中，即得半成品G，氨基酸溶液的浓度为2g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照4:1.3:1.2：
1.1:0.08质量比配制。
1.1:0.08质量比配制。
[0077] 将半成品G取出，置于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得半成品H，冻干条件为：
[0078] 将半成品G在零下35℃条件下，真空度低于10Pa条件下，真空干燥50h；
[0079] 将半成品H取出装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品I。
[0080] 实施例3 脱细胞异体真皮基质的制备方法
[0081] 本发明提供一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，优选制备实施例包括按顺序进行下列步骤：
[0082] 将原料投入盛有交联剂溶液的容器中，浸泡5小时，交联剂为京尼平与N-羟基丁二酰亚胺，京尼平与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为3:1，交联剂与异体皮原料质量比为1.5：1，浸泡8小时。将原料取出，投入另一盛有生理盐水溶液容器中5℃浸泡56小时，每隔8小时换一次生理盐水溶液，即得半成品A。
[0083] 将半成品A投入到0.2％胰蛋白酶与菠萝蛋白酶溶液(w/v)浸泡振荡，其中，胰蛋白酶与菠萝蛋白酶的质量比为1:1，用PBS缓冲溶液调pH值至7.4，振荡转速为100rpm,浸泡4小时，即得半成品B。
[0084] 将半成品B投入盛有含有表面活性剂和高渗盐溶液的容器中，超声浸泡，得半成品C。超声浸泡条件为：50KHz，220W，超声6分钟，浸泡3小时，重复3次；含有表面活性剂和高渗盐溶液的配方是含有0.2g/L聚乙二醇与SDS其中，聚乙二醇选择分子量为2000，聚乙二醇与SDS的质量比为60:40，高渗盐为50mM tris-HCl，1M氯化钠，10mM EDTA。
[0085] 将半成品C取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡4次，振荡转速为100rpm,得半成品D。
[0086] 将半成品D取出，投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，20℃浸泡4小时，得半成品E，DNA水解酶溶液的浓度是8g/L，用PBS缓冲溶液调pH至7.2。
[0087] 将半成品E取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中，振荡，每振荡2小时，更换生理盐水溶液一次，共振荡3次，振荡转速为100rpm,得半成品F。
[0088] 将半成品F取出，投入盛有氨基酸溶液的容器中，于5℃条件下浸泡3次，每次浸泡2.5小时，将处理后的半成品F取出，投入生理盐水溶液中，即得半成品G，氨基酸溶液的浓度为1.5g/L，氨基酸溶液的配方是由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸按照3.5:1.0:
1.1：1.0:0.07质量比配制。
1.1：1.0:0.07质量比配制。
[0089] 将半成品G取出，置于冷冻干燥机内进行冷冻干燥，得半成品H，冻干条件为：
[0090] 将半成品G在零下35℃条件下，真空度低于10Pa条件下，真空干燥50h；
[0091] 将半成品H取出装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品I。
[0092] 实施例4 脱细胞异体真皮基质的生物学性能检测
[0093] 对实施例1-3制备获得的脱细胞异体真皮基质的机械特性等生物学性能进行测试，性能指标包括拉伸强度、顶破强度、缝合强度、拉伸延长率、含水量、DNA残留量，具体检测结果如表1所示。结果显示，本发明产品韧性和弹性良好、便于缝合、牵拉，且有足够的顶破强度，能够满足硬脑膜损伤补片的治疗需要。
[0094] 表1 脱细胞异体真皮基质复水后检测结果
[0095]脱细胞异体真皮基质 实施例1产品 实施例2产品 实施例3产品 ZL00120211.1产品拉伸强度(MPa) 5.0 6.1 5.8 4.1
缝合强度(N) 18.8 19.3 20.1 16.4
顶破强度(KPa) 21 24 23 11
拉伸延长率(％) 12.4 13.6 13.0 19.6
含水量(％) 4.03 4.11 4.07 6.9
DNA残留量(ng/mg) 0.9 0.7 1.0 4.2
缝合强度(N) 18.8 19.3 20.1 16.4
顶破强度(KPa) 21 24 23 11
拉伸延长率(％) 12.4 13.6 13.0 19.6
含水量(％) 4.03 4.11 4.07 6.9
DNA残留量(ng/mg) 0.9 0.7 1.0 4.2
[0096] 实施例5 脱细胞异体真皮基质用于硬脑膜损伤修复
[0097] 将前述实施例1-3制备的脱细胞异体真皮基质用于实验动物硬脑膜损伤修复。
[0098] 3.1 实验动物及实验材料
[0099] 3.1.1 实验动物
[0100] 所使用的实验动物模型为标准新西兰大白兔，性别均为雌性，体重为2.5±0.1kg。
[0101] 3.1.2 实验材料
[0102] 人工脑膜材料：实验人工脑膜材料为本发明脱细胞异体真皮基质材料，对照人工脑膜材料为国内一企业生产的来源于猪心包膜或胸膜的生物型硬脑(脊)膜补片。
[0103] 3.2 实验方法
[0104] 3.2.1 实验兔分组
[0105] 实验组(TP)：去骨瓣去脑膜，植入实验人工脑膜材料；
[0106] 普通对照组(NC)：去骨瓣去脑膜，植入对照人工材料，
[0107] 空白对照组(空白)：去骨瓣去脑膜，不植入任何人工材料。
[0108] 观察时间分别为1周、1月、3月、6月，观察时间到期后取出人工材料观察其临床改变及组织学改变。实验兔分组情况汇总见表2，具体分组编号汇总见表3。
[0109] 表2 实验兔分组情况
[0110]
[0111] 表3 实验兔具体分组编号
[0112]时间\编组 TP NC 空白
一周 TP10,TP13TP15,TP16,TP23,TP24 NC16,NC17,NC21,NC22,NC23 11,14,15,22,23一月 TP08,TP09,TP12,TP20,TP21,TP22 NC10,NC14,NC15,NC18,NC19,NC20 12,13,18,19,20,21三月 TP07,TP11,TP14,TP17,TP18,TP19 NC07,NC08,NC09,NC11,NC12,NC13 07,08,09,10,16,17六月 TP01,TP02,TP03,TP04,TP05,TP06 NC01,NC02,NC03,NC04,NC05,NC06 01,02,03,04,05,06[0113] 3.2.2 手术过程及术后管理
一周 TP10,TP13TP15,TP16,TP23,TP24 NC16,NC17,NC21,NC22,NC23 11,14,15,22,23一月 TP08,TP09,TP12,TP20,TP21,TP22 NC10,NC14,NC15,NC18,NC19,NC20 12,13,18,19,20,21三月 TP07,TP11,TP14,TP17,TP18,TP19 NC07,NC08,NC09,NC11,NC12,NC13 07,08,09,10,16,17六月 TP01,TP02,TP03,TP04,TP05,TP06 NC01,NC02,NC03,NC04,NC05,NC06 01,02,03,04,05,06[0113] 3.2.2 手术过程及术后管理
[0114] 将兔子麻醉，在顶叶距中线2mm与中线平行切口，长3-4cm，常规消毒铺巾，连接手术器材，划皮，拉开皮肤，双极止血，磨钻打开直径1.4cm大小圆形骨窗，用咬骨钳将骨窗边缘处理平整，封骨蜡，剪开脑膜，将脑膜处理成直径1-1.2cm大小圆形缺口，填补人工材料，不归还骨瓣，填塞明胶海绵，缝合皮，盖以敷料。术后抗生素的使用为Penicillin和Streptomycin复用，如有真菌感染加用两性霉素B。将TP、NP、空白组分别在1周、1月、3月、6月的腹腔注射水合氯醛麻醉，进行手术并行术后观察。其中，实验兔各组存在意外死亡情况，除外与手术直接相关的死亡原因(腹腔感染，为注射麻醉剂部位感染)，与手术及植入物肯定有关及可能有关的死亡(脑脓肿与未明原因感染)，TP组、NC组与空白组与手术及植入物肯定有关及可能有关的死亡率，三组之间无明显统计学差异(P<0.05)。证明结果有效。
[0115] 3.2.3 样本收集方法
[0116] 将兔子耳缘静脉注射氯化钾法处死，用头架固定兔子头部，备皮，按原切口切开头部皮肤，观察骨窗周围软组织增生情况，小心除去增生组织，暴露植入人工材料(实验组和普通对照组)或脑皮层，用咬骨钳咬去骨窗周围骨骼，使覆盖的人工材料及脑组织完全暴露出来，观察人工材料与周围组织长合情况，小心用手术刀将附有人工材料的脑组织完整的分离取下，直接存放于37％甲醛溶液中固定，4℃保存。
[0117] 3.2.4 样本处理方法
[0118] 将组织进行石蜡包埋、切片。进行肉眼观察、HE染色观察及AB染色观察。HE染色是常用的形态学染色方法，可以观察到各种组织或细胞的一般形态结构特点，镜下观察细胞核呈蓝色；细胞浆一般呈红色；胶原纤维呈不同程度的红色，红细胞呈亮红色；钙化组织呈深蓝色等。AB染色，使用阿利新蓝作为染料，与酸性基团形成盐后，使胞质中的酸性粘多糖染成蓝色，定位于胞质内，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，通过阿利新蓝染色可以有效的显示炎症发生部位以及术后炎症恢复情况。
[0119] 3.3 实验结果
[0120] 3.3.1 肉眼观察
[0121] 短时间内(一周及一月)：TP实验组和NC对照组的观察结果相似。其人工材料与脑膜及脑皮层无粘合，均能轻易分离，与人工材料接触部分脑皮层色泽正常。
[0122] 长周期上(三月及六月)：TP实验组的观察结果好于NC对照组。TP实验组的人工材料与脑膜粘合良好，与皮层无粘连，能够轻易分离，与人工材料接触部分脑皮层色泽正常；NC对照组与脑膜粘合良好，与皮层略有粘连，能够分离，与人工材料接触部分脑皮层色泽正常。
[0123] 3.3.2 HE染色
[0124] 结果显示TP、NC、空白组均无脑皮层血管破裂出血；均未出现脑组织肿胀；均未出现深层白质的水肿、胶质细胞和神经元肿胀、胞浆和胞核染色变淡、细胞间隙增宽等现象；均出现术后胶原纤维增生，其中TP和NC组较为明显，两者无明显差异；TP、NC、空白组随时间变化炎性细胞浸润变化不明显；胶质细胞无明显增生，神经元数目无明显减少；TP组由于人工材料与脑皮层无粘连，部分标本取下时人工材料与脑皮层分离，切片后镜下观察人工材料已脱落。结果如图1所示。
[0125] 3.3.3 AB染色
[0126] 不同实验组染色结果显示：空白组染色结果全是阴性，表明空白组手术并未使组织产生炎症反应；TP组跟NC组染色结果均有阳性，并且在同一时间上NC组阳性面积较TP组阳性面积大、染色细胞分布区域广，说明TP组发生炎症(I型变态反应)的程度较NC组的为轻。
[0127] 不同检测时间染色结果显示：TP实验组跟NC实验组经过手术之后，随着饲养周期的增长，阿尔新兰染色的阳性细胞从多个变成局部几个细胞，甚至变为阴性染色结果。说明经过手术之后，经过3到6个月的饲养，脑部炎症情况会减轻，直至消失。空白组阿尔新兰染色在不同时间段均呈阴性结果。
[0128] TP组较NC组发现更多的胶原增生，空白组胶原增生较少。
[0129] AB染色结果如图1A-D所示。
[0130] 3.3.4 实验结论
[0131] TP组、NC组与空白组与手术及植入物肯定有关及可能有关的死亡率，三组之间无明显统计学差异(P<0.05)。
[0132] 肉眼观察显示：短时间内(一周与一月)，TP组与NC组人工材料与脑膜及脑皮层无粘合，均能轻易分离；长周期上(三月及六月)，TP组人工材料与脑皮层的粘连情况好于NC组。
[0133] HE染色结果显示：镜下观察TP组、NC组与空白组三组之间无明显差异。(图2A-D)[0134] AB染色结果显示：炎症及排异由重到轻依次为NC组，TP组，空白组，并随时间延长，炎症及排异反应逐渐减轻。(图3)
[0135] 可见，本申请的硬脑膜补片植入实验动物硬脑膜缺损部位后，能够有效修复缺损部位，各项观察指标与对照产品相当，其安全性及有效性得到了验证，正在开展临床试验以进一步观察。
[0136] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 危险污染物收集试剂盒和快速测试 | 2020-05-11 | 482 |
| 用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的分子标记、引物组合物、试剂盒及应用 | 2020-05-12 | 383 |
| 一种共轭三烯类化合物及其制备方法和应用 | 2020-05-11 | 530 |
| 小分子诱导人成纤维细胞直接重编程为肝细胞的方法 | 2020-05-11 | 942 |
| 二氧化氯气体的发生方法、液态组合物、凝胶状组合物、及二氧化氯气体发生试剂盒 | 2020-05-11 | 398 |
| 医药试剂盒及其用途 | 2020-05-11 | 108 |
| 数据管理方法、体外诊断设备及存储介质 | 2020-05-11 | 185 |
| 以水为载流的原子荧光分析同步测定汞与砷的方法 | 2020-05-11 | 229 |
| 一种检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒 | 2020-05-12 | 633 |
| 快速检测苹果褐斑病菌的LAMP引物及其检测方法和试剂盒 | 2020-05-11 | 783 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈