本发明涉及检测或确定丙型肝炎病毒(HCV)的方法以及检测或确定 HCV的试剂。

用于检测感染的病因性病毒的方法是抗体试验、抗原试验和遗传试 验。

免疫测定是抗体试验和抗原试验的基本方法，广泛应用于病毒感染 的诊断，输血用血液之病毒筛选试验，监测病毒感染的治疗等。遗传试 验可以利用基因扩增法进行，例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式 反应(LCR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)、具有改进的标记效能的分 支DNA(bDNA)方法等，这些方法能够进行高灵敏度地测定。

遗传试验不仅用于确定诊断，而且用于检测水平在上述抗体试验和 抗原试验检测水平限之下的病毒，以及评价药物治疗中的病毒消除。近 来，期望将基因扩增法应用于输血用血液的筛选试验，以检测抗体试验 或抗原试验不能检测到的早期病毒感染。

然而，遗传试验还存在多种问题；例如，程序复杂，需要特殊装置， 需要技术人员，花费高昂，缺乏足够的重现性和测量精确性，不适合处 理大量样品，由于样品中的抑制因素易于显示假阴性结果，与样品中的 蛋白质相比核酸自身不稳定，而且基因的扩增效能不一致。据报道，如 果来源于病毒的核酸是RNA，则核酸仍然不太稳定，得出根据试验方法 和试验样品的保存条件而变化很大的结果。

抗病毒抗体的试验，即检测体内免疫机制产生的抗病毒抗体，是观 察病毒感染效果的方法。针对抗原的抗体的产生在不同个体中各不相同； 即，存在表现高抗体效价的个体和根本不能产生抗体的个体。而且，难 以预测患者的实际状况和患者体内的病毒量，因为抗体量不一定对应于 病毒量。还存在不能做出准确判断的问题，因为病毒感染的早期不产生 抗体，这就不可能检测早期感染，还观察到抗体的非特异性反应。

抗原试验是检测来源于病毒的抗原的方法，商业提供了多种用于来 源于病毒的抗原的测定系统。对于抗原试验，主要应用利用识别病毒来 源抗原的抗体的免疫测定，但与基因扩增法相比它的灵敏度不够好。于 是，还存在小量病毒不能被准确检测到的问题。而且，病毒和抗病毒抗 体在体内共同存在，这些共存的抗体和免疫测定中应用的抗体竞争性地 与抗原反应，有时这使得难于高灵敏度地测定抗原。已经研究出一些检 测HBV和其它肝炎病毒、HIV等的抗原测定系统，但它们比DNA扩增 法例如PCR灵敏度低，不足以用作诊断或治疗的标志。

近来，研究出一种用于HCV核心蛋白质(HCV的内部抗原)的测 定系统(日本公开而未审的专利申请，公开号29427/96)。与测定基因的 方法相比，该方法简便，能够稳定测定，该方法中应用的试剂盒用于HCV 的确诊和HCV治疗效能的预测和判断。然而，与PCR法相比，该方法 灵敏度不够好，因此单独该HCV核心蛋白测定法不足以用作诊断或治疗 的标志。实际上，该方法的检测限为8pg/ml(PCR滴度为104-5病毒粒 /ml)，它高于PCR法的局限10倍以上。因此，在判断治疗效果时，HCV 核心蛋白含量为8pg/ml或更低的样品被判断为阴性，这意味着该方法不 能检测小量病毒。

通常知道抗原-抗体反应中应用高浓度的盐会抑制反应，并使抗原从 抗原-抗体反应产物中解离出来。

例如，超灵敏酶免疫测定[Eiji Ishikawa，Gakkai Shuppan Center (1993)]的第9章中有下列描述：“因为蛋白质与固相的非特异性吸附依条 件而改变，因此期望通过调整条件减少血清的相互作用，从而降低非特 异性吸附的程度。在胰岛素夹心免疫测定中，通过降低与抗-胰岛素IgG- 固定化聚苯乙烯小珠一同培养的血清浓度和减少培养时间而降低了血清 干扰(表IX-14)(Ruan等，1986)。还可以通过增加无机盐的浓度降低 蛋白质与固相非特异性吸附的程度，而降低血清干扰(表IX-15，图 IX-18-IX-21)(Hashida，等1983)。有效浓度根据无机盐的种类而改变；

然而，如果浓度太高，免疫反应自身被抑制。例如，对于氯化钠， 最高浓度可以是0.3-0.4mol/l。”

本发明的目的在于提供一种检测或确定HCV抗原的方法，它能够简 便和高灵敏度地检测或确定HCV抗原，适用于需处理大量样品的血液交 易和健康检查中筛选，本发明的目的还在于提供所述方法中应用的检测 或确定HCV抗原的试剂。

本发明人出乎意料地发现，与应用其它物质而不是碱性磷酸酶标记 抗HCV核心蛋白抗体的情况不同，使碱性磷酸酶标记的抗HCV核心蛋白 抗体和HCV核心蛋白在含有高浓度盐的水溶液中进行抗原-抗体反应，能 够高灵敏度地检测HCV核心蛋白，而不抑制免疫反应。本发明基于这些 发现完成。

本发明涉及下列(1)-(29)方面：

(1)检测或确定样品中HCV核心蛋白的免疫测定，包括使碱性磷酸酶 标记的抗-HCV核心蛋白抗体和样品中的HCV核心蛋白在含有高浓度盐的 水溶液中进行抗原-抗体反应，形成抗原-抗体复合物，然后测定形成的 抗原-抗体复合物的碱性磷酸酶活性。

(2)按照(1)的免疫测定，其中盐是卤化碱金属盐。

(3)按照(1)的免疫测定，其中盐是氯化钠。

(4)按照(1)-(3)之一的免疫测定，其中盐浓度为0.5M至饱和。

(5)按照(1)-(4)之一的免疫测定，其中抗-HCV核心蛋白的抗体是 识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5个连续氨基酸残 基序列的抗体。

(6)按照(1)-(4)之一的免疫测定，其中抗-HCV核心蛋白抗体选自 KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。

(7)按照(1)-(6)之一的免疫测定，其中样品在进行抗原-抗体反 应之前，用促溶物质和/或碱性试剂处理。

(8)按照(7)的免疫测定，其中促溶物质是胍盐。

(9)按照(7)或(8)的免疫测定，其中碱性试剂是氢氧化碱金属。

(10)按照(7)-(9)之一的免疫测定，其中促溶物质的浓度为1M 至饱和。

(11)按照(7)-(10)之一的免疫测定，其中碱性物质的处理在45-55 ℃下进行。

(12)检测或确定HCV核心蛋白的试剂，包括一种碱性磷酸酶标记的 抗-HCV核心蛋白抗体，一种浓度为0.5M至饱和的盐，和一种测定碱性 磷酸酶活性的试剂。

(13)按照(12)的试剂，其中盐是卤化碱金属盐。

(14)按照(12)或(13)的试剂，其中盐是氯化钠。

(15)按照(12)-(14)之一的试剂，其中抗-HCV核心蛋白抗体是 识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5个连续氨基酸残 基序列的抗体。

(16)按照(12)-(14)之一的试剂，其中抗-HCV核心蛋白抗体选 自KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。

(17)检测或确定HCV核心蛋白的试剂盒，包括(12)-(16)之一 的试剂和包含促溶物质和/或碱性试剂的样品处理试剂。

(18)按照(17)的试剂盒，其中促溶物质是胍盐。

(19)按照(17)或(18)的试剂盒，其中碱性试剂是氢氧化碱金属 盐。

(20)按照(17)-(19)之一的试剂盒，其中促溶物质的浓度为1M 至饱和。

(21)识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5个连续 氨基酸残基序列的单克隆抗体。

(22)识别HCV核心蛋白N-末端41-50位氨基酸序列的单克隆抗体。

(23)按照(22)的单克隆抗体，其由杂交瘤KTM-145(FERM BP-6838) 制备。

(24)识别HCV核心蛋白N-末端11-30位氨基酸序列的单克隆抗体。

(25)按照(24)的单克隆抗体，其由杂交瘤KTM-153(FERM BP-6839)制备。

(26)识别HCV核心蛋白N-末端31-50位氨基酸序列的单克隆抗体。

(27)按照(26)的单克隆抗体，其由杂交瘤KTM-157(FERM BP-6840)制备。

(28)识别HCV核心蛋白N-末端21-40位氨基酸序列的单克隆抗体。

(29)按照(28)的单克隆抗体，其由杂交瘤KTM-163(FERM BP-6841)或杂交瘤KTM-167(FERM BP-6842)制备。

任何来源的碱性磷酸酶都可以用于制备本发明的碱性磷酸酶标记的 抗-HCV核心蛋白抗体。例如，可以使用来源于微生物(例如大肠杆菌) 和动物(例如牛)的碱性磷酸酶。

用于制备本发明的碱性磷酸酶标记的抗-HCV核心蛋白抗体的抗 -HCV核心蛋白抗体是指，可与日本公开未审的专利申请No.145194/95 和肝病学(Hepatology)16，886(1992)中描述的HCV核心蛋白反应的抗 体。可以用日本公开未审专利申请145194/95和29427/96以及肝病学， 16，886(1992)中所述的重组DNA技术制备HCV核心蛋白。可以按 照制备单克隆抗体的已知方法，例如，单克隆抗体试验手册(Sakuji toyama编，Kodansha)中描述的方法，利用上述重组HCV核心蛋白作 为免疫原制备抗体。

将上述免疫原对动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、山羊、绵 羊或家禽，优选小鼠或大鼠施用，用于免疫接种以制备单克隆抗体。

可以按照已知方法[例如Saido和Toyoshima，Shin Seikagaku Jikken Koza(关于生化试验的新文献)1，389(1990)Tokyo Kagaku Dojin]进行 免疫接种。例如，将免疫原用完全或不完全弗氏佐剂乳化，将得到的乳 液给动物腹膜内、皮下或肌内施用。以7-30天，优选12-16天的有规律 的间隔给药两次或多次，优选2-4次，完成免疫接种。

可以从免疫动物的脾、淋巴结、外周血等处得到生成抗体的细胞。 还可以通过所谓的“体外免疫”；即通过直接免疫从未免疫动物的脾、淋 巴结、外周血等中收集到的负责抗体产生的细胞，得到产生抗体的细胞 [Arai和Ohta，试验药物，6，43(1988)]。

对用于与产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞没有特别限制，但优选 使用来源于与产生抗体的细胞来源动物相同种动物的细胞系。还优选使 用具有特定药物标记的骨髓瘤细胞以便有效地选择已适当融合的细胞。 例如，优选使用8-氮杂鸟嘌呤抗性骨髓瘤细胞，因为它们不能在含有次 黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(下文称为HAT培养基)中生长，但 这些骨髓瘤细胞和正常细胞融合得到的融合细胞能够在HAT培养基中 生长，因此可以从未融合的骨髓瘤细胞中区分出来。具体实施例是P3× 63-Ag.8.653[免疫学杂志，123，1548(1979)]，P3×63-Ag.8.Ul[微生物 免疫学当前课题(Curr.Topics.Microbiol.Immunol.)，81，1(1978)](下文 简称为P3U1)和Sp/O-Ag14[自然，276，269(1978)]。

可以通过Khler和Milstein[自然，256，495(1975)]研究出来的 方法和它的各种改进方法进行细胞融合。在通常应用的方法中，产生抗 体的细胞和骨髓瘤细胞以10-3∶1的比例混合，然后用30-50％的聚乙二醇 (平均分子量：1500-6000)作为融合试剂处理。还可以通过电穿孔进行 融合[Ohkouchi等，试验药物，6，50(1988)]。

已经历细胞融合处理的细胞悬浮于选择培养基(例如，HAT培养基)， 在适于选择所需细胞的培养容器例如96-孔培养板中培养，以选择性地使 融合细胞生长。通过例如酶免疫测定或放射免疫测定等方法检测融合细 胞的培养基上清液中是否存在所需抗体，从上述生长的融合细胞中筛选 产生抗HCV核心蛋白抗体的细胞。通过限制性稀释法、软琼脂培养法等 从筛选的细胞得到单细胞克隆，建立生产HCV核心蛋白特异性单克隆抗 体的杂交瘤细胞系。

得到的杂交瘤在适当的培养基中培养，或者移植到动物腹膜内，使 其在腹水中生长。可以从收集的培养物或腹水得到单克隆抗体。如果需 要，可以纯化后使用培养物或腹水中的抗体。可以通过各种方法，例如 利用硫酸铵进行的盐析分级分离、离子交换色谱、凝胶过滤柱色谱、利 用蛋白A或蛋白G进行的亲和柱色谱、以及利用抗原-固定化凝胶进行 的亲和柱色谱，以及它们的组合进行纯化。本发明中可用的抗体包括抗 体片段，例如通过使上面获得的抗体接受酶例如胃蛋白酶和/或还原处理 得到的Fab、Fab’和F(ab)2。

优选的抗体是识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列至少5 个连续氨基酸残基序列的抗体。

产生本发明单克隆抗体的杂交瘤的具体例子是杂交瘤KTM-145、杂 交瘤KTM-153、杂交瘤KTM-157、杂交瘤KTM-163和杂交瘤KTM-167。

杂交瘤KTM-145、杂交瘤KTM-153、杂交瘤KTM-157、杂交瘤 KTM-163和杂交瘤KTM-167于1999年8月12日保藏于国家生物科学 和人类技术研究所，工业科学和技术处，国际贸易和工业部，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本，登记号分别为 FERM BP-6838、FERM BP-6839、FERM BP-6840、FERM BP-6841和 FERM BP-6842。杂交瘤KTM-145、杂交瘤KTM-153、杂交瘤KTM-157、 杂交瘤KTM-163和杂交瘤KTM-167产生的单克隆抗体在下文分别称为 KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。

按照例如戊二醛法、高碘酸法、马来酰亚胺法、吡啶二硫化物法和 应用已知交联剂的方法(参见，例如，Eiji Ishikawa，酶免疫测定，Igaku Shoin)，将抗-HCV核心蛋白抗体与碱性磷酸酶经共价键结合得到本发明 的碱性磷酸酶标记的抗-HCV核心蛋白抗体。

在一个实施方案中，用亚胺硫烷等巯基化的抗体与用SMCC(4-[N- 马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)马来酰亚胺基化的碱性 磷酸酶混合。

如本文使用的“含有高浓度盐的水溶液”指含有0.5M或更多无机 盐的水溶液。稳定的无机盐包括卤化碱金属盐、例如，氯化钠、氯化钾 和氯化锂。无机盐的浓度优选0.5M至饱和，更优选1-3M。如果需要， 含有高浓度盐的水溶液可以包括缓冲液、除氯化钠之外的盐、表面活性 剂、血清、防腐剂、免疫反应中的非特异性吸附抑制剂等。

上述溶液中可以使用任何缓冲液。合适的缓冲液是Tris缓冲液。表 面活性剂的例子是Triton X-100、Triton X-705和Tween 20。防腐剂的例 子是叠氮钠。血清的例子是正常小鼠血清。除氯化钠之外其它盐的例子 是氯化锌和氯化镁。免疫反应中非特异性吸附抑制剂的例子是蛋白质， 例如牛血清白蛋白和酪蛋白，和商业产品Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)。

可以通过本发明的方法测定的试验样品包括全血、血清、血浆、尿 和淋巴液。

待测定HCV抗原存在与否的样品可以如上述使用，也可以利用病毒 分离试剂浓缩后使用。分级分离试剂的例子是用于密度梯度的试剂，例 如聚乙二醇(PEG)试剂和Percoll。PEG的分子量和浓度没有特别限制， 但分子量优选1000-20000，浓度优选在3-10％范围内。

优选用具有蛋白质变性活性、蛋白质溶解活性、和蛋白质分散活性 的试剂处理样品。试剂的例子是促溶物质、碱性试剂、酸性试剂和表面 活性剂。优选促溶物质和碱性试剂。

促溶物质的例子是脲、盐酸胍和硫氰酸胍。优选脲和盐酸胍。盐酸 胍的浓度优选1-8M。

作为碱性试剂，可以应用任何水溶液中pH为10或更高的碱性试剂。 适当的碱性试剂的例子是氢氧化碱金属盐。优选氢氧化钠溶液。

酸性试剂的例子是盐酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸和三氯乙酸。

适当的表面活性剂包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳 离子表面活性剂和两性表面活性剂。

优选用促溶物质和碱性试剂二者处理样品。用碱性试剂处理优选在 45-55℃下进行。

优选将用酸性试剂或碱性试剂处理的样品中和后，进行抗原-抗体反 应。样品用酸性试剂处理的情况下，用碱性试剂进行中和；样品用碱性 试剂处理的情况下，用酸性试剂进行中和。在这两种情况下，可还使用 具有高缓冲容量的溶液。

对于本发明的免疫测定没有特别限制，可以使用本领域广泛使用的 方法，例如夹心免疫测定。

具体地说，本发明的免疫测定可以通过夹心免疫测定，例如已知的 1步法、延迟1步法和2步法，利用结合到固相支持物上的抗体和碱性磷 酸酶标记的抗-HCV核心蛋白抗体进行。优选的是2步法，其包括(1) 将抗体结合的固相和含抗原的水溶液样品一同保温，然后用清洗溶液清 洗固相，(2)向其中加入含有标记抗体的水溶液和高浓度盐，然后进一 步培养和清洗，以及(3)测定固相上形成的抗原-抗体复合物的碱性磷 酸酶活性。

上述方法中可以使用常规免疫测定中使用的各种固相支持物。有用 的固相支持物的例子是塑料试管、微板孔、玻璃珠、塑料珠、各种膜和 磁性颗粒(参见，例如，Eiji Ishikawa，酶免疫测定，Igaku Shoin)。待 结合固相支持物的抗体的例子是上述抗-HCV核心蛋白单克隆抗体，优 选使用识别不同于碱性磷酸酶标记之抗体识别表位的抗体。抗体与固相 支持物的结合可以通过已知方法进行，例如物理吸附和化学结合。

碱性磷酸酶的活性可以利用色原、荧光试剂、发光试剂等通过常规 方法测定。(参见，例如，Bunji Maruo，酶手册，Asakura Shoten)。可 以使用本领域已知的任何色原，它们包括能够灵敏检测的酶循环反应试 剂，具体是，利用催化辅酶NAD(AmpliQ，Dako)等氧化-还原循环的 酶的酶循环反应试剂。荧光试剂是4-甲基伞形酮衍生物和2-羟基二苯基 衍生物。

发光试剂的例子是具有二氧杂丁环(dioxetane)结构的衍生物，具 体说是AMPPD[3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧杂丁环]，CDP-星[4-氯-3-(甲氧基螺{1，2-二氧杂丁环-3，2’-(5’-氯) 三环[3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)-苯基磷酸氢二钠]和CSPD[3-(4-甲氧基螺 {1，2-二氧杂丁环-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)苯基磷酸氢二 钠]。不具有二氧杂丁环结构的发光原衍生物也可以使用，具体是APS 化合物([10-甲基-9(10H)-亚吖啶基]苯氧甲基磷酸氢二钠等。

检测或确定本发明的HCV核心抗原的试剂包括碱性磷酸酶标记的 抗-HCV核心蛋白抗体，浓度为0.5M至饱和的盐，和测定碱性磷酸酶活 性的试剂。试剂可以进一步包括抗-HCV核心蛋白抗体-固定化固相和标 准HCV核心蛋白。本发明的试剂可以为包括含有上述成分试剂的试剂盒 形式。

试剂盒可以进一步含有样品浓缩试剂和样品处理试剂。样品浓缩试 剂的例子是上述分级分离试剂。样品处理试剂的例子是上述具有蛋白质 变性活性、蛋白质溶解活性和蛋白质分散活性的试剂。用于测定碱性磷 酸酶活性的试剂包括含有上述色原、荧光物质或发光物质的试剂。抗 -HCV核心蛋白抗体的例子是上述单克隆抗体。

本发明的某些实施方式以下面实施例方式举例说明。本发明的这些 实施例不构成本发明范围的限制。至于血清样品，使用Uniglobe或Boston Biomedica，Inc.(BBI)商业提供的样品。

参考实施例1：HCV核心蛋白的制备

按照日本公开未审专利申请No.29437/96描述的方法制备和纯化具 有HCV核心蛋白N-末端125个氨基酸残基的重组HCV核心蛋白。

利用BioRad蛋白质测定试剂盒(BioRad)和BCA蛋白质测定试剂 盒(Pierce)计算纯化的重组HCV核心蛋白质的浓度。

参考实施例2：抗-HCV核心蛋白抗体的制备

用完全弗氏佐剂乳化从参考实施例1中得到的HCV核心蛋白(25-100 μg)，得到的乳剂施于BALB/C小鼠或SD大鼠用于免疫。2-3周后，用 不完全弗氏佐剂乳化HCV核心蛋白(25-100μg)，得到的乳剂施于动物 进行加强免疫。确定抗体效价升高后，静脉给药25-100μg HCV核心蛋 白。3-4天后，从动物中取出脾，制备脾细胞。然后，预先在RPMI-1640 培养基中培养的小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)与脾细胞以1∶2-1∶5的比率混 合，然后用聚乙二醇进行细胞融合。融合的细胞悬浮于HAT培养基，将 得到的悬浮液移入96孔培养板，然后在CO2培养箱中于37℃培养。以 下述方式筛选抗-HCV核心蛋白的抗体。

将HCV核心蛋白悬浮于8M盐酸胍溶液或10M脲溶液，至浓度为 2μg/ml，得到的悬浮液移入96孔ELISA平板(Nunc)，每孔50μl，4 ℃静置过夜，使HCV核心蛋白吸附到平板上。用含有1％牛血清白蛋白 (下文简称为BSA)的磷酸盐缓冲盐水(下文简称为PBS溶液)封闭后， 将50μl融合细胞的培养上清液置于各孔，然后在室温下反应1小时。 清洗后，向各孔中加入过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG抗体，然后室温下 反应1小时。清洗后，向孔中加入底物ABTS，观察到颜色的孔被筛选 出来，用来得到产生识别HCV核心蛋白的抗体的杂交瘤KTM-145、 KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。将杂交瘤分别移植到降 植烷等处理的小鼠腹腔，得到在腹水中产生的单克隆抗体。按照常规方 法，利用蛋白质A柱(Sakuji Toyama编，单克隆抗体试验手册， Kodansha)纯化获得的单克隆抗体。得到的抗体被分别称为KTM-145、 KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。

参考实施例3：单克隆抗体的反应特异性

利用HCV核心蛋白-或大肠杆菌裂解液吸附的96孔微滴平板，确定 参考实施例2中得到的单克隆抗体的反应特异性。结果证明KTM-145、 KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167与HCV核心蛋白特异性 反应。还通过Western印迹确证它们表现相同的反应。另外，利用HCV 核心蛋白的部分肽进行了表位分析，由此证实KTM-145识别HCV核心 蛋白N-末端41-50位的序列，KTM-153识别11-30位的序列，KTM-157 识别31-50位的序列，KTM-163和KTM-167识别21-40位的序列。

参考实施例4：碱性磷酸酶标记的单克隆抗体的制备

按照常规方法(Eiji Ishikawa，酶免疫测定，Igaku Shoin)，通过马 来酰亚胺化将参考实施例2中得到的各种单克隆抗体与碱性磷酸酶 (Boehringer Mannheim)结合。单克隆抗体(5mg)对50mM Tris缓 冲液(pH 8)透析，然后用亚氨基硫烷巯基化。通过Sephadex G-25柱 (Pharmacia)从亚氨基硫烷化的抗体中除去游离亚氨基硫烷。用马来酰 亚胺化试剂SMCC(Pierce)使碱性磷酸酶马来酰亚胺化，通过G-25 柱从中除去游离的SMCC。

将上述巯基化的单克隆抗体和马来酰亚胺化的碱性磷酸酶混合，使 其在4℃下反应过夜。反应完成后，用Sephacryl S-200柱(Pharmacia) 纯化形成的碱性磷酸酶标记的单克隆抗体。

用标记的抗体稀释液[含有50mM Tris缓冲液(pH 7.6)，10mM氯 化镁，0.1mM氯化锌和20％ Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.， Ltd.)的水溶液]将纯化的碱性磷酸酶标记抗体稀释到固定浓度，用于酶联 免疫吸附测定(ELISA)。

参考实施例5：固相的制备

用含有0.1％叠氮钠的PBS将参考实施例2中得到的各种单克隆抗 体稀释至终浓度为5μg/ml。将抗体稀释液置于固相96孔微滴平板的孔 中，每孔200μl，4℃静置过夜。用PBS清洗后，向各孔中加入300μl 含有0.1％ BSA的PBS，然后使平板在4℃静置过夜，以使封闭。

参考实施例6：过氧化物酶标记的单克隆抗体的制备

按照常规方法将参考实施例2中得到的各种单克隆抗体和过氧化物 酶(Toyobo Co.，Ltd.)通过马来酰亚胺化结合。单克隆抗体(5mg)对50 mM Tris缓冲液(pH 8)透析，然后用亚氨基硫烷巯基化。通过Sephadex G-25柱(Pharmacia)从亚氨基硫烷化的抗体中除去游离亚氨基硫烷。 用马来酰亚胺化试剂SMCC(Pierce)使过氧化物酶马来酰亚胺化，通 过G-25柱从中除去游离SMCC。

将上述巯基化的单克隆抗体和马来酰亚胺化的过氧化物酶混合，使 其在4℃下反应过夜。用Sephacryl S-200柱(Pharmacia)纯化获得的 过氧化物酶标记的单克隆抗体。

用标记的抗体稀释液[含有50mM Tris缓冲液(pH7.6)，10mM氯 化镁，0.1mM氯化锌和20％ Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.， Ltd.)的水溶液]将纯化的标记抗体稀释到固定浓度，用于ELISA。

实施例1：重组HCV核心蛋白的确定

参考实施例1中得到的重组HCV核心蛋白用含有0.1％BSA的PBS 稀释至浓度为0-100pg/ml。

将各重组HCV核心蛋白的稀释液置于参考实施例5中制备的微平板 的孔中，每孔200μl，然后在室温下反应1小时。用清洗液(含有AMPAK 灵敏度增强试剂，Dako)清洗后，向孔中加入参考实施例4得到的标记 抗体。用含有50mM Tris缓冲液(pH 7.6)，10mM氯化镁，0.1mM氯 化锌，20％ Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0-3M氯化 钠的溶液稀释标记抗体，得到的稀释液移入孔中，每孔200μl。室温下 振荡反应1小时后，用清洗液清洗孔，向各孔加入200μl颜色试剂[酶循 环反应试剂(Dako)]，然后在室温下振荡反应20分钟。向各孔加入100 μl混入上述试剂的反应终止剂，测定490nm主波长和660nm辅波长 处的吸光度。该试验中，KTM-145应用于固相，KTM-163应用于碱性 磷酸酶标记。

结果显示在表1中。在表1中，各抗原浓度的数字表示吸光度(Abs)。

                        表1   氯化钠的浓度     (M)     抗原浓度(pg/ml)     S/N比值     0     100     0     0.146     0.226     1.55     0.25     0.145     0.317     2.18     0.5     0.146     0.453     3.11     0.75     0.144     0.583     4.06     1.0     0.150     0.666     4.45     1.5     0.151     0.818     5.43     2.0     0.152     0.925     6.10     3.0     0.195     1.032     5.29

标记抗体稀释液中氯化钠浓度的升高几乎不影响无抗原(0pg/ml) 试验组的吸光度；然而，它使含有抗原(100pg/ml)试验组的吸光度增 加。在表中，S/N的比率表明，含有抗原(100pg/ml)的试验组与无抗 原(0pg/ml)的试验组之间吸光度的比值。发现添加氯化钠增加S/N比 值，能够高灵敏度地检测抗原。也就是说，上述结果表明应用本发明的 方法能够准确地判断尽管存在抗原但不能被判断抗原为阳性的样品，因 为在缺乏氯化钠的情况下，存在抗原的样品的吸光度与无抗原样品相比 轻微增加。

实施例2：重组HCV核心蛋白的确定

参考实施例1中得到的重组HCV核心蛋白用含有0.1％ BSA的PBS 稀释至浓度为0-20pg/ml。

将各重组HCV核心蛋白的稀释液置于参考实施例5制备的微平板的 孔中，每孔200μl，然后在室温下反应1小时。用清洗液(含有AMPAK 灵敏度增强试剂，Dako)清洗后，向孔中加入参考实施例4得到的标记 抗体。用含有50mM Tris缓冲液(pH 7.6)，10mM氯化镁，0.1mM氯 化锌，20％ Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0-2 M氯化 钠的溶液稀释标记抗体，得到的稀释液移入孔中，每孔200μl。室温下 振荡反应1小时后，用清洗液清洗孔，向各孔加入200μl颜色试剂[酶循 环反应试剂(Dako)]，然后在室温下振荡反应40分钟。向各孔加入100 μl混入上述试剂的反应终止剂，测定490nm主波长和660nm辅波长 处的吸光度。该试验中，KTM-145应用于固相，KTM-163应用于碱性 磷酸酶标记。

结果显示在表2中。在表2中，各抗原浓度的数字表示吸光度(Abs)。

                                     表2   氯化钠的浓度     (M)                        抗原浓度(pg/ml)     0     5     10     20     0     0.178     0.345     0.448     0.747     0.25     0.182     0.371     0.539     0.924     0.5     0.180     0.448     0.691     1.284     0.75     0.239     0.618     0.959     1.676     1.0     0.147     0.595     1.059     2.061     1.5     0.162     0.725     1.291     2.447     2.0     0.166     0.754     0.389     2.557

标记抗体稀释液中氯化钠浓度的升高几乎不影响无抗原(0pg/ml) 试验组的吸光度；然而，它使含有抗原的试验组的吸光度增加。该结果 表明应用本发明的方法能够准确地判断尽管存在抗原但不能被判断抗原 为阳性的样品，因为在缺乏氯化钠的情况下，与无抗原样品相比其吸光 度轻微增加。

实施例3：检测限

用含有0.1％ BSA的PBS将参考实施例1中得到的重组HCV核心 蛋白稀释至浓度为0-10pg/ml。

将各重组HCV核心蛋白的稀释液置于参考实施例5中制备的微平板 的孔中，每孔200μl，然后在室温下反应1小时。用清洗液(含有AMPAK 灵敏度增强试剂，Dako)清洗后，向孔中加入参考实施例4得到的标记 抗体。用含有50mM Tris缓冲液(pH 7.6)，10mM氯化镁，0.1mM氯 化锌，20％ Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0或1M氯 化钠的溶液稀释标记抗体，得到的稀释液移入孔中，每孔200μl。室温 下振荡反应1小时后，用清洗液清洗孔，向各孔加入100μl颜色试剂[酶 循环反应试剂(Dako)]，然后在室温下振荡反应30分钟。向各孔加入 100μl混入上述试剂的反应终止剂，测定490nm主波长和660nm辅波 长处的吸光度。该试验中，KTM-145应用于固相，KTM-163应用于碱 性磷酸酶标记。

结果显示在表3中。在表3中，各盐浓度的数字表示吸光度(Abs)。

                  表3     抗原浓度     (pg/ml)     盐浓度(M)     0     1     0     0.100     0.067     0.125     未测出     0.080     0.25     未测出     0.096     0.5     未测出     0.120     1     0.114     0.178     2     未测出     0.299     5     0.172     0.686     10     未测出     1.325

标记抗体稀释液中氯化钠浓度的升高使极端低浓度抗原的检测成为 可能。如表3所示，当不加氯化钠时，观察到不含抗原的溶液和含有1 pg/ml抗原的溶液之间10mAbs数量级的吸光度差异，而加有1M氯化 钠时，不含抗原的溶液和含0.125pg/ml抗原的溶液之间即具有10mABs 数量级的吸光度差异。表明，加入氯化钠增强了检测灵敏度。

比较实施例1

用含有0.1％ BSA的PBS将参考实施例1中得到的重组HCV核心 蛋白稀释至浓度为0、10、100和1000pg/ml。

将各重组HCV核心蛋白的稀释液置于参考实施例5制备的微平板的 孔中，每孔200μl，然后在室温下反应1小时。用清洗液(含有AMPAK 灵敏度增强试剂，Dako)清洗后，向孔中加入参考实施例6得到的过氧 化物酶标记的抗体。用含有50mM Tris缓冲液(pH 7.2)，0.1％ BSA和 0-4M氯化钠的溶液稀释标记抗体，得到的稀释液移入孔中，每孔200 μl。室温下振荡反应1小时后，用清洗液清洗孔，向各孔加入200μl 颜色试剂TMB(四甲基联苯胺，Intergen Co.)，然后在室温下振荡反应 30分钟。向各孔加入100μl 1N硫酸，终止颜色反应，测定450nm主波 长和660nm辅波长处的吸光度。该试验中，KTM-145应用于固相， KTM-163应用于碱性磷酸酶标记。

结果显示在表4中。在表4中，各抗原浓度的数字表示吸光度(Abs)。

                                   表4   氯化钠的浓度     (M)                       抗原浓度(pg/ml)     0     10     100     1000     0     0.125     0.136     0.144     0.296     0.1     0.166     0.188     0.202     0.479     0.2     0.191     0.211     0.251     0.606     0.5     0.217     0.234     0.310     0.893     1.0     0.234     0.284     0.372     1.076     1.5     0.283     0.331     0.388     1.050     2.0     0.403     0.387     0.411     1.141     3.0     0.616     0.588     0.624     1.138     4.0     0.898     0.839     0.915     1.293

当使用过氧化物酶标记的抗体时，加入氯化钠降低了无抗原反应系 统的反应特异性。在含有抗原的反应系统中，氯化钠浓度的升高没有改 善反应特异性。

实施例4：人血清样品的测定

按照日本公开未审的专利申请No.29427/96描述的方法处理人血清。 即将50μl 20％ PEG4000加入200μl血清样品，将得到的混合物在冰上 静置1小时。4℃下4000xg离心5分钟，沉淀悬浮于50μl的50mM Tris 缓冲液(pH 8.0)，向其中加入50μl的0.5M氢氧化钠溶液，在37℃下 处理30分钟。然后，用50μl含有0.3％ Triton X-100的0.5M磷酸氢钠 溶液中和混合液。用300μl 0.1％ BSA-PBS溶液将得到的混合液稀释三 倍，制备测定液。对于人血清样品，使用抗HCV抗体阳性样品(Uni-2 和0401)和正常样品作为对照，按照实施例1测定吸光度(Abs)同样 的方法测定。结果如表5所示

                                   表5 氯化钠浓度     (M)   正常样品     样品Uni-2     样品0401   吸光度     吸光度   S/N比值     吸光度 S/N比值     0     0.149     0.166     1.11     0.201     1.35     0.25     0.148     0.189     1.27     0.269     1.81     0.50     0.146     0.237     1.63     0.385     2.65     0.75     0.149     0.287     1.93     0.464     3.12     1.00     0.152     0.314     2.07     0.542     3.57     1.50     0.156     0.360     2.30     0.665     4.26     2.00     0.164     0.397     2.42     0.726     4.43     3.00     0.241     0.526     2.19     0.953     3.96

如表5所示，当使用正常血清样品时，升高标记抗体稀释液中氯化 钠的浓度仅略微增加吸光度。另一方面，当使用抗-HCV抗体-阳性血清 样品，升高标记抗体稀释液中氯化钠的浓度，能够增加吸光度。结果表 明通过应用本方法能够正确判断含低水平抗原样品的抗原-阳性。还可以 从S/N比值清楚地看到，当氯化钠浓度为0.5-3M，尤其为1-3M时，灵 敏度显著增加。

实施例5：用盐酸胍和碱处理样品

将50μl的20％ PEG4000加入200μl血清样品，将得到的混合液 在冰上静置1小时。4℃下4000xg离心5分钟，沉淀悬浮于50μl含有 0-8M盐酸胍的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)用来变性，向所得悬浮液 中加入50μl 0.5M氢氧化钠溶液，在37℃下处理30分钟。然后，用0.5 M磷酸氢钠溶液中和得到的混合液。然后用0.1％ BSA-PBS溶液将得到 的混合液稀释三倍，制备测定液。按照如实施例4的同样方法进行测定， 除了氯化钠的浓度为1M。对于人样品，使用正常人血清样品和3个抗 -HCV抗体-阳性样品(U-19，U-21和U-29)。结果如表6所示。在表6 中，各样品的数字表示吸光度(Abs)。

                               表6   盐酸胍(M)     正常样品     U-19     U-21     U-29     0     0.129     0.890     0.350     0.320     2     o.129     1.020     0.503     0.499     4     0.059     1.358     0.816     0.631     6     0.045     1.982     1.226     0.912     8     0.052     2.614     1.798     1.268

如表6所示，取决于盐酸胍的浓度，吸光度增加。

实施例6

用脲和盐酸胍重复实施例5的同样程序。脲的浓度为10M，盐酸胍 的浓度为8M。作为样品，使用正常人血清样品和4个抗-HCV抗体-阳 性血清样品(104、106、187和197)。结果如表7所示。在表7中，各 试剂的数字表示吸光度(Abs)。

                表7     样品     盐酸胍     脲     正常     0.044     0.041     104     0.078     0.059     106     0.654     0.416     187     0.429     0.252     197     0.165     0.042

如表7所示，当用脲处理样品时，正常人血清与样品104和197的 吸光度之间没有显著差异，这两个样品不能判断为阳性。然而用盐酸胍 处理能够判断这两个样品为阳性。

实施例7：关于碱处理之温度的试验

重复实施例6的同样程序，除了改变碱处理的温度。作为血清样品， 使用样品6、9和138。在37℃、50℃、70℃和100℃进行碱处理。结果 如表8所示。在表8中，各样品的数字表示吸光度(Abs)。

                                   表8   温度(℃)   正常样品     样品6     样品9   样品138     37     0.065     0.438     0.198     0.405     50     0.064     0.482     0.218     0.474     70     0.061     0.302     0.151     0.345     100     0.058     0.089     0.076     0.102

如表8所示，血清碱处理的优选温度为50℃左右。

实施例8：各检测方法的比较

以下列方式进行本发明的测定法。将50μl的20％ PEG4000加入 200μl各血清样品，将得到的混合物在冰上静置1小时。4℃下4000xg 离心5分钟，沉淀悬浮于50μl含有8M用于变性的盐酸胍的50mM Tris 缓冲液(pH 8.0)。向得到的悬浮液中加入50μl 0.5M氢氧化钠溶液， 在50℃下处理30分钟，用含有0.3％ Triton X-100的0.5M磷酸氢钠溶 液中和得到的混合液。然后用0.1％ BSA-PBS溶液将得到的混合液稀释 三倍，制备测定液。按照实施例4的同样方法进行测定，除了标记抗体 稀释液中使用2M氯化钠。

另外，用下列市售试剂进行相同样品的测定，以比较本方法的灵敏 度，市售试剂为：Immunocheck F-HCV Ag core，它是一种测定HCV核 心蛋白的测定试剂盒(Kokusai Siyaku，下文仅称为HCV核心蛋白质测 定试剂盒)，第三代抗-HCV抗体，它是一种抗-HCV抗体的测定试剂盒 (Ortho，下文仅称为抗-HCV抗体测定试剂盒)，以及Amplicore HCV monitor，它是一种通过PCR对HCV的RNA的测定试剂盒(Roche，下 文仅称之为RNA测定试剂盒)。

结果如表9所示。在表9中，“_”表示“未检测到”，“+”表示“可 检测到”。

表9     样品     本发明 HCV核心蛋白测     定试剂盒 抗-HCV抗体测     定试剂盒 RNA测定试     剂盒     吸光度(Abs)   判断     正常1     0.059     -     -     -     -     正常2     0.060     -     -     -     -     正常3     0.062     -     -     -     -     正常4     0.062     -     -     -     -     正常5     0.061     -     -     -     -     正常6     0.061     -     -     -     -     U-19     2.973     +     +     +     +     B-2     0.910     +     +     +     +     U-16     0.867     +     +     +     +     B-19     0.212     +     +     +     +     T1     0.582     +     +     +     未检     T2     0.145     +     -     +     未检     T3     0.134     +     -     +     未检     U168     0.117     +     -     +     +     U169     0.149     +     -     +     +

如表9所示，通过本发明方法进行的测试对HCV核心蛋白测定试剂 盒(International Reagents Corp.)不能判断是否为阳性的样品给出阳性 结果。除了正常人血清样品，血清样品为抗-HCV抗体-阳性，通过RNA 测定试剂盒(Roche)测试的样品被判断为HCV-阳性。

测定血清样品的HCV核心蛋白测定试剂盒(International Reagents Corp.)的灵敏度级别为104病毒粒/ml，而本发明方法的数量级为103病 毒粒/ml，它等同于RNA测定试剂盒(Roche)的灵敏度。

实施例9：抗体组合

重复实施例6的相同程序，除了用于固相和碱性磷酸酶-标记的抗体 种类被改变，来自未感染HCV的人血清和来自感染HCV的人血清用作 样品，稀释标记抗体的氯化钠水溶液的浓度为0或1M。测定各试验的 吸光度，计算S/N比值。结果如表10所示。在表10中，各氯化钠浓度 的数值表示S/N比值。

                      表10     固相抗体     标记抗体     氯化钠浓度(M)     0     1     KTM-153     KTM-145     3.07     5.46     KTM-145     KTM-153     1.46     6.48     KTM-153     KTM-157     2.96     11.17     KTM-145     KTM-167     7.20     15.61     KTM-145     KTM-163     7.50     15.30

如表10所示，在固相抗体和标记抗体的所有组合中，通过将氯化钠 加入溶液稀释标记抗体，增加了S/N比值。表明可以在存在氯化钠的条 件下较高灵敏度地检测HCV感染。

实施例10

用正常血清溶液连续稀释各样品溶液(U-14和U-19)，制备样品。 将50μl的20％ PEG4000加入200μl各连续稀释的样品，将得到的混 合液在冰上静置1小时。4℃下4000xg离心5分钟，沉淀悬浮于50μl含 有8M用于变性的盐酸胍的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)。向得到的悬 浮液中加入50μl 0.5M氢氧化钠溶液，在50℃下处理30分钟，用含有 0.3％ Triton X-100的05M磷酸氢钠溶液中和得到的混合液。然后用 0.1％ BSA-PBS溶液将得到的混合液稀释三倍，制备测定液。按照实施 例4描述的方法测定各稀释样品。标记抗体稀释液中氯化钠的浓度为2 M。

用参考实施例1中得到的已知浓度的HCV核心蛋白作为标准物质制 备标准曲线，从各样品的吸光度(Abs)计算HCV核心蛋白的量。

应用样品U-14和样品U-19进行的测试结果分别显示于表11和表 12。

                     表11     样品的稀释度     样品U-14     吸光度     浓度(pg/ml)     1/128     0.073     0.14     1/64     0.082     0.26     1/32     0.105     0.56     1/16     0.146     1.11     1/8     0.204     1.86     1/4     0.372     4.08     1/2     0.661     7.89     1     1.219     15.26

                   表12     样品的稀释     样品U-19     吸光度     浓度(pg/ml)     1/800     0.084     0.28     1/400     0.104     0.59     1/200     0.138     1.11     1/100     0.199     2.07     1/10     1.413     20.40

如表11和表12所示，本发明的测定方法能够检测级别为0.1pg/ml 的HCV核心蛋白。

实施例11：在血清转化板样品中HCV核心蛋白的检测

按照实施例8中描述的方法测定商业提供的血清转化板PHV 908 (BBI)的HCV核心蛋白。HCV核心蛋白的量表示为将正常人样品的吸光 度定为1时，S/N的比值形式。

还用抗-HCV抗体测定试剂盒(Ortho)测定了上述板。抗体效价表 示为阈值参数(S/CO)的形式，抗体效价为1.0或更高的样品判断为阳 性。

结果显示于表13。

                                     表13 样品号 观察起始点之后的天数     本发明的方法     (S/N比值) 抗-HCV抗体测定试   剂盒(S/CO)     01     0     6.5     0     02     3     6.4     0     03     5     4.8     0     04     11     7.1     0.1     05     13     7.1     0.3     06     19     10.9     1.7     07     25     11.1     4.9     08     27     6.9     4.9     09     32     4.5     ＞5.0     10     35     1.5     ＞5.0     11     41     1.9     ＞5.0     12     45     1.3     ＞5.0     13     48     6.4     ＞5.0

如表13所示，本发明的方法能够在抗-HCV抗体测试得到阳性结果 之前检测核心蛋白；也就是说，本发明能够检测早期状态的HCV感染。

实施例12：HCV核心蛋白测定试剂盒

制备了包括下列试剂的试剂盒。

抗体-包被的平板(按照参考实施例5描述的相同方法，应用参考实施例

2中得到的KTM-145制备)

样品稀释液(包括含有0.1％ BSA和1％正常小鼠血清的PBS之水溶液) 酶标记抗体(按照参考实施例4中描述的同样方法，利用参考实施例2

中得到的KTM-163制备)

标准抗原

0pg/ml

10pg/ml

(如下制备，将参考实施例1中得到的HCV核心蛋白溶解于包括含 有0.067％ BSA、0.89M盐酸胍、5.56mM Tris缓冲液(pH 8)、0.056 M氢氧化钠、0.056M磷酸二氢钠和0.005％ Triton X-100的PBS溶 液中，使浓度为0或10pg/ml)。

标记抗体稀释液(含有50mM Tris缓冲液(pH 7.6)、10mM氯化镁、 0.2mM氯化锌、20％ BlockAce、2M氯化钠、0.1％叠氮钠、0.1 Triton X-705和1％正常小鼠血清)

颜色试剂[在酶循环反应试剂(AmpliQ，Dako)中含有颜色试剂] 反应终止剂[在酶循环反应试剂(AmpliQ，Dako)中含有反应终止剂] 沉淀剂(20％ PEG 4000)

分散剂[8M盐酸胍和50mM Tris缓冲液(pH 8)]

碱性试剂(0.5M氢氧化钠溶液)

中和剂(0.5M磷酸氢二钠和0.3％ Triton X-100)