高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL的方法
阅读：1044发布：2020-10-29
专利汇可以提供高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种高效荷载 肿瘤 抗原 的DC 疫苗 及其诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL的方法。所述DC疫苗通过以下方法制备得到：(1)制备肿瘤抗原；(2)采集、分离和高效培养扩增DC细胞；(3)用肿瘤抗原和激活剂致敏活化DC细胞；(4)DC细胞表面PD-L1分子的封闭。本发明还提供了序贯抽血以DC疫苗体外诱导扩增CTL的方法，及对体外诱导扩增CTL表面PD-1分子的封闭。本发明解决了现有肿瘤抗原免疫原性不强、抗原靶点不全、患者的肿瘤抗原不易获得、DC和CTL体外扩增数量不足的问题。DC疫苗能够有效地在体外和体内诱导肿瘤抗原特异性CTL，并能高效地对肿瘤产生特异性杀伤，无明显毒 副作用 ，临床应用前景广阔。，下面是高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL的方法专利的具体信息内容。
1.高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备肿瘤抗原；
(2)从外周静脉抽取抗凝血分离单个核细胞，以贴壁的低起始量细胞定向诱导与扩增DC细胞；
(3)用肿瘤抗原和激活剂致敏活化DC细胞；
(4)封闭DC细胞表面的PD-L1分子后收获DC疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的肿瘤抗原与步骤(2)的外周血来自同一个体或不同个体，取决于临床获取自体肿瘤组织或细胞的可行性以及肿瘤抗原的类型；
步骤(1)所述肿瘤抗原类型选自肿瘤组织裂解物、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞表面蛋白抗原、肿瘤细胞膜蛋白抗原、肿瘤细胞外泌体、其它肿瘤相关或特异性蛋白、肿瘤特异性多肽、基于基因测序的高度个性化新生抗原中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肿瘤抗原通过化学处理和物理加热序贯进行的以下方法获得：向肿瘤细胞中加入三氧化二砷培养后，待肿瘤细胞缩小变圆、贴壁率降低、细胞质出泡后，40-46℃培养细胞，以诱导热休克蛋白的表达。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备每人份的DC疫苗在步骤(2)只需抽取40-50ml外周静脉抗凝血，以低起始数量的单个核细胞诱导扩增大量的DC。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)致敏活化DC细胞的方法为：采用来自外周血供体的自体肿瘤来源的抗原，或根据病人的病理检测结果，加入与病理检测结果相匹配的相应肿瘤的混合肿瘤抗原，同时加入激活剂，孵育得到致敏活化的DC细胞；
所述激活剂为细菌产物、复合免疫球蛋白、单克隆抗体、小分子化合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)是向致敏活化后的DC细胞加入抗人PD-L1抗体，30-40℃下孵育0.5-2小时，以封闭DC细胞表面的PD-L1分子。
7.权利要求1-6任一所述的制备方法制备得到的高效荷载肿瘤抗原DC疫苗，所述DC疫苗可直接用于主动免疫治疗，可在体内诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL。
8.权利要求7所述的DC疫苗在体外或体内诱导扩增肿瘤相关或特异性CTL的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，诱导肿瘤抗原特异性CTL方法为在患者第一次抽血制备DC疫苗并收获DC的当日，在同一个体第二次抽取40～50mL抗凝外周血分离并贴壁培养吸出未贴壁单个核细胞与DC疫苗以3-7:1的比例混合，加入CTL无血清启动培养基，体外抗原提呈后，加入抗人CD3单抗、抗人CD28单抗、rh-IL-2进行CTL培养；
当CTL开始克隆化生长后改为扩增培养基进行扩增培养；CTL培养至细胞对数生长高峰时，在CTL收获之前，加入终浓度为1-10ug/ml的抗人PD-1单克隆抗体，封闭CTL表面的PD-1分子，孵育0.5-2小时；收集细胞悬液并离心洗涤；留取质控样品；所得CTL用生理盐水重悬，以备患者输注。
10.权利要求7所述的DC疫苗在体外诱导外周血获得的肿瘤相关或特异性CTL。
高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性
CTL的方法
技术领域
背景技术
[0002] 肿瘤是人类进化的必然产物，也是威胁人类健康和生命的重大疾病。目前我国肿瘤发病率逐年上升，而传统的手术、化疗、放疗等均具有较大的局限性。手术只能切除肉眼所见肿块，无法彻底清除肿瘤细胞，更没有改变肿瘤患者失平衡的体内环境；化疗、放疗可以杀伤部分肿瘤细胞，但相当一部分实体肿瘤对放、化疗不敏感，其诸多副作用给患者的免疫系统和生活质量带来了一系列负面影响，亦无法阻止肿瘤的复发转移；现有分子靶向药物应用范围有限，且极易产生耐药。因此，亟需开辟新的治疗途径和手段。
[0003] 大量研究表明，恢复/重建患者自身抗肿瘤免疫功能是肿瘤治疗不可或缺的策略之一。近年来肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的第四大手段，而肿瘤特异性免疫治疗又是重中之重，影响肿瘤特异性免疫治疗的几个要素包括：1)能够正确诱导和扩增足够数量具有强大抗原提呈功能的树突状细胞(DC)以及肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)；2)最佳的肿瘤抗原；3)趋化肿瘤特异性细胞毒T细胞浸润到肿瘤组织中去；4)切断肿瘤微环境的免疫抑制机制。
[0004] DC来源可以不同，但最便捷的是从外周血分离获得单个核细胞。由于DC和CTL扩增比较困难，为满足治疗所需的细胞数量，人们通常在培养起始的细胞数量上采取措施，包括：1)在单个核细胞采集前2-3天注射GM-CSF进行骨髓动员，以增加外周血单个细胞的比率和绝对计数；2)采用血细胞分离机，通过外周血循环数千毫升来大量采集单个核细胞。这样的处理实际上对患者的骨髓和外周血进行了强有力的外来干预，特别是对于肿瘤患者术后、放、化疗后已经紊乱了的免疫系统等机体内环境进一步造成了很大干扰。因此，临床急需一种对机体没有明显影响，以较小的细胞培养起始量开始，经过培养扩增和抗原致敏活化后，在细胞数量和表型均能满足治疗需求的DC疫苗及其诱导扩增的效应细胞CTL。
[0005] 除了细胞数量以外，最佳的肿瘤抗原是保证肿瘤特异性免疫治疗精准性的关键，需要满足三个方面：1)肿瘤抗原的特异性和较强的免疫原性；2)多靶点；3)个体化。迄今为止，已经发现了一些在正常组织低表达而在肿瘤组织高表达的肿瘤相关抗原(TAA)；少数在正常组织(睾丸和胎盘除外)不表达，仅在肿瘤组织中表达的肿瘤特异性抗原(TSA)；通过组织标本库及组织芯片和单克隆抗体大规模筛查的肿瘤特异性多肽；基于基因测序和生物信息学分析获得的新生抗原(为个体化的Neo-Antigen)；但对于大多数肿瘤来说，仍然未获得众所公认具有广泛代表性的肿瘤特异性抗原。目前已有肿瘤疫苗中的肿瘤抗原各有千秋：全肿瘤细胞瘤苗和肿瘤裂解物瘤苗抗原覆盖面广，免疫原性强，但含混杂物多，特异性差；
肿瘤相关多肽特异性强，但免疫原性较弱；抗独特型抗体疫苗往往是单靶点；基因修饰的肿瘤疫苗试图提高肿瘤的免疫原性或抗原递呈细胞的活性，但通常也是单靶点，且转基因操作本身对抗原递呈细胞就是一种损伤。肿瘤细胞排出的囊泡抗原(外泌体)可满足多靶点和颗粒性抗原免疫原性强的要求，但制备过程中只收集细胞培养上清中的抗原，却丢掉了肿瘤细胞表面的大量抗原。鉴于肿瘤细胞的多基因改变，肿瘤组织的高度异质性，以及肿瘤患者的高度个性化，使肿瘤的特异性免疫治疗仍然面临极大的挑战。此外，肿瘤疫苗作为一种生物制剂，从生产角度还要考虑生产过程所获肿瘤抗原的效率。迫切需要开发靶点覆盖面广(多靶点)，特异性高，免疫原性强的肿瘤抗原制备方法，以满足个体化的新型DC疫苗抗原负载，以及能在体外和体内强有力的诱导与扩增多靶点肿瘤特异性细胞毒T细胞。
肿瘤相关多肽特异性强，但免疫原性较弱；抗独特型抗体疫苗往往是单靶点；基因修饰的肿瘤疫苗试图提高肿瘤的免疫原性或抗原递呈细胞的活性，但通常也是单靶点，且转基因操作本身对抗原递呈细胞就是一种损伤。肿瘤细胞排出的囊泡抗原(外泌体)可满足多靶点和颗粒性抗原免疫原性强的要求，但制备过程中只收集细胞培养上清中的抗原，却丢掉了肿瘤细胞表面的大量抗原。鉴于肿瘤细胞的多基因改变，肿瘤组织的高度异质性，以及肿瘤患者的高度个性化，使肿瘤的特异性免疫治疗仍然面临极大的挑战。此外，肿瘤疫苗作为一种生物制剂，从生产角度还要考虑生产过程所获肿瘤抗原的效率。迫切需要开发靶点覆盖面广(多靶点)，特异性高，免疫原性强的肿瘤抗原制备方法，以满足个体化的新型DC疫苗抗原负载，以及能在体外和体内强有力的诱导与扩增多靶点肿瘤特异性细胞毒T细胞。
[0006] 肿瘤患者通常有不同程度的免疫耐受，如何打破免疫耐受，修复或激发树突状细胞(DC)的强大抗原递呈能力，使其充分诱导活化肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)是肿瘤免疫治疗的关键。近来，免疫检测点在肿瘤治疗中的作用受到越来越多的关注，PD-1抗体与PD-L1抗体正在被用于肿瘤的治疗。但是，人们普遍关注的是用PD-1抗体封闭T细胞表面的PD-1分子，用PD-L1抗体阻断肿瘤细胞表达的PD-L1，以活化或增强T细胞的功能。实际上不仅肿瘤细胞可以表达PD-L1，DC也同样可以表达PD-L1。特别是荷载抗原后被激活的成熟DC可以高表达PD-L1，这也是DC诱导特异性免疫的一种“刹车”机制，而松开这一“刹车”并有效地应用于临床疾病的治疗当中，利用封闭DC细胞表面的PD-L1受体，最大限度地实现DC的抗原递呈和活化CTL的能力，联合封闭CTL表面的PD-1分子，提高CTL的肿瘤特异性细胞毒水平，对打破DC耐受和肿瘤特异性、个体化的免疫治疗是一种值得探索的途径。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL的方法，该DC疫苗是利用低起始量外周血单个核细胞来高效制备荷载自体或其它来源肿瘤抗原，在体外和体内有效地诱导、大规模扩增多靶点肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)，用于肿瘤患者的临床治疗。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)制备肿瘤抗原；
[0010] (2)采集外周血分离单个核细胞，以贴壁的低起始量细胞定向诱导与扩增DC细胞；
[0011] (3)用肿瘤抗原和激活剂致敏活化DC细胞；
[0012] (4)封闭DC细胞表面PD-L1分子，收获DC疫苗。
[0013] 上述制备方法中，步骤(1)的肿瘤抗原与步骤(2)的外周血来自同一个体或不同个体，取决于临床获取自体肿瘤组织或细胞的可行性以及肿瘤抗原的类型。
[0014] 步骤(1)所述肿瘤抗原类型选自肿瘤组织裂解物、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞表面蛋白抗原、肿瘤细胞膜蛋白抗原、肿瘤细胞外泌体、其它肿瘤相关或特异性蛋白、肿瘤特异性多肽、基于基因测序和生物信息学分析，预测并制备高度个性化新生抗原中的一种或多种。
[0015] 所述肿瘤抗原既可以单独使用，也可以混合使用。本发明的一个较佳方案的实施例中，所用肿瘤抗原为肿瘤细胞表面蛋白抗原、肿瘤细胞膜蛋白抗原和肿瘤细胞外泌体按质量比1∶1∶2的混合物。
[0016] 步骤(1)所述肿瘤抗原通过化学处理和物理加热序贯进行的以下方法获得：向肿瘤细胞中加入三氧化二砷培养后，待肿瘤细胞缩小变圆、贴壁率降低、细胞质出泡后，40-46℃培养细胞，以诱导热休克蛋白的表达。
[0017] 优选地，向从病人肿瘤组织分离的或建系培养的肿瘤细胞中加入终浓度为1umol/L-15umol/L的三氧化二砷37℃，5％CO2培养4-24小时，待肿瘤细胞缩小变圆、贴壁率降低、细胞质出泡后，43℃、5％CO2培养1-12小时。
[0018] 本发明提供的上述DC疫苗的制备方法中，步骤(2)采集和分离培养DC细胞的方法如下：
[0019] 1)外周血单个核细胞的分离：从外周静脉抽取抗凝血加在淋巴细胞分离液上，离心分离单个核细胞，加入无血清DC细胞培养液重悬细胞，至细胞浓度为3×106-1.5×107个/ml；
[0020] 2)DC细胞的分离、定向诱导与扩增：单个核细胞贴壁培养2-6小时；吸出未贴壁细胞，所得贴壁细胞即为DC前体细胞；向DC前体细胞中加入终浓度1000IU的rh-IL-4和终浓度1000IU的th-GM-CSF，定向诱导与扩增DC前体细胞7-9天，所得未成熟DC细胞用于致敏活化。
[0021] 本发明制备DC疫苗方法在步骤(2)中一个关键点在于，制备每人份的DC疫苗只需采集40-50ml外周抗凝血，以低起始数量的单个核细胞诱导扩增大量的DC。
[0022] 在本发明的一个实施例的步骤(2)中，采集和分离培养DC细胞的方法如下：
[0023] 1)外周血单个核细胞的分离：抽取外周抗凝血40-50ml(优选45m1)，常规密度梯度离心法获取单个核细胞，洗涤后加入无血清DC细胞培养液重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为3×106-1.5×107个/ml。
[0024] 所述无血清DC细胞培养基为专用培养基(BYN-PD701)，所述淋巴细胞分离液可来自市售商业化产品，优选购自Sigma公司产品。
[0025] 2)DC细胞的分离、定向诱导与扩增：细胞在37℃，5％CO2孵箱中，以无血清DC细胞培养基(BYN-PD701)贴壁培养2-6小时；吸出未贴壁细胞可用于肿瘤抗原致敏DC活化的细胞毒T细胞(DC-AT)或细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)扩增培养，所得贴壁细胞即为DC前体细胞；向DC前体细胞中加入DC细胞专用培养基、终浓度1000IU的rh-IL-4和终浓度1000IU的rh-GM-CSF，在37℃5％CO2孵箱中，定向诱导与扩增DC前体细胞7-9天，所得未成熟DC细胞有待致敏活化。根据细胞生长和扩增情况，个体化适时适量补加含有终浓度1000IU的rh-IL-4和终浓度1000IU的rh-GM-FCS的无血清DC细胞专用培养基(BYN-PD701)。
[0026] 本发明提供的高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备方法中，步骤(3)致敏活化DC细胞的方法为：采用来自外周血供体的自体肿瘤来源的抗原，或根据病人的病理检测结果，加入与病理检测结果相匹配的相应肿瘤的混合肿瘤抗原，同时加入激活剂，孵育得到致敏活化的DC细胞；所述激活剂为细菌产物、复合免疫球蛋白、单克隆抗体、小分子化合物。
[0027] 优选地，所述激活剂为聚肌胞注射液、抗人CD40单克隆抗体、TNF-d或细菌产物来源的上市药品(注射液)。本发明的实施例中，选用的混合肿瘤抗原含有肿瘤细胞表面抗原，细胞膜抗原，肿瘤细胞外泌体。本领域技术人员应当理解，混合肿瘤抗原包括但不限于以下肿瘤抗原的任两个或多个的混合：肿瘤组织裂解物、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞表面蛋白抗原、肿瘤细胞膜蛋白抗原、肿瘤细胞外泌体、其它肿瘤相关或特异性蛋白、肿瘤特异性多肽、基于基因测序的高度个性化新生抗原。
[0028] 具体地，步骤(3)用肿瘤抗原和激活剂致敏活化DC细胞的方法如下：向DC细胞浓度为5×106-1.5×107个/ml的无血清DC细胞培养液中加入1/10体积的混合肿瘤抗原(肿瘤细胞表面蛋白抗原∶肿瘤细胞膜蛋白抗原∶肿瘤细胞外泌体质量比1∶1∶2)，同时加入终浓度0.2-0.8μg/ml的聚肌胞注射液和终浓度2-10μg/ml的激活剂，孵育过夜，得到成熟的DC细胞。
[0029] 更优选地，所述激活剂选自抗人CD40单克隆抗体。
[0030] 本发明提供的高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备方法中，步骤(4)是向致敏活化后的DC细胞加入抗人PD-L1抗体，30-40℃下孵育0.5-2小时，以封闭DC细胞表面的PD-L1分子。
[0031] 具体地，步骤(4)中，向成熟的DC细胞中加入终浓度1-10ug/ml的抗人PD-L1抗体，37℃5％CO2条件下孵育0.5-2小时，封闭DC细胞表面PD-L1抗原分子，收获封闭后的DC细胞，即为高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗，可直接用于主动免疫治疗，即在体内诱导扩增CTL。
[0032] 另一方面，本发明还提供了所制得的高效荷载肿瘤抗原DC疫苗在体外诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL中的用途。该用途包括两个关键步骤：(1)序贯抽取少量外周血分离非贴壁单个核细胞，以DC疫苗体外诱导，并先后用启动培养基和扩增培养基培养扩增CTL；(2)体外诱导扩增的CTL表面PD-1分子的封闭。具体如下：
[0033] (1)肿瘤抗原致敏活化DC体外诱导扩增肿瘤特异性CTL
[0034] 本方法制备的肿瘤抗原致敏活化DC细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、HLA-DR(图1A、图1B)，说明其成熟度较高，亦可在体外诱导肿瘤特异性CTL，故在第一次抽血制备的肿瘤抗原致敏DC收获当天，第二次抽取同一肿瘤患者抗凝血40～50mL(即序贯抽血)，分离单个核细胞贴壁培养，吸出未贴壁单个核细胞，与当天收获的肿瘤抗原致敏活化DC以3-7∶1的比例混合，置培养瓶内加入CTL无血清启动培养基(BYN-PT331)，37℃，5％CO2孵箱培养，次日加入抗人CD3单抗、抗人CD28单抗、rh-IL-2继续培养。然后根据细胞生长和扩增情况，个体化适时适量补加含有rh-IL-2的无血清扩增培养基(BYN-PT332)进行CTL扩增培养。
[0035] (2)CTL表面PD-1分子的封闭与CTL收获
[0036] CTL培养至第11-14日，细胞对数生长高峰时，在CTL收获之前，加入抗人PD-1单克隆抗体1-10ug/ml(终浓度)，封闭CTL表面的PD-1分子，37℃，5％CO2孵箱中孵育0.5-2小时。收集细胞悬液并离心洗涤2次；留取质控样品；所得CTL用生理盐水100mL重悬，加入0.5％人血白蛋白，备人体静脉滴注用；或根据临床需求采用30mL或2mL重悬，备人体胸腔、腹腔注射用，或部分肿瘤局部注射用。苔盼蓝染色，进行细胞计数，细胞活率95％以上；细胞总数量1×1010左右；流式细胞术检测细胞表型显示CD3+T细胞占90％以上，且以CD8+细胞(细胞毒性T细胞)占优势，(图2A、图2B)。
[0037] 本发明的DC疫苗在体外诱导外周血获得的肿瘤相关或特异性CTL属于本发明的保护范围。
[0038] 本发明的DC疫苗针对现有肿瘤抗原免疫原性不强、抗原靶点不全、肿瘤患者的肿瘤抗原不易获得等肿瘤抗原制备方面问题、DC和CTL体外扩增数量不足的问题、以及DC和CTL体外培养过程中激活的免疫检测点的封闭问题，提出了整体解决方案，能够有效地在体外和体内诱导肿瘤抗原特异性CTL，并能高效地对肿瘤产生特异性杀伤，无明显毒副作用。
[0039] 本发明的有益效果具体体现在以下方面：
[0040] (1)在制备肿瘤抗原方面，本发明用三氧化二砷靶向诱导肿瘤干细胞凋亡后，用加热的方法处理肿瘤细胞，既可以诱导肿瘤细胞凋亡，也可以诱导肿瘤细胞表达热休克蛋白。热休克蛋白可以存在于细胞内质网中，也可以表达于细胞表面，是重要的肿瘤抗原分子伴侣，可以增加肿瘤抗原的免疫原性。
[0041] (2)在肿瘤抗原的选择方面，本发明DC疫苗可选用的肿瘤抗原不仅包含肿瘤细胞的表面蛋白、细胞膜蛋白、细胞内蛋白，在肿瘤细胞培养扩增后还包括培养液中肿瘤细胞外排的囊泡。这样可以最大限度的从肿瘤细胞不同层面获取全肿瘤细胞抗原，其抗原靶点覆盖全面，兼顾了可溶性蛋白、脂类蛋白、其富含的热休克蛋白作为抗原分子伴侣以及囊泡抗原的颗粒性，增加了该混合抗原的免疫原性；同时可从患者自体切除或活检肿瘤组织、胸腹水肿瘤细胞获取抗原，拓展了自体肿瘤抗原的来源，满足了个体化的要求。
[0042] (3)在外周血采集量和DC细胞量的获得方面，本发明利用低起始量外周血单个核细胞经过8-10天培养扩增及荷载肿瘤抗原后，可以收获较高数量和较高成熟度的DC，具有临床操作简单，安全可靠，副反应小，有效率高等特点，一方面减轻了肿瘤患者由于抽取大量外周血的带来得痛苦和对身体的不利影响；另一方面降低了制作成本，保证了治疗用DC细胞的充足用量。
[0043] (4)在阻断DC细胞表面PD-L1启动T细胞凋亡程序从而抑制免疫方面，本发明联合使用CD40单抗和PD-L1单抗打破DC免疫耐受，以CD40单抗活化DC，以抗PD-L1单抗封闭DC表面PD-L1。目前在PD-1/PDL-1检测点的免疫抑制机制研究方面，本领域技术人员主要关注的是T细胞活化后表达程序化死亡分子(PD-1)，组织中肿瘤细胞则表达PD-L1分子(PD-1的配体)，一旦二者结合则启动T细胞的凋亡，这是肿瘤免疫逃逸的重要免疫抑制机制之一。然而，往往忽略了DC荷载肿瘤抗原并活化后即高表达PD-L1分子，当DC与T细胞接触，完成肿瘤抗原递呈和T细胞活化的过程中可能启动T细胞的凋亡程序。本发明采用抗PD-L1单抗封闭荷载肿瘤抗原DC表面的PD-L1，阻断这一免疫抑制机制，以活化机体抗肿瘤特异性免疫反应，为体内和体外诱导扩增肿瘤特异性细胞毒T细胞，以及持续发挥T细胞作用奠定了基础。
[0044] (5)在增强DC疫苗再体内诱导肿瘤特异性免疫反应以及体外诱导扩增肿瘤特异性CTL方面，本发明另辟蹊径地采用在荷载肿瘤抗原DC疫苗收获时，第二次采集同一肿瘤患者少量外周血分离单个核细胞。在非贴壁单个核细胞培养的零时刻起，利用本发明制得的DC疫苗在体外以更高的比例与单个核细胞群中的纯净T细胞混合培养，在排除肿瘤患者特有免疫抑制因素的体外优越微环境中，完成抗原递呈和活化T细胞。本方法可从45ml外周血的起始单个核细胞获得CTL细胞总数量1×1010左右，高于通常方法扩增的DC-CIK数量(1×109左右)；细胞活率95％以上；细胞表面可高表达CD3、CD8分子。这些肿瘤特异性CTL过继转移到患者体内可直接杀伤肿瘤细胞，与DC疫苗联合应用，可以提高疗效。附图说明
[0045] 图1A-图1B为本发明DC细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、HLA-DR典型图谱。
[0046] 图2A-图2B为本发明CTL细胞表面高表达CD3、CD8分子典型图谱。
具体实施方式
[0047] 以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用生物材料均为市售商品。
[0048] 实施例1高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备
[0049] 1.肿瘤细胞培养
[0050] 肿瘤细胞来自患者自身手术切除的肿瘤组织或肿瘤组织活检标本，以及与患者具有同一病理诊断特征的肿瘤细胞系。细胞系可为实验室自建系，也可购自中国国家细胞保藏中心或美国ATCC，分别按照该肿瘤细胞生物学特性进行体外培养。通常使用含10-15％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2孵箱中培养，传代扩增。
[0051] 2.诱导细胞发生凋亡并表达热休克蛋白
[0052] 待细胞生长至对数期，80％铺满瓶底时，进行药物处理，加入三氧化二砷(1-15umol/L均可)继续在37℃，5％CO2孵箱中培养4-24小时。镜下观察肿瘤细胞缩小变圆，贴壁率降低和细胞质“出泡”，将细胞转移至43℃加热，5％CO2孵箱中培养10小时。
[0053] 3.肿瘤细胞外泌体的制备
[0054] 经过三氧化二砷和加热序贯诱导后，肿瘤细胞发生凋亡，贴壁细胞悬浮，外排更多的外泌体。为了收获更多抗原，可进一步用细胞刮子分离贴壁细胞，然后继续下列程序：
[0055] 1)低速离心300-600g 10-15分钟，收集肿瘤细胞沉淀以制备肿瘤细胞蛋白类抗原(见步骤4、5)。
[0056] 2)收集上清高速离心10000g 30分钟，再收集上清进一步超速离心100000g 60分钟，收集沉淀，即为肿瘤细胞外泌体。
[0058] 5.肿瘤细胞膜蛋白抗原的制备，使用膜蛋白提取试剂盒，Pierce Cell Surface Protein lsolation Kit，购自Thermo，Inc.USA。按照商品使用手册操作，制备肿瘤细胞膜蛋白抗原。
[0059] 6.荷载肿瘤抗原DC疫苗的制备
[0060] 1)外周血单个核细胞的分离
[0061] 利用本领域公知的，简便的外周血单个核细胞的分离方法。本实施例采用以下方法：无菌采集外周血45ml，轻加在比重1.077的淋巴细胞分离液上，采用梯密度离心法分离单个核细胞。吸取离心管中间白色细胞层，移入含有生理盐水的离心管中，洗涤细胞，弃上清，加入无血清DC细胞培养基(BYN-PD701)，重悬细胞，进行细胞计数。
[0062] 2)DC的定向诱导与扩增
[0063] 细胞在37℃，5％CO2孵箱中贴壁培养2-6小时，吸出未贴壁细胞，加入rh-IL-4，rh-GM-CSF 1000IU(终浓度)，37℃，5％CO2孵箱中，定向诱导与扩增DC细胞7-9天。根据细胞生长和扩增情况，个体化适时适量补加含有rh-IL-4，rh-GM-CSF 1000IU(终浓度)的无血清培养基(BYN-PD701)。
[0064] 3)DC的肿瘤抗原致敏与活化
[0065] DC培养至第7-9日，采用来自患者自体肿瘤来源的抗原，或根据病人的病理检测结果，加入1/10体积与之匹配的相应混合肿瘤抗原(肿瘤细胞表面蛋白抗原∶肿瘤细胞膜蛋白抗原∶肿瘤细胞外泌体质量比1∶1∶2)，同时加入聚肌胞注射液(终浓度0.2-0.8μg/ml)、抗人CD40单克隆抗体(终2-10μg/ml浓度)，37℃，5％CO2孵箱中过夜。
[0066] 4)DC表面PD-L1分子的封闭
[0067] DC培养和致敏至第8-10日，在收获DC之前，加入抗人PD-L1抗体(君实生物)1-10ug/ml(终浓度)，封闭DC表面的PD-L1分子，37℃，5％CO2孵箱中孵育0.5-2小时。
[0068] 5)DC细胞的收获
[0069] 待DC表面PD-L1分子的封闭后，吸出培养液(含有细胞不弃)，以冰生理盐水吹打冲洗尚存贴壁细胞直至脱落，收集所有细胞悬液并离心洗涤2次；细胞用生理盐水1ml重悬备治疗用。同时留取质控样品，常规检测微生物，内毒素；流式细胞细胞术检测DC细胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达情况(图1A-1B)，由图1A-1B可见DC细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、HLA-DR。
[0070] 本实施例制备的DC疫苗，从45毫升外周抗凝血分离贴壁单个核细胞群中的低起始量DC前体细胞，经培养扩增和抗原致敏后，最终可收获肿瘤抗原致敏DC总数量约1×108-28
×10 ，可以同时满足1-2次DC疫苗治疗所需剂量和一次诱导扩增肿瘤特异性CTL的需要。该方法具有临床应用操作简单，安全可靠，副反应小，有效率高等特点，为临床提供了又一优选的DC疫苗和用于肿瘤特异性细胞制备的新途径。
×10 ，可以同时满足1-2次DC疫苗治疗所需剂量和一次诱导扩增肿瘤特异性CTL的需要。该方法具有临床应用操作简单，安全可靠，副反应小，有效率高等特点，为临床提供了又一优选的DC疫苗和用于肿瘤特异性细胞制备的新途径。
[0071] 实施例2高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备
[0072] 从肿瘤患者胸、腹水中分离肿瘤细胞，培养扩增后，一次性从肿瘤细胞与肿瘤细胞培养液中的外泌体联合制备肿瘤抗原的制备方法。
[0073] 1.无菌条件下收取肿瘤患者胸水或腹水500-1000ml，300g离心8分钟，弃上清。
[0074] 2.加入生理盐水至100ml重悬，制成细胞悬液。
[0075] 3.双比重密度离心：由下至上为：第1层100％人淋巴细胞分离液(密度1.077g/ml)；第2层75％淋巴细胞分离液(密度1.077g/ml)；第3层细胞悬液。离心：700g，20分钟。
[0076] 4.分别吸出收集第1界面和第2界面的细胞，生理盐水洗涤2次。
[0077] 5.重复操作步骤3、步骤4一次。
[0078] 6.第2界面的细胞为肿瘤细胞。
[0079] 7.如果获取肿瘤细胞足够，可取肿瘤细胞直接按实施例1进行处理，提取自体肿瘤膜蛋白抗原。
[0080] 8.也可以将分离的肿瘤细胞体外培养后，按实施例1进行处理，除提取自体肿瘤细胞膜蛋白抗原，同时提取肿瘤细胞囊泡。
[0081] 肿瘤抗原制备后，可参照实施例1的方法制备肿瘤抗原致敏DC疫苗和CTL。
[0082] 实施例3肿瘤抗原致敏活化DC体外诱导扩增肿瘤特异性CTL
[0083] 分别选用实施例1和实施例2制得的DC疫苗。
[0084] 1、在DC疫苗收获当天，第二次抽肝素抗凝血40～50毫升，按照实施例1步骤6的1)和2)的操作，吸出新鲜分离的未贴壁单个核细胞，以5∶1的比率与制得的DC疫苗(参照实施例1或实施例2方法制得的DC疫苗)混合，置含有无血清CTL启动培养基(BYN-PT331)培养瓶内过夜，次日加入抗人CD3单抗、抗人CD28单抗、rh-IL-2，在37℃，5％CO2孵箱中培养。其后根据细胞生长和扩增情况，个体化适时适量补加含有rh-IL-2的无血清扩增培养基(BYN-PT332)进行CTL扩增培养。
[0085] 2、CTL的收获
[0086] CTL培养至第11-14日，细胞对数生长高峰时，在CTL收获之前，加入抗人PD-1单克隆抗体1-10ug/ml(终浓度)，封闭CTL表面的PD-1分子，37℃，5％CO2孵箱中孵育0.5-2小时。收集细胞悬液并离心洗涤2次；留取质控样品；CTL用生理盐水100ml重悬，加入0.5％人血白蛋白，备人体静脉滴注用；或者，根据临床需求采用30ml或2ml重悬，备人体胸腔或腹腔注射用，或部分用于肿瘤局部注射。苔盼蓝染色，进行细胞计数，细胞活率95％以上；细胞总数量一般1×1010左右，高者可达2×1010；肿瘤患者CTL细胞表面可高表达CD3、CD8分子(图2A-
2B)。
2B)。
[0087] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈