稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途
阅读：697发布：2023-02-24
专利汇可以提供稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及特异性靶向Muc1 抗原 且高 水 平稳定表达PD‑1 抗体 的CAR‑T细胞及用途。具体而言，本发明的T细胞含有表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的编码序列和PD‑1抗体的编码序列；和/或表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体和PD‑1抗体。本发明提供的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有膜蛋白 信号 肽、抗Muc1近膜端的单链抗体、长50个 氨 基酸残基以上的 铰链 区、跨膜区、共刺激 信号分子 胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。本发明的T细胞能克服免疫微环境抑制，促进 肿瘤 细胞的凋亡，发挥抗肿瘤的免疫反应，本发明提供的T细胞可以用于多种Muc1阳性 恶性肿瘤 的 治疗 。，下面是稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途专利的具体信息内容。
1.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞：
(1)含有表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的编码序列和PD-1抗体的编码序列；和/或(2)表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体和PD-1抗体；
优选地，所述T细胞的基因组中整合了识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的表达框和PD-1抗体的表达框。
2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有任选的膜蛋白信号肽、抗Muc1近膜端的单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
3.如权利要求2所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：
所述信号肽为分泌型信号肽和膜结合型信号肽，优选为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；更优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述长50个氨基酸残基以上的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区和IgG4 Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区是CD8α铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区；更优选地，CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD28的胞内结构域；优选地，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；和
所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所述。
4.如权利要求2或3所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：
所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:14第1-66位碱基所示；
所述单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:14第67-807位碱基所示；
所述铰链区的编码序列如SEQ ID NO:14第808-1491位所示；
所述跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:14第1492-1575位碱基所示；
所述胞内共刺激信号域的编码序列如SEQ ID NO:14第1576-1698位碱基所示；和所述胞内信号域的编码序列如SEQ ID NO:10第1699-2034位碱基所示。
5.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗Muc1近膜端的单链抗体、IgG4 Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ的酪氨酸活化基序；
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-678位氨基酸残基所示；优选地，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:14第70-2034位碱基所示。
6.如权利要求1-5中任一项所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1抗体含有抗PD-1单链抗体和IgG4Fc；其中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第267-495位氨基酸残基所示；
优选地，所述抗PD-1单链抗体中抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-131位氨基酸残基所示；优选地，所述抗PD-1单链抗体中的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第147-266位氨基酸序列所示；
优选地，所述PD-1抗体还含有轻链信号肽；优选地，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示。
7.如权利要求6所述的T细胞，其特征在于，所述抗PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-266位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第61-798位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-495位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO:1所示；优选地，所述PD1抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第61-1485位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
8.一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒含有：
(1)含权利要求2-5中任一项所限定的嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
(2)含权利要求6-7中任一项所限定的PD-1抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
9.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-7中任一项所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体。
10.权利要求1-7中任一项所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述癌症为其癌细胞表面异常表达Muc1的癌症，优选为在Muc1在癌细胞表面的表达量为正常时的100倍以上、且Muc1在整个细胞表面均匀分布的癌症；优选地，所述癌症选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌/宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。
11.一种PD-1抗体，其特征在于，所述PD-1抗体含有抗PD-1单链抗体和IgG4Fc；其中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第267-495位氨基酸残基所示；
优选地，所述抗PD-1单链抗体中抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-131位氨基酸残基所示；优选地，所述抗PD-1单链抗体中的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1第147-266位氨基酸序列所示；
优选地，所述PD-1抗体还含有轻链信号肽；优选地，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示。
12.如权利要求11所述的PD-1抗体，其特征在于，所述抗PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-266位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第61-798位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:2所示。
13.一种多核苷酸序列，选自编码权利要求11或12所述的PD-1抗体的序列或其互补序列；优选地，所述编码序列含有SEQ ID NO:2第61-1495位碱基序列所示的序列，优选含有SEQ ID NO:2所示的序列。
14.一种核酸构建物，其含有权利要求13所述的多核苷酸序列；优选地，所述核酸构建物为表达载体或将所述多核苷酸序列整合入宿主细胞基因组的整合载体。
15.一种细胞，其含有权利要求14所述的核酸构建物。
16.权利要求11或12所述的PD-1抗体、权利要求13所述的多核苷酸序列、权利要求14所述的核酸构建物以及权利要求15所述的细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。
稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途。
背景技术
[0002] 嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治疗技术无疑是肿瘤免疫细胞治疗领域中一颗冉冉升起的巨星。CAR-T技术是通过基因工程技术将识别某抗原分子的抗体可变区基因序列与T淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mRNA转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，使T淋巴细胞能通过非MHC限制性的方式识别特定抗原，增强其识别和杀伤肿瘤的能力。
[0003] CAR的结构自1989年以色列Eshhar研究小组首次提出后，经过近30年的发展，已经被证实经过CAR结构修饰的T细胞在肿瘤免疫治疗中具有较好的疗效。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的片段(single-chain variable fragment，scFv)，胞内激活信号由CD3ζ信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)，可诱导的T细胞共刺激剂(ICOS)以及DNAX活化蛋白10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(激活诱导的细胞死亡，AICD)。第三代CAR受体则是在共刺激结构CD28和ITAM信号链之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，因而产生了一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。常用的经典CAR-T结构即为二代CAR受体，其结构具体可分为以下4部分：识别肿瘤抗原的抗体单链可变区(scFv)、铰链区、跨膜区、胞内刺激信号结构区域。其中，CAR结构铰链区负责形成正确构象，形成二聚体。铰链区的长短及氨基酸序列特征决定了CAR的空间构象，也决定了其与肿瘤细胞表面抗原结合的能力。
[0004] 实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗缺乏理想的通用、广谱靶点，限制了CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。因而，寻找有效的CAR-T细胞治疗靶点已然成为CAR-T细胞治疗的重中之重。Muc1(mucins，粘蛋白)是一类高分子量(>200kD)的Ⅰ型跨膜糖蛋白(多以O-糖苷键与多肽骨架上的Ser/Thr相连)，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在肿瘤发生时，Muc1蛋白可在肿瘤细胞表面异常表达，表达量可达正常时的100倍以上。并且，其在细胞表面的极性分布丧失，可在整个细胞表面均匀分布。另外，由于糖基化不全，Muc1蛋白的结构也发生改变，出现新的糖链及肽表位。出现的这些新的糖链和肽表位虽然可以成为CAR-T细胞治疗很理想的靶点，但由于在不同的肿瘤细胞表面会展示出不同的糖链和肽表位，特异性靶向某种糖肽的CAR-T细胞也许不能在多种类型的肿瘤中得到应用。
[0005] PD-1(Programmed Death 1，重编程细胞死亡受体1)是调节性T细胞CD28家族的成员，属于免疫球蛋白超家族受体。PD-1和它的配体PD-L1/PD-L2在T细胞的共抑制和衰竭中起重要作用，他们的相互作用抑制了共刺激分子调节的T细胞的增殖和细胞因子的分泌，下调了抗凋亡分子BCL-xl的表达，削弱了肿瘤特异性T细胞的功能，导致一些肿瘤患者不能完全消除肿瘤。PD-1抗体通过与肿瘤特异性T细胞表面的PD-1分子结合，竞争了PD-1与其配体PD-L1/PD-L2的结合，从而缓解PD-1与PD-L1/PD-L2结合引起的免疫微环境抑制作用。目前商品化的PD-1抗体有Nivolumab及Pidilizumab。这2种单抗已经证实在黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、非小型细胞肺癌、肾细胞癌等实体瘤上取得了良好的临床疗效，但PD-1抗体在临床应用中仍然存在一些不可避免的问题。一方面由于PD-1单抗是静脉注射全身用药，大多数接受PD-1抗体阻断治疗的患者都会出现不同程度的药物毒副作用。另一方面PD-1单抗的生产涉及复杂的生产制备与纯化工艺，成本高，导致治疗费用昂贵。
[0006] 综上所述，CAR-T细胞具有杀灭肿瘤细胞能力，且能有效进入肿瘤组织内部，但其活性容易在肿瘤微环境中被抑制；而PD-1抗体能重新激活T细胞的抗肿瘤活性，但大分子抗体对实体瘤的穿透力不足，全身用药具有较大的毒副作用，且药物成本很高。因而，如果在保持CAR-T细胞杀伤毒性的前提下，能由其高效表达PD-1抗体，通过CAR-T细胞的肿瘤趋向特性，在肿瘤局部高水平表达PD-1抗体，将同时克服CAR-T细胞治疗与PD-1抗体治疗各自的缺陷，发挥两者的协同作用而提高疗效，同时降低治疗成本。
发明内容
[0007] 本发明提供一种T细胞，所述T细胞：(1)含有识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的编码序列和PD-1抗体的编码序列；和/或(2)表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体和PD-1抗体。
[0008] 在一个或多个实施方案中，所述T细胞的基因组中整合有识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的表达框和PD-1抗体的表达框。
[0009] 在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有膜蛋白信号肽、抗Muc1近膜端的单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
[0010] 在一个或多个实施方案中，所述信号肽为分泌型信号肽和膜结合型信号肽，优选为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；更优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0011] 在一个或多个实施方案中，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0012] 在一个或多个实施方案中，所述长50个氨基酸残基以上的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区和IgG4Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区是CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区；更优选地，CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述IgG4Fc CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013] 在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0014] 在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD28的胞内结构域；优选地，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0015] 在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所述。
[0016] 在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗Muc1单链抗体、CD8a铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ的酪氨酸活化基序。
[0017] 在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗Muc1单链抗体、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ的酪氨酸活化基序。
[0018] 在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-678位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:13所示；优选地，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:14第70-2034位碱基所示，或如SEQ ID NO:14所示。
[0019] 在一个或多个实施方案中，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-495位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示；优选地，所示PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第61-1488位碱基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
[0020] 本发明还提供一种组合物，所述组合物含有：含本发明所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和含PD-1抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
[0021] 在一个或多个实施方案中，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-495位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示；优选地，所述PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第63-1488位碱基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
[0023] (1)含本发明所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
[0024] (2)含PD-1抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
[0025] 在一个或多个实施方案中，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-495位氨基酸残基所示。
[0026] 本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体。
[0027] 本发明还提供本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。优选地，所述癌症为其癌细胞表面异常表达Muc1的癌症，优选为在Muc1在癌细胞表面的表达量为正常时的100倍以上、且Muc1在整个细胞表面均匀分布的癌症；优选地，所述癌症选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌/宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。附图说明
[0028] 图1：pNB328-Muc1CAR、pS328-Muc1CAR、pNB328-m279V、pS328-m279V-wt、pS328-m279V、pNB328-Muc1CAR-2A-m279V、
[0029] pNB328-m279V-IRES-Muc1CAR的表达框模式。
[0030] 图2A-2B：PBMCs经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因不同组合形式修饰活化后表达Muc1CAR基因阳性率及PD-1抗体表达量测定。
[0031] 图3A-3B：PBMCs经pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒不同质量比修饰后表达Muc1CAR基因阳性率及PD-1抗体表达量测定。
[0032] 图4：不同患者来源(从上到下依次为患者1、患者2、患者3)的PBMCs经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因修饰活化后T细胞表达Muc1CAR基因阳性率测定。
[0033] 图5：不同患者来源的PBMCs经PD-1抗体基因修饰后PD-1抗体基因表达的ELISA检测图。
[0034] 图6A-6D：Muc1CAR-anti PD1多能T细胞在体外可以增强T细胞的杀伤活性。A：流式检测间接反映T细胞杀伤活性的标记CD107α，活化标记CD25和耗竭标记LAG3，B:流式检测反映T细胞记忆的表型的标记蛋白CD45RO、CD62L和CCR7。C：流式检测T细胞CD3/CD4/CD8的比例。D：通过多因子检测试剂盒检测Muc1CAR-anti PD1多能T细胞，Muc1CAR-T细胞和Mock T细胞受Muc1抗原刺激后IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子的变化。
[0035] 图7：Muc1CAR-anti PD1多能T细胞的杀伤作用检测。
[0036] 图8：表达PD-1抗体的Muc1CAR T细胞的体内功能研究。
具体实施方式
[0037] 下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
[0038] 在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
[0039] 术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
[0040] 术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
[0041] 术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
[0042] 术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
[0043] 术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
[0044] 术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0045] 术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
[0046] 术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
[0048] 术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
[0049] 术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。
[0050] 有研究表明PD-1抗体的IgG4Fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而被吞噬，本发明对PD-1抗体IgG4Fc片段进行碱基突变改造以满足T细胞自身表达的PD-1抗体既可以很好的发挥功能又不引起ADCC反应。
[0051] 因此，本发明提供一种PD-1抗体，所述PD-1抗体含有抗PD-1单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第267-495位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第799-1485位碱基序列所示。
[0052] 在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体(scFv)中抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-131位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第61-393位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体中的重链可变区(VH区)氨基酸序列如SEQ ID NO:1第147-266位氨基酸序列所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第
439-798位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-266位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第61-798位碱基序列所示。
439-798位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-266位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:2第61-798位碱基序列所示。
[0053] 在某些实施方案中，所述PD-1抗体还含有轻链信号肽。在某些实施方案中，所述PD-1抗体从N端到C端，依次含有轻链信号肽、抗PD-1单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示；优选地，所示轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1-60位碱基序列所示。
[0054] 在某些实施方案中，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-495位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO:1所示。
[0055] 本发明还包括所述PD-1抗体的编码序列或其互补序列，所述编码序列至少包括本文所述的IgG4Fc的编码序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述PD-1抗体的编码序列含有SEQ ID NO:2第61-1495位碱基序列所示的序列，优选含有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0056] 本发明还包括一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的PD-1抗体的编码序列或其互补序列。优选地，所述核酸构建物是表达载体或用于将所述编码序列或其互补序列整合入宿主细胞的整合载体。
[0057] 本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸构建物。
[0058] 本发明还提供所述PD-1抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤中的用途，所述肿瘤尤其是与PD-1相关的肿瘤，包括但不限于本文所述的各种恶性肿瘤。
[0059] 有研究表明，有多种方式可以将2种不同的蛋白在同一细胞中表达，包括以2A或IRES连接2种基因片段形成单质粒后，再进行体外修饰细胞，该种方法可以确保当一种基因在某一细胞中表达后另一种基因必定能在同一细胞中表达，但该种质粒所携带的基因片段如果太长就会导致转录翻译的蛋白表达较弱。或者，也可将2种基因片段分别构建在2种载体上，同时体外修饰细胞。该种方法可以使得转录翻译的蛋白表达增强，但不能保证2种蛋白在同一个细胞中表达。
[0060] 为了实现Muc1CAR基因与PD-1抗体均能在细胞高效且稳定表达，本发明将Muc1CAR基因与PD-1抗体做了多种组合形式的测试，包括以2A连接Muc1CAR基因、PD-1抗体以及PB基因形成单个质粒、以IRES连接Muc1CAR基因、与PD-1抗体以及PB基因形成单个质粒、携带PB基因的Muc1CAR基因质粒与PD-1抗体质粒的双质粒组合以及携带PB基因的PD-1抗体质粒与Muc1CAR基因质粒的双质粒组合。通过测试表明携带PB基因的Muc1CAR基因质粒与PD-1抗体质粒的双质粒组合能取得稳定的Muc1CAR基因及PD-1抗体表达。
[0061] 因此，本发明还提供一种经Muc1CAR基因修饰并能表达PD-1抗体的T细胞，该T细胞能高水平稳定的表达Muc1CAR基因及PD-1抗体，外源表达的Muc1CAR基因可以准确的靶向Muc1抗原，增强T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。同时，外源表达的PD-1抗体可以克服免疫微环境的抑制，促进肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤的免疫反应。此外，外源Muc1CAR基因及PD-1抗体基因可经PB转座酶系统整合到T细胞的基因组中，从而在T细胞中稳定持续的表达。本发明高水平稳定表达Muc1CAR基因及PD-1抗体基因的T细胞可用于多种Muc1高表达的恶性肿瘤的治疗。
[0062] 本发明的CAR通常含有任选的信号肽序列、识别Muc1抗原的scFv、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
[0063] 信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。在本发明的某些实施方案中，信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；更优选地为CD8信号肽。CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:5所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:14第1-66位碱基所示。
[0064] 本文所述的识别Muc1抗原的scFv可以是本领域周知的针对Muc1抗原的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对Muc1近膜端氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，该Muc1近膜端氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。示例性的抗Muc1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:14第67-807位碱基所示。
[0065] 本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8a的胞外铰链区、IgG1FcCH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区或IgG4FcCH2CH3铰链区。示例性的CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的编码序列如SEQ ID NO:4所示或如SEQ ID NO:14第808-1491位所示。
[0066] 跨膜区可以是CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:14第1492-1575位碱基所示。
[0067] 胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10(DAP10)的胞内结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域为CD28的胞内结构域，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，示例性的编码序列如SEQ ID NO:14第1576-1698位碱基所示。在某些实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域为CD137/4-1BB的胞内结构域；优选地，所述CD137/4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
[0068] 胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所述；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:10第1699-2034位碱基所示。
[0069] 在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的CD信号肽、scFv、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域；优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13第23-678位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体还含有信号肽，优选地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的CD信号肽、scFv、CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD28的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域。
[0070] 应理解，本发明也包括本文所述的嵌合抗体受体及其编码序列。
[0071] 形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、抗Muc1单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
[0072] 应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
[0073] 本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0074] 本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0075] 本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列或编码所述PD-1抗体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述核酸构建物是表达框。
[0076] 调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
[0077] 调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
[0078] 在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文CAR的编码序列或PD-1抗体的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
[0079] 通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述CAR的编码序列或PD-1抗体的编码序列，以及任选的可选择的标记。
[0080] 合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0081] 在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:5所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:7所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；
SEQ ID NO:8所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；
SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
SEQ ID NO:8所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；
SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
[0082] 可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
[0083] 在某些实施方案中，将本文所述嵌合抗原受体的编码序列和PD-1抗体的编码序列分别克隆到用于将目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在5’LTR和3’LTR之间是本发明的CAR或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、CAR或抗体的编码序列以及polyA加尾信号序列。
[0084] 在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
[0085] 转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
[0086] 在某些实施方案中，本发明含嵌合抗原受体的编码序列的载体为CN201510638974.7所公开的pNB328载体。可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体的编码序列，并将其克隆入合适的载体中。
[0087] 在某些实施方案中，所述用于将目的基因整合到宿主细胞的基因组中的载体不含有转座酶编码序列。例如，可在pNB328载体的基础上除去转座酶编码序列即可获得这类载体。通常，用这类载体将PD-1抗体的编码序列及信号肽编码序列(如轻链信号肽的编码序列)整合到宿主细胞的基因组中。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1第1-20位氨基酸残基所示，示例性的轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO：2第1-60位碱基所示。
[0088] 在某些实施方案中，本文所述的经Muc1CAR基因修饰并能表达PD-1抗体的T细胞可转入：
[0089] (1)用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的表达框的含转座酶编码序列的载体；
[0090] (2)用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的不含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的表达框的不含转座酶编码序列的载体；
[0091] (3)用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的表达框的不含转座酶编码序列的载体；或
[0092] (4)用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的不含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的表达框的含转座酶编码序列的载体。
[0093] 优选地，所述T细胞转入了用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的表达框的不含转座酶编码序列的载体。更优选地，所述T细胞转入了以pNB328载体为骨架载体构建的含嵌合抗原受体编码序列的载体以及以pS328载体(与pNB328相比不含转座酶编码序列)为骨架载体构建的含PD-1抗体表达框的载体。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:14所示；所述PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第61-1488位碱基序列。在某些实施方案中，所述含PD-1抗体的编码序列的载体中，PD-1抗体的信号肽为轻链信号肽。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示。更具体而言，在某些实施方案中，所述在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体依次含有5’LTR、启动子、CD8信号肽编码序列、识别Muc1抗原的scFv的编码序列、IgG4Fc CH2CH3铰链区的编码序列、CD28跨膜区的编码序列、CD28胞内结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号域的编码序列、polyA加尾信号序列、3’LTR和转座酶的编码序列及其启动子；所述在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体在5’LTR和3’LTR之间依次含有启动子、轻链信号肽的编码序列、PD-1抗体的编码序列和polyA加尾信号序列。
[0094] 优选地，转染时，含嵌合抗原受体编码序列的载体与含PD-1抗体编码序列的载体的质量比为1～7：1～7，优选1～3：1～3，优选1：1～3，更优选1：1～2，更优选1：1。
[0095] 转染的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述载体转染感兴趣的细胞中。
[0096] 感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
[0097] 本发明还提供一种组合物，所述组合物含有含本文所述嵌合抗原受体表达框的载体和含本文所述PD-1抗体的表达框的载体。该组合物中还可含有合适的试剂，包括但不限于转染用的试剂。
[0098] 本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有含本文所述嵌合抗原受体表达框的载体和含本文所述PD-1抗体的表达框的载体，或者含有本文所述的组合物。试剂盒中还可配有将所述载体转入细胞中的试剂或仪器。
[0099] 应理解，本文所述的表达框除含有本文所述的CAR或抗体的编码序列外，还至少含有合适的启动子和polyA加尾信号序列。
[0100] 本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体。药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体或辅料。药物组合物中含有治疗或预防有效量的T细胞。可根据患者的病情等因素确定T细胞的治疗或预防有效量。
[0101] 本发明还提供本文所述的T细胞或其药物组合物或或所述T细胞及其表达的PD-1抗体在制备治疗治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。本发明还提供恶性肿瘤的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的本发明所述的T细胞。适用于本文所述T细胞进行治疗或预防的癌症优选Muc1阳性癌症，具体包括癌细胞表面异常表达Muc1的癌症，如在Muc1在癌细胞表面的表达量为正常时的100倍以上、且Muc1在整个细胞表面均匀分布的癌症。具体而言，这类癌症可选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌/宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。
[0102] 下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。此外，用理解的是，本文所用的“含有”也包括“由……组成”。
[0103] 实施例1：重组质粒pNB328-Muc1CAR、pS328-Muc1CAR、pNB328-m279V、pS328-m279V-wt、pS328-m279V、pNB328-Muc1CAR-2A-m279V、pNB328-m279V-IRES-Muc1CAR的构建和多种类型多能T细胞的获得。
[0104] 1、重组质粒构建
[0105] 委托上海捷瑞生物公司合成Muc1CAR外源基因(含CD8信号肽，抗原识别单链抗体，IgG4CH2CH3铰链区，CD28跨膜区，CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体或pS328载体(pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；与pNB328相比，pS328缺少PB转座子序列)中，构成重组质粒，分别命名为pNB328-Muc1CAR及pS328-Muc1CAR。
[0106] 委托上海杰瑞生物公司合成野生型PD-1抗体的外源基因(包括轻链信号肽的编码序列；轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:16第1-60位碱基序列所示，野生型PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:16第61-1488位碱基序列；轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第1-20位氨基酸残基所示，野生型PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15第21-495位氨基酸残基所示)和突变型PD-1抗体的外源基因(包括轻链信号肽的编码序列；轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1-60位碱基序列所示，突变型PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:2第61-1488位碱基序列；轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示，突变型PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第21-495位氨基酸残基所示)，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，分别将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体及pS328载体中，构成重组质粒，分别命名为pNB328-m279V、pS328-m279V-wt、pS328-m279V。
[0107] 将前述合成的Muc1CAR外源基因与突变型PD-1抗体的外源基因以2A(SEQ ID NO:17，氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)连接，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体中，构成重组质粒，命名为pNB328-Muc1CAR-2A-m279V。
[0108] 将前述合成的突变型PD-1抗体的外源基因与Muc1CAR外源基因以IRES(SEQ ID NO:19)连接，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体中，构成重组质粒，命名为pNB328-m279V-IRES-Muc1CAR。
[0109] 构建得到的各重组质粒的结构如图1所示。各结构模式图中未示出启动子序列和polyA加尾信号序列，其分别位于5’LTR和信号肽序列之间以及3’LTR之前。
[0110] 2、获得Muc1CAR-anti PD1多能T细胞
[0111] 利用Filcoll分离法从捐献者血液中分离获得外周血单核细胞(PBMCs)。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp，离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；
[0112] 针对每一种重组质粒，分别取6个1.5ml离心管，编号a，b，c，d，e，f和g。每管加入5×106个细胞，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，每管按比例加入电转试剂共100ul，a管加入4ug重组质粒pS328-Muc1CAR和4ug重组质粒pNB328-m279V(质量比1:1)，b管加入4ug重组质粒pNB328-Muc1CAR和4ug重组质粒pS328-m279V(质量比1:1)，c管加入8ugpNB328-Muc1CAR-2A-m279V质粒，d管加入8ug pNB328-m279V-IRES-Muc1CAR，e管加入8ug pNB328载体质粒，f管加入4ug重组质粒pNB328-Muc1CAR和4ug重组质粒pS328-m279V-wt，g管加入4ug重组质粒pNB328-Muc1CAR，分别重悬混匀细胞；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；同样的取另外4个1.5ml离心管，编号1，2，3，4，每管加入5×106个细胞，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，每管按比例加入电转试剂共100ul，每管以不同的质量比(1:1、3:5、1:3、1:7)加入重组质粒pNB328-Muc1CAR和重组质粒pS328-m279V，使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培养液的六孔板中(含2％FBS的AIM-V培养液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，6小时后加入刺激因子IL-2和Muc1抗原、CD28抗体，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得相应的T细胞，分别命名为pS328-Muc1CAR+pNB328-antiPD1T细胞、pNB328-Muc1CAR+pS328-antiPD1T细胞、Muc1CAR-2A-antiPD1T细胞、antiPD1-IRES-Muc1CAR T细胞、pNB328-Muc1CAR+pS328-antiPD1-wt T细胞，以及Muc1CAR T细胞。
[0113] 实施例2：PBMCs经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因不同组合形式修饰活化后表达Muc1CAR基因阳性率及PD-1抗体表达测定。
[0114] 上述构建的不同种类的不同患者来源的活化T细胞在电转后培养第12天按照1×106细胞沉淀，用PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2.5ul的Biotin-Muc1抗体，4℃孵育30min，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2ul PE-链霉素二抗，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。同样的，收集2×106细胞数目并按2×106细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。用双抗体夹心ELISA方法(使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的鼠抗人IgG4mAb检测，以商品化的PD-1抗体作为标准品，待测样品50倍稀释后定量检测基因修饰后的T细胞中PD-1抗体的表达量。
[0115] 结果如图2A和2B以及下表所示，由pNB328-Muc1CAR质粒和pS328-m279V质粒组合电转所获得的T细胞具有较高的Muc1CAR基因及PD-1抗体分泌：
[0116]T细胞类型 PD-1抗体表达量(ng/ml) CAR-T细胞阳性率(％)
Mock T 0.466 0.31
pS328-Muc1CAR+pNB328-antiPD1T 1590.49 45.93
pNB328-Muc1CAR+pS328-antiPD1T 2190.49 91.17
Muc1CAR-2A-antiPD1T 105.20 10.38
antiPD1-IRES-Muc1CAR T 366.47 35.33
Mock T 0.466 0.31
pS328-Muc1CAR+pNB328-antiPD1T 1590.49 45.93
pNB328-Muc1CAR+pS328-antiPD1T 2190.49 91.17
Muc1CAR-2A-antiPD1T 105.20 10.38
antiPD1-IRES-Muc1CAR T 366.47 35.33
[0117] 实施例3：PBMCs经pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒不同质量比修饰后表达Muc1CAR基因阳性率及PD-1抗体表达量测定
[0118] 如实施例1所述将重组质粒pNB328-Muc1CAR和pS328-m279V以不同质量比电转PBMCs细胞(1：1、3：5、1：3、1：7)，获得多种同时表达Muc1CAR基因和PD-1抗体的T细胞。电转6 6
后培养第12天将这些T细胞按2×10细胞数目收集细胞并按2×10 细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。用双抗体夹心ELISA方法(使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的鼠抗人IgG4mAb检测，以商品化的PD-1抗体作为标准品，待测样品50倍稀释后定量检测基因修
6
饰后的T细胞中PD-1抗体的表达量。同时收集1×10细胞沉淀，用PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2.5ul的Biotin-Muc1抗体，4℃孵育30min，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2ul PE-链霉素二抗，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
后培养第12天将这些T细胞按2×10细胞数目收集细胞并按2×10 细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。用双抗体夹心ELISA方法(使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的鼠抗人IgG4mAb检测，以商品化的PD-1抗体作为标准品，待测样品50倍稀释后定量检测基因修
6
饰后的T细胞中PD-1抗体的表达量。同时收集1×10细胞沉淀，用PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2.5ul的Biotin-Muc1抗体，4℃孵育30min，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2ul PE-链霉素二抗，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
[0119] 结果发现如图3A、3B和下表所示，由pNB328-Muc1CAR质粒和pS328-m279V质粒以1：1质量比进行电转所获得的T细胞具有较高的Muc1CAR基因及PD-1抗体分泌。
[0120]
[0121] 实施例4：不同患者来源的PBMCs经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因修饰活化后T细胞表达Muc1CAR基因阳性率测定。
[0122] 培养实施例1获得的不同患者的Mock T细胞、Muc1CAR T细胞及转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞，第12天按1×106细胞数目收集细胞沉淀，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2.5ul的Biotin-Muc1抗体，4℃孵育30min，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入2ul PE-链霉素二抗，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
[0123] 结果如图4所示，Muc1CAR重组蛋白可以在T细胞表面稳定表达。
[0124] 实施例5：不同患者来源的pBMCs经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因修饰活化后T细胞表达PD-1抗体表达量的定量检测。
[0125] 培养实施例1获得的不同患者的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞及转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞，第12天按2×106细胞数目收集细胞并按2×106细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。用双抗体夹心ELISA方法(使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的鼠抗人IgG4mAb检测，以商品化的抗PD-1抗体作为标准品，待测样品50倍稀释后定量检测经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因修饰后的T细胞中PD-1抗体的表达量。
[0126] 结果如图5所示，经PD-1抗体基因修饰的Muc1CAR T细胞能够高水平稳定表达PD-1抗体。
[0127] 实施例6：不同患者来源的PBMCs细胞经Muc1CAR基因及PD-1抗体基因修饰后T细胞基因组中Muc1CAR基因组表达水平的检测。
[0128] 提取实施例1得到的Mock T细胞、Muc1CAR T细胞及转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞的基因组DNA(试剂盒法)，实验步骤参照试剂盒内附带的说明书，测定Mock T细胞、Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1T细胞的DNA浓度，采用实时荧光定量PCR的方法检测Muc1CAR基因组的表达水平，反应程序为：50℃，2min→95℃,10min→95℃,15s→60℃,1min，40个循环。得到的Muc1CAR基因组的CT值及Actin的CT值根据相应的公式计算出绝对拷贝数含量。
[0129] 结果发现，经PB转座酶系统，Muc1CAR基因组被整合到T细胞基因组中，具体如下表所示：
[0130]
[0131] 实施例7：流式检测Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-antiPD1T细胞活化表型和细胞因子分泌的区别。
[0132] 1、收集实施例1得到的悬浮的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，分别加入2ul的同型对照抗体IgG1-PE，荧光流式抗体anti-CD25-PE，anti-LAG3-PE，anti-PD1-PE；同型对照抗体IgG1-PC5，荧光流式抗体anti-CD107α-PC5；同型对照抗体IgG1FITC，荧光流式抗体anti-CD62L-FITC；同型对照抗体IgG1-PC5，荧光流式抗体anti-CD45RO-PC5；同型对照抗体IgG1-PE，荧光流式抗体anti-CCR7-PE，轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
[0133] 结果发现Muc1CAR-antiPD1T细胞分泌的PD-1单链抗体可以很好的封闭T细胞表面的PD-1蛋白，且Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-antiPD1T细胞在体外均有明显的杀伤活性，也能促进效应记忆T的形成，活化标记CD25明显高于Mock T细胞而Muc1CAR-antiPD1T细胞的耗竭标记LAG3要明显低于Mock T细胞和Muc1CAR T细胞，具体如图6A、6B所示。
[0134] 2、收集1×106个的实施例1得到的Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞，分别加入1.5ml的EP管中，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min，加入2ul的α-CD3CD4CD8抗体，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，加入
400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
[0135] 结果发现Muc1CAR T细胞、Muc1CAR-antiPD1T细胞和Mock T中CD3+CD4+，CD3+CD8+细胞所占的百分比并没有很大的差异，具体如6C所示。
[0136] 3、用5ug/ml的Muc1抗原包被24孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入3×105个实施例1得到的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II检测Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-antiPD1T细胞受Muc1抗原刺激后细胞因子的分泌情况：
[0137] (1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
[0138] (2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
[0139] (3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
[0140] (4)室温避光孵育3h；
[0141] (5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200g离心5min，弃上清；
[0142] (6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
[0143] 结果发现Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1T细胞分泌的IL-2，TNF-α和IFN-γ相比于Mock T细胞而言有了很大的提高，而三种细胞分泌的IL-4、IL-6和IL-10并没有什么差异，具体如图6D所示。
[0144] 实施例8：Mock T细胞、Muc1CAR T细胞及Muc1CAR-antiPD1 T细胞在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验。
[0145] 选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
[0146] (1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
[0147] (2)靶细胞铺板：宫颈癌细胞Hela，肝癌细胞HCC-LM3，肺癌细胞A549(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
[0148] (3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞(实施例1得到的Mock T细胞，Muc1CAR T细胞和转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞)，每孔50μl，效靶比设置为4:1，以未转质粒的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，获得细胞增殖曲线。
[0149] 结果显示，表达PD-1抗体的Muc1CAR T细胞对三种肿瘤细胞的杀伤均优于Muc1CAR T细胞。具体如图7所示。
[0150] 实施例9：表达PD-1抗体的Muc1CAR T细胞的体内功能研究。
[0151] 第一步：4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠15只，平均重量22～27g，由北京维通达生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。
[0152] 第二步：体外培育人宫颈癌细胞Hela，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
[0153] 第三步：于小鼠右肋背部皮下接种Hela-luc细胞，0.1ml/只。接种10天左右后，通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为4组，每组5只小鼠，分别给予PBS(100ul)以及实施例1获得的Mock T细胞、Muc1CAR T细胞、转入了pNB328-Muc1CAR和pS328-m279V-wt的Muc1CAR-antiPD1-wt T细胞及转入了pNB328-Muc1CAR与pS328-m279V质粒的Muc1CAR-antiPD1T细胞(1×107个/只)。给药途径为尾静脉注射。
[0154] 第四步：每日观察小鼠的生活状态并每隔10天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
[0155] 结果如图8所示。
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