技术领域
[0001] 本
发明属于兽用
生物制品领域，具体涉及一种含犬细小病毒
抗原及其他抗原的疫苗组合物、试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)所引发的
疾病发病急、病程短、死亡率高，传染性强，可感染各种年龄、性别、品种的犬、狐狸、
水貂、貉子和狼，特别易感染幼龄动物，8周龄内的动物发病死亡率高达70％，1岁内的动物死亡率也可达30％。
[0003] 犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是世界范围内存在的一种高发病率、高死亡率病毒性疾病，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，其宿主已由传统的犬科(包括犬、狐狸、貉子等)、浣熊科和鼬科(水貂等)动物扩展到食肉目所有8个科及偶
蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且呈现不断扩大的趋势。
[0004] 犬腺病毒(Canine Adenovirus,CAV)是
哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有2个血清型，其中I型腺病毒(CAV-I)引起犬传染性
肝炎(ICH)和狐狸脑炎(FE)；II型腺病毒(CAV-II)则引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。
[0005] 狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)的主要宿主为犬、猫等动物，为人畜共患传染病，多数的人狂犬病是与人类密切
接触的带毒犬或猫传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。
[0006] 犬副流感病毒(Canine Parainfluenza Virus,CPIV)主要感染犬的
呼吸道，临床表现发热、流涕和咳嗽，病理变化以卡他性鼻炎和支气管炎为特征。
[0007] 犬冠状病毒(Canine Coronavirus,CCV)呈急性胃肠炎综合症，导致食欲缺乏、腹泻、呕吐等，是养犬业与养狐业危害较大的疾病之一。
[0008] 犬钩端螺旋体(Leptospira canicola，Lep)有十几个血清型，均能引起发病，且为
人畜共患病；国内以黄疸出血型和犬型的致病
力最高，其中黄疸出血型常致急性出血性黄疸综合症，犬型以肾
炎症状为主。
[0009] 目前商品化的犬细小疫苗所涉及到的CPV毒株均为早期出现的CPV-2型，而目前流行的CPV毒株与其在
氨基酸水平上差异较大，特别地这些商品化进口疫苗自引入国内起的临床病例中犬细小病毒单独或混合感染均未得到显著抑制或减少，仍然给宠物犬、养犬业和
毛皮经济动物等养殖行业造成极大危害和严重的损失。
[0010] 临床上CPV单独感染约占30％左右，与其他病毒(包括CDV、CCV、CAV、RV、CPIV)的混合感染高达50％以上，特别地混合感染的病例治愈率比单纯感染的低70％。
[0011] 因此，亟需提供针对目前流行的CPV野毒株的含有犬细小病毒抗原和多种其他抗原的疫苗组合物，以满足临床上的需要。
发明内容
[0012] 为了解决
现有技术的不足，本发明提供了一种含免疫量的犬细小病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物，该疫苗组合物可以
预防和/或
治疗犬细小病毒等的感染，其针对目前流行的CPV野毒株，能有效预防犬细小
病毒感染。
[0013] 本发明涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的犬细小病毒抗原、免疫量的其他抗原和
兽医学上可接受的载体；其中，所述犬细小病毒抗原为犬细小病毒S0425株抗原，犬细小病毒S0425株保藏号为CCTCC NO.V201634。
[0014] 本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法。
[0015] 本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0016] 本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括有效量的犬细小病毒抗原、有效量的其他抗原以及兽医学上可接受的载体，所述犬细小病毒抗原为犬细小病毒S0425株抗原，犬细小病毒S0425株保藏号为CCTCC NO.V201634；其中，所述试剂盒中犬细小病毒抗原与其他抗原分别放置或一同放置。
[0017] 本发明还涉及所述试剂盒的制备方法。
[0018] 本发明还涉及所述试剂盒在制备预防和/或治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0019] 本发明的疫苗组合物、试剂盒对当前流行的犬细小单独或混合感染有良好的预防和控制效果，其仅经过一次免疫，就能实现完全保护，其免疫效果较商售的活苗相当甚至更优，且免疫期长，一次免疫持续期可长达18个月以上。
具体实施方式
[0020] 以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0021] 术语“疫苗组合物”又称免疫原性组合物，是指一种含免疫原的制剂，包括如
蛋白质、肽、全细胞、灭活的、亚单位或减毒的活的病毒或细菌，或者多糖，或其组合，其被施用来刺激受体对存在于免疫原性组合物中一种或多种抗原的体液和细胞免疫反应。免疫接种是施用疫苗组合物并在宿主中刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程。优选的宿主为哺乳动物诸如犬。
[0022] 术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量
抗体效价、淋巴
细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、
温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
[0023] 术语“犬细小病毒”指“犬细小病毒”(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，所引发的临床症状包括肠炎症状和心肌炎症状，肠炎型的共同症状为严重的呕吐与严重的出血性腹泻。心肌炎型可以导致幼犬呼吸与心血管的衰竭。
[0024] 术语“犬细小病毒抗原”是指至少含有一种犬细小病毒抗原形式的任何组合物，所述犬细小病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬细小病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的活的或亚单位的抗原，所述亚单位抗原为包含VP2蛋白或其结构域的抗原。减毒和灭活方法是本领域技术人员熟知的。减毒方法包括但不限于在细胞培养物中在核实的细胞系上连续传代(病毒和一些细菌)、在肉汤培养物中连续传代(细菌)、紫外线照射(病毒和细菌)和化学诱变(病毒和细菌)。病毒或细菌的灭活方法包括但不限于用福尔
马林、β-丙内酯(betapropriolactone,BPL)或二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)处理或本领域技术人员已知的其他方法。
[0025] 术语“犬瘟热病毒抗原”至少含有一种犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)抗原形式的任何组合物，所述犬瘟热病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬瘟热病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬瘟热病毒抗原包括活的抗原如吉林省五星动物保健药厂生产的犬五联活疫苗的CDV R-20/8株，齐鲁动物保健品有限公司生产的犬瘟热活疫苗的CDV 11株，杨凌绿方
生物工程有限公司生产的犬五联活疫苗的CDV XN112株，辉瑞公司生产的犬多联苗的CDV Snyder Hill株，英特威公司生产的犬四联疫苗的CDV Onderstepoort株，梅里亚公司生产的犬多联苗的CDV BA5-Vero 150株，海博莱公司生产的犬多联苗的CDV Lederle株，CDV YBR株(参见中国
专利CN101914503A)，CDV CC12-30株(参见中国专利CN102839158A)；灭活的抗原如中国专利CN101914503A公开的CDV YB株，CDV NJ01株(参见毕振威等，非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达.中国预防兽医学报，2011,33(8):625-629)，CDV TM-CC株(李维克.犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建.东北林业大学博士论文，2014)，CDV LIU株(何洪斌，李金中，夏咸柱等.犬瘟热病毒野毒株H蛋白基因的序列分析.中国兽医学报，1999,19(4):404-407)，CDV
93039株病毒液(参考遇秀玲,田克恭.犬实验感染CDV的病理学研究.中国畜禽传染病,
1998,20(2):76-78)；亚单位的抗原如含CDV抗原性蛋白H蛋白、F蛋白、M蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
[0026] 术语“犬腺病毒II型抗原”指至少含有一种犬腺病毒(Canine Adenovirus-II，CAV-II)抗原形式的任何组合物，所述犬腺病毒II型抗原可诱导、刺激或能抵抗犬腺病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬腺病毒II型抗原包括活的抗原如吉林省五星动物保健药厂生产的犬五联活疫苗的CAV-II YCA18株，杨凌绿方生物工程有限公司生产的犬五联活疫苗的CAV-II XN3株，辉瑞公司生产的犬多联苗的CAV-II NL-CPI株，英特威公司生产的犬四联疫苗的CAV-II Manhattan LPV3株，梅里亚公司生产的犬多联苗的CAV-II CGF2004/75株、海博莱公司生产的犬多联苗的CAV-II Manhattan株，CAV YCA18株(参见中国专利CN1876181A)；灭活的抗原如Ditchfield等(Ditchfield et al，Can.Vet.J.,3:238-247，1962)所述，亚单位的抗原如含CAV抗原性蛋白E3蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
[0027] 术语“狂犬病毒抗原”指至少含有一种狂犬病毒(Rabies Virus,RV)抗原形式的任何组合物，所述狂犬病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗狂犬病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述狂犬病毒抗原包括活的抗原如乾元浩生物公司生产的狂犬活疫苗的RV Flury株，RV Rb/E3株(参见中国专利CN1876181A)；灭活的抗原如吉林正业公司生产的狂犬病灭活疫苗的RV Flury LEP株，上海海利公司生产的狂犬病灭活疫苗的RV SAD株，中国人民解放军军事医学科学院研制的狂犬病灭活疫苗的RV CVS-11株，唐山怡安生物工程公司等生产的狂犬病灭活疫苗的RV CTN-1株，英特威公司生产的狂犬病灭活疫苗的RV Pasteur RIV株、辉瑞公司生产的狂犬病灭活疫苗的RV HCP-SAD株、梅里亚公司生产的狂犬病灭活疫苗的RV G52株、维克公司生产的狂犬病灭活疫苗的RV VP12株；亚单位的抗原如含RV抗原性蛋白G蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
[0028] 术语“犬副流感病毒抗原”是指至少含有一种犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)抗原形式的任何组合物，所述犬副流感病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬副流感病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬副流感病毒抗原包括活的抗原如CY-c株(保藏号为CGMCC No.5268，参见中国专利CN102343088A)，A-20/8株(参见中国专利CN1876181A)，XN-4株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):722-724)，Solvary株(金昌德，李六金，娄庆林等.犬副流感流行毒株的分离鉴定.中国畜禽传染病,1997(1):24-27)，以 KC-Plus呈现的活减毒犬副流感病毒D008株、以Canixin DHPPi/L呈现的活减毒犬副流感病毒Manhattan株、以Duramune DAPPi呈现的活减毒犬副流感病毒FDL株、以Vanguard 7呈现的活减毒犬副流感病毒NL-CPI-5株、以 和/或KC呈现的活减毒犬副流感病毒Cornell株，以吉林省五星动物保健药厂生产的犬五联活疫苗的犬副流感病毒A-20/8株，和/或来自
NaramuneTM、 Univac 2、Univac 5、Kennel-JecTM、
Plus 5的活减毒的犬副流感病毒毒株；灭活的抗原如犬副流感病毒D008株
(美国ATCC保存，保藏号为VR-399)，XN931株(金昌德，李六金，施新猷等.犬副流感病毒流行毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):719-721)，XN934株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):722-724)，
78238株(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主编.兽医
微生物学.北京:中国农业出版社,
1998:414-415)、yz0506株(岑皓.犬副流感病毒的分离及单克隆抗体的制备.扬州大学硕士学位论文,2007)；亚单位抗原如含CPIV免疫原性蛋白F(fusion protein，即融合蛋白)、HN(hemagglutinin-neuraminidase，即血凝素神经氨酸酶)、M(matrix protein，即基质蛋白)、NP(nucleocapsid protein，即核衣壳蛋白)、P(phosphopritein，即磷蛋白)和/或L(Large protein，即大蛋白)蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
[0029] 术语“犬冠状病毒抗原”是指至少含有一种犬冠状病毒(Canine Coronavirus,CCV)抗原形式的任何组合物，所述犬冠状病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬冠状病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬冠状病毒抗原包括活的抗原如CCV YS1/V60株(参见中国专利CN1876181A)；灭活的抗原如辉瑞公司生产的犬多联苗的CCV NL-18株；亚单位抗原如含CCV免疫原性蛋白S蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
[0030] 术语“犬钩端螺旋体抗原”是指至少含有一种犬钩端螺旋体(Leptospira canicola，Lep)抗原形式的任何组合物，所述犬钩端螺旋体抗原可诱导、刺激或能抵抗犬钩端螺旋体感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬钩端螺旋体抗原包括活的抗原如外膜蛋白(Outer membrane protein,OMPs)，灭活的抗原如辉瑞公司生产的犬多联苗的Lep犬型C-51株、黄疸型NADL11403株，英特威公司生产的犬多联苗的Lep犬型CA-12-000株、钩端型820K株；亚单位抗原如含Lep免疫原性蛋白、外膜蛋白(OMPs)或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
[0031] 术语“犬”通常被称为狗者，但也包括犬科家族的其他成员如狼、貉子、狐狸。
[0032] 术语“TCID50”是指组织培养感染剂量，并且其被定义为感染50％的给定批次的已接种细胞培养所需的病毒稀释。各种方法可用于计算TCID50，包括Sperman-Karber方法(如BW Mahy,HO Kangro.Virology methods manual,1996:25-46)、Reed-Muench方法。在本发明中当抗原含量为灭活抗原含量时，表示灭活前的抗原含量。
[0033] 术语“CFU”是菌落形成单位(Colony Forming Units)的缩写，其表示：能产生微生物菌落的微生物、微生物芽孢/孢子(spore)、微生物的部分发育的芽孢或营养细胞的数目。在本发明中当抗原含量为灭活抗原含量时，表示灭活前的抗原含量。
[0034] 术语“兽医学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物种除犬瘟热病毒抗原之外的其他所有成分，不刺激
机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括
铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂如可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂；水包油包水乳剂；
丙烯酸或甲基丙烯酸的
聚合物；
顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。
[0035] 术语“乳剂”可尤其基于轻液体石
蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯
烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如
角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其
植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链
脂肪酸或醇的酯，尤其异
硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子
表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、
蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙
氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。
[0036] 术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢
原子被具有至少2个
碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基
蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。
[0037] 术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
[0038] 本发明涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的犬细小病毒抗原、免疫量的其他抗原和/或兽医学上可接受的载体；其中，所述犬细小病毒抗原为犬细小病毒S0425株抗原，犬细小病毒S0425株保藏号为CCTCC NO.V201634。
[0039] 所述犬细小病毒S0425株(Canine Parvovirus，Strain S0425)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201634，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2016年6月14日。
[0040] 作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物中所述犬细小病毒S0425株抗原为灭活的全病毒抗原，所述灭活的全病毒抗原的含量为灭活前105-109TCID50/ml。
[0041] 作为本发明的一种优选实施方式，所述犬细小病毒S0425株抗原为灭活的全病毒抗原，所述灭活的全病毒抗原的含量为灭活前106-108TCID50/ml。
[0042] 作为本发明的一种优选实施方式，所述犬细小病毒S0425株抗原为灭活的全病毒抗原，所述灭活的全病毒抗原的含量为灭活前107TCID50/ml。
[0043] 作为本发明的一种实施方式，所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬伪狂犬病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性
乳头瘤病毒抗原、犬微小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原、支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种。
[0044] 作为本发明的一种优选实施方式，所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、狂犬病病毒抗原中的一种或几种。
[0045] 作为本发明的一种实施方式，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
[0046] 优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
[0047] 优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体
石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其
植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
[0048] 优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
[0049] 优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
[0050] 优选地，所述佐剂为GEL A佐剂；
[0051] 所述佐剂的浓度范围是从5％到50％V/V，优选5％V/V。
[0052] 作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒抗原包括CDVR-20/8株抗原、CDV 11株抗原、CDV XN112株抗原、CDV Snyder Hill株抗原、CDV Onderstepoort株抗原，CDV BA5-Vero 150株抗原、CDV Lederle株抗原，CDV YBR株抗原、CDV CC12-30株抗原、CDV YB株抗原、CDV NJ01株抗原、CDV TM-CC株抗原、CDV LIU株抗原、CDV 93039株抗原，H蛋白、F蛋白、M蛋白或其结构域的亚单位抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0053] 所述犬腺病毒II型抗原包括CAV-II YCA18株抗原、CAV-II XN3株抗原、CAV-II NL-CPI株抗原、CAV-II Manhattan LPV3株抗原，CAV-II CGF2004/75株抗原、CAV-II Manhattan株抗原、CAV YCA18株抗原，E3蛋白或其结构域的亚单位抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0054] 所述狂犬病毒抗原包括RV Flury株抗原、RV Rb/E3株抗原，RV Flury LEP株抗原、RV SAD株抗原、RV CVS-11株抗原、RV CTN-1株抗原、RV Pasteur RIV株抗原、RV HCP-SAD株抗原、RV G52株抗原、RV VP12株抗原，RV G亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0055] 所述犬副流感病毒抗原包括CY-c株抗原、A-20/8株抗原、Solvary株抗原、D008株抗原、Manhattan株抗原、FDL株抗原、NL-CPI-5株抗原、Cornell株抗原、A-20/8株抗原，TMNaramune 、
Univac 2、Univac 5、Kennel-JecTM、 Plus 5的犬副流感病毒毒株抗原；D008株抗原、XN931株抗原、XN934株抗原、78238株抗原、yz0506株抗原、亚单位抗原CPIV F亚单位蛋白抗原、HN亚单位蛋白抗原、M亚单位蛋白抗原、NP亚单位蛋白抗原、P亚单位蛋白抗原、或L亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0056] 所述犬冠状病毒抗原包括CCV YS1/V60株抗原、NL-18株抗原、CCV S亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0057] 所述犬钩端螺旋体抗原包括Lep犬型C-51株抗原、黄疸型NADL11403株抗原、Lep犬型CA-12-000株抗原、钩端型820K株抗原、Lep亚单位蛋白抗原、外膜蛋白或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合。
[0058] 作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒抗原为CDV Onderstepoort株弱毒株，含量为105-106TCID50/头份；所述犬腺病毒II型抗原为CAV-II YCA18株自然弱毒株，含量为105TCID50/头份。
[0059] 本发明的疫苗组合物可直接施用于肌内、鼻腔或皮下，用于肠胃外施用的合适的方法包括肌内、滴鼻和皮下注射。作为本发明的一种优选实施方式，所述药物经皮下注射
给药。
[0060] 本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)分别制备所述犬细小病毒抗原、所述其他抗原；以及步骤(2)按比例将所述步骤(1)中所述制备的犬细小病毒抗原、其他抗原放置，添加兽医学上可接受的载体。
[0061] 术语“预防和/或治疗”在涉及犬细小病毒感染时是指抑制犬细小病毒的复制、抑制犬细小病毒的传播或防止犬细小病毒在其宿主体内定居，以及减轻犬细小病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或
摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
[0062] 本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0063] 本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述犬细小病毒抗原、有效量的其他抗原和兽医学上可接受的载体，所述犬细小病毒抗原为犬细小病毒S0425株抗原，犬细小病毒S0425株保藏号为CCTCC NO.V201634，其中，所述试剂盒中犬细小病毒抗原与其他抗原分别放置或一同放置。
[0064] 作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述犬细小病毒S0425株抗原为灭活的全病毒抗原，所述灭活的全病毒抗原的含量为灭活前105-109TCID50/ml。
[0065] 作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述犬细小病毒S0425株抗原为灭活的全病毒抗原，所述灭活的全病毒抗原的含量为灭活前106-108TCID50/ml。
[0066] 作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述灭活的全病毒抗原的含量为灭活前107TCID50/ml。
[0067] 作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述试剂盒中犬细小病毒抗原与其他抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原形式时，犬细小病毒抗原与其他抗原一同放置；所述犬细小病毒抗原为灭活抗原形式，所述其他抗原中包含活抗原形式成分时，所述活抗原形式抗原成分与灭活抗原形式抗原成分分别放置。
[0068] 作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬伪狂犬病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬微小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原、支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种。
[0069] 作为本发明的一种优选实施方式，所述试剂盒中所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、狂犬病病毒抗原中的一种或几种。
[0070] 作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒抗原包括CDV R-20/8株抗原、CDV 11株抗原、CDV XN112株抗原、CDV Snyder Hill株抗原、CDV Onderstepoort株抗原，CDV BA5-Vero 150株抗原、CDV Lederle株抗原，CDV YBR株抗原、CDV CC12-30株抗原、CDV YB株抗原、CDV NJ01株抗原、CDV TM-CC株抗原、CDV LIU株抗原、CDV 93039株抗原，H蛋白、F蛋白、M蛋白或其结构域的亚单位抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0071] 所述犬腺病毒II型抗原包括CAV-II YCA18株抗原、CAV-II XN3株抗原、CAV-II NL-CPI株抗原、CAV-II Manhattan LPV3株抗原，CAV-II CGF2004/75株抗原、CAV-II Manhattan株抗原、CAV YCA18株抗原，E3蛋白或其结构域的亚单位抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0072] 所述狂犬病毒抗原包括RV Flury株抗原、RV Rb/E3株抗原，RV Flury LEP株抗原、RV SAD株抗原、RV CVS-11株抗原、RV CTN-1株抗原、RV Pasteur RIV株抗原、RV HCP-SAD株抗原、RV G52株抗原、RV VP12株抗原，RV G亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0073] 所述犬副流感病毒抗原包括CY-c株抗原、A-20/8株抗原、Solvary株抗原、D008株抗原、Manhattan株抗原、FDL株抗原、NL-CPI-5株抗原、Cornell株抗原、A-20/8株抗原，NaramuneTM、Univac 2、Univac 5、Kennel-JecTM、 Plus 5的犬副流感病毒毒株抗原；D008株抗原、XN931株抗原、XN934株抗原、78238株抗原、yz0506株抗原、亚单位抗原CPIV F亚单位蛋白抗原、HN亚单位蛋白抗原、M亚单位蛋白抗原、NP亚单位蛋白抗原、P亚单位蛋白抗原、或L亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0074] 所述犬冠状病毒抗原包括CCV YS1/V60株抗原、NL-18株抗原、CCV S亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；
[0075] 所述犬钩端螺旋体抗原包括Lep犬型C-51株抗原、黄疸型NADL11403株抗原、Lep犬型CA-12-000株抗原、钩端型820K株抗原、Lep亚单位蛋白抗原、外膜蛋白或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合。
[0076] 作为本发明的一种优选实施方式，所述试剂盒中，所述犬瘟热病毒抗原为CDV Onderstepoort株弱毒株，含量为105-106TCID50/头份；所述犬腺病毒II型抗原为CAV-II YCA18株自然弱毒株，含量为105TCID50/头份。
[0077] 作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中活抗原部分还包括冻干保护剂，所述灭活抗原和/或亚单位抗原部分还包括佐剂；所述冻干保护剂包括
脱脂牛奶、明胶、海藻糖、牛血清
白蛋白、聚乙烯吡咯烷
酮、山梨醇、谷氨酸钠、Vc、蔗糖、甘氨酸和/或精氨酸；
[0078] 所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
[0079] 优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
[0080] 优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
[0081] 优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
[0082] 优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
[0083] 优选地，所述佐剂为GEL A佐剂；
[0084] 所述佐剂的浓度范围是从5％到50％V/V，优选5％V/V。
[0085] 本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)分别制备所述犬细小病毒抗原、所述其他抗原；以及步骤(2)按比例将所述制备的犬细小病毒抗原、其他抗原放置，添加兽医学上可接受的载体。
[0086] 本发明还涉及所述试剂盒在制备预防和/或治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0087] 下面结合具体
实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行
修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0088] 本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
[0089] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的
生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0090] 实施例1犬细小病毒的分离、鉴定及含量测定
[0091] 1.1犬细小病毒的分离及鉴定
[0092] 从临床上犬细小病毒感染的动物中分离CPV野毒株，感染动物的临床症状为：厌食，精神沉郁，体温升高，呕吐，排稀便、粘便甚至番茄酱样血便，发病后期呈脱水症状等，将其作为入选动物的标准。
[0093] 用无血清RPMI-1640培养液将病犬的肠内容物稀释为10％V/V悬液，用0.22μm滤
膜过滤除菌，并将滤液按10％V/V比例接种F81
单层细胞(购自上海酶联检测技术有限公司)进行病毒分离，24～48小时出现
拉丝的细胞病变，约96小时细胞病变达到80％以上，冻融收毒作为第1代病毒液；用同步接毒法将第1代所获得的病毒液接种F81细胞，接种24小时后出现拉丝的细胞病变，接种72～96小时后细胞病变达到80％以上，冻融收毒作为第2代病毒液；用同步接毒法将第2代所获得的病毒液接种F81细胞，接种24小时后出现拉丝的细胞病变，接种72～96小时后细胞病变达到80％以上，冻融收毒作为第3代病毒液。将第3代病毒液通过电镜观察来进行形态学检测，结果表明：可见具有典型的细小病毒特征的病毒粒子。
[0094] 采用间接免疫
荧光法(参见康洪涛.貉细小病毒分离鉴定及免疫原性研究.中国农业科学院硕士学位论文,2012)对S0425株第3代病毒液进行病毒特异性鉴定，结果显示：F81细胞接种病毒形成拉丝的细胞病变部位出现特异性绿色荧光，表明特异性良好。
[0095] 以CPV P21:5’-AGAGACAATCTTGCACCAAT-3’、CPV P22:5’-ATGTTAATATAATTTTCTAGGTGCT-3’为引物，按照Zhang R等(Zhang R,Yang S,Zhang W,et al.Phylogenetic analysis of the VP2 gene of canine parvoviruses circulating in China.Virus genes,2010,40(3):397-402)的方法扩增CPV的VP2基因，扩增目的
片段连接T载体后转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，并与GenBank中CPV VP2基因序列进行比对，结果表明：S0425株属于CPV-2b型，与Pfizer疫苗株(EU914139)VP2基因序列的同源性为90％。
[0096] 以上结果进一步证实分离株为犬细小病毒野毒株，命名为CPV S0425株，提交保藏。
[0097] 1.2犬细小病毒毒株含量的测定
[0098] 将CPV S0425株在F81细胞上扩增，将扩增后的CPV S0425株按照Reed-Muench方法(参见殷震.动物病毒学.北京:科学出版社,1997)进行病毒含量测定，结果表明：该毒株的7.0
含量为10 TCID50/ml。
[0099] 实施例2疫苗组合物的制备
[0100] 2.1CPV灭活全病毒抗原的制备
[0101] 将实施例1的CPV S0425株经终浓度为0.025％V/V BPL(β-丙内酯)进行灭活，并按照《中国兽药典》(中国兽药委员会，2010年版三部，中国农业出版社，2010)方法对CPV进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，结果表明：CPV S0425株灭活后，未受到细菌、霉菌的污染，也未受到支原体和外源病毒的感染，纯净性良好。
[0102] 2.2疫苗组合物的制备
[0103] 用生理盐水溶液将实施例2.1制备的CPV S0425株抗原、现有技术中的其他抗原以及PET GEL A佐剂(购自法国SEPPIC公司，终浓度为5％)按照表1所示组分及含量进行配制。其中，灭活的CPV S0425株抗原、活的抗原组成疫苗组合物(包括疫苗1、2、3)时，将灭活的CPV S0425株抗原、PET GelA佐剂用PBS溶液按表1中所示终浓度进行混合配制得
混合液，并对各混合液分别进行性状检验(久置后上层为无色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液)、无菌检验(按现行《中国兽药典》进行检验，均无菌生长)；并对活抗原进行性状检验(为乳白色海绵状树洞团
块，易于瓶壁脱离)、无菌检验(按现行《中国兽药典》进行检验，均无菌生长)。免疫使用时，使用含灭活的CPV S0425株抗原、佐剂的混合液稀释活的抗原，使活的抗原的终浓度如表1所示。
[0104] 表1含犬细小病毒抗原的疫苗组合物所含组分及含量
[0105]编号 S0425(TCID50/头份) CDV(TCID50/头份) CAVⅡ(TCID50/头份)
疫苗1 107 105 0
疫苗2 107 106 0
疫苗3 107 106 105
[0106] 注：疫苗1、2、3中的CDV抗原为弱毒的Onderstepoort株(参见Maia O B,Gouveia A M G.Serologic response of maned wolves(Chrysocyon brachyurus)to canine distemper virus and canine parvovirus vaccination[J].Journal of Zoo and Wildlife Medicine,2001,32(1):78-80.)；疫苗3中的CAVⅡ抗原为弱毒的YCA18株(参见夏咸柱，范泉水，扈荣良等.Ⅱ型犬腺病毒自然弱毒YCA18株的实验免疫研究.中国兽药杂志,2001,35(2):1-4)。
[0107] 实施例3疫苗组合物的应用
[0108] 3.1疫苗组合物的安全性试验
[0109] 选取CDV抗原、抗体阴性，CPV抗原阴性、抗体HI≤1∶4及CAV抗原、抗体阴性的2～3月龄健康比格犬15只，随机分为3组，5只/组，分别免疫实施例2制备的疫苗1-3，每只比格犬均注射10个使用剂量的疫苗，观察14日。结果：免疫接种比格犬精神、饮食均正常；体温无明显变化，均在正常38.5℃-39.5℃范围内；接种部位没有出现肿胀、
坏死，无全身不良反应。表明：疫苗1-3的安全性试验均合格。
[0110] 3.2疫苗组合物之犬细小病毒抗原的动物试验
[0111] 选取CPV抗原阴性、抗体HI≤1∶4的2～3月龄健康比格犬25只，随机分为5组，5只/组，第1、2、3组分别免疫疫苗1-3，1头份/只。第4组免疫购自辉瑞公司的犬细小病毒病活疫7.0
苗(卫佳-5，作为现有疫苗1，其含有犬细小病毒NL-35-D致弱株至少10 TCID50/头份)，1头份/只。另设第5组作为空白对照，不免疫，隔离饲养。分别于免疫前以及免疫后14天、21天
采血，检测HI抗体效价(HI抗体效价的检测根据：殷震,刘景华.动物病毒学.第2版.北京：科学出版社,1997:204-437)。免疫后21天，对所有犬分别通过口服途径攻击犬细小病毒CPV-
825/98株(现在流行的野毒株)(参见Siedek EM,Schmidt H,Sture GH et al.Vaccination with canine parvovirus type 2(CPV-2)protects against challenge with virulent CPV-2b and CPV-2c.Berl Munch Tierarztl Wochenschr.2011,124(1-2):58-64)病毒液
1ml(病毒含量为103.5TCID50)，观察14日。结果见表2。
[0112] 表2疫苗组合物之犬细小病毒抗原的动物试验结果
[0113]
[0114] 注：#表示现有疫苗组中有1只犬食欲减退、体温升高、排稀便，其余4只中有2只体温略有升高、2只食欲轻微减退，*表示对照组各犬均出现食欲减退、精神沉郁、呕吐、腹泻、粘便、血便等犬细小病毒病的典型症状。
[0115] 由表2可知：(1)免疫后的抗体效价，疫苗2、3免疫犬后所产生的CPV HI抗体效价相当，高于疫苗1免疫后产生的抗体效价，并且与现有弱毒活疫苗免疫后的CPV HI抗体效价相当甚至略高，表明犬细小病毒灭活抗原与犬瘟热病毒、犬腺病毒弱毒抗原混合使用时，不影响CPV的HI抗体效价；(2)攻毒保护，疫苗1-3免疫后用CPV流行的强毒株攻毒均未出现犬细小病毒病的典型症状，且保护率均为100％，而现有疫苗1免疫后的攻毒效果较差。
[0116] 3.3疫苗组合物之犬细小病毒抗原的免疫持续期实验
[0117] 采用28日龄左右的健康易感犬(血球凝集抑制(HI)抗体≤1∶4)20只，随机分成4组，5只/组，其中第1-3组分别经皮下接种1ml/只疫苗1、2、3，第4组经皮下接种1ml/只现有疫苗1。相同条件下饲养，首免后7天、14天、21天，采血测抗体滴度，第21天时再加强免疫一次，首免后每隔3个月进行采血，采用血凝抑制试验(参照中国专利CN103387996A)检测抗体效价；连续观察检测24个月，结果见表3。
[0118] 表3疫苗组合物之犬细小病毒抗原的免疫持续期检测结果
[0119]
[0120]
[0121] 由表3可知：灭活疫苗1、2、3分别二次免疫犬后在长达18个月内抗CPV抗体均值都维持在较高的水平，均≥1:256，在其有效抗体
维持期间均能对注射犬完全保护(HI>1∶128)；并且在首次免疫后第7天即开始产生特异性抗体，第14天即产生较高滴度的特异性抗体。表明灭活疫苗1、2、3能够使机体在免疫后短时间内产生较高滴度的特异性抗体，并且能够在长达18个月甚至更长时间内预防犬细小病毒病的疫情。
[0122] 3.4疫苗组合物之犬瘟热病毒抗原的动物试验
[0123] 选取CDV抗原、抗体阴性的2～3月健康龄比格犬25只，随机分为5组，5只/组，分别免疫疫苗1-3，1头份/只。第4组为现有技术对照组，免疫购自英特威公司的犬瘟热、犬细小病毒二联活疫苗(作为现有疫苗2，其含有犬瘟热病毒Onderstepoort株至少105.0TCID50，犬细小病毒154株至少107.0TCID50/头份)，1头份/只。另设第5组作为空白对照组，不免疫，隔离饲养。分别于免疫前以及免疫后14天、21天采血以检测犬瘟热病毒的中和抗体即CDV SN抗体(参见殷震,刘景华.动物病毒学.第2版.北京：科学出版社,1997:204-437)。免疫21天后，对所有犬分别通过滴鼻和
腹腔注射途径攻击犬瘟热病毒CDV 93039株病毒液(参考遇秀玲,田克恭.犬实验感染CDV的病理学研究.中国畜禽传染病,1998,20(2):76-78)，观察14日，结果见表4。
[0124] 表4犬瘟热病毒抗原动物试验结果
[0125]
[0126] 注：#表示现有疫苗组中有1只体温升高、食欲减退、拉稀便并且死亡，*表示对照组各犬均出现体温升高、精神萎靡、食欲减退、稀便等犬瘟热病毒病的典型症状。
[0127] 由表4可知：(1)免疫后的抗体效价，疫苗2、3免疫犬后所产生的CDV SN抗体效价相当，高于疫苗1免疫后产生的抗体效价，也高于现有疫苗2免疫后的抗体效价，表明犬瘟热病毒减毒抗原所产生的免疫效果优于犬瘟热病毒现有疫苗2的免疫效果；且本发明疫苗1中使用的犬瘟热病毒抗原与现有疫苗2的抗原相同，含量相当时即本发明疫苗1产生的CDV SN抗体效价较现有疫苗2的抗体效价更高，说明本发明的疫苗组合物中发生了协同作用；(2)攻毒保护，疫苗1-3免疫后用CDV流行的强毒株攻毒均未出现犬瘟热病毒病的症状，且保护率均为100％；而现有疫苗免疫后用CDV流行的强毒株攻毒后有3只出现犬瘟热病毒病的症状，保护率为80％，低于疫苗1-3的保护率。
[0128] 3.5疫苗组合物之犬腺病毒抗原的动物试验
[0129] 选取CAV抗原阴性、抗体≤1:2的2～3月龄的健康龄比格犬15只，随机分为3组，5只/组，第1组免疫疫苗3，1头份/只。第2组作为现有技术对照组，免疫购自美国辉瑞公司的卫佳-5(作为现有疫苗3)。另设第3组作为空白对照组，不免疫，隔离饲养。分别于免疫前和免疫后14天、21天采血，检测CAV中和抗体(即CAV SN抗体检测根据：殷震,刘景华.动物病毒学第2版.北京：科学出版社,1997:204-437)。二免后21天，对所有犬分别鼻腔途径攻击犬腺病毒CAV-Ⅰ型A8301株(参见夏咸柱，范泉水，扈荣良等.Ⅱ型犬腺病毒自然弱毒YCA18株的实5.5
验免疫研究.中国兽药杂志,2001,35(2):1-4)病毒液1ml(病毒含量为10 TCID50)，观察14日，结果见表5。
[0130] 表5疫苗组合物之犬腺病毒抗原的动物试验结果
[0131]
[0132] 注：*对照犬均出现体温升高、食欲减少、渴饮增加、沉郁、血便、“兰眼”、咳嗽等犬腺病毒感染的典型症状。
[0133] 由表5可知：(1)疫苗3免疫犬后所产生的CAV SN抗体效价略高于现有疫苗的，表明犬腺病毒Ⅱ型抗原与犬瘟热病毒、犬细小病毒抗原混合使用时，不影响犬腺病毒Ⅱ型的抗体水平，且发明疫苗组合物产生的CAV SN抗体效价较现有疫苗3更早达到较高的水平；(2)攻毒保护，疫苗3免疫后用犬腺病毒流行的强毒株攻毒均未出现犬腺病毒病的症状，且保护率均为100％，与现有疫苗免疫后的攻毒效果相当。
[0134] 综上所述：本发明制备的含犬细小病毒抗原的疫苗组合物免疫后不仅没有出现食欲减退、精神沉郁、呕吐、腹泻、粘便、血便等犬细小病毒病的典型的临床症状，而且免疫效果优于现有商品化疫苗，特别地，对疫苗组合物中所含其他抗原没有免疫干扰作用。
[0135] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
