技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物医学技术领域，具体涉及一种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 札幌病毒(Sapovirus，SaY)属于杯状病毒科(Caliciviridae)、札幌样病毒属(Sappora-like virus)，是一种单股正链RNA病毒。能够引起人和动物的急性病毒性胃肠炎及腹泻，通常以粪-口途径传播。
[0003] 猪SaY分布广泛，包括欧洲、亚洲及美洲都检测到了该病毒，可以感染各年龄阶段的猪，1月龄左右断奶仔猪最易感，成年猪感染后很少出现临床症状，对养猪业造成了一定的威胁和损失。最新研究显示，对于不同基因型的人源和动物源的SaY在遗传上和
抗原特性上有相似之处，且已发现人源和猪源的SaY重组毒株[X]，说明SaY可能存在跨种传播能
力，对人类公共卫生构成潜在的威胁。因此对札幌病毒进行流行病学监测就显得尤为重要。
[0004] 目前，国内外对于猪源札幌病毒的检测方法还不成熟，还没有检测猪SaY抗体的商品化试剂盒，而是主要集中在病毒形态及病毒RNA的检测等方法上。电镜诊断用于病毒粒子结构观察，可直接检测标本，但机器价格昂贵，技术要求高，不适用于大量的病毒诊断；RT-PCR技术用于检测病毒RNA，灵敏度较高，但技术要求高，设备及操作环境要求也较高；ELISA技术广泛应用于检测病毒的抗原抗体，特异性强、重复性好，可用于大范围的流行病学监测。
发明内容
[0005] 针对
现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，操作步骤简便，试剂成本较低，检测灵敏度较高，尤其适合于猪血清标本的快速批量检测，为猪SaV流行病学调查奠定
基础。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒，包括含有SaV包被抗原的酶标板和SaV标记抗原-HRP(辣根过
氧化物酶)标记物，其中，所述SaV包被抗原为SaV swCH430株P蛋白
片段，SaV标记抗原为SaV swCH430株S蛋白片段。
[0008] 一种制备上述猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
[0009] S1制备SaV包被抗原以及制备SaV标记抗原，所述SaV包被抗原为SaV swCH430株P蛋白片段，SaV标记抗原为SaV swCH430株S蛋白片段；
[0010] S2通过SaV标记抗原和HRP的偶联，制备得到SaV标记抗原-HRP标记物；
[0011] S3采用
碳酸盐缓冲液以一定比例将SaV包被抗原稀释，100μL/孔加入到酶标板，封装于加有干燥剂的
铝膜袋中，包被完毕。
[0012] 需要说明的是，所述步骤S1具体方法如下：
[0013] 1.1)PCR扩增猪源swCH430株SaV ORF2基因部分的两个片段：SaV swCH430株S片段和SaV swCH430株P片段；
[0014] SaV swCH430株S片段设计引物为：
[0015] FS 5′-GGAATTCCATATGGAGGCGCCTGCCC-3′ 5140-5156；
[0016] RS 5′-CCGCTCGAGGTTTGGAGGCTTGAGCAGGGTGA-3′ 5775-5798；
[0017] FS为S片段上游引物，带有Nde I酶切位点，RS为片段下游引物，带有Xho I酶切位点；
[0018] SaV swCH430株P片段设计引物为：
[0019] FP 5′-CGGGATCCATGCAAACCATGGAAGCAGGGCTTGACCCT-3′ 5799-5826；
[0020] RP 5′-CGGAATTCTCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3′ 6755-6774；
[0021] FP为P片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RP为P片段下游引物，带有EcoR I酶切位点；
[0022] 1.2)PCR扩增S片段和P片段后回收，采用相应的内切酶分别进行双酶切，获得的酶切片段分别连接到pMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用相应的内切酶分别酶切鉴定并进行测序，将测序正确的阳性克隆质粒分别命名为T-S和T-P；
[0023] 1.3)将pET30a(+)与步骤1.2)中鉴定得到的测序正确的阳性克隆质粒T-S和T-P分别以相应的内切酶消化，进行琼脂糖
电泳，胶回收目的片段后分别进行连接，将连接产物分别转化大肠杆菌JM109，挑取转化子，小提质粒，用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定，构建得到可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名为pET-S和pET-P；
[0024] 1.4)阳性重组质粒pET-S和pET-P分别转化BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于卡那霉素LB培养液中培养10h；再各自取过夜培养液100μL，以1∶100的比例接种于10mL卡那霉素抗性的LB中进行菌体活化，37℃振荡培养至OD600＝0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG分别诱导表达6h；然后将培养物4℃6000rmp离心15分钟收集菌体，菌体采用20mL 1％Triton-X-100的PBS悬浮，
超声波破碎，4℃12000rmp离心30分钟，收集沉淀得到表达的重组蛋白；
[0025] 1.5)对步骤1.4)得到的重组蛋白分别进行纯化，得到目的蛋白；
[0026] 1.6)目的蛋白进行SDS-PAGE，当条带与预期大小相一致，则分别命名为P蛋白和S蛋白，P蛋白即为SaV包被抗原，S蛋白即SaV标记抗原。
[0027] 进一步需要说明的是，步骤1.6)具体为：
[0028] 1.6.1)取50mL步骤1.4)中经诱导表达6h得到的表达产物，分别在4℃下12000g离心2min收集菌体沉淀，加入5mL 1mmol/L、PH7.4的PBS充分悬浮，在4℃下以6000rpm/min的速度离心15min，保留沉淀，如此反复离心3次；
[0029] 1.6.2)分别用5mL PBS重悬菌体进行超声破碎，破碎条件为功率40％，超声3s，间歇3s；破碎10min；然后将裂解液12000g离心30min，收集包涵体沉淀，然后用结合缓冲液溶解沉淀，其中所述结合缓冲液包含8mol/L尿素、1mmol/L EDTA和20mmol/L Tris；
[0030] 1.6.3)先用结合缓冲液平衡Ni SepharoseTM 6 Fast Flow重力柱，再将步骤1.6.2)溶解得到的包涵体溶液过三遍平衡的Ni2+重力柱；
[0031] 1.6.4)分别用10倍柱体积的PH8.0的
磷酸盐缓冲液和PH7.8的磷酸盐缓冲液先后经过重力柱；
[0032] 1.6.5)用洗脱液洗脱Ni2+重力柱上的蛋白，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果，其中，所述洗脱液通过250mmol咪唑溶解于1L PH8.0的磷酸盐缓冲液获得。
[0033] 进一步需要说明的是，步骤1.6)中，采用GE公司Ni SepharoseTM 6 Fast Flow蛋白纯化柱纯化。
[0034] 需要说明的是，步骤S2中，SaV标记抗原和HRP的偶联具体采用NaIO4氧化法，包括步骤如下：
[0035] 2.1)将步骤S1中所得的SaV标记抗原于PBS溶液中4℃
透析过夜；
[0036] 2.2)紫外分光光度计测定SaV标记抗原浓度；
[0037] 2.3)采用分析天平秤取10mg HRP溶于2mL超纯
水中制备终浓度为5mg/mL的HRP溶液，分析天平秤取NaIO4，溶于超纯水中制备终浓度为20mg/mL的NaIO4溶液备用；
[0038] 2.4)缓慢滴加225μL NaIO4溶液于2mL HRP溶液中，室温下避光静置20分钟；
[0039] 2.5)加入20μL乙二醇于HRP混合溶液中，之后室温下静置30分钟，得到活化好的HRP溶液；
[0040] 2.6)取1mL 2.1mg/mL的SaV标记抗原缓慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中，得到SaV标记抗原-HRP结合物；
[0041] 2.7)将SaV标记抗原-HRP结合物于50mmol/L CB pH9.6的溶液中4℃避光透析2.5个小时；
[0042] 2.8)分析天平称量NaBH4溶于水中，制备终浓度为4mg/mL的NaBH4溶液；
[0043] 2.9)向步骤2.7)的透析袋中加入162μL的NaBH4溶液，室温下在摇床上轻轻震动2个小时；
[0044] 2.10)在PBS溶液中4℃透析过夜；
[0045] 2.11)透析结束后1∶1比例加入甘油，-20度保存，即为SaV标记抗原-HRP标记物。
[0046] 需要说明的是，步骤S3的具体步骤如下：
[0047] 采用50mmol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液将SaV包被抗原稀释至6μg/mL，然后1∶2000倍稀释加入SaV包被抗原，100μL/孔加入到酶标板，4℃包被过夜；次日采用PBST洗涤液洗板三次，所述PBST洗涤液包括10mmol/L PB、150mmol/LNaCl和0.05％Tween-20，pH7.4；最后一次拍干，150μL/孔加入含30％新生
牛血清，8％
蔗糖，5％牛血清
白蛋白，150mmol/L NaCl的PH7.4，10mmol/L PB封闭液，4℃封闭12小时，次日甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25℃、湿度20％-25％、有通
风设备的干燥房间内风干过夜；封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
[0048] 本发明的有益效果在于：基于双夹心ELISA原理，操作步骤简便，试剂成本较低，检测灵敏度较高，尤其适合于猪血清标本的快速批量检测，为猪SaV流行病学调查奠定基础。
附图说明
[0050] 图2为S、P基因PCR扩增示意图；
[0051] 图3和图4分别为pET30a-S双酶切产物和pET30a-P双酶切产物；
[0052] 图5为重组蛋白纯化SDS-PAGE分析示意图。
具体实施方式
[0053] 以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本
实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
[0054] 一种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒，包括含有SaV包被抗原的酶标板和SaV标记抗原-HRP(辣根过氧化物酶)标记物，其中，所述SaV包被抗原为SaV swCH430株P蛋白片段，SaV标记抗原为SaV swCH430株S蛋白片段。
[0055] 如图1所示，一种制备上述猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
[0056] S1制备SaV包被抗原以及制备SaV标记抗原；
[0057] 1.1)首先PCR扩增猪源swCH430株SaV ORF2(兰州兽医研究所传染病室保存)基因部分的两个片段，上下游引物设计如图2所示，分别带有酶切位点，其中其中M表示DL5000marker，1表示S基因扩增片段，2表示P基因扩增片段。
[0058] SaV swCH430株S片段设计引物为：
[0059] FS 5′-GGAATTCCATATGGAGGCGCCTGCCC-3′ 5140-5156；
[0060] RS 5′-CCGCTCGAGGTTTGGAGGCTTGAGCAGGGTGA-3′ 5775-5798；
[0061] FS为S片段上游引物，带有Nde I酶切位点，RS为片段下游引物，带有Xho I酶切位点；
[0062] SaV swCH430株P片段设计引物为：
[0063] FP 5′-CGGGATCCATGCAAACCATGGAAGCAGGGCTTGACCCT-3′ 5799-5826；
[0064] RP 5′-CGGAATTCTCGTGAGCTGTGAAGGGAC-3′ 6755-6774；
[0065] FP为P片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RP为P片段下游引物，带有EcoR I酶切位点；
[0066] 1.2)PCR片段扩增后回收，采用相应的内切酶进行双酶切，获得的酶切片段连接到pMD18-T载体(大连宝生物，货号D103A)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用相应的内切酶酶切鉴定并测序，将鉴定正确的阳性克隆分别命名为T-S和T-P；
[0067] 1.3)将pET30a(+)(兰州兽医研究所传染病室保存)与步骤S2中鉴定得到的合适的克隆质粒分别以相应的内切酶消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名pET-S(如图3所示，其中M表示5000DNA分子
质量标准，1表示pET-S)和pET-P(如图4所示，其中M表示5000DNA分子质量标准，2表示pET-P)；将连接产物转化大肠杆菌JM109，挑取转化子，小提质粒，用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定。
[0068] 1.4)阳性重组质粒pET-S和pET-P转化BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于卡那霉素LB培养液中培养10h；菌液以1∶100的比例加入到1L含100μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基37℃振荡培养至OD600＝0.8左右，加入的终浓度为0.5mmol/L的IPTG；
[0069] 1.5)挑取单菌落培养过夜，再取过夜培养液100μL以1∶100的比例接种于10mL卡那霉素抗性的LB中进行菌体活化，37℃培养OD600至0.6-0.8之间，加入0.8mmol/L的IPTG分别诱导表达6h；4℃6000rmp离心15分钟收集菌体，菌体采用20mL 1％Triton-X-100的PBS悬浮，
超声波破碎，4℃12000rmp离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式；结果发现重组蛋白主要以包涵体的形式存在。
[0070] 1.6)蛋白纯化；
[0071] 步骤1.6)中，采用GE公司Ni SepharoseTM 6 Fast Flow蛋白纯化柱纯化。包括如下步骤：
[0072] 1.6.1)取50mL加入IPTG浓度为0.8mmol诱导6h的菌液，4℃12000×g离心2min收集菌体沉淀，加入5mL 1mmol/L PH7.4的PBS充分悬浮，4℃6000rpm/min15min离心，保留沉淀，如此反复离心3次；
[0073] 1.6.2)用5mL PBS重悬菌体进行超声破碎(功率40％，超声3s，间歇3s；破碎10min)，然后将裂解液12000×g离心30min，收集包涵体沉淀，然后用用结合缓冲液(8mol/L尿素、1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris)溶解沉淀；
[0074] 1.6.3)先用结合缓冲液(8mol/L尿素、1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris)平衡Ni 2+
SepharoseTM 6 Fast Flow重力柱，再将溶解的包涵体溶液过三遍平衡的Ni 重力柱；
[0075] 1.6.4)分别用10倍柱体积PH8.0的磷酸盐缓冲液和PH7.8的磷酸盐缓冲液先后经过重力柱；
[0076] 1.6.5)用洗脱液(250mmol咪唑溶解于1L PH8.0的磷酸盐缓冲液)洗脱Ni2+重力柱上的蛋白。同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果。
[0077] 1.7)目的蛋白进行SDS-PAGE，条带与预期大小相一致，分别命名为P蛋白和S蛋白，P蛋白即为SaV包被抗原，S蛋白即SaV标记抗原。如图5所示，M表示
蛋白质标准分子量；1表示纯化的P蛋白；2表示纯化的S蛋白。
[0078] S2 SaV标记抗原-HRP标记物的制备；
[0079] 需要说明的是，步骤S2中，SaV标记抗原和HRP的偶联采用NaIO4氧化法，具体包括步骤如下：
[0080] 2.1)首先将步骤S1得到的纯化SaV标记抗原于PBS溶液中4℃透析过夜；
[0081] 2.2)紫外分光光度计测定SaV标记抗原浓度；
[0082] 2.3)分析天平秤取HRP 10mg溶于2mL超纯水中制备终浓度为5mg/mL的HRP溶液，分析天平秤取NaIO4，溶于超纯水中制备终浓度为20mg/mL的NaIO4溶液备用；
[0083] 2.4)缓慢滴加225μL NaIO4溶液于2mL HRP溶液中，室温下避光静置20分钟；
[0084] 2.5)加入20μL乙二醇于HRP混合溶液中，之后室温下静置30分钟，得到活化好的HRP溶液；
[0085] 2.6)取1mL 2.1mg/mL的SaV标记抗原缓慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中，得到S蛋白-HRP结合物；
[0086] 2.7)将S蛋白-HRP结合物于50mmol/L CB pH9.6的溶液中4℃避光透析2.5个小时；
[0087] 2.8)分析天平称量NaBH4溶于水中，制备终浓度为4mg/mL的NaBH4溶液；
[0088] 2.9)向步骤2.7)的透析袋中加入162μL的NaBH4溶液，室温下在摇床上轻轻震动2个小时；
[0089] 2.10)标记物在PBS溶液中4℃透析过夜；
[0090] 2.12)透析结束后1∶1比例加入甘油，-20度保存。
[0091] S3采用碳酸盐缓冲液以一定比例将P抗原稀释，100μL/孔加入到酶标板，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
[0092] 以下通过实验进一步描述本发明的试剂盒的性能：
[0093] 酶标板中每孔加入100μL样品稀释液(PH7.4PB，150mmol/L NaCl，5％牛血清白蛋白，0.5％鱼明胶，2％Tween-20，0.1％Ttiton X-100，0.1％硫柳汞)，加入50μL待测样品、阴性参照样品(健康猪阴性血清)、阳性参照样品(HEV抗体猪阳性血清)对照，37℃温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，最后一次拍干。100μL/孔加入含有20％新生牛血清，以一定比例稀释的HRP-S溶液，37℃温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。
[0094] 每孔加入含0.5％过氧化氢尿素(生工，货号UB1753)、4.76％三水合乙酸钠、0.9％
冰醋酸的
显色剂A及含0.32％TMB(生工，货号TB0514)、5mmol/L
柠檬酸、0.5mmol/LEDTA-2Na、5％甲醇、2％二甲基甲酰胺的显色剂B各50μL，37℃避光显色15分钟。每孔加50μL，含2M
硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm
波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值。
[0095] 临界值(Cutoff Value(COV))计算：COV＝阴性对照平均OD值X1.5(阴性对照OD值低于0.065按0.075计算，高于0.065按实际OD值计算)，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值＜COV为阴性。
[0096] 检测结果
[0097] 选用经过RIBA 2.0(Ortho-Clinical Diagnostics)验证的200份猪HEV阳性血清和3000份猪阴性血清，采用本发明的猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒检测300份猪血清，其灵敏度为97.3％，特异性为97.5％，准确率为98％。
[0098] 对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种想要的改变和
变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明
权利要求的保护范围之内。
