一种疫苗组合物及其制备方法和应用
阅读：358发布：2023-03-12
专利汇可以提供一种疫苗组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 疫苗 组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪 肺 炎支原体 抗原 、免疫量的猪流感病毒抗原以及免疫量的猪蓝 耳 病毒抗原。该疫苗组合物各抗原不仅不产生抗原成分的相互干扰或影响，反而有相互增强免疫效果的作用，一次免疫即可达到单一抗原二次免疫的免疫效果和 抗体 持续 水 平，同时具备安全性好、制备方法简单、免疫方便快捷、降低免疫成本等优点。，下面是一种疫苗组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的猪流感病毒抗原以及免疫量的猪蓝耳病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支原体全病原抗原、活的形式的猪肺炎支原体抗原、猪肺炎支原体亚单位抗原、猪肺炎支原体重组活载体抗原和猪肺炎支原体DNA载体的抗原；
所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒全病毒抗原、活的形式的猪流感病毒抗原、猪流感病毒亚单位抗原、猪流感病毒重组活载体抗原和猪流感病毒DNA载体的抗原；以及
所述猪蓝耳病毒抗原为灭活形式的猪蓝耳病毒全病毒抗原、活的形式的猪蓝耳病毒抗原、猪蓝耳病毒亚单位抗原、猪蓝耳病毒重组活载体抗原和猪蓝耳病毒DNA载体的抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支原体HN0613株全病原抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株全病毒抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的猪蓝耳病毒CH-1R株全病毒抗原。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包括佐剂，所述佐剂为水佐剂；所述疫苗组合物活疫苗部分还包括冻干保护剂。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为
8.0 10.0 5.0 7.0
10 ～10 MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为10 ～10 EID50/头份；所
5.0 6.0
述猪蓝耳病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份；优选地，所述猪肺炎支原体抗原灭活前
9.0 6.0
含量为10 MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为10 EID50/头份；所述猪蓝耳
6.0
病毒抗原含量为10 TCID50/头份。
6.一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）繁殖培养猪肺炎支原体，灭活；
（2）繁殖培养猪流感病毒，灭活；
（3）繁殖培养猪蓝耳病毒；
（4）将所述灭活猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原混合，并与所述猪蓝耳活病毒抗原分开保藏。
7.根据权利要求1～5任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪呼吸道疾病综合征的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述猪免疫时为3～4周龄。
9.一种免疫试剂盒，所述免疫试剂盒包括含所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原的抗原组合物以及所述猪蓝耳病毒抗原，其中，含所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原的抗原组合物与所述猪蓝耳病毒抗原分开保藏。
10.根据权利要求9所述的免疫试剂盒，其中，所述猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原为灭活形式的全病原抗原，所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的全病毒抗原。
一种疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物，以及该疫苗组合物的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。猪繁殖与呼吸综合征病毒又称猪蓝耳病毒，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型。目前，该病是严重影响世界养猪业发展的重要疾病之一。疫苗接种是预防该病最有效的方法。
[0003] 猪流感（Swine influenza，SI）是当前危害养猪业的一种重要的呼吸系统疾病，主要表现为高热、咳嗽和呼吸困难等特征，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的群发性疫病之一。猪流感主要由A型猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引发，据国内外的文献报道，猪体内的A型流感病毒血清亚型有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2，国内的猪流感病毒血清亚型主要以H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2为主，而其中又以H1N1和H3N2亚型为主。由于猪流感病毒对呼吸道上皮有高度特异的亲嗜性，易使呼吸道上皮管壁受损，导致胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒的继发感染或混合感染，增加疫情的复杂性，给养猪业造成极大的经济损失。
[0004] 猪支原体性肺炎（Mycoplasma pneumonia of swine，MPS）是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎，也是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一。长期以来，本病一直被认为是对养猪业造成重大经济损失、最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。猪肺炎支原体是条件性致病菌，发生本病后，可使机体抵抗力降低，极易继发感染猪蓝耳病毒、猪流感病毒等，使病情加重和病死率升高。
[0005] 自20世纪90年代中期以来，由猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪流感病毒等主要原发性病原体引起的PRDC给世界各国养猪业造成了严重的损失。临床PRDC中，上述三种病原即猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪流感病毒常常以混合感染形式出现。而目前针对这三种病原的感染尚无法实现一种疫苗免疫抵抗这三种病原引起的混合感染。
[0006] 对于多病原混合感染所致疾病的免疫，采用单苗免疫时需要多次注射，由于抗菌药物的使用常常会引起耐药性及药物残留问题，单苗多次注射不仅会引发应激和安全问题，并且在混合感染的情况下，免疫预防效果质量下降。因此，本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗猪肺炎支原体、猪蓝耳病毒及猪流感病毒感染的联合疫苗，减少所述感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现。
[0007] 与单一疫苗相比，联合疫苗不仅方便、多效、低成本，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
发明内容
[0009] 优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支原体全病原抗原、活的形式的猪肺炎支原体抗原、猪肺炎支原体亚单位抗原、猪肺炎支原体重组活载体抗原和猪肺炎支原体DNA载体的抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒全病毒抗原、活的形式的猪流感病毒抗原、猪流感病毒亚单位抗原、猪流感病毒重组活载体抗原和猪流感病毒DNA载体的抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为灭活形式的猪蓝耳病毒全病毒抗原、活的形式的猪蓝耳病毒抗原、猪蓝耳病毒亚单位抗原、猪蓝耳病毒重组活载体抗原和猪蓝耳病毒DNA载体的抗原。
[0010] 本发明所用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”可互换使用，是指包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫原性物质的药物组合物。
[0011] 本发明中术语“猪肺炎支原体抗原”是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是猪肺炎支原体全病原，优选灭活形式的猪肺炎支原体全病原、改良的猪肺炎支原体活病原或减毒形式的猪肺炎支原体病原；含有至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何其它含至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分。
[0012] 猪肺炎支原体抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种或几种抗原：如勃林格殷格翰动物保健（美国）有限公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗、西班牙海博莱生物大药厂的喜可舒的J株猪支原体肺炎灭活疫苗、美国先灵葆雅公司的猪支原体肺炎灭活疫苗（Myco Silencer ）、美国普泰克公司的MycoGard疫苗、美国辉瑞公司的RespiFend的MH P-5722-3株疫苗、梅里亚动物保健公司的猪克喘的BQ14株疫苗、南京天邦生产的猪肺炎支原体的168株疫苗以及普莱柯生物工程股份有限公司分离的猪肺炎支原体HN0613株制备的疫苗。
[0013] 本发明中术语“猪流感病毒抗原”是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪流感病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪流感病毒抗原是猪流感全病毒抗原，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，优选为灭活形式的猪流感全病毒、改良的猪流感活病毒或减毒形式的猪流感病毒；含有至少猪流感病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何至少含有猪流感病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分。
[0014] 本发明中术语“猪蓝耳病毒抗原”是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪蓝耳病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪蓝耳病毒抗原是猪蓝耳全病毒抗原，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，优选为灭活形式的猪蓝耳全病毒，改良的猪蓝耳活病毒或减毒形式的猪蓝耳病毒；含有至少猪蓝耳病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何其它含至少猪蓝耳病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分。
[0015] 更优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支原体J株或HN0613株全病原抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株或猪流感病毒（H3N2亚型）WX株中的一株或两株的全病毒抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的猪蓝耳病毒R98株、ATCCVR-2332株或CH-1R株中的一株或几株的全病毒抗原。
[0016] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）J株，保藏于美国菌种保藏中心ATCC 25934。
[0017] 猪肺炎支原体HN0613（Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613），已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：中国 武汉 武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCC NO:M2012230。
[0018] 猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株（Swine influenza virus（H1N1 subtype）strain ZJS）和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株（Swine influenza virus（H3N2subtype）strain WX），均在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：中国 武汉 武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年08月13日，保藏号分别为CCTCC NO:V201233和CCTCC NO:V201234。
[0019] 猪蓝耳病毒R98株，公开于猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORFs3～7基因特性研究（中国兽医学报，2008年1月，第28卷，第1期）
[0020] 猪蓝耳病毒ATCCVR-2332株，保藏于美国菌种保藏中心，保藏号为ATCCVR-2332。
[0022] 进一步优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支原体HN0613株全病原抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株全病毒抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的猪蓝耳病毒CH-1R株全病毒抗原。
[0023] 优选地，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包括兽药学上可接受的佐剂，所述佐剂为水佐剂；所述疫苗组合物活疫苗部分还包括冻干保护剂。
[0024] 更优选地，所述佐剂为GEL 01佐剂。
[0026] 优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为107.0～10.0 4.0 7.0
2×10 MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为10 ～10 EID50/头份；所述猪
4.0 6.0
蓝耳病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份。
2×10 MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为10 ～10 EID50/头份；所述猪
4.0 6.0
蓝耳病毒抗原含量为10 ～10 TCID50/头份。
[0027] 更优选地，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为108.0～1010.0MHDCE/头份；所述猪5.0 7.0 5.0
流感病毒抗原灭活前含量为10 ～10 EID50/头份；所述猪蓝耳病毒抗原含量为10 ～
6.0
10 TCID50/头份。
流感病毒抗原灭活前含量为10 ～10 EID50/头份；所述猪蓝耳病毒抗原含量为10 ～
6.0
10 TCID50/头份。
[0028] 最优选地，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为109.0MHDCE/头份；所述猪流感病6.0 6.0
毒抗原灭活前含量为10 EID50/头份；所述猪蓝耳病毒抗原含量为10 TCID50/头份。
毒抗原灭活前含量为10 EID50/头份；所述猪蓝耳病毒抗原含量为10 TCID50/头份。
[0030] 本发明的另一目的在于提供了一种本发明所述疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0031] （1）繁殖培养猪肺炎支原体，灭活；
[0032] （2）繁殖培养猪流感病毒，灭活；
[0033] （3）繁殖培养猪蓝耳病毒；
[0034] （4）将所述灭活猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原按比例混合，并与所述猪蓝耳活病毒抗原分开保藏。
[0035] 具体方法如下：分别繁殖培养猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒获得菌液；将猪肺炎支原体菌液和猪流感病毒液分别灭活，然后将灭活检验合格的猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原分别进行浓缩处理；将所述猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原与疫苗佐剂混合制得抗猪肺炎支原体、猪流感病毒的二联疫苗组合物（即灭活疫苗部分）；将猪蓝耳病毒抗原与冻干保护剂混合制备抗猪蓝耳病毒的疫苗组合物（即活疫苗部分）。使用时可将抗猪肺炎支原体、猪流感病毒的二联疫苗组合物稀释抗猪蓝耳病毒的疫苗组合物，得到抗猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒的三联疫苗组合物，也可将抗猪肺炎支原体、猪流感病毒的疫苗组合物与抗猪蓝耳病毒的疫苗组合物分别单独使用。
[0036] 优选地，将所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原与Gel 01佐剂混合制得含量为12%（V/V）的灭活疫苗部分；将猪蓝耳病毒抗原与冻干保护剂以1:1（V/V）的比例混合制得活疫苗部分；然后用所述灭活疫苗部分按比例稀释所述活疫苗部分，优选比例为1:1（头份/头份），制成猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗。
[0037] 本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
[0038] 本发明的又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪呼吸道疾病综合征的药物中的应用，其中，所述应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的猪流感病毒抗原和免疫量的猪蓝耳病毒抗原免疫猪，所述猪免疫时为3～4周龄。
[0039] 本发明的另一目的在于提供一种免疫试剂盒，所述免疫试剂盒包括含所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原的抗原组合物以及所述猪蓝耳病毒抗原，其中，含所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原的抗原组合物与所述猪蓝耳病毒抗原分开保藏。
[0040] 优选地，上述免疫试剂盒中所述猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原为灭活形式的全病原抗原，所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的全病毒抗原。
[0041] 技术效果
[0042] 首先，本发明的猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗，在一定抗原含量范围内不仅不会产生抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且三种抗原混合后在产生保护性免疫应答的同时，还意外发现猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒的抗原有相互增强免疫效果的作用。如本发明后续实施例所证明的，三联疫苗免疫一次即可达到各单苗二次免疫的抗体持续水平，该现象出乎本领域普通技术人员预料。
[0043] 其次，本发明的猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗与猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病的单疫苗相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此本发明的三联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。
[0044] 此外，本发明解决了现有技术的困难，首次将猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒抗原按照合适的比例联合使用，改变了之前人们认为猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病这三种疾病难以同时进行预防进而获得三联疫苗的认识偏见。
[0045] 最后，本发明的猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗含有三种抗原、可以同时预防三种疾病，该联合疫苗具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等特点；同时，与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫，而且降低免疫成本，节约免疫程序；另外，由于疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用本发明所述的联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
具体实施方式
[0046] 下面结合具体实施例进一步描述本发明。这些实施例仅是举例说明，不应被视为对本发明总体范围的任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本发明的保护范围内。
[0047] 本发明实施例中用猪肺炎支原体HN0613株、猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株、猪蓝耳病毒CH-1R株为例说明本发明。
[0048] 本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0时，记为0分，1%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，大于75%为4分。
[0050] 本实施例中的疫苗组合物、三联疫苗均指预防或治疗猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒感染的疫苗组合物，即至少包含猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原和猪蓝耳病毒抗原的疫苗组合物。
[0051] 实施例1猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原和猪蓝耳病毒抗原的制备[0052] 1、猪肺炎支原体抗原制备
[0053] 1.1菌株来源：
[0054] 制造及检验本品用的猪肺炎支原体菌株为HN0613株，在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：中国 武汉 武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏编号：CCTCC NO:M2012230。
[0056] 一级种子的繁殖：冻干菌种（HN0613株，保藏编号为CCTCC No.M2012230），用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d，作为一级种子。
[0057] 二级种子的繁殖：取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。
[0058] 液体培养基的配方（按1065m1计）：牛心浸出液300ml，ddH2O360ml，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份:Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，
0.25%酚红10ml猪血清200ml，5%水解乳蛋白100m1，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1%醋酸铊溶液25m1。
0.25%酚红10ml猪血清200ml，5%水解乳蛋白100m1，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1%醋酸铊溶液25m1。
[0059] 固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar即可。
[0060] 1.3制苗用菌液的制备：
[0061] 将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液以1:10（v/v）接种于液体培养基中。37℃下培养3～6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养（继代次不超过6代）。培养结束后，取样，进行纯粹检验，应纯粹。
[0062] 1.4猪肺炎支原体菌体含量测定：
[0063] 用PCR方法对培养物进行计数。10倍系列稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检-3出的最低限量为3×10 μg（相当于1000个左右的菌体），按稀释的倍数计数菌体数（沈青春，谭青松，王琴，等.PCR方法测定Mhp培养物菌数[J]，中国预防兽医学报，2006，28（1）：
9
55～57）。培养物含量应为1～2×10MHDCE/ml。（MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体）。
9
55～57）。培养物含量应为1～2×10MHDCE/ml。（MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体）。
[0064] 1.5猪肺炎支原体菌液的灭活与浓缩：
[0065] 将检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%的甲醛溶液（V/V），放37℃灭活，其间每隔4小时搅拌一次，24小时后取出，进行灭活检验。将灭活检验合格的猪肺炎支原体菌液采用超滤浓缩技术进行浓缩，浓缩后抗原含量为
11
10 MHDCE/ml。
11
10 MHDCE/ml。
[0066] 2、猪蓝耳病毒抗原制备
[0067] 菌株来源：猪蓝耳病毒CH-1R株，以保藏号CGMCC No.1883保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0068] 将Marc145或MA104细胞系经EDTA-胰酶消化液分散传代，以细胞生长液继续培养，形成致密单层时，备用，用于继续传代或接种病毒。将猪蓝耳病毒CH-1R株病毒液，按M.O.I.=0.001～0.01的剂量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，进一步优选接毒剂量为M.O.I.=0.001～0.005，吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70%～80%细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融1～2次后置-20℃以下保存，取少量做
8.0
半成品检验，抗原液病毒含量10 TCID50/ml，按照国家标准检验均符合规定。
8.0
半成品检验，抗原液病毒含量10 TCID50/ml，按照国家标准检验均符合规定。
[0069] 3、猪流感病毒抗原制备
[0070] 3.1菌株来源：
[0071] 猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株和（H3N2亚型）WX株，均在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：中国 武汉 武汉大学）进行保藏，保藏编号分别为CCTCC NO:V201233和CCTCC NO:V201234。
[0072] 3.2猪流感病毒液的制备：
[0073] 将猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株（以下简称“SIV H1N1”）和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株（“SIV H3N2”）毒种分别按病毒感染复数（multiplicity of infection,M.O.I.）为0.001的接种量分别接种于长满单层的MDCK（ATCC CCL-34TM）细胞上，37℃吸附30分钟，加入含有3%体积比的犊牛血清的D-MEM液体培养基（用购自美国Life Technologies公司的D-MEM干粉培养基按照其说明书配制），置37℃继续培养，每日观察2次，细胞生长良好，
72h收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒，并使用PBS将SIV H1N1病毒液稀释至病毒滴度
8.0 8.0
为10 EID50/ml，同样，使用PBS将SIV H3N2病毒液稀释至病毒滴度为10 EID50/ml。
72h收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒，并使用PBS将SIV H1N1病毒液稀释至病毒滴度
8.0 8.0
为10 EID50/ml，同样，使用PBS将SIV H3N2病毒液稀释至病毒滴度为10 EID50/ml。
[0074] 3.3猪流感病毒液的处理、灭活：
[0075] 将SIV H1N1和SIV H3N2病毒液用中空纤维（0.5μm～2μm）滤柱（购自GE Healthcare Life Sciences）过滤，除去细胞碎片，再加入0.2%～0.3%的甲醛溶液37℃灭活18h。
[0076] 实施例2 猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗的制备
[0077] 1、猪支原体肺炎、猪流感灭活疫苗部分的制备
[0078] 1.1稀释剂的配制
[0080] 1.2疫苗佐剂处理
[0081] Gel 01佐剂灭菌：将Gel 01佐剂转入可灭菌容器内，121℃高压灭菌30min备用。
[0082] 1.3配苗
[0083] 通过无菌操作，将实施例1中制备的浓缩猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原与佐剂、防腐剂、稀释剂等按照不同配比混合后，用乳化机低速搅拌30min。灭活疫苗部分7.0 10.0 4.0
猪肺炎支原体抗原含量为10 ～2×10 MHDCE/头份，猪流感病毒抗原含量为10 ～
7.0
10 EID50/头份，其中猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原在所述灭活疫苗部分的含量为
12%（V/V）。
猪肺炎支原体抗原含量为10 ～2×10 MHDCE/头份，猪流感病毒抗原含量为10 ～
7.0
10 EID50/头份，其中猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原在所述灭活疫苗部分的含量为
12%（V/V）。
[0084] 2、猪蓝耳病活疫苗部分的制备
[0085] 将检验合格的猪蓝耳病各收次病毒液，混合于同一容器，与冻干保护剂（2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制）以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定4 6
量分装，迅速进行冷冻真空干燥，成品含量为10 ～10TCID50/头份。
量分装，迅速进行冷冻真空干燥，成品含量为10 ～10TCID50/头份。
[0086] 3、三联疫苗的制备
[0087] 将实施例1中所制备的各抗原按照表1中各组疫苗的配比进行疫苗配制。使用前取灭活疫苗部分稀释活疫苗部分。
[0088] 表1各组疫苗配比
[0089]
[0090] 实施例3 不同抗原含量猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗效力试验[0091] 1试验材料
[0092] 实施例2中制备的疫苗1（猪肺炎支原体107MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）4 4
和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗2（猪肺炎
8 5
支原体10MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头
5 9
份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗3（猪肺炎支原体10MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1
6 6
亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗4（猪
10 7
肺炎支原体10 MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/
6 10
头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）和疫苗5（猪肺炎支原体2×10 MHDCE/头份、猪流感病
7 6
毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）。
和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗2（猪肺炎
8 5
支原体10MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头
5 9
份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗3（猪肺炎支原体10MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1
6 6
亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗4（猪
10 7
肺炎支原体10 MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/
6 10
头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）和疫苗5（猪肺炎支原体2×10 MHDCE/头份、猪流感病
7 6
毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）。
[0093] 3～4周龄、无猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒抗体的断奶仔猪。
[0094] 2试验方法
[0095] 2.1安全试验
[0096] 选3～4周龄、无猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒抗体的断奶仔猪30只，随机分为6组，其中5组分别颈部肌肉注射两头份（4ml）疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5，剩余做为对照，观察两周，疫苗接种猪应无明显体温变化，精神食欲正常，无其他可见临床反应出现。2.2效力试验
[0097] 选3～4周龄、无猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒抗体的断奶仔猪120只，随机分为24组，第1、2、3、4组免疫1头份疫苗1，第5、6、7、8组免疫1头份疫苗2，第9、10、11、12组免疫1头份疫苗3，第13、14、15、16组免疫1头份疫苗4，第17、18、19、20组免疫1头份疫苗5。第21、22、23、24组为对照攻毒组。免疫后35天，第1、5、9、13、17、21组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心）进行气管注
9
射，5ml/头（2×10MHDCE/ml），30天后剖检统计肺病变，判定保护情况；第2、6、10、14、18、
6.0
22组注射猪流感病毒（H1N1亚型）（ZJS株，10 EID50/0.1mL），第3、7、11、15、19、23组注射
6.0
猪流感病毒（H3N2亚型）（WX株，10 EID50/0.1mL），每毒株通过滴鼻和气管内注射攻毒各
1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据试验猪的肺部损伤评分来评价疫苗对接种猪的保护效果；第4、8、12、16、20、24组用猪蓝耳病毒HuN4-F5强毒
4.0
（3×10 TCID50，公开于中国专利CN101280292A）攻击。连续观察21天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况。
9
射，5ml/头（2×10MHDCE/ml），30天后剖检统计肺病变，判定保护情况；第2、6、10、14、18、
6.0
22组注射猪流感病毒（H1N1亚型）（ZJS株，10 EID50/0.1mL），第3、7、11、15、19、23组注射
6.0
猪流感病毒（H3N2亚型）（WX株，10 EID50/0.1mL），每毒株通过滴鼻和气管内注射攻毒各
1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据试验猪的肺部损伤评分来评价疫苗对接种猪的保护效果；第4、8、12、16、20、24组用猪蓝耳病毒HuN4-F5强毒
4.0
（3×10 TCID50，公开于中国专利CN101280292A）攻击。连续观察21天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况。
[0098] 3试验结果
[0099] 3.1安全试验结果
[0100] 对仔猪双倍剂量注射疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4和疫苗5，注射后观察体温、食欲、精神状态，有无可见临床反应和死亡情况，疫苗注射局部有无肿胀等炎症反应，连续观察2周，三周后剖杀，进行病理变化观察，观察结果见表2。
[0101] 表2三联疫苗安全试验观察结果
[0102]
[0103] 安全试验结果显示：注射疫苗4和疫苗5的免疫组有个别猪体温持续2天达到40.5℃，其中注射疫苗5的免疫组有1只猪注射部位出现肿胀，可能是由于疫苗4和疫苗5中抗原含量较其他疫苗高，抗原含量高导致应激反应更加明显。
[0104] 3.2效力试验结果
[0105] 不同抗原含量的三联疫苗的效力试验结果见表3。
[0106] 表3不同抗原含量的三联疫苗的效力试验结果
[0107]
[0108]
[0109] 效力试验结果显示：对猪肺炎支原体的保护率疫苗1为60%，疫苗2为80%，疫苗3、疫苗4和疫苗5均为100%；对猪流感病毒的保护率疫苗1为40～60%，疫苗2为80%，疫苗3为100%，而疫苗4为80～100%，疫苗5为80%；对猪蓝耳病毒的保护率疫苗1为60%，疫苗
2为80%，疫苗3为100%，疫苗4为80%，而疫苗5只有60%。结果表明，猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗在一定抗原范围内，均能对相应病毒产生较好的保护作用，且抗原含量越高，产生的保护作用越强；但是当猪肺炎支原体抗原的含量达到1010MHDCE/头份时，发现对猪蓝耳病毒的保护率下降到80%，当其抗原含量达到2×1010MHDCE/头份时，对猪蓝耳病毒的保护率只有60%，并且对猪流感病毒的保护率也下降至80%。说明当猪肺炎支原体抗原的含量过高时，对猪流感病毒和猪蓝耳病毒的免疫保护有一定影响。
2为80%，疫苗3为100%，疫苗4为80%，而疫苗5只有60%。结果表明，猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗在一定抗原范围内，均能对相应病毒产生较好的保护作用，且抗原含量越高，产生的保护作用越强；但是当猪肺炎支原体抗原的含量达到1010MHDCE/头份时，发现对猪蓝耳病毒的保护率下降到80%，当其抗原含量达到2×1010MHDCE/头份时，对猪蓝耳病毒的保护率只有60%，并且对猪流感病毒的保护率也下降至80%。说明当猪肺炎支原体抗原的含量过高时，对猪流感病毒和猪蓝耳病毒的免疫保护有一定影响。
[0110] 实施例4猪支原体肺炎、猪流感与猪蓝耳病三联疫苗一次免疫与各单苗二次免疫的免疫效果比较试验
[0111] 1、试验材料
[0112] 实施例2中制备的疫苗3（猪肺炎支原体109MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）6 6
和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗6（猪肺
9
炎支原体10MHDCE/头份）、疫苗7（猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各
6 6
10EID50/头份）、疫苗8（猪蓝耳病毒10TCID50/头份）。
和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗6（猪肺
9
炎支原体10MHDCE/头份）、疫苗7（猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各
6 6
10EID50/头份）、疫苗8（猪蓝耳病毒10TCID50/头份）。
[0113] 3～4周龄、无猪肺炎支原体、猪流感病毒与猪蓝耳病毒抗体的断奶仔猪。
[0114] 2、试验方法
[0115] 选取3～4周龄断奶仔猪60头，分为12组，每组5头，第1、2、3、4组免疫1头份疫苗3，第5组免疫1头份疫苗6，第6、7组免疫1头份疫苗7，第8组免疫1头份疫苗8，第9～12组为攻毒对照组；间隔14d后，第5、6、7、8组加强免疫1次。首免后35天，第9
1、5、9组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株）进行气管注射，5ml/头（2×10MHDCE/ml），
30天后剖检统计肺病变，判定保护情况；第2、6、10组用猪流感病毒（H1N1亚型）（ZJS株，
6.0
10 EID50/0.1mL）通过滴鼻和气管内注射攻毒各1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25
6.0
日称重后扑杀，剖检；第3、7、11组用猪流感病毒（H3N2亚型）（WX株，10 EID50/0.1mL）通过滴鼻和气管内注射攻毒各1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖
4.0
检；第4、8、12组用猪蓝耳病毒HuN4-F5强毒（3×10 TCID50）攻击。连续观察21天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况。免疫效果比较试验中疫苗免疫及攻毒分组情况见表4。
1、5、9组用猪肺炎支原体强毒株（CVCC354株）进行气管注射，5ml/头（2×10MHDCE/ml），
30天后剖检统计肺病变，判定保护情况；第2、6、10组用猪流感病毒（H1N1亚型）（ZJS株，
6.0
10 EID50/0.1mL）通过滴鼻和气管内注射攻毒各1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25
6.0
日称重后扑杀，剖检；第3、7、11组用猪流感病毒（H3N2亚型）（WX株，10 EID50/0.1mL）通过滴鼻和气管内注射攻毒各1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖
4.0
检；第4、8、12组用猪蓝耳病毒HuN4-F5强毒（3×10 TCID50）攻击。连续观察21天，进行剖检，记录发病数（包括死亡数），判定保护情况。免疫效果比较试验中疫苗免疫及攻毒分组情况见表4。
[0116] 表4疫苗免疫及攻毒分组情况
[0117]
[0118]
[0119] 3、试验结果
[0120] 3.1免疫效果比较试验结果
[0121] 免疫效果比较试验结果见表5、表6和表7。
[0122] 表5猪肺炎支原体攻毒保护结果
[0123]
[0124] 注：组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）[0125] 表6猪流感病毒攻毒保护结果
[0126]
[0127]
[0128] 注：攻毒菌株相同的组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同[0129] 者表示差异显著（P＜0.05）
[0130] 表7猪蓝耳病毒攻毒保护结果
[0131]
[0132] 注：发病判断标准仔猪体温升高（≥40.5℃），至少持续3～4日，食欲减退，出现明显的呼吸道症状；病理变化，剖检仔猪肺部组织呈现红褐色花斑状，不塌陷；淋巴结中度到重度肿大，个别猪的脾脏头部明显肿大，切面红髓增生；显微病理变化肺泡隔不均匀增宽，可见肿大、毛细血管内皮增生，并有巨噬细胞和淋巴细胞侵润；用IFA方法检测肺脏，脾脏和淋巴结，应检测到大量的PRRSV抗原。
[0133] 免疫效果比较试验结果显示：猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗一次免疫对猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒的保护与各单苗的二次免疫的保护水平相当。说明猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病的三联疫苗能很好得抵抗猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒的感染。
[0134] 实施例5 猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗与单苗免疫持续期比较试验[0135] 1、试验材料9
[0136] 实施例2中制备的疫苗3（猪肺炎支原体10MHDCE/头份、猪流感病毒（H1N1亚型）6 6
和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗6（猪肺
9
炎支原体10MHDCE/头份）、疫苗7（猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各
6 6
10EID50/头份）、疫苗8（猪蓝耳病毒10TCID50/头份）。
和猪流感病毒（H3N2亚型）各10EID50/头份、猪蓝耳病毒10TCID50/头份）、疫苗6（猪肺
9
炎支原体10MHDCE/头份）、疫苗7（猪流感病毒（H1N1亚型）和猪流感病毒（H3N2亚型）各
6 6
10EID50/头份）、疫苗8（猪蓝耳病毒10TCID50/头份）。
[0137] 3～4周龄、无猪肺炎支原体、猪流感病毒与猪蓝耳病毒抗体的断奶仔猪。
[0138] 2、试验方法
[0139] 选取3～4周龄断奶仔猪25头，随机分为5组，第1组免疫1头份疫苗3，第2组免疫1头份疫苗6，第3组免疫1头份疫苗7，第4组免疫1头份疫苗8，第5组为空白对照组，疫苗免疫及抗体测定分组情况见表8。各组分别于3周龄、5周龄、3月龄、6月龄采血，分离血清。分别采用竞争性ELISA检测抗猪肺炎支原体的血清抗体，采用间接ELISA检测猪流感病毒抗体水平，采用免疫荧光法检测猪蓝耳病毒抗体水平。
[0140] 表8疫苗免疫及抗体测定分组情况
[0141]
[0142] 3、试验结果
[0143] 分别对各组3周龄、5周龄、3月龄、6月龄的猪的血清进行抗体测定，猪肺炎支原体抗体在不同免疫时期抗体水平测定结果见表9，猪流感病毒抗体在不同免疫时期抗体水平测定结果见表10，猪蓝耳病毒抗体在不同免疫时期抗体水平测定结果见表11。
[0144] 表9免疫不同时期猪肺炎支原体抗体水平测定结果
[0145]
[0146]
[0147] 表10免疫不同时期猪流感病毒抗体水平测定结果
[0148]
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