本发明主要涉及骨和软骨的生物学领域，并涉及提供促进组织 (例如：骨和/或软骨)形成的方法、药用组合物/药物和装置以及制造 包含这类组合物的诸如修复术性的装置。

骨

脊椎动物的骨作为一种对肌体提供机械性支持的组织，通过骨 的形成和再吸收(目前广泛认为分别通过成骨细胞和破骨细胞的活性 介导)经历持续性的再建。骨再建包含着细胞和细胞外基质间(ECM) 间复杂和高度组织性的相互作用。然而，这种再建过程根据对生长 或日常性活动的需要而调整。在一个正常健康成人的骨骼中，在称 为骨再建的过程中，骨形成的速率与骨再吸收的速率大致相同。尽 管骨的再吸收或形成不是整个骨骼同时发生的一个综合特征，但是 却出现在可被静态骨区域包围的不同位置中。当出现过度再吸收时， 或者在骨骼的特定区域或者在骨骼的更广泛的区域，可出现多种临 床问题。

例如：骨质疏松症是一种以骨组织的数量和结构排列出现异常 为特征的疾病。骨质疏松症是一种主要临床症状，其可导致只有极 小外伤的骨折。骨质疏松症是由于骨的再吸收和形成之间的平衡向 再吸收偏离而使纯骨量减少所引起。除患者的痛苦外，据估计直接 用于骨质疏松症的医院费用仅在美国就将近130亿美元，在英国就 将近7.5亿英镑。术语“骨质疏松症”实际上指的是与骨组织丢失并 伴随着出现在松质骨空间中的结构异常相关的一组症状。当绝经期 后妇女出现该症状时，其被称为绝经后骨质疏松症。骨折通常发生 在臀、脊骨和桡骨末梢处，在许多国家被认为是主要的公众健康问 题(Lindsay R(1993)，Clinical Rheumatology Osteoporisis；V.7，No.3)。 虽然遗传、饮食和生活方式似乎是该病发病的要素，但至少对于绝 经后骨质疏松症，卵巢功能的丧失是一个重要的决定性因素。

骨质疏松症中骨形成水平低下的一个原因是活性成骨细胞数量 的减少。因此，可将能够增加这些细胞数量的药物用在以低骨质为 特征的症状中。

与骨质疏松相关的其它病症包括类固醇诱发的骨质疏松症，先 天性幼年骨质疏松症和移植术后骨质疏松症，其中骨再吸收是疾病 的一种继发病症。

在称为变形性骨炎的疾病中，存在骨的破骨细胞过度再吸收， 从而引起过多的成骨细胞的骨形成，导致骨结构的紊乱。

长期卧床休息或各种原因的残疾与骨疾没有必然的直接联系， 但在再运动或恢复活动能力上会导致骨丢失和骨折的危险。

在癌症中，原发和继发肿瘤的形成常引起再吸收和/或形成，从 而增大骨折或功能损坏的倾向。

肿瘤诱导的骨质疏松症也会导致病态性血清钙水平的上升，目 前认为这一点能明显增加癌症患者的病态。

目前已采用多种方法来治疗低骨质症，这些方法以使用可减少 或抑制骨丢失的抗再吸收药物(例如二膦酸盐)为基础，但由于骨形成 继发性增加出现缓慢，这些方法无一能十分满足要求。

使用二膦酸盐抑制骨再吸收仍不理想，原因是由于某些患者认 为该类药物副作用程度过高，不可接受，很大比例的人群不能完全 忍受使用该类药物。

雌激素和其它激素替代品单独或联合其它治疗剂用于绝经期后 骨质疏松症已有一段历史。但是，由于子宫内膜癌和乳癌风险的增 加以及持续性经血，这在占骨质疏松症大多数受害者的老年妇女人 群中通常是不受欢迎的，因此需要提供另一种治疗方法。

目前已采用使用影响破骨细胞功能的药物(如降钙素或甲状旁腺 激素)的其它疗法治疗骨质疏松症，但鲜有成功。

除对骨再生率具有影响的疾病和症状外，物理性碰撞和意外也 会导致骨折。

仅在美国，估计每年的骨折率约为6百万例。

目前骨修复最好的方法为机械方法，该方法一般包含硬植入物 和金属元件，例如钢板、针和螺钉。硬植入物的种类中包括塑料、 有机合成粘合剂和金属修补物。在使用机械性金属元件和植入时， 有两个主要的需要考虑和关心的事项。首先涉及的是金属进入机体 系统的生理学综合效力，其次是被植入的非生物性材料的长期耐用 性问题。尽管存在这些问题，机械植入仍很受欢迎，虽然植入物不 包含活骨组织，但对帮助骨的重建有重大贡献。

当骨完全折断时，除简单固定(上石膏)外，折断的重要部分需要 医治。这种情况下主要的问题是两骨末端不够接近。这样导致不适 于修复且修复过程延长，从而妨碍痊愈。机体修复骨折至能适度承 载的平均时间为25-100天，完全恢复则需一年。因而，单纯性骨折 和医学上的复杂型骨折都受益于能加速和/或完成恢复过程的新的治 疗手段。对于那些骨疾(指的是如骨质疏松症或骨质减少)同样如此， 导致骨变薄，其原发症状为常见的衰老性骨折。

一直以来在进行某些研究，采用外源性生长因子(例如骨形态发 生蛋白(BMP))帮助骨的再生。采用该方法将极大量的生长因子(例如 BMP)给予到损伤的骨的部位。然而这种方法有其缺点，即高浓度的 生长因子能引起生物学平衡的偏移，从而可能使该生长因子的效用 降低。

使用生长因子(例如BMP)的另一个问题是90％的外源性生长因 子在用后头二十四小时可被排出，这表明大多数的生长因子未达到 其靶细胞。

在先前有关BMP和BMP结合蛋白(例如Follistatin)的研究中， 认为Follistatin通过BMP结合而抑制BMP作用(Follistatin，Ketan Patel，The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 30(1998) 1087-1093；Direct binding of Follistatin to a complex of bone- morphogenic protein and its receptor inhibits ventral and epidermal cell fates in early xenopus embryo，Shar-Lchiro lemura etal， Proc.Natl.Acs.Sci.USA.Vol.95 pp 9337-9342 August 1998 Developmental Biology.)。这种BMP结合蛋白(如Follistatin)与BMP 结合，产生失活的BMP，因而这一点是可信的。因此，认为BMP 结合蛋白(例如Follistatin)通过抑制BMP活性抑制骨形成。

然而我们惊讶地发现与这些已确立的定理相反的是，当通过直 接给予BMP结合蛋白(例如Follistatin)治疗缺陷性特征的疾病时，可 促进细胞的分化和/或增殖。

我们发现BMP结合蛋白(例如Follistatin)增大基质干细胞、成肌 细胞和未分化的基质干细胞至成骨细胞的分化。

软骨

软骨的自身恢复能力有限。

物理碰撞会损伤机体的软骨。受损软骨易于进一步恶化，即骨 关节炎。

以关节软骨坏损为特征的骨关节炎症(OA)也会在无任何极小损 伤的情况下发生。该病影响至少有1600万的美国人，75岁以上老人 中80％患有该病。随着人口老龄化，其相关问题增加，并使健康服 务的负担变得越来越大。

软骨的主要组成是胶原蛋白。

胶原蛋白是自然界最丰富的动物蛋白质之一。它存在于所有类 型的多细胞动物(包括人类)中，现估计它约占整个人体蛋白质的 30％。胶原蛋白构成软的结缔组织的纤维组分(如皮肤，韧带和腱)， 并且是钙化组织(如骨、牙质)的有机基质的主要成分。除了它结构上 的意义外，胶原蛋白在生长和伤口愈合中起着重要的作用，并且还 与衰老和一些疾病过程有关。

有几种遗传性不同类型的胶原蛋白，被称为I型、II型、III型等 等。II型胶原蛋白是软骨的主要胶原蛋白。它由软骨细胞合成为原胶 原分子，该原胶原分子具有非胶原蛋白性氨基前肽和羧基肽突出端。 通过特定的肽酶除去这两种突出端，然后将II型胶原蛋白与原纤维结 合。

术语软骨指动物或人体的任何软骨，包括但不限于：关节软骨、 透明软骨、半月板软骨和黄弹性软骨。

因此，目前需要一种方法来增强软骨的生长、恢复和再生。

本发明另一方面的目标是提供一种新的组织再生的方法。

本发明再一方面的目标是提供一种帮助组织再生的组合物。

本发明一个目标是提供一种促进骨形成的组合物，其可作为目 前推荐疗法(如二膦酸盐、甲状旁腺素(PTH)及其衍生物)的替代方法， 用于治疗骨缺陷和骨异常。

本发明一个目标是提供一种结合骨形态发生蛋白(BMP)的支架结 构，用以控制BMP释放。

本发明另一个目标是提供一种控制释放所结合的BMP的方法。

本发明再一个目标是提供一种帮助组织再生的支架结构。

本发明一个目标是提供一种新的软骨再生方法。

本发明一个目标是提供一种帮助软骨再生的支架。

本发明一个目标是提供一种帮助内源性或外源性BMP到达其靶 细胞的支架。

本发明一个目标是提供一种供软骨形成的支架，它是目前的推 荐疗法(如镶嵌塑料、自体软骨细胞移植法和组织工程学方法)的一种 替代疗法。

本发明提供一种含有BMP结合蛋白的药物。

本发明还提供一种含有帮助组织再生的BMP结合蛋白的药物。

在本申请中，术语“药物”和“药用组合物”具有相同的含义。

术语BMP结合蛋白指能与BMP家族蛋白质结合的任何蛋白质。 所述BMP结合蛋白优选结合BMP以提高BMP的活性，例如：增 强组织的再生。术语BMP结合蛋白包括(但绝不限于)以下蛋白质： Follistatin、Follistatin相关的蛋白质(FSRP)、FLIK、α-2-HS糖蛋白、 胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Chordin、 Sog、Crim、Nell、结缔组织生长因子(CTGF)、Dan、Gremlin、Cerberus、 Endoglin、Twisted Gastulation基因、ZFSTA2及其以上提到的蛋白质 的衍生物、片段和/或类似物。

一组典型的BMP结合蛋白包括“Follistatin”组，其包括 Follistatin、Follistatin相关的蛋白质(FSRP)、ZFSTA2、FLIK以及以 上提到的BMP蛋白的衍生物、片段和/或类似物。

另一组典型的BMP结合蛋白包括“富含半胱氨酸”的BMP结 合蛋白，其包括胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、胶原蛋 白Vα2、Chordin、Sog、Crim、Nell、结缔组织生长因子(CTGF)及以 上提到的BMP蛋白的衍生物、片段和/或类似物。

另一组典型的BMP结合蛋白包括“Cerberus”BMP结合蛋白， 其包括Cerberus、Gremlin、Dan及以上提到的BMP蛋白的衍生物、 片段和类似物。

此外一组适合的BMP结合蛋白包括Follistatin、胶原蛋白IIa、 胶原蛋白IV、Chordin、Nell、Crim及以上提到的蛋白质的衍生物、 片段和类似物。

适宜的BMP结合蛋白包括Follistatin、FLIK、胶原蛋白IIa、胶 原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Endoglin、Dan、Gremlin、 Cerberus、Chordin、Sog、Crim、Nell或以上提到的蛋白质的衍生物、 片段和/或类似物。

所述BMP结合蛋白一般可以是Follistatin或胶原蛋白IIa或 Follistatin或胶原蛋白IIa的衍生物、片段和/或类似物。

所述BMP结合蛋白最适合是Follistatin。或者在本发明的某些 方面，BMP结合蛋白可以是胶原蛋白IIa。在本发明的其它方面，BMP 结合蛋白可以是Endoglin。

本发明提供一种包含选自以下的蛋白质的药用组合物： Follistatin、FSRP、FLIK、ZFSTA2、α-2-HS糖蛋白、胶原蛋白Iia、 胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Chordin、Sog、Crim、 Nell、结缔组织生长因子(CTGF)、Dan、Gremlin、Cerberus、Endoglin、 Noggin、Twisted Gastulation基因、ZFSTA2或以上提到的BMP蛋白 质的衍生物、片段和/或类似物。

本发明还提供一种包含选自以下的蛋白质的药用组合物： Follistatin、FSRP、FLIK、α-2-HS糖蛋白、胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、 胶原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Chordin、Sog、Crim、Nell、结缔组 织生长因子(CTGF)、Dan、Gremlin、Cerberus、Endoglin、Noggin、 Twisted Gastulation基因、ZFSTA2或以上提到的BMP蛋白质的衍生 物、片段和/或类似物。

本发明适宜的BMP结合蛋白质包括：Follistatin、FSRP、ZFSTA2、 FLIK、α-2-HS糖蛋白、胶原蛋白Iia、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、 胶原蛋白Vα2、Chordin、Sog、Crim、Nell、结缔组织生长因子(CTGF)、 Dan、Gremlin、Cerberus、Endoglin、Twisted Gastulation基因或以上 提到的BMP结合蛋白质的衍生物、片段和/或类似物。

本发明的BMP结合蛋白质一般包括：Follistatin、FLIK、α-2-HS 糖蛋白、Nell、Crim、Endoglin及以上提到的BMP结合蛋白质的衍 生物、片段和/或类似物。

例如本发明一组适宜的BMP结合蛋白质包括胶原蛋白型蛋白 质，即胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1和胶原蛋白Vα2 或以上提到的BMP结合蛋白质的衍生物、片段和/或类似物。

本发明另一组适宜的BMP结合蛋白例如为Endoglin、Dan、Sog、 Crim、Nell和Chordin或以上提到的BMP结合蛋白的衍生物、片段 和/或类似物。

本发明再一组适宜的BMP结合蛋白例如为Sog、Crim、Nell及 以上提到的BMP结合蛋白的衍生物、片段和/或类似物。

本发明再一组适宜的BMP结合蛋白为Cerberus、Chordin、FLIK 及其衍生物、片段和/或类似物。

所述BMP结合蛋白一般是Follistatin。

所述BMP结合蛋白一般是胶原蛋白IIa或其衍生物、片段和/或 类似物。

在本发明的某些方面，BMP结合蛋白是Crim或其衍生物、片 段或类似物。在本发明的其它方面，BMP结合蛋白是Dan或其衍生 物、片段和/或类似物。在本发明的特定实施方案中，BMP结合蛋白 是ZFSTA2或其衍生物、片段或类似物。在本发明的其它实施方案 中，BMP结合蛋白是Endoglin或其衍生物、片段或类似物。同样地， 本发明的BMP结合蛋白可以是Nell或其衍生物、片段或类似物。本 发明的其它实施方案可包含作为BMP结合蛋白的BMP结合蛋白Nell 或其衍生物、片段或类似物

术语BMP指BMP超家族的骨形成蛋白，它包括但不限于：

BMP-2、

BMP-3、

BMP-3B/GDF-10、

BMP-4、

BMP-5、

BMP-6、

BMP-7/OP-1、

BMP-8/OP-2、

BMP-8B、

BMP-9、

BMP-10、

BMP-11、

BMP-12、

BMP-13、

BMP-14、

CDMP-1、

CDMP-2、

CDMP-3、

GDF-1、

GDF-2、

GDF-3、

GDF-4、

GDF-5/CDMP-1/BMP-14、

GDF-6/CDMP-2/BMP-13、

GDF-7/CDMP-3/BMP-12、

GDF-8、

GDF-9。

在本发明的某些方面，BMP可以是例如已发现的天然存在于体 内的内源性BMP，或者可以是加入到治疗部位的天然BMP。在本发 明的其它方面，例如：BMP可以是或可以包括BMP重组体。

适合的BMP包括BMP-2、BMP-5、BMP-4、BMP-6和BMP-7。

一组典型的BMP包括BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8/OP-2 和BMP-8B。另一组典型的BMP包括BMP-2和BMP-4。另一组典 型的BMP还包括BMP3和BMP3B/GDF-10。此外，再一组典型的BMP 包括GDF-5/CDMP-1/BMP-14、GDF-6/CDMP-2/BMP-13、GDF- 7/CDMP-3/BMP-12。BMP一般可以是GDF-9。在本发明的其它实施 方案中，BMP也可以是GDF3。本发明的适当的BMP可以包括 BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7。

在本发明的具体实施方案中，BMP可以是在治疗部位发现的内 源性BMP的混合物。在本发明的其它方面，可将重组BMP加入到 治疗部位，或者加入构成本发明的装置中以确保BMP的存在。在本 发明的某些实施方案中，BMP可以包括BMP-2。或者在本发明的某 些实施方案中可包括BMP-4。另外，在本发明的其它实施方案中，BMP 可以是BMP-7。同样地，再其它实施方案中，BMP可以是BMP-6。

本发明的实施方案还提供一种包含BMP结合蛋白的药物。

本发明进一步提供一种包含选自下列BMP结合蛋白的药物： Follistatin、FSRP、FLIK、ZFSTA2、α-2-HS-糖蛋白、胶原蛋白IIa、 胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Chordin、Sog、Crim、 Nell、结缔组织生长因子(CTGF)、Dan、Gremlin、Cerberus、Endoglin、 Twisted Gastulation基因或本文上以上提到的BMP结合蛋白质的衍生 物、片段和/或类似物。

本发明再进一步提供一种包含选自下列BMP结合蛋白的药物： Follistatin、FSRP、ZFSTA2、FLIK、胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、胶 原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Endoglin、Dan、Gremlin、Cerberus、 Chordin、Sog、Crim、Nell或以上提到的BMP结合蛋白质的衍生物、 片段和/或类似物。

这类药物可用于治疗组织再生，例如骨和/或软骨组织的再生。

本发明提供一种包含选自以下的蛋白质的药用组合物：促卵胞 抑制素(一种氨基酸序列(1)描述的蛋白质)或其衍生物、片段和/或类 似物。

本发明还提供一种促进组织生成的药用组合物，其中该药用组 合物包含选自促卵胞抑制素(一种以下氨基酸序列(1)描述的蛋白质)或 其衍生物、片段和/或类似物的蛋白质。

所述氨基酸序列(I)是：

(I)

1  mvrarhqpgg lcllllllcq fmedrsaqa-g ncwlrqakng rcqvlyktel skeeccstgr

61 lstswteedv ndntlfkwmi fnggapncip cketcenvdc gpgkkcrmnk knkprcvcap

121 dcsnitwkgp vcgldgktyr necallkarc keqpelevqy qgrckktcrd vfcpgsstcv

181 vdqtnnaycv tcnricpepa sseqylcgnd gvtyssachl rkatcllgrs iglayegkci

241 kakscediqc tggkkclwdf kvgrgrcslc delcpdsksd epvcasdnat yasecamkea

301 acssgvllev khsgscneee eededqdysf pissilew

所述组织最好可是骨组织，因此本发明可以用于促进骨的生长。 所述组织也可以是中枢神经系统组织，因此本发明可以用于促进中 枢神经系统的生长和/或恢复，例如帮助中风病人的复原。

所述组织也可以是软骨细胞/软骨组织，因此本发明可以用于促 进软骨生长和/或修复。

本发明还提供一种药物，其含有选自促卵胞抑制素(一种氨基酸 序列(1)描述的蛋白质)或其片段和/或类似物的蛋白质。

本发明还提供一种用于治疗以骨缺陷为特征的疾病或临床症状 的药物，其包含选自促卵胞抑制素(一种氨基酸序列(1)描述的蛋白质) 或其片段的蛋白质。

本发明还提供BMP结合蛋白在制备一种药物中的用途，该药物 用于治疗可通过促进组织再生(例如软骨和/或骨组织再生)而缓解的疾 病或临床症状。

本发明进一步提供BMP结合蛋白在制备一种药物中的用途，该 药物用于治疗可通过促进组织再生(例如软骨和/或骨组织再生)而缓解 的疾病或临床症状，其中所述蛋白选自：Follistatin、FSRP、ZFSTA2、 FLIK、α-2-HS-糖蛋白、胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、 胶原蛋白Vα2、Chordin、Sog、Crim、Nell、结缔组织生长因子(CTGF)、 Dan、Gremlin、Cerberus、Endoglin、Twisted Gastulation基因或以上 提到的BMP结合蛋白质的衍生物、片段和/或类似物。

本发明再进一步提供BMP结合蛋白在制备一种药物中的用途， 该药物用于治疗可通过促进组织再生(例如软骨和/或骨组织再生)而缓 解的疾病或临床症状，其中所述蛋白选自：Follistatin、FSRP、ZFSTA2、 FLIK、α-2-HS-糖蛋白、胶原蛋白IIa、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、 胶原蛋白Vα2、Endoglin、Dan、Gremlin、Cerberus、Chordin、Sog、 Crim、Nell或以上提到的BMP结合蛋白质的衍生物、片段和/或类似 物。

因此，本发明提供一种能结合BMP的蛋白质在制备一种药物中 的用途，该药物用于治疗可通过促进骨的形成而缓解的疾病或临床 症状，其中所述蛋白质选自促卵胞抑制素(一种本文列出的氨基酸序 列(1)描述的蛋白质)或其片段和/或类似物。

因此，本发明提供一种能结合BMP的蛋白质在制备一种药物中 的用途，该药物用于治疗可通过促进组织生成(例如骨形成、软骨形 成或中枢神经系统的组织形成)而缓解的疾病或临床症状，其中所述 蛋白质选自促卵胞抑制素(一种以下列出的氨基酸序列(1)描述的蛋白 质)或其片段和/或类似物。

本发明另一方面提供一种治疗可通过促进骨形成而缓解的疾病 或临床症状的方法，该方法包括给予治疗有效量的能结合BMP的蛋 白质这一步骤，其中所述蛋白质选自促卵胞抑制素(一种本文列出的 氨基酸序列(1)描述的蛋白质)或其片段和/或类似物。

本发明再一方面提供一种预防可通过促进骨形成而缓解的疾病 或临床症状的方法，该方法包括给予治疗有效量的能结合BMP的蛋 白质这一步骤，其中所述蛋白质选自促卵胞抑制素(一种本文列出的 氨基酸序列(1)描述的蛋白质)或其片段和/或类似物。

本发明另一方面提供一种促进骨形成的方法，该方法包括给予 治疗有效量的能结合BMP的蛋白质这一步骤，其中所述蛋白质选自 促卵胞抑制素(一种下文所列的氨基酸序列(1)描述的蛋白质)或其片段 和/或类似物。

本发明另一方面提供一种预防或治疗可通过促进组织形成(例如 骨、软骨或中枢神经系统的组织)而缓解的疾病或临床症状的方法， 该方法包括给予治疗有效量的能结合BMP的蛋白质这一步骤，其中 所述蛋白质选自促卵胞抑制素(一种以下列出的氨基酸序列(1)描述的 蛋白质)或其片段和/或类似物。

本发明另一方面提供一种预防或治疗可通过促进组织形成(例如 骨、软骨或中枢神经系统的组织)而缓解的疾病或临床症状的方法， 该方法包括给予治疗有效量的BMP结合蛋白这一步骤。

在本发明其它方面提供诊断方法和诊断试剂盒。提供测定体内 样本(如血液、尿、骨活检组织、骨髓细胞活检样品)中本发明蛋白质 或其衍生物或分解物为基础的诊断方法和诊断试剂盒。

另外，本发明提供本发明蛋白质在应用用以鉴别个体基因型的 基因多态性、突变、缺失或其它变异的DNA为基础的筛选技术中的 用途，该用途用以鉴定骨疾(例如骨丢失)风险个体。

虽然设想本发明有助于骨折的恢复，但它也可用于治疗其它临 床症状或疾病。

受益于本发明的骨丢失性临床症状或疾病包括但不限于：骨质 疏松症(包括不用性骨质疏松症、Schuller氏病、绝经后骨质疏松症、 创伤后骨质疏松症、老年性骨质疏松症)，佩吉特氏病，癌症和肾病 中特征性的不良骨再吸收以及类风湿性关节炎。

设想在不需高浓度BMP结合生长因子下，本发明可以用于治疗 骨修复或诱发骨生长。目前使用高浓度BMP结合生长因子一直存在 一个问题，即高浓度生长因子(如上所提)可引起生物平衡的偏离，从 而可能导致该生长因子效能降低这一缺点。

本发明把能更好地使BMP到达其靶细胞。

使用生长因子(如BMP)的另一个问题是90％的外源性生长因子 可在用药后头二十四小时里排泄，这表明大多数的生长因子未达到 靶细胞。

适用于本发明的蛋白质包括促卵胞抑制素及其衍生物。具体地 讲，本发明的蛋白质包括以下列出的氨基酸序列(1)描述的氨基酸和/ 或其片段或类似物。

(I)

1 mvrarhqpgg lcllllllcq fmedrsaqa-g ncwlrqakng rcqvlyktel skeeccstgr

61 lstswteedv ndntlfkwmi fnggapncip cketcenvdc gpgkkcrmnk knkprcvcap

121 dcsnitwkgp vcgldgktyr necallkarc keqpelevqy qgrckktcrd vfcpgsstcv

181 vdqtnnaycv tcnricpepa sseqylcgnd gvtyssachl rkatcllgrs iglayegkci

241 kakscediqc tggkkclwdf kvgrgrcslc delcpdsksd epvcasdnat yasecamkea

301 acssgvllev khsgscneee eededqdysf pissilew

本发明还提供一种促进组织产生的药用组合物，其中该药用组 合物包含选自胶原蛋白IIa(一种以下所列的氨基酸序列(II)描述的蛋 白质)或其衍生物、片段和/或类似物。

适用于本发明的蛋白质包括胶原蛋白IIa及其衍生物。具体地 讲，本发明的蛋白质包括以下所列的氨基酸序列(II)描述的氨基酸和/ 或其片段或类似物。

所述氨基酸序列(II)是：

1  mirlgapqsl vlltllvaav lrcqgqdvqe agscvqdgqr yndkdvwkpe pcricvcdtg

61 tvlcddiice dvkdclspei pfgeccpicp tdlatasgqp gpkgqkgepg dikdivgpkg

121 ppgpqgpage qgprgdrgdk gekgapgprg rdgepgtpgn pgppgppgpp gppglggnfa

181 aqmaggfdek aggaqlgvmq gpmgpmgprg ppgpagapgp qgfqgnpgep gepgvsgpmg

241 prgppgppgk pgddgeagkp gkagergppg pqgargfpgt pglpgvkghr gypgldgakg

301 eagapgvkge sgspgengsp gpmgprglpg ergrtgpaga agargndgqp gpagppgpvg

361 paggpgfpga pgakgeagpt gargpegaqg prgepgtpgs pgpagasgnp gtdgipgakg

421 sagapgiaga pgfpgprgpp gpqgatgplg pkgqtgepgi agfkgeqgpk gepgpagpqg

481 apgpageegk rgargepggv gpigppgerg apgnrgfpgq dglagpkgap gergpsglag

541 pkgangdpgr pgepglpgar gltgrpgdag pqgkvgpsga pgedgrpgpp gpqgargqpg

601 vmgfpgpkga ngepgkagek glpgapglrg lpgkdgetga agppgpagpa gergeqgapg

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721 lpgtpgtdgp kgasgpagpp gaqgppglqg mpgergaagi agpkgdrgdv gekgpegapg

781 kdggrgltgp igppgpagan gekgevgppg pagsagarga pgergetgpp gpagfagppg

841 adgqpgakge qgeagqkgda gapgpqgpsg apgpqgptgv tgpkgargaq gppgatgfpg

901 aagrvgppgs ngnpgppgpp gpsgkdgpkg argdsgppgr agepglqgpa gppgekgepg

961 ddgpsgaegp pgpqglagqr givglpgqrg ergfpglpgp sgepgkqgap gasgdrgppg

1021 pvgppgltgp agepgregsp gadgppgrdg aagvkgdrge tgavgapgap gppgspgpag

1081 ptgkqgdrge agaqgpmgps gpagargiqg pqgprgdkge agepgerglk ghrgftglqg

1141 lpgppgpsgd qgasgpagps gprgppgpvg psgkdgangi pgpigppgpr grsgetgpag

1201 ppgnpgppgp pgppgpgidm safaglgpre kgpdplqymr adqaagglrq hdaevdatlk

1261 slnnqiesir spegsrknpa rtcrdlklch pewksgdywi dpnqgctlda mkvfcnmetg

1321 etcvypnpan vpkknwwssk skekkhiwfg etinggfhfs ygddnlapnt anvqmtflrl

1381 lstegsqnit yhcknsiayl deaagnlkka lliqgsndve iraegnsrff ytalkdgctk

1441 htgkwgktvi eyrsqktsrl piidiapmdi ggpeqefgvd igpvcfl

本发明的典型蛋白质是有着上述氨基酸序列(I)的氨基酸序列的 物质，优选该物质是本身肽或蛋白质；其功能性活性片段或其类似 物；具有高度守恒性的同系物，特别是具有保持半胱氨酸区域的同 系物以及编码包含氨基酸序列(I)描述的氨基酸序列的肽和蛋白质的 载体例如DNA载体(质粒或病毒)。

功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、修饰、取代或缺 失以上所列的氨基酸序列(I)描述氨基酸序列中的一或多个氨基酸残 基而形成。

术语“类似物”也包括嵌合蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体、 上述化合物的前体和其它功能等效物或模拟物。也包括模拟BMP结 合蛋白活性的合成体。

本发明也提供以上所列的氨基酸序列(I)或其功能性活性片段或 类似物在制备用于促进骨形成的药物中的用途。

本发明还提供促进组织再生(例如骨和/或软骨组织再生)的方 法，该方法包括给予BMP结合蛋白的步骤。

本发明还提供促进组织再生(例如骨和/或软骨组织再生)的方 法，该方法包括给予BMP结合蛋白的步骤，其中BMP结合蛋白选 自：Follistatin、FSRP、ZFSTA2、FLIK、α-2-HS糖蛋白、胶原蛋白 IIa、胶原蛋白IV、胶原蛋白Vα1、胶原蛋白Vα2、Chordin、Sog、 Crim、Nell、结缔组织生长因子(CTGF)、Dan、Gremlin、Cerberus、 Endoglin、Twisted Gastulation基因或以上提到的BMP结合蛋白质的 衍生物、片段和/或类似物

本发明还提供促进哺乳动物患者(优选)骨形成的方法，该方法包 括给予有效量的以上所列的氨基酸序列(I)或其功能性活性片段或类 似物。

本发明一方面还包括表达本发明蛋白质及其片段的cDNA的 DNA载体以及由表达该cDNA构建物转染的细胞在促进骨形成中的 用途。上述cDNA和转染细胞可通过本领域技术人员已知的标准技 术制备。

本发明还涵盖促进临床需要的哺乳动物患者(优选)骨形成的基因 疗法。

可使本发明蛋白质与“寻找骨”物质(例如四环素或二膦酸盐)偶 合以改善根据本领域技术人员熟知的靶向专一性。

可根据选择的适当方法制备本发明的功能改善药物。这些方法 包括合成或重组的方法或从天然资源(如果存在)纯化的方法。

本发明的药用组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方 法制备。药用组合物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的 载体，并适宜为单位剂量形式。本发明的药用组合物可包含前药形 式的本发明的蛋白质，该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本发 明物的活性形式。

本发明的药用组合物还可与其它疗法(例如二膦酸盐)联合应用， 如同时、序贯或分别应用。本发明的药用组合物可包含有其它活性 作用物，例如二膦酸盐、PTH、维生素D、BMP和雌激素。

另一方面，我们还提供一种包含本发明蛋白质的医用装置，例 如：骨螺旋钉、体内假器官(例如髋假器官)或外伤钉(例如具有骨接 触表面的髓内钉)。

本发明蛋白质适宜以层面的形式存在，例如覆盖在骨连接装置 的表面的层面形式。本发明的医用装置适于通过将本发明的蛋白质 吸附于如氧化钛或其它金属表面或多聚物表面的表面(如骨螺钉)上， 通过将本发明蛋白质与载体物质结合，然后将载体包附于该医疗装 置表面来制备。

在本发明该方面的一实施方案中，所述骨接触表面已经过“衍 生的”或修饰，因此可将本发明蛋白质直接与表面结合(适于通过共 价键结合)。

在本发明的另一个方面中，我们提供一种用于促进骨形成的人 造支架材料，该支架能与本发明的蛋白质有效地结合。

本发明的支架可以是三维基质或层面(例如连续的薄膜或凝胶)的 形式。该基质结构可由纤维或适宜的材料制造，然后通过纺织处理(例 如编织、针织、交织或非交织、熔融吹制、粘结、水缠)，并进一步 制成所要求的三维形状。该基质结构也可以为其它形式，例如海绵 状或泡沫状形式。

适宜的支架材料优选是生物可降分解的，而且不会抑制细胞生 长或增殖。该材料优选不应该引起患者身体的不良反应，并且应能 通过例如环氧乙烷处理灭菌。该材料一般具有骨传导性。

因此，适宜的材料包括生物可降解的聚酯，例如聚乳酸(PLA)、 聚乙二醇酸(PGA)、聚二噁酮、多羟基链烷酸酯(例如多羟基丁酸酯 (ICI))和透明质酸衍生物(如HYAFF(Fidia))。更适合的材料包括在结 合到本文中作为参考的我们专利申请WO 91/13638和WO 97/06835 中公开的那些，例如亲水性聚氨基甲酸酯、聚醚聚酯、聚环氧乙烷、 聚醚聚酰胺、羧甲基纤维素、乙烯—醋酸乙烯酯共聚物、聚丁二烯、 苯乙烯—丁二烯—苯乙烯嵌段共聚物等。

其它支架材料是以胶原蛋白为基础的物质，例如交联胶原蛋白/ 弹性蛋白材料、由酸溶性I型牛胶原蛋白原料制备的交联胶原蛋白、 胶原蛋白凝胶(如那些商品名为COLLASTAT和COLETICA的物质)。 天然或重组来源的胶原蛋白(如胶原蛋白IIa)均可使用。

本发明还提供了改良或嵌合重组性纤维状胶原蛋白(在此称为 “改性胶原蛋白”)，其与本发明蛋白质结合，并具有能增强其装配 性、稳定性和作为生物材料的用途的特征。该改性胶原蛋白可以用 作上述的支架材料。方法包括使用I型胶原蛋白的C-末端球状区域以 促进三螺旋的形成；移出或改造该胶原酶裂解位点以抑制退化；掺 杂其它的赖氨酸以促进交联，并改造N-末端球状区域的裂解位点以 促进成熟纤维的N-末端区域的保留。例如，可将胶原蛋白IIa的 chordin/SOG序列用蛋白质/多肽功能操控剂代替。可采用类似结构域 改组方法使本发明的蛋白质结合入其它细胞外的基质组分中(例如纤 连蛋白连接蛋白或胶原蛋白IV)或ECM结合分子或序列(例如肝素结 合结构域)。参见例如WO 97/08311，其整个内容结合到本发明中作 为参考。

在其它具体实施方案中，我们提供了一种含有一种合成材料的 骨替代材料，该合成材料包含任意一种上述的支架材料和与本发明 蛋白质结合的晶体相态(例如一种磷灰石，如羟磷灰石)。

在本发明的适当方面中，本发明的蛋白质作为支架以凝胶形式 提供。该凝胶一般包括凝血酶、纤维蛋白原和因子XIII或其它与凝胶 交联的转谷氨酰胺酶。

本发明还包括用于组织(如骨)疾病研究中的动物模型的研制。可 采用非人类哺乳动物(例如小鼠)研究本发明的蛋白质在骨骼系统中的 作用。

将适宜的蛋白质结合于一固体基质上，然后植入到要求的整形 外科的部位。该手术的创伤(即植入结合蛋白的基质)能导致BMP的 产生，由于BMP和本发明蛋白质的相互作用，所产生的BMP将结 合在所述基质上。

本发明的蛋白质(优选结合固体基质)较先前技术具有优势，即不 会浪费体内天然产生的过多的BMP。过量的BMP通常能迅速地从 体内排出。本发明能浓集BMP，所述BMP可在体内自然生成，并 通常能迅速地排出。

本发明提供一种含有胶原蛋白IIa的支架。

本发明还提供一种促进组织生成的支架，其中该支架包含BMP 结合蛋白。

本发明还提供一种促进组织生成的支架，其中该支架包含胶原 蛋白IIa。

所述支架装置适于完全或主要由胶原蛋白IIa制成，或者主要用 胶原蛋白IIa包覆。

本发明提供一种包含胶原蛋白IIa的支架，该支架能够释放性结 合BMP，并能控制BMP的释放。

因此，BMP的靶向性得到改善。

在具体实施方案中，所结合的BMP(一经结合)可通过正常细胞 活动和/或通过一种可以释放该结合BMP的操控装置或药物释放。该 BMP可通过所述支架的降解释放。

本发明适宜能使可溶性BMP与靶细胞(例如在缺损愈合部位)相 互作用，在靶细胞能形成软骨的实施方案中，诱发这些靶细胞表达 和合成软骨成分，从而使缺损部位复原。

然而BMP不一定释放方才具有本发明特定实施方案中所述的活 性，结合型的BMP也有活性。

BMP和正规软骨型细胞的连续相互作用可以导致骨的形成。

骨可通过内部软骨的骨化过程形成，该过程中首先形成软骨， 接着矿化软骨。在该过程中，骨通过软骨的形成而形成，因此发现 能愈合骨的任何治疗都可被认定为能刺激软骨的形成，并认为该可 逆过程也是正确的。

本发明另一方面提供一种治疗可通过促进软骨形成而缓解的疾 病或临床症状的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架 包含治疗有效量的能结合BMP的胶原蛋白IIa。

本发明再一方面提供一种预防可通过促进软骨形成而缓解的疾 病或临床症状的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架 包含治疗有效量的能结合BMP的胶原蛋白IIa。

本发明再一方面提供一种促进软骨形成的方法，该方法包括给 予一种支架这一步骤，该支架包含治疗有效量的能结合BMP的胶原 蛋白IIa。

尽管设想本发明有利于软骨修复，但还可以用来治疗其它临床 症状和疾病。

可得益于本发明的软骨丢失的临床症状和疾病包括：骨关节炎、 branchypodism、Hunter-Thompson软骨发育异常。也用于治疗关节的 软骨病变，包括那些限于软骨和那些穿透软骨下骨的软骨病变，也 可以用于治疗OA。

设想在不需高浓度生长因子下，本发明可以用于治疗软骨修复 或诱发软骨生长。目前使用高浓度生长因子一直存在一个问题，即 高浓度生长因子(如上所提)可引起生物平衡的偏离，从而可能导致该 生长因子效能降低这一缺点。

本发明能更好地使BMP集中作用于其靶细胞。

使用生长因子(例如BMP)的另一个问题是90％的外源性生长因 子在用药后头二十四小时可被排出，这表明大多数的生长因子未达 到其靶细胞。

本发明胶原蛋白IIa或支架适宜以层面的形式存在，例如覆盖在 软骨接触的装置表面上的层面形式。本发明的医用装置适于通过将 本发明的胶原蛋白IIa或支架吸附于如软骨固定凹销的表面上，通过 将本发明的胶原蛋白IIa或支架与载体物质结合，然后将载体包覆于 该医疗装置表面来制备。

类似地，本发明的特定方面的胶原蛋白IIa或支架可以用于促进 骨的再生。

本发明还提供一种制备促进组织工程化的支架的方法，该方法 包括将支架用BMP结合蛋白包覆盖这一步骤。

在本发明该方面的一实施方案中，已将与软骨接触的表面衍生 化或修饰，这样易于通过共价键直接将本发明的胶原蛋白IIa或支架 结合于所述表面上。

本发明的支架可以是三维基质或层面(例如连续的薄膜或凝胶)的 形式。该基质结构可由纤维或适宜的材料制造，然后通过纺织处理(例 如编织、针织、交织或非交织、熔融吹制、粘结、水缠)，并进一步 制成所要求的三维形状。该支架构造也可以为其它形式(例如海绵状 或泡沫状)，其中可将该胶原蛋白IIa包覆或结合在该支架的表面上。

适宜的支架材料优选是生物可降解的，而且不会抑制细胞生长 或增殖。该材料优选不应该引起患者身体的不良反应，并且应能通 过例如环氧乙烷处理灭菌。该材料优选为具有骨传导性。

其它支架材料是以胶原蛋白为基础的物质，例如交联胶原蛋白/ 弹性蛋白材料，由酸溶性I型牛胶原蛋白原料制备的交联胶原蛋白、 胶原蛋白凝胶(如那些商品名为COLLASTAT和COLETICA的物质)。 天然或重组来源的胶原蛋白(如胶原蛋白IIa)均可使用。

本发明还提供了改良或嵌合重组性的纤维状胶原蛋白(本发明称 为“改性胶原蛋白”)，其与胶原蛋白IIa结合，并具有能增强其装配 性、稳定性和作为生物材料的用途的特征。该改性胶原蛋白可以用 作上述的支架材料。方法包括使用I型胶原蛋白的C-末端球状区域以 促进三重螺旋的形成；移出或改造该胶原酶切割位点以抑制降解； 掺入其它的赖氨酸以促进交联，并改造N-末端球状区域的切割位点 以促进成熟纤维的N-末端区域的保留。例如，可将该胶原蛋白IIa的 chordin/SOG序列用蛋白质/多肽功能操控剂代替。可采用类似重排区 域的方法使本发明的蛋白质结合入其它细胞外的基质组分中(例如纤 连蛋白连接蛋白或胶原蛋白IV)或ECM结合分子或序列(例如肝素结 合结构域)。参见例如WO 97/08311，其整个内容结合到本发明中作 为参考。

在其它具体实施方案中，我们提供了一种含有一种复合材料的 软骨替代材料，该复合材料包含任意一种上述的支架材料和与BMP 结合蛋白(例如胶原蛋白IIa)结合的陶瓷骨传导性或骨感应性相态物 质(例如一种磷灰石，如羟磷灰石)。

在其它具体实施方案中，我们提供了一种含有一种复合材料的 骨替代材料，该复合材料包含任意一种上述的支架材料和与BMP结 合蛋白(胶原蛋白IIa)结合的陶瓷骨传导性或骨感应性相态物质(例如 一种磷灰石，如羟磷灰石)。

在本发明的适当方面中，本发明的支架结构为凝胶形式。该凝 胶一般包括凝血酶、纤维蛋白原和因子XIII或其它与凝胶交联的转谷 氨酰胺酶。

本发明还包括用于软骨疾病研究中动物模型的研制。可采用非 人类哺乳动物(例如小鼠)研究本发明的蛋白质在骨骼系统中的作用。

将适宜的BMP结合蛋白(例如胶原蛋白IIa)结合于一固体基质 上，形成本发明的支架，然后植入到要求的整形外科的部位。据认 为该手术的创伤(即植入BMP结合胶原蛋白IIa结合包覆的本发明支 架)能导致BMP的产生，由于BMP和本发明支架上的BMP结合蛋 白胶原蛋白IIa的相互作用，所产生的BMP会结合在所述支架上。 所述BMP将通过正常细胞活动释放，而使该可溶性BMP与靶细胞 相互作用刺激增殖和基质的生成。

本发明的支架较先前技术具有优势，即不会浪费体内天然产生 的过多的BMP。组织创伤时产生的BMP不是局部性的，但是准确 地提供给所述细胞。目前通过将BMP注射于损伤部位而给予BMP 的方法不能克服这个问题，原因是该BMP还是不能准确地提供给所 述细胞。过量的BMP通常能迅速地从体内排出。本发明浓集BMP(它 们可在体内自然生成，并通常能迅速地排出)，然后在所要求的区域 缓慢逐步释放这些BMP。在本发明的某些实施方案中，可将所结合 的BMP缓慢逐步释放到本发明的支架上，其中优选将胶原蛋白IIa 本身结合或覆盖于固体基质上，然后这种情况可现在体内自然出现。 结合BMP似乎并不含失活BMP或引起对BMP功能的任何永久性破 坏。

现在仅以下列实施例、表格和图示的实例方式说明本发明，：

图1.1显示与各种对照组对比，含有Follistatin和BMP-2的细胞 样本其每个细胞所释放的碱性磷酸酶的条棒图。

图1，2a-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-2活性的影响(溶液 实验)

图1，2b-也显示Follistatin对C2C12细胞BMP-2活性的影响(溶 液实验)

图1，2c-显示Follistatin对C2C12细胞对BMP-5活性的影响(溶 液实验)

图1，2d-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-6活性的影响(溶液 实验)

图1，2e-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-7活性的影响(溶液 实验)

图1，3a-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-2活性的影响(结合 实验)

图1，3b-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-6活性的影响(结合 实验)

图1，3c-也显示Follistatin对C2C12细胞BMP-6活性的影响(结 合实验)    

图1，3d-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-7活性的影响(结合 实验)

图1，4-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-4活性的影响(溶液实 验)

图1，5-显示Follistatin对C2C12细胞BMP-4活性的影响(结合实 验)

图1，7-显示Follistatin对MC3T3E1细胞BMP-2活性的影响(结 合实验)

图1，8-显示Follistatin288对C2C12细胞BMP-2活性的影响(溶 液实验)

图1，9-显示Follistatin288对C2C12细胞BMP-2活性的影响(结 合实验)

图1.10a显示只用BMP-2处理的大鼠腓肠肌中的钙化组织的放 射显影图。

图1.10b显示大鼠腓肠肌中的钙化组织的放射显影图，其中与图 1.10a对照，当存在Follistatin和BMP-2时，可发现骨形成增加。

图1.10c显示了在×50放大倍率下，用von Kossa和van Gieson 复染剂染色的被植入了Follistatin和BMP-2的组织的组织切片的显 微照相片。

图1.10d显示了在×100放大倍率下，用von Kossa和van Gieson 复染剂染色的被植入了Follistatin和BMP-2的组织的组织切片的显 微照相片。

图2.2a显示Follistatin和BMP-2对软骨细胞产生GAG的影响。

图2.2b显示Follistatin和BMP-2对软骨细胞产生胶原蛋白的影 响。

图2.2c显示Follistatin和BMP-2对软骨细胞增殖的影响。

图2.3a显示Follistatin和BMP-2对体外软骨细胞产生GAG的 影响(没进行抗坏血酸盐处理)。

图2.3b显示Follistatin对细胞形态的影响。

图2.4显示Follistatin和OP-1对软骨细胞产生GAG的影响。

       实验所用的重组蛋白的来源 Follistatin 300  a)R&D Systems Europe  Abingdon  OXON  b)Produced on site at Smith  &Nephew  GRC，York Science Park，YORK Follistatin 288  R&D Systems Europe  Abingdon  OXON BMP-2  a)R&D Systems Europe  Abingdon  OXON  b)NIBSC  Potters Bar  Hertfordshire  BMP-4  BMP-5  BMP-6  BMP-7  a)R&D Systems Europe  Abingdon  OXON

             溶液实验和结合实验的通法

溶解细胞的冷冻融溶法：从细胞中去除培养基，然后将细胞层 用0.2M碳酸盐缓冲液洗涤。应用Rago等采用的冷冻融溶的方法(通 过在蒸馏水中冷冻溶解细胞，然后采用Hoechst 33258在96孔组织 培养板中进行DNA荧光法测试。Anal Biochem.191：p31-34，1990)， 将细胞融溶。向各孔中加入100μl 0.1％triton X-100在0.2M碳酸盐 缓冲液的溶液。然后采用液氮，将培养板冷冻，在37℃下融溶，共 进行3次。在光学显微镜下检查培养板以确保所有细胞均溶解。

对硝基苯基磷酸酯碱性磷酸酶试验：采用Leboy所述的测试方 法(大鼠骨髓基质细胞培养物中地塞米松诱导的成骨细胞mRNA。 1991，J Cell Physiol.146：p370-378)测定碱性磷酸酶活性。该反应包 括通过碱性磷酸酶从对硝基苯基磷酸酯(pNPP)中酶促断裂磷酸酯 基，得到有色产物对硝基苯酚(pNP)。采用微板读数器，在405nm处 测定该产物的吸光度。从标准pNP溶液(0-250nM ml-1pNP的范围)的 剂量反应曲线中，通过内插法计算碱性磷酸酶的活性。

PicoGreen试验：采用PicoGreen试验测定细胞数。该方法为荧 光光度法，依据PicoGreen对双链DNA的高敏感性。由于每个细胞 包含7.7pgDNA，所以可通过存在的DNA的量计算细胞数。制备(0- 8μg ml-1范围的DNA标准液。在微板读数器上，在发射波长485nm 和激发波长538nm处测定吸光度。采用回归模式处理微量滴定板的 数据，以建立源于该标准DNA溶液的标准曲线，由其可测定DNA 的浓度。

实施例1 Follistatin和BMP-2对C2C12细胞的影响

所用的BMP-2的浓度大约为1μg/ml。所用的Follistatin的浓度 大约为25μg/ml。发现该Follistatin粘附于该组织培养塑料板的孔表 面。在4℃下孵育过夜，约16小时。孵育后，将各孔用磷酸盐缓冲 盐水(PBS)洗涤3次以除去未结合的Follistatin。然后将BMP-2与结 合的Follistatin一起孵育。于37℃孵育1小时后，移去混合物，将各 孔用PBS洗涤3次以除去未结合的BMP-2。将C2C12小鼠成肌细胞 与该蛋白质混合物一起孵育。测试这些培养物的碱性磷酸酶的活性， 发现与不含Follistatin的培养物相比，碱性磷酸酶的活性水平明显增 加，表明该Follistatin能增加BMP-2的活性。

用以下试剂一式三份测定细胞样本(1.06×104细胞cm-2)的碱性磷 酸酶的活性：

1.Follistatin

2.Follistatin和BMP-2

3.组织培养塑料(TCP)

4.BMP-2

5.牛血清白蛋白(BSA)

6.BSA和BMP-2

还测定了这些样本的总DNA的量，以每pg/ml的DNA表示。 由于各细胞每ml含有7.7pg的DNA，所以将DNA的量除以7.7得 到细胞的平均数。然后计算每个细胞中碱性磷酸酶的量pmol/ml。

附表(表1.1)和图(图1.1)清晰表明用Follistatin和BMP-2处理的 细胞样本的碱性磷酸酶活性明显增加，因此说明骨细胞形成增加。

实施例1.2：Follistatin和BMP-2、5、6和7对C2C12细胞的 影响-溶液法

BMP-2和BMP-7可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清(SF)的 Dulbeccos氏改良Eagle培养基(DMEM)稀释得到10μgml-1的浓度制 备。再将其用SFDMEM稀释至5μg ml-1。

BMP-6可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清SFDMEM稀释 得到20μgml-1的浓度制备。再将其用SFDMEM稀释至5μg ml-1。

BMP-5可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清SFDMEM稀释 得到50μgml-1的浓度制备。再将其用SFDMEM稀释至5μg ml-1。

Follistatin可通过将一安瓿的内容物用3ml无血清SFDMEM稀 释得到8.3μgml-1的终浓度制备。

用胰蛋白酶/EDTA从组织培养瓶中移出C2C12细胞(ECACC批 号91031101)。采用锥虫蓝和Neubauer血细胞计数器测定细胞数和 细胞的成活力。以3.4×104细胞/ml的密度培养细胞(96孔板每孔100 μl，因此1.06×104细胞/cm2)，在潮湿空气中，在37℃/5％CO2下孵 育2小时。

然后将下列溶液加入到96孔组织培养板的各孔中(每孔最少重 复四份)：

BMP-2和Follistatin

条件1-40μlFollistatin+60μl SFDMEM

条件2-40μlFollistatin+20μl BMP-2+40μl SFDMEM

条件3-20μl BMP-2+80μl SFDMEM

条件4-100μl SFDMEM

BMP-5和Follistatin

条件1-40μlFollistatin+60μl SFDMEM

条件2-40μlFollistatin+20μl BMP-5+40μl SFDMEM

条件3-20μl BMP-5+80μl SFDMEM

条件4-100μl SFDMEM

对于BMP-6和Follistatin

条件1-40μlFollistatin+60μl SFDMEM

条件2-40μlFollistatin+22.6μl BMP-6+37.4μl SFDMEM

条件3-22.6μl BMP-6+77.4μl SFDMEM

条件4-100μl SFDMEM

对于BMP-7和Follistatin

条件1-40μlFollistatin+60μl SFDMEM

条件2-40μlFollistatin+19.4μl BMP-7+40.6μl SFDMEM

条件3-19.4μl BMP-7+80.6μl SFDMEM

条件4-100μl SFDMEM

在37℃/5％CO2下，将培养板孵育4日。4日后，用冷冻融溶法 溶解细胞。用pNPP试验测定碱性磷酸酶的活性，然后采用通法中所 列的PicoGreen试验法测定细胞数。

结果见表(1.2a-1.2e)和图(1.2a-1.2e)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.3：Follistatin和BMP-2、6和7对C2C12细胞的影响 -结合法

BMP-2和BMP-7可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清 SFDMEM稀释得到10μgml-1的浓度制备。再将其用SFDMEM稀释 至1μgml-1。

BMP-6可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清SFDMEM稀释 得到20μgml-1的浓度制备。再将其用SFDMEM稀释至1μg ml-1。

Follistatin可通过将一安瓿的内容物用3ml无血清SFDMEM稀 释得到8.3μgml-1的终浓度制备。

在96孔培养板的各孔中开始建立四种条件(每个条件最少重复 四份)：

条件1)50μlFollistatin

条件2)50μlFollistatin

条件3)组织培养塑料(TCP)

条件4)TCP

将以上溶液加入到96孔组织培养板的各孔中，然后在4℃下孵 育过夜。孵育后，移出该蛋白质溶液，将各孔用PBS洗涤3次。

向条件2和3(如上)的各孔中加入125.5μl/孔的BMP-2(1μgml-1) 或142.5μl/孔的BMP-6(1μg ml-1)或121.5μl/孔的BMP-7(1μgml-1)。 向条件1和4(如上)的各孔中加入100μl/孔的SFDMEM。将这些溶 液在37℃/5％CO2下孵育1小时，然后移去溶液，将各孔用PBS洗 涤3次。以3.4×104细胞ml-1的密度(96孔板每孔100μl，因此为1.06×104 细胞/cm2)，在各孔中加入100μl的C2C12细胞(ECACC批号 91031101)，然后在潮湿空气中，在37℃/5％CO2下孵育大约4日。

4日后，用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP试验测定碱性磷酸酶 的活性，然后采用通法中所列的PicoGreen试验法归一化为DNA水 平。

结果见表(1.3a-1.3d)和图(1.3a-1.3d)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.4：Follistatin和BMP-4对C2C12细胞的影响-溶液法

BMP-4可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得到10 μgml-1的浓度制备。再将其用SFDMEM稀释至2.5μg ml-1。Follistatin 可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得到25μgml-1的终 浓度制备。

在96孔培养板的各孔中开始建立四种条件(每个条件最少重复 四份)：

条件1-20μlFollistatin+80μl PBS

条件2-20μlFollistatin+10μl BMP-4+70μl PBS

条件3-10μl BMP-4+90μl PBS

条件4-100μl PBS

在潮湿空气中，在37℃/5％CO2下，将以上溶液孵育45分钟。 温育后，在不移出试剂下，以3.4×104细胞/ml的密度(96孔板每孔100 μl，因此1.06×104细胞/cm2)，加入100μl的C2C12细胞(ECACC批 号91031101)。在37℃/5％CO2下，将该培养板孵育大约4日。

用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP试验测定该培养物的碱性磷 酸酶的活性，然后采用通法中所列的PicoGreen试验法归一化DNA 水平。

结果见表(1.4)和图(1.4)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.5：Follistatin和BMP-4对C2C12细胞的影响-结合法

BMP-4可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得到10 μgml-1的浓度制备。再将其用SFDMEM稀释至2.5μg ml-1。Follistatin 可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得到25μgml-1的终 浓度制备。

在96孔培养板的各孔中开始建立四种条件(每个条件最少重复 四份)：

条件1-20μlFollistatin+80μl PBS

条件2-20μlFollistatin+80μl PBS

条件3-TCP

条件4-TCP

将以上溶液加入到96孔组织培养板的各孔中，然后在4℃下孵 育过夜。孵育后，移出该蛋白质溶液，将各孔用PBS洗涤3次。将 各孔用200μl/孔的BSA(2mg ml-1)封闭1小时，然后移去封闭液，将 各孔用PBS洗涤3次。

向条件2和3(见上所列)的各孔中加入100μl/孔的BMP-2(2.5μ g ml-1)或向条件1和4(如上)的各孔中加入100μl/孔的SFDMEM。将 这些溶液在37℃/5％CO2下孵育1小时，然后移去溶液，将各孔用PBS 洗涤3次。

以3.4×104细胞/ml的密度(96孔板每孔100μl，因此1.06×104细 胞/cm2)加入C2C12成肌细胞。然后在潮湿空气中，在37℃/5％CO2下，将培养板孵育大约4日。4日后，用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP 试验测定该培养物的碱性磷酸酶的活性，然后采用通法中所列的 PicoGreen试验法归一化DNA水平。

结果见表(1.5)和图(1.5)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.6：Follistatin和BMP-2对MC3T3E1细胞的影响-溶 液法

BMP-2可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得到10 μgml-1的浓度制备。当需要时，再将其用SFDMEM稀释至1μg ml-1 。Follistatin可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得到25 μgml-1的终浓度制备。

在96孔培养板的各孔中建立四种条件(每个条件最少重复四 份)：

条件1-20μlFollistatin+80μl PBS

条件2-10μl BMP-2+20μlFollistatin+70μl PBS

条件3-10μl BMP-2+90μl PBS

条件4-100μl PBS

将这些蛋白质混合物室温孵育45分钟，然后在不移出试剂下， 加入MC3T3E1(DSMZ，批号ACC210/3)。以6.4×104细胞ml-1的密 度(每孔100μl，即在96孔板中每孔6.4×103细胞，因此2.0×104细 胞cm-2)培养细胞。在潮湿空气中，在37℃/5％CO2下，将该培养板 孵育大约4日。

用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP试验测定该培养物的碱性磷 酸酶的活性，然后采用通法中所列的PicoGreen试验法归一化DNA 的水平。

结果见表(1.6)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.7：Follistatin和BMP-2对MC3T3E1细胞的影响-结 合法

BMP-2可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清SFDMEM稀释 得到10μgml-1的浓度制备。当需要时，再将其用SFDMEM稀释至1 μg/ml。Follistatin可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀释得 到25μgml-1的终浓度制备。在PBS中稀释BSA，得到的终浓度为 2mgml-1。

在96孔培养板的各孔中开始建立五种条件(每个条件最少重复 四份)：

条件1)50μlFollistatin

条件2)50μlFollistatin

条件3)50μl BMP-2

条件4)50μl BSA

条件5)50μl BSA

将以上溶液加入到96孔组织培养板的各孔中，然后在4℃下孵 育过夜。孵育后，移出该蛋白质溶液，将各孔用PBS洗涤3次。将 各孔用200μl/孔的BSA(2mg ml-1)封闭1小时，然后移去封闭液，将 各孔用PBS洗涤3次。

向条件2和5(见上所列)的各孔中加入100μl/孔的BMP-2(1μg ml-1)或向条件1、3和4(如上)的各孔中加入100μl/孔的SFDMEM。 将这些溶液在37℃/5％CO2下孵育1小时，然后移去溶液，将各孔用 PBS洗涤3次。以6.4×104细胞ml-1的密度(每孔100μl，即在96孔 板中每孔6.4×103细胞，因此2.0×104细胞cm-2)培养MC3T3E1细胞。 然后在潮湿空气中，在37℃/5％CO2下，将培养板孵育4日。

用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP试验测定该培养物的碱性磷 酸酶的活性，然后采用通法中所列的PicoGreen试验法归一化DNA 的水平。

结果见表(1.7)和图(1.7)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.8：Follistatin-288和BMP-2对C2C12细胞的影响-溶 液法

BMP-2可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清SFDMEM稀释 得到10μgml-1的终浓度制备。Follistatin-288可通过将一安瓿的内容 物用1ml SFDMEM稀释得到25μgml-1的终浓度制备。

在96孔培养板的各孔中开始建立四种条件(每个条件最少重复 四份)：

条件1-20μlFollistatin-288+80μl PBS

条件2-20μlFollistatin-288+10μl BMP-2+70μl PBS

条件3-10μl BMP-2+90μl PBS

条件4-100μl PBS+70μl PBS

将以上溶液加入到96孔组织培养板的各孔中，然后在37℃下孵 育45分钟。孵育后，在不移出试剂下，以3.4×104细胞/ml的密度加 入100μl C2C12成肌细胞(96孔板中每孔100μl，因此1.0×104细胞 /cm2)。在37℃/5％CO2下，将该培养板孵育大约3日。

用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP试验测定该培养物的碱性磷 酸酶的活性，然后采用通法中所列的PicoGreen试验法归一化DNA 的水平。

结果见表(1.8)和图(1.8)中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.9：Follistatin-288和BMP-2对C2C12细胞的影响-结 合法

BMP-2可通过将一安瓿的内容物用1ml无血清SFDMEM稀释 得到10μgml-1的浓度制备。当需要时，再将其用SFDMEM稀释至1 μg/ml。Follistatin-288可通过将一安瓿的内容物用1ml SFDMEM稀 释得到25μgml-1的终浓度制备。在PBS中稀释BSA，得到的终浓度 为2mgml-1。

在96孔培养板的各孔中建立四种条件(每个条件最少重复四 份)：

条件1-20μlFollistatin288+80μl PBS

条件2-20μlFollistatin-288+70μl PBS

条件3-TCP

条件4-TCP

将以上溶液在4℃下孵育过夜。孵育后，移出该蛋白质溶液，将 各孔用PBS洗涤3次。室温下，将各孔用200μl/孔的BSA(2mg ml-1) 的PBS溶液封闭1小时，然后移去封闭液，将各孔用PBS洗涤3次。

向条件2和3中加入100μl/孔的BMP-2(1μg ml-1)。向条件1 孔中加入100μl/孔的SFDMEM，条件4的各孔空置。将这些溶液在 37℃/5％CO2下孵育1小时，然后移去溶液，将各孔用PBS洗涤3次。

以3.4×104细胞/ml的浓度(在96孔板中每孔100μl，因此1.06× 104细胞/cm2)加入C2C12细胞。然后在37℃/5％CO2下，将培养板孵 育4日。

用冷冻融溶法溶解细胞，用pNPP试验测定该培养物的碱性磷 酸酶的活性，然后采用通法中所列的PicoGreen试验法归一化DNA 的水平。

结果见表1.9和图1.9中所示。

从这些结果可以看出，与单独在BMP中生长的培养物所表达的 碱性磷酸酶相比，在Follistatin和BMP的条件中生长的培养物所表 达的碱性磷酸酶增加，这表明这些细胞已被刺激沿成骨细胞系进一 步分化。

因此该结果说明细胞响应于Follistatin和BMP，从而导致高水 平的成骨组织再生。

实施例1.10：体内的肌内研究

将约285-365g的刚成年Sprague Dawley大鼠麻醉，将后肢剃光 毛。将蛋白溶液(BMP-2和Follistatin300)和对照液装载于胶原蛋白海 绵(10mm×3mm×3mm，Duragen，Life Sciences)中，然后植入腓肠肌中。 植入八组(如下所列)：

组1    载体

组2    载体+BMP(A)

组3    载体+BMP(B)

组4    载体+FS300(A)

组5    载体+FS300(B)

组6    载体+FS300(A)+BMP(A)

组7    载体+FS300(B)+BMP(B)

组8    载体+FS300(A)+BMP(B)

(A＝20μg蛋白质 &B＝5μg蛋白质)

处理日：第一日

动物      左后肢                   右后肢

1         载体+FS300(B)            载体

2         载体+BMP2(A)             载体

3         载体+FS300(B)+BMP2(B)    载体+BMP2(B)

4         载体                     载体+BMP2(B)

5         载体+FS300(A)            载体+FS300(A)+BMP2(A)

6         载体+FS300(A)+BMP2(B)    载体+FS300(B)+BMP2(B)

7         载体+BMP2(A)             载体+BMP2(B)

处理日：第二日

动物      左后肢                   右后肢

8         载体+FS300(B)+BMP2(B)    载体+FS300(B)

9         载体+FS300(A)+BMP2(A)    载体+FS300(B)+BMP2(B)

10        载体+FS300(A)+BMP2(B)    载体+FS300(A)

11        载体+FS300(A)            载体+BMP2(A)

12        载体+FS300(B)            载体+FS300(A)+BMP2(B)

13        载体+BMP2(A)             载体+FS300(A)+BMP2(B)

14        载体+FS300(A)+BMP2(A)    载体+BMP2(A)

处理日：第三日

动物      左后肢                   右后肢

15        载体                     载体+FS300(A)

16        载体                     载体+FS300(A)+BMP2(A)

17        载体+FS300(A)+BMP2(A)    载体+BMP2(B)

18        载体                     载体+FS300(A)+BMP2(B)

19        载体+FS300(B)            载体+FS300(A)+BMP2(A)

20        载体+BMP2(B)             载体+FS300(B)

21        载体+FS300(A)+BMP2(A)    载体+FS300(A)+BMP2(B)

处理日：第四日

动物  左后肢                   右后肢

22    载体+FS300(A)            载体+FS300(B)

23    载体                     载体+FS300(B)+BMP2(B)

24    载体+FS300(B)+BMP2(B)    载体+FS300(A)

25    载体+BMP2(A)             载体+FS300(B)+BMP2(B)

26    载体+BMP2(A)             载体+FS300(B)

27    载体+BMP2(B)             载体+FS300(A)

28    载体+BMP2(B)             载体+FS300(A)+BMP2(B)

放射显影图分析

在植入后第17-18日之间进行放射性试验(见图1.10a和1.10b)。 当在等倍放大量下扫描和测定时，用5μg的Follistatin和BMP-2处 理的大鼠的钙化组织的面积为7.77mm2(图1.10b)，单独用5μg的 BMP-2处理的大鼠的钙化组织的面积为3.0mm2(图1.10a)，单独用作 对照的20μg的BMP-2处理的大鼠的钙化组织的面积为4.62mm2， 因此，即用Follistatin和BMP-2处理形成更多的骨(未显示数据)。在 阴性对照组(仅用载体处理)中未观测到骨。

组织学

移植4星期后，将动物处死。从腓肠肌上取出移植部位周围的 皮肤，切去该腓肠肌。将样本在10％福尔马林缓冲液中固定过夜， 用石蜡包埋处理，以5μm切片，用苏木精和曙红(H&E)染色，然后 用van Gieson复染。从显微照片(图1.10c和1.10d，其中B是被染 成暗红色的骨，O是被染成粉红色的类骨质，M是被染成黄色的肌 肉)中可以清晰地看到在BMP-2和Follistatin组别中生成的物质是骨。

其它测试(包括碱性磷酸酶活性和钙含量)表明在Follistatin和 BMP标本中骨再生水平增高。

实施例1.11

我们发现从R+D Systems UK购买的Follistatin对固体基质载体 具有粘附性。所用的Follistatin的浓度约为25μg/ml。

将载体包覆的Follistatin皮下移植给28-35日龄的雄性大鼠。将 不含Follistatin的移植作为空白对照。

移植21天后处死动物，然后定量测定移植部位的骨形成活性。 将对BMP-2存在下所述载体上Follistatin进行的试验与1/载体+BMP 和2/载体+Follistatin进行的试验相比较。

与对照组相比，移植有BMP-2存在下固体基质载体包覆的 Follistatin的动物在移植部位显示出更好的骨形成活性。

实施例1.12

骨传导腔的移植包括将具有圆筒形内部空间的刻有螺纹状的钛 腔移植入大鼠骨。该腔内径为2mm，长7mm。外径3.5mm，全长 13mm。

该腔的一端留有供组织向内生长的许多孔。为在骨内移植该腔， 可将该腔旋入骨内。

实验选用雄性Sprague-Dawley大鼠(每鼠移植一腔)。

移植钛腔后，将大鼠随机分组。第一组移植适宜的附有Follistatin 的基质，第二组只移植基质，第三组不向腔内移植任何物质。

移植试验物质6星期后处死大鼠。用腔里的组织切片，评估骨 的内生长。与对照组相比，用Follistatin处理的骨组织显示出更好的 骨再生性。

实施例1.13

我们发现从R+D Systems UK购买的Follistatin对固体基质载体 具有粘附性。所用的Follistatin的浓度约为25μg/ml。

将载体包覆的Follistatin肌内移植给28-35日龄的雄性大鼠。将 不含Follistatin的移植作为空白对照。

移植21天后处死动物，然后定量测定移植部位的骨形成活性。 将对BMP-2存在下所述载体上Follistatin进行的试验与1)载体+BMP 和2)载体+Follistatin进行的试验相比较。

与对照组相比，移植有BMP-2存在下固体基质载体包覆的 Follistatin的动物在移植部位显示出更好的骨形成活性。

实施例1.14

我们发现从R+D Systems UK购买的Follistatin对固体基质载体 具有粘附性。所用的Follistatin的浓度约为25μg/ml。

将载体包覆的Follistatin移植入绵羊的部分楔形切开的腓骨内。 移植30日后处死动物，然后定量测定移植部位的骨形成活性。

与单独移植载体的对照组相比，移植有固体基质载体包覆的 Follistatin的动物在移植部位显示出更好的骨形成活性。

实施例1.15

节段损伤性体内模型

节段损伤桡骨/尺骨模型已在公开的文献中详细说明，并一直用 于研究诸如去矿质骨基质和骨形成蛋白的化合物。最常使用以下动 物进行桡骨/尺骨模型试验：大鼠、兔和狗。已报道狗的天性比兔或 大鼠更好动，这样会导致加剧长骨的断裂损伤。因此，选用新西兰 白兔类兔(骨骼成熟，即生长板融合)作为最适合的动物。

在兽医外科医师监督下进行外科手术前，先拍X-光照片，以确 认骺板融合，即骨骼成熟。如果生长板融合，即可维持麻醉，然后 进行外科手术。

手术方法

通过将手术部位的毛刮去，用适宜的手术用洗涤剂(如：Hibitane、 Pevidine)洗净皮肤，准备出供无菌手术的手术区域。

1.直接在尺骨上方切口，然后切开周围的肌肉露出尺骨。

2.从尺骨的最末端测量3cm的距离，沿着尺骨的中轴放置一个 定位装置。用解剖刀在该装置的两端标记尺骨。

3.使用摇摆式锯在各标记内进行该尺骨的完全截骨术。

4.使用解剖刀切断桡骨和尺骨间的韧带，以释放出该尺骨部分。

5.使用解剖刀刮去紧邻桡骨部分的骨膜。

6.用盐水冲洗缺损部位以去除碎片。

7.在缺损处移植入骨移植材料或让缺损部位保持空位。

8.缝合手术部位。

样本准备

各次移植含有重组BMP-2、Follistatin或它们的组合物。

分析

在肱尺/肱挠关节和桡腕关节处分离尺骨和桡骨结构，同时小心 避免对桡骨和尺骨施加过度的弯曲力。除去皮肤后，将标本置于福 尔马林中。

通过放射显影照片和组织学分析评价该节段损伤的骨愈合情 况。结果表明Follistatin和BMP组比对照组能增强骨的生长。

实施例2.1：

通过制备适宜体积的支架，消毒后然后用胶原蛋白IIa(或者是完 整的蛋白质或者是含有BMP结合位点的胶原蛋白IIa前肽)包覆制造 试验装置。

在新西兰白兔的膝盖骨凹槽处制造直径为3mm深度为3mm的 骨软骨缺损。将该缺损处或者让其空置、或者只用所述支架填充或 者用上描述的装置填充。在第1、3、6月处死兔子，对损伤部位进 行组织学检查。

采用O′Driscoll记录系统，由富有经验的组织学家用盲法对软骨 修复进行分类。在所有时间点上，用包覆有胶原蛋白IIa的支架处理 的缺损比任一对照组的缺损，软骨愈合明显改善。

该数据表明胶原蛋白IIa对骨软骨缺损的愈合有效，我们相信它 是通过结合并提供自体BMP而起效。

Follistatin对软骨形成影响的体外测定方法

实施例2.2：对单层软骨细胞的影响

从新鲜的绵羊膝关节中分离出初级软骨细胞。从膝盖骨的凹槽 和膝盖骨后解剖出关节软骨，剁碎该组织(约1-4mm3)，然后用0.25％ 庆大霉素溶液洗涤。弃去该庆大霉素溶液，在37℃下，将软骨碎块 在胶原酶溶液(0.2％)中轻轻振摇过夜。使用Worthington氏II型胶原 酶，将该酶用培养基稀释，然后无菌过滤。培养基是包含有10％牛 胎血清、1％青霉素/链霉素、1％非必需氨基酸和1％L-谷氨酰胺的标 准DMEM(4.5g/L葡萄糖)。除另有说明，在整个细胞培养实验中都 使用该培养基。

胶原酶过夜处理后，将得到的消化液倾倒通过70μm尼龙细胞 渗滤器，将滤液转移至离心管中，用等体积的PBS和培养基洗涤。 以1000rpm转速离心10分钟。弃去培养基，将沉淀用培养基洗涤， 然后以1000rpm速度离心5分钟。将该细胞沉淀再悬浮于适量体积(最 少5mL)的培养基中，取一小等份试样进行细胞计数。

以1×105/孔的密度，将该软骨细胞接种于24孔培养板的孔中。 所用BMP-2(由R&D systems提供)的浓度在50ng/mL-1000ng/mL之 间。尽管两种因子的比率不同，Follistatin(同样由R&D systems提供) 的应用浓度相似。将浓度为50ng/mL的抗坏血酸加入到培养基中。 设定适当的对照组，即单用BMP、单用Follistatin或不用生长因子处 理。在37℃、5％CO2下，将细胞培养4天至一个月。每2-3天补充 适量培养基供给细胞。培养结束时，通过生化分析法分析该样本：

生化分析：在供给细胞或培养结束时，保留培养基用于GAG分 析。将该细胞单层进行木瓜蛋白酶消化。将1.42g磷酸氢二钠、0.0788g 盐酸半胱氨酸和0.1861g乙二胺四乙酸(EDTA)混合，制备木瓜蛋白 酶缓冲液。加入90mL UHQ水，搅拌至溶解，调节pH至6.5。将0.0264g 木瓜蛋白酶溶解于25ml木瓜蛋白酶缓冲液中，制得木瓜蛋白酶溶液。 向每个孔中加入0.5mL该溶液，将滴定板盖子置于每个培养板上。 在杂交烘箱中于60℃，将培养板孵育过夜。

GAG试验：然后对细胞消化液进行GAG测定。将16mg 1，9-二 甲基亚甲基蓝、2g甲酸钠、5mL 100％乙醇和2mL甲酸混合，溶解 于UHQ水中，然后调至终体积为1000mL，制得1，9-二甲基亚甲基 蓝(DMB)溶液。

制备1mg/ml软骨素-4-硫酸酯(硫酸软骨素A，牛气管)的UHQ 水的溶液的储备液，用空白木瓜蛋白酶溶液1∶10稀释至100μg/ml。 制备浓度范围在0-75μg/ml之间的一套标准液。

将20μL标准液或样品液置于96孔培养板的各孔中。加入200 μl DMB溶液，立即在平板读数仪上，在双波长540nm(测量波长)和 595nm(参比波长)下，读取该培养板。

同样对培养基样本进行GAG测定，但用10％DMEM而不是用 空白木瓜蛋白酶制备标准液。

DNA试验：还对细胞消化液进行Hoechst DNA测试。将1.211g Tris、3.802g EDTA和5.844g NaCl加入到800ml UHQ级水中，然后 搅拌至溶解，制得Hoechst稀释缓冲液。调节pH至7.0，加入UHQ 级水至终体积1000ml。将1mg/mL Hoechst储备液用稀释缓冲液按1∶ 2000稀释。用1mg/mL鲑睾丸DNA储备液制备DNA标准液，将其 稀释至标准物浓度为0-100μg/ml的范围。

将75μl标准液或细胞消化液置于比色杯(4面清晰)中。加入1.5ml Hoechst溶液，然后再加1mL稀释缓冲液。将样品混合，培养约5分 钟，然后用荧光光度计在355nm激发波长和460nm发射波长下测定。

胶原蛋白试验：采用羟脯氨酸试验测定样品中胶原蛋白的总量。 胶原蛋白由14.3％的羟脯氨酸组成，因此可通过计算存在的羟脯氨酸 的量而计算出胶原蛋白的总量。这些实验的目的就是在样品间进行 直接的比较，因而不必要将羟脯氨酸的量转变成总胶原蛋白的量。 将50g柠檬酸和120g乙酸钠混合，然后溶于650ml UHQ水中，制 得羟脯氨酸试验用储备液。将34g氢氧化钠溶于250ml UHQ水中， 制得第二种溶液，然后将该溶液加入初始溶液中。加入12ml冰醋酸， 用UHQ水补充至终体积1000ml。加入10滴甲苯。将150ml异丙醇 加入到500ml羟脯氨酸储备液中，制得羟脯氨酸试验用工作溶液。 将该溶液混匀，用盐酸调至pH6.0，然后用UHQ水补充至终体积 750ml。

将20ml羟脯氨酸工作溶液加入到2.5ml异丙醇和0.3525g氯胺 T中，制得氯胺T溶液。将该混合液搅拌至全部固体溶入溶液，室 温下保存于玻璃容器内。将3.75g p-DAB加入到15ml异丙醇和6.5ml 高氯酸中，制得对二甲氨基苯甲醛(p-DAB)溶液。

如下进行本试验。将250μl木瓜蛋白酶消化液加入到装有250 μl浓盐酸的Pyrex(Corning)带磨口盖的玻璃管中，置加热板上在120 ℃下温育过夜。次日，将内容物转移至小玻璃瓶中，在90℃下开盖 温育至干燥。将样品冷却至室温，将残留物溶解于1mL 0.25M磷酸 钠缓冲液中。水解的木瓜蛋白酶溶液(HPS)提供代表性的空白对照， 并为样本和标准液提供稀释剂。

用1mg/ml羟脯氨酸储备液制备0-30μg/mL浓度范围的标准液。 将50μl标准液或样品液加入到96孔培养板的各孔中。加入50μl氯 胺T溶液，将培养板在室温下培养20分钟。加入50μl p-DAB溶液， 60℃下培养30分钟。将板冷却，然后用平板计数仪在单波长540nm 下读数。

结果：表2.2给出这些结果的原始数据。

图2.2a、2.2b和2.2c分别表示GAG产生、胶原蛋白产生和增殖。

这些结果表明Follistatin与BMP-2联合能刺激增殖作用。细胞 数量的增加与GAG和胶原蛋白产物(两者都是软骨产生的标志)的增 长一致。在这些实验中，在Follistatin存在下，每μg DNA表达的细 胞外基质组分没有增加。这表明在某些情况下胶原蛋白和GAG的增 长是由于产生这些分子的细胞数量的增加。这些结果特别有意义， 原因是增殖的增长通常与分化的减少相关联，即GAG和胶原蛋白的 产生。Follistatin-刺激增殖不会导致分化的减少，这表明Follistatin是 刺激软骨修复的适宜分子。

实施例2.3：抗坏血酸不存在时对单层软骨细胞的影响

第二实验重复上述工作，但研究的是无抗坏血酸下的影响。在 该实验中每个细胞的GAG产物增加。在Follistatin存在下，并没增 强增殖作用，这表明在抗坏血酸不存在时，Follistatin只刺激分化作 用。本实验中也包括单一使用Follistatin。由图Fig.2.3a中可以看出 Follistatin本身的刺激作用不在对照水平之上，因此它是BMP-2和 Follistatin联合造成的影响。与BMP本身相比，BMP+Follistatin样品 中每μgDNA的GAG产物在统计学上明显增加(P＝0.02)。很显然无 抗坏血酸盐就不会产生胶原蛋白，因此没有可测量的数据。这些实 验的数据都包含在表2.3中，图为图2.3a。

图2.3b显示了Follistatin对细胞形态学的影响。用 Follistatin+BMP-2处理这些细胞具有很明显的圆形形态，表明它们保 留了软骨细胞的表型，这种表型在其它细胞中未见到。因此用 Follistatin+BMP-2处理的细胞保留了软骨型细胞的特征。

实施例2.4：Follistatin和BMP-7(OP-1)的影响

重复实施例2.2，但用生长因子BMP-7或生骨蛋白-1代替BMP- 2。所述生长因子由R&D systems提供，所用浓度同BMP-2。实验结 果包含在表2.4中。结果以图示方式表达在图2.4中。与BMP一样， 在Follistatin存在下，OP-1对软骨细胞产生的GAG具有增强作用。 此效果显著(p＝0.093)。

实施例2.5：Follistatin对骨髓基质细胞的影响

使用骨髓基质细胞(BMSCs)重复实施例2.2。从新处死的绵羊胫 骨中分离出这些细胞。剥离去骨上的肉，用无菌钢锯锯开骨头。将 骨髓用无菌刮刀从骨腔中挖出，转移至falcon管中。将培养基加入 到该管中，以1000rpm转速离心10分钟。弃去堆积在基质表面的所 有脂肪层。将细胞再悬浮，再离心。再次弃去脂肪，将细胞再悬浮。 进行细胞计数，然后以每175cm2 2×106的密度，将细胞转移至组织 培养瓶中。使BMSCs粘附2日。血细胞也存在于骨髓中，但不粘附 在组织培养塑料上，因此可以从BMSCs中分离出来。待细胞一融合， 立即将培养瓶表面的细胞胰蛋白酶化，计数，然后以5×104的密度置 于24孔培养板的孔中。按软骨细胞所述处理，然后以同样的方式进 行分析。

无BMP存在时，BMSCs不表达任何胶原蛋白或GAG。BMP存 在时，生成的水平相对较低。带有Follistatin时，能增加所述表达， 再次表明Follistatin可以提高BMP活性，并能刺激软骨形成。

实施例2.6：单层细胞的免疫组织化学

为确定软骨细胞在培养过程中是否保留其分化表型，通过免疫 组织化学法测定II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白I的存在。

按实施例1所述分离软骨细胞，然后将其培养于12孔玻璃多玻 片上。按已述的相同方法处理生长因子。一周培养期过后，将玻片 在1∶1的甲醇∶丙酮混合液中固定，空气干燥。

采用间接链霉抗生物素ABC免疫过氧化物酶方法(Dako，Ely，UK) 进行免疫组织化学。整个实验都使用Tris缓冲盐水(TBS)作为稀释剂 和洗涤缓冲液(0.15M NaCl，0.05M Tris-(羟甲基)氨基甲烷，pH7.6，在 DDW中)，所有培养均在室温下进行。

通过用10％兔血清阻断中断非特异性背景的染色，然后通过用 抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(Vector Labs)处理切片，封闭内源性 抗生物素蛋白结合部位。接着将切片在第一抗体中培养1小时，生 物素化的兔抗-lg抗体(F(ab’)2片段)培养30分钟，再在链霉抗生物素 /HRP ABC复合物(Vectastain elite ABC试剂盒，Vector Labs)中培养30 分钟，同时在每个步骤之间都进行冲洗。通过经H2O2催化3，3’-二氨 基联苯胺底物(DAB)反应，显现结合的抗体。用苏木素将切片反染色， 然后脱水，清理，封固。从该标记流程中省略第一抗体，将此作为 阴性对照。在BMP-2和Follistatin处理的样本中，对细胞II和聚集 蛋白聚糖的染色增加。

实施例2.7：沉淀培养物

采用软骨细胞和BMSCs，在包含下列组分的培养基中制备沉淀 培养物：DMEM(4.5g/l葡萄糖)+丙酮酸盐、ITS+预混合液(1ml/100ml 培养基)、抗坏血酸盐-2-磷酸盐(100μM)、地塞米松(10-7M)、HEPES(20 μl/ml)。还将浓度范围为50-1000ng/ml的BMP-2和相同浓度范围的 Follistatin也补充到该培养基中。还建立单独含有BMP-2、单独含有 Follistatin和不含任何生长因子的对照组。将0.5ml培养基中含500,000 个细胞(软骨细胞和BMSCs)的各等分试样地加入2ml无菌圆底微量 离心管中，以2500rpm的速度离心10分钟。使细胞在管底形成沉淀。 在37℃下、5％CO2中，将该沉淀培养物培养两周。在此期间，每3- 4日更换一次培养基。

两周培养期结束后，收集所述沉淀培养物，分析。通过全部生 物化学分析或免疫组织化学和组织学染色进行分析。

生物化学分析：按实施例所述对这些样本进行生物化学分析。 在用木瓜蛋白酶消化前，先将样本进行冷冻干燥。将冻结的样本置 于排气管中，冷冻干燥过夜。然后在密封的eppendorf管中进行消化 过夜。随后对消化液进行生物化学分析。

免疫组织化学：将沉淀培养物在10％中性福尔马林缓冲液中固 定，然后用石蜡包封。在进行免疫标记前，将组织切片(5μm)脱蜡， 然后通过不同分级乙醇至水再水化。按实施例1所述进行免疫组织 学染色。

组织学分析：按用于免疫组织化学分析处理的切片还进行传统 的组织学染色。使用爱茜蓝染色法进行粘多糖(GAG)组织化学染色。 将切片在3％乙酸中漂洗，然后置于60℃下的爱茜蓝溶液(1％爱茜蓝 (w/v)的3％冰醋酸溶液)中10分钟。将玻片用0.5％中性红水溶液复染 色，用无水乙醇漂洗，在二甲苯中清理，然后固封。用该技术将GAGs 染成蓝色。同样进行H&E染色，以检查组织的结构。用Safarin O染 色法识别样本中的软骨。

结果表明：在Follistatin+BMP-2处理的样本中，软骨产生增加。

实施例2.8：三维毡圈培养物

为了测定在三维基质中Follistatin对细胞的影响，建立在多羟基 乙酸(PGA)毡圈上的培养物。PGA毡圈由S&N制造。用环氧乙烷处 理灭菌。将细胞(软骨细胞和BMSCs)接种于已用FCS预湿润的24孔 培养板中的毡圈上。向每个支架上接种100μL标准10％FCS DMEM 和抗坏血酸盐中的一百万个细胞。一小时后，将支架浸入含有上述 生长因子混合物的培养基中。在37℃下、5％CO2中，在旋转震荡器 上，将所述支架培养两周，每3-4天补充更换一次培养基。

培养期结束后，收集样本，然后按已述的方法进行生物化学、 免疫组织化学和组织学分析。

结果表明：在Follistatin+BMP处理的样本中，软骨产生增加。

实施例2.9：体外测试GDF-5

用GDF-5(CDMP-1)重复所有已述的试验。该生长因子由R&D systems提供，所用浓度同BMP-2中所述。在所有的试验中，用GDF-5 重复用BMP-2检测的趋向。

结果表明：在Follistatin+BMP处理的样本中，软骨产生增加。

实施例2.10：兔体内研究

对30只新西兰白兔进行动物研究。所有的兔子均为雄性，约8 个月大小，即它们骨骼已发育成熟。

在双后关节处大腿骨的滑车形凹槽上钻直径为3mm深3mm的 双侧全厚度缺损孔。缺损处于与关节成90o处，然后置于凹槽中心处。

将动物分为4个治疗组：

·缺损处空置

·仅用支架

·30μgFollistatin

·30μgFollistatin+10μg BMP-2

所述支架由直径为3.5mm深3mm的PGA毡圈组成，因而能被 挤压入所制造的缺损孔洞内。将BMP-2和Follistatin的溶液或 Follistatin本身的PBS溶液注射在毡圈上。每毡圈注射总量为30μl。 对于仅放置了支架的缺损孔洞内，注射30μl的PBS。

依照下表分配总共三十只动物的缺损孔洞，然后在第3和6个 月两个时间点进行评估。 缺损孔洞1 缺损孔洞2 三个月 六个月 空支架 未经处理的缺损 N＝2  N＝3 空支架 活性支架1 N＝2  N＝3 空支架 活性支架2 N＝2  N＝3 活性支架1 未经处理的缺损 N＝2  N＝3 活性支架1 活性支架2 N＝2  N＝3 活性支架2 未经处理的缺损 N＝2  N＝3

分析

在研究过程的结束时，将动物麻醉，然后使用致死量麻醉剂处 死动物。切除动物的后肢，识别该经处理区域。对缺损孔洞部位进 行宏观检查，记录观察值并拍下照片。完整地除去缺损孔洞周围的 软骨，立即转移进行组织固定。按体外样本中所述方法，对样本进 行组织学和免疫组织化学分析。

用结构紊乱的纤维组织填充未经处理的缺损孔洞。免疫组织化 学表明该修复组织主要由I型胶原蛋白组成。仅包含支架的缺损孔洞 显示出较好的组织结构，但仍含较高的I型胶原蛋白，并且在植入组 织和天然的组织之间整合性较差。用Follistatin和Follistatin+BMP-2 处理的缺陷孔洞在所有的时间点上都具有高水平的II型胶原蛋白和 GAGs。在缺陷孔洞边缘和软骨下骨存在组织整合的迹象，并且该组 织在本质上是高度有序结构。因此可以得出结论：将Follistatin加入 到愈合关节中，可通过增强BMP活性致使软骨修复。

                                                  表1.1     ALP     nmol/ml     (a)     DNA     浓度pg/ml     (b)     细胞数     (b/7.7)     (c)     ALP nmol/ml     (a/c)     (d) 每个细胞平均ALP   pmol/ml(平均d) Follistatin     -38.5093     128940     16745.45     -0.0023     -31.677     147080     19101.3     -0.00166     -29.8137     188780     24516.88     -0.00122     0 Follistatin+BMP-2     241.6149     127620     16574.03     0.014578     270.4969     115135     14952.6     0.01809     245.9327     223330     29003.9     0.00848     13.7 TCP     -44.0994     116910     15183.12     -0.0029     -40.9938     167840     21797.4     -0.00188     -40.6832     205720     26716.88     -0.00152     0 BMP-2     19.87578     87170     11320.78     0.001756     29.19255     103860     13488.31     0.002164     37.57764     193300     25103.9     0.001497     1.8 BSA     -38.5093     102430     13302.6     -0.00289     -36.9565     139390     18102.6     -0.00204     -33.2298     171140     22225.97     -0.0015     0 BSA+BMP-2     83.22981     120740     15680.52     0.005308     77.63975     102650     13331.17     0.005824     59.93789     220560     28644.16     0.002092     4.4

                表1，2a-Follistatin对C2C12细胞BMP-2的影响(溶液实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml)     DNA浓度μg/ml     pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml) SD FS+BMP-2s     209     3.250307038     64.30161752     214.6666667     3.422720831     62.71813485     215.5     3.338504622     64.54985821     215.6666667     3.148748229     68.49282668     65.01560931  2.456022384 FSs     0     1.977414131     0     0     2.25907956     0     0     2.196929617     0     0     2.049281328     0     0  0 BMP-2s     28.5     1.10534449     25.78381695     35     1.107011269     31.61666098     16.16666667     1.301140428     12.42499758     19.83333333     1.170558067     16.94348524     21.69224019  8.634573673 TCPs     0     1.497624671     0     0     1.599183481     0     0     1.455853971     0     0     1.473601458     0     0  0

                表1，2b-Follistatin对C2C12细胞BMP-2的影响(溶液实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml)     DNA浓度μg/ml     pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)  SD FS+BMP     179.5     2.307530873     77.78877507     217.6666667     2.633666239     82.64777952     212.5     2.663425332     79.78447806     190.6666667     2.66113098     71.64873434     77.967   4.6607 FS     0     1.697165801     0     0     1.664909913     0     0     1.364187867     0     0     1.565645455     0     0   0 BMP-2     14.33333333     0.966630677     14.82813827     21.16666667     1.109825224     19.07207207     28.16666667     1.100674809     25.59036186     20.83333333     1.08431743     19.21331591     19.676   4.4370 TCP     0     0.974829611     0     0     1.076584115     0     0     1.141311829     0     0     1.060233484     0     0   0

                     表1，2c-Follistatin对C2C12细胞BMP-5的影响(溶液实验) 处理 释放的pNP(ALP)(nmol/ml) DNA浓度μg/ml   pNP/DNA  每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)     SD FS+BMP-5s     43.297     7.18   6.03022284     49.122     7.6   6.46342105     53.261     7.35   7.24639456     37.719     7.24   5.20980663     6.237     0.8501 FSs     0     5.91   0     0     5.38   0     0     4.42   0     0     4.89   0     0     0 BMP-5s     19.494     6.21   3.13913043     19.478     5.6   3.47821429     19.772     6.24   3.16858974     19.052     6.11   3.11816694     3.226     0.1694 TCPs     0     6.27   0     0     5.84   0     0     4.9   0     0     5.03   0     0     0

                    表1，2d-Follistatin对C2C12细胞BMP-6活性的影响(溶液实验) 处理 释放的pNP(ALP)(nmol/ml)     DNA浓度μg/ml   pNP/DNA   每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)     SD FS+BMP-6s     250.45     4.306332046   58.15854358     211.34     5.282303732   40.00905868     203.03     5.533758044   36.68935259     202.11     4.820900901   41.92369936     44.195     9.5568 FSs     0.12     5.817696268   0.020626721     0.34     6.096396396   0.055770652     0.33     6.327631918   0.052152212     0.68     5.053539254   0.134559161     0.066     0.0485 BMP-6s     155.24     5.475662806   28.35090573     159.03     6.15951094   25.81860826     157.95     5.658893179   27.91181862     163.04     5.022934363   32.45911418     28.635     2.7785 TCPs     0.12     5.849433719   0     -0.07     6.708764479   0     -0.29     6.599227799   0     -0.15     4.672754183   0     0     0

                 表1，2e-Follistatin对C2C12细胞BMP-7活性的影响(溶液实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml)    DNA浓度μg/ml     pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml) SD FS+BMP-7s     85.05     4.284749035     19.8494706     95.65     3.777631918     25.32009526     81.74     4.613166023     17.7188507     80.96     6.076229086     13.32405327     19.053     4.9837 FSs     4.55     5.817696268     0.782096519     5.19     6.096396396     0.851322595     5.08     6.327631918     0.802827988     5.94     5.053539254     1.175413844     0.903     0.1840 BMP-7s     30.27     5.66978121     5.33883035     37.04     5.07099099     7.304292211     41.95     4.164388674     10.07350737     52.14     3.362458172     15.50651259     7.572     2.3787 TCPs     4.7     5.849433719     0.803496582     4.52     6.708764479     0.673745518     3.46     6.599227799     0.524303768     4.11     4.672754183     0.879566919     0.720     0.1559

                   表1，3a-Follistatin对C2C12细胞BMP-2的影响(结合实验) 处理 释放的pNP(ALP)(nmol/ml)   DNA浓度μg/ml     pNP/DNA   每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)     SD FS+BMP-2     251.84     6.52     38.62576687     284.41     6.37     44.64835165     236.17     6.39     36.95931142     335.16     5.68     59.00704225     44.810     10.0243 FS     0     5.88     0     0     5.56     0     0     5.68     0     0     5.93     0     0     0 BMP-2     36.42     8.65     4.210404624     31.4     8.28     3.792270531     30.5     8.3     3.674698795     40.5     7.98     5.07518797     4.188     0.6345 TCP     0     6.83     0     0     6.9     0     0     6.58     0     0     5.55     0     0     0

                    表1，3b-Follistatin对C2C12细胞BMP-6活性的影响(结合实验) 处理 释放的pNP(ALP)(nmol/ml)     DNA浓度μg/ml   pNP/DNA   每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)    SD FS+BMP-6b     101.64     4.377477477   23.21885162     87.31     5.005045045   17.44439844     94.68     5.020913771   18.85712528     108.71     5.012277992   21.68874116     20.302     2.6258 FSb     25.81     4.895032175   5.272692615     21.82     4.735508366   4.607741834     19.18     5.078288288   3.776863169     19.69     5.66047619   3.478505931     4.284     0.8141 BMP-6b     34.37     5.290888031   6.496073967     36.06     6.051544402   5.958809455     34.12     5.628095238   6.062441831     34.34     5.429009009   6.325279612     6.211     0.2449 TCPb     15.76     5.573204633   2.827816496     15.28     5.063153153   3.017882244     11.66     5.625855856   2.072573542     13.14     5.944761905   2.210349247     2.532     0.4612

                            表1，3c-Follistatin对C2C12细胞BMP-6活性的影响(结合实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml) DNA浓度μg/ml     pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)   SD FS+BMP-6b     25.76     2.37     10.8692     33.16     1.28     25.90625     39.73     1.82     21.82967     48.9     1.63     30     22.151     8.2278 FSb     0     1.9     0     0     1.81     0     0     1.82     0     0     1.27     0     0     0 BMP-6b     0.37     1.66     0.222892     -0.28     1.11     -0.25225     0     1.01     0     0.05     0.92     0.054348     0.006     0.1967 TCPb     0     1.6     0     0     1.88     0     0     1.85     0     0     1.66     0     0     0

                     表1，3d-Follistatin对C2C12细胞BMP-7活性的影响(结合实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml)     DNA浓度μg/ml    pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml) SD FS+BMP-7b     34.17     4.313101673   7.922372944     39.15     4.124388674   9.492315854     30.07     5.063552124   5.938518903     32.08     4.12018018   7.786067258     7.785     1.4541 FSb     25.81     4.895032175   5.272692615     21.82     4.735508366   4.607741834     19.18     5.078288288   3.776863169     19.69     5.66047619   3.478505931     4.284     0.8141 BMP-7b     16.7     4.28993585   3.892832285     18.44     3.36957529   5.472499771     15.67     4.889485199   3.20483637     18.25     3.569189189   5.113206118     4.421     1.0556 TCPb     15.76     5.573204633   2.827816496     15.28     5.063153153   3.017882244     11.66     5.825855856   2.072573542     13.14     5.944761905   2.210349247     2.532     0.4612

                          表1，4-Follistatin对C2C12细胞BMP-4的影响(溶液实验) 处理    释放的pNP(ALP)nmol/ml  DNA浓度μg/ml   pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)    SD FS+BMP-4s     82     4.7613   17.22219     102.1666667     4.8615   21.01546     85.16666677     4.2813   19.89271     89.83333333     5.0527   17.77927     18.977     1.7802 FSs     -2.666666667     6.3443   -0.42032     0.666666667     8.0583   0.08273     -4.833333333     7.0452   -0.88605     -4.833333333     6.8855   -0.72513     0     0 BMP-4s     24.66666667     4.6547   5.299303     25.33333333     5.0515   5.015012     41.16666667     4.6542   8.845058     20.33333333     4.669   4.354965     5.879     2.0168 TCPs     -2.166666667     5.4711   -0.39602     -4.666666667     5.6445   -0.82676     -5.166666667     5.7691   -0.89558     -4     5.5138   -0.72545     0     0

                          表1，5-Follistatin对C2C12细胞BMP-4的影响(结合实验) 处理  释放的pNP(ALP)nmol/ml   DNA浓度μg/ml   pMP/DNA  每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)     SD FS+BMP-4b     184.1666667     3.79   48.59279     178.1666667     3.5472   50.22741     196.8333333     3.4499   57.05479     105.5     3.5566   29.66316     46.385     11.7346 FSb     -2.666666667     5.5329   -0.48197     -3.833333333     6.0595   -0.63262     0.333333333     5.6301   0.059206     -4.333333333     5.6836   -0.76243     0     0 BMP-4b     53.16666667     3.8842   13.68793     71.16666667     4.1643   17.08971     69     3.7796   18.2559     37.33333333     4.2224   8.841733     14.469     4.2224 TCPb     -4.5     4.791   -0.93926     -4.666666667     5.7638   -0.80965     -4.5     4.5645   -0.98587     -4.5     4.6975   -0.95796     0     0

                         表1，6-Follistatin对MC3T3E1细胞BMP-2活性的影响(溶液实验) 处理   释放的pNP(nmol/ml) DNA浓度μg/ml     pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)      SD FS+BMP-2s     130.521     4.0698     32.07062     131.678     3.8437     34.25814     148.667     3.8895     38.22265     130.455     4.0879     31.91247     34.116     2.9396 FSs     0     3.2027     0     0     2.6139     0     0     2.5035     0     0     2.8822     0     0     0 BMP-2s     0     1.2724     0     0     0.5672     0     55.556     1.7679     31.42485     63.264     1.592     39.73869     17.791     20.8218 TCPs     0     3.6327     0     0     3.2233     0     0     3.2787     0     0     3.6762     0     0     0

                      表1，7-Follistatin对MC3T3E1细胞BMP-2活性的影响(结合实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml)     DNA浓度μg/ml   pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)     SD FS+BMP-2b     66.97     4.503258487   14.87146     63.09     3.035459527   20.78433     54.45     4.914297529   11.07992     15.579     4.8907 FSb     0     2.939935904   0     0     2.541300527   0     0     3.800268789   0     0     0 BMP-2b     36.15     4.178573969   8.65542     33.32     3.93156208   8.475003     32.47     5.230641993   6.207651     7.779     1.3641 TCPb     0     3.482083476   0     0     3.448588179   0     0     4.643233743   0     0     0

       表1.8-Follistatin288对C2C12细胞BMP-2活性的影响(溶液实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml) 平均pNP(nmol/ml)/孔   SD FS288+BMP-2s     83     148.8333333     199.3333333     162.8333333     148.5     48.5793 FS288s     -3.5     -3     -3.5     -3.333333333     0     0 BMP-2s     5.666666667     13.5     13.33333333     0.5     8.25     6.3282 TCPs     -3.833333333     -3.66666667     -3.666666667     -3.333333333     0     0

                表1，9-Follistatin288对C2C12细胞BMP-2活性的影响(结合实验) 处理 释放的pNP(nmol/ml) DNA浓度μg/ml  pNP/DNA 每μg DNA的平均pNP(nmol/ml)     SD FS288+BMP-2b     31.25     4.232  7.384216     15.5     3.8651  4.010246     21.75     4.2676  5.096541     26.5     3.9742  6.668009     5.790     1.5232 FS288b     1     4.2372  0.236005     1     4.8237  0.20731     1.75     4.5518  0.384463     1.75     4.3356  0.403835     0.308     0.1005 BMP-2b     5.5     5.0876  1.08106     6.75     5.443  1.240125     4.25     5.1542  0.82457     5.75     4.6221  1.244023     1.097     0.1971 TCPb     0.75     5.1705  0.145054     1     5.817  0.17191     0.75     5.5955  0.134036     0.5     5.416  0.092319     0.136     0.03311 Young    孔数   消化液体积   DNA/ml    总DNA  GAG med 1/m GAG/ml med 2/    GAG med 1    GAG med 2    培养基总GAG     GAG/ml(消化液)    消化液总GAG   总GAG   胶原蛋白/ml   总胶原蛋白 对照     1     0.5   12.899     6.4495     54.9     52.75     9.62     26.375     35.995     19.24     9.62   45.615     2.55     1.275     2     0.5   11.938     5.969     44.2     41.31     9.225     20.655     29.88     18.45     9.225   39.105     2.34     1.17     3     0.5   12.768     6.384     45.6     41.82     9.465     20.91     30.375     18.93     9.465   39.84     2.55     1.275     4     0.5   12.784     6.392     42.32     39.82     9.45     19.91     29.36     18.9     9.45   36.81     2.65     1.325     5     0.5   12.735     6.3675     43.62     47.57     9.73     23.785     33.515     19.46     9.73   43.245     2.51     1.255     6.31     0.19   41.32   2.98     1.26     0.06 BMP-2 500mg     6     0.5   22.527     11.2635     62.7     95.43     41.35     47.715     89.065     64.59     32.295   121.36     6.49     3.245     7     0.5   22.328     11.164     71.47     71.63     35.735     35.815     71.55     56.34     28.17   99.72     6.93     2.965     8     0.5   23.807     11.9035     83.74     85.56     41.87     42.78     84.65     66.79     33.396   118.045     6.91     3.455     9     0.5   21.575     10.7675     72.23     73.7     36.115     36.65     72.965     56.37     28.185   101.15     5.88     2.94     10     0.5   22.589     11.2945     71.77     72.01     35.885     38.005     71.89     61.42     30.71   102.6     6.14     3.07     11.28   108.56     3.14     0.40   10.28     0.22 BMP∶FS 100∶300   11     0.5   15.331     7.6655     64.64     65.08     32.32     32.54     64.86     23.7     11.65   76.71     2.95     1.475     12     0.5   14.929     7.4645     57.69     51.64     28.845     25.82     54.665     24.16     12.08   66.745     3.24     1.62     13     0.5   15.675     7.8375     66.81     58.47     33.405     29.235     62.64     22.55     11.275   73.915     2.97     1.485     14     0.5   17.164     8.852     61.93     46.85     30.965     23.425     54.39     25.2     12.6   66.99     3.1     1.55     15     0.5   14.273     7.1365     58.67     46.05     29.335     24.025     53.36     21.61     10.805   64.165     3     1.5     7.74   69.71     1.53     0.54   5.93     0.08 BMP∶FS 500∶1500  16     0.5   26.996     13.498     95.38     117.95     47.69     58.975     106.665     62.39     31.195   137.66     7.34     3.67     17     0.5   26.609     13.3045     92.79     107.45     46.395     53.725     100.12     61.04     31.345   131.465     6.82     3.41     18     0.5   28.309     14.1545     93.86     105.63     46.93     52.815     99.745     62.69     30.875   130.62     7.43     3.715     19     0.5   29.078     14.539     93.53     100.9     46.795     50.45     97.245     61.75     26.365   123.61     7.61     3.805     20     0.5   26.682     13.341     88.79     92.92     44.395     46.46     90.855     52.73     26.365   117.22     6.97     3.465     13.77   128.16     3.62     0.55   7.93     0.15

表2.2

   孔数 消化液体积     DNA/ml   总DNA   GAG/ml(培养基) 培养基体积 培养基总GAG  GAG/ml(消化液) 消化液总GAG     总GAG    GAG/ug DNA 对照     1     0.5     8.19     4.095     17.1     0.5     8.55     8.65     4.325     12.875     3.14     2     0.5     9.27     4.635     20.1     0.5     10.05     9.12     4.56     14.61     3.15     3     0.5     9.27     4.635     17.68     0.5     8.84     7.24     3.82     12.46     2.69     4     0.5     9.2     4.6     16.8     0.5     8.4     7.88     3.94     12.34     2.68     4.49     8.9     8.22     4.11     13.07     2.02     0.26     0.75     0.83     0.42     1.05     0.27 BMP-2     5     0.5     9.28     4.64     28.79     0.5     14.395     13.36     6.68     21.075     4.54     6     0.5     9.05     4.525     28.93     0.5     14.465     12.41     6.205     20.67     4.57     7     0.5     10.15     5.075     29.91     0.5     14.955     13.58     6.79     21.745     4.28     8     0.5     9.78     4.89     26.44     0.5     13.22     12.71     6.355     19.575     4.00     4.78     14.25     13.02     6.51     20.77     4.35     0.25     0.74     0.55     0.27     0.91     0.26 FS     9     0.5     8.8     4.4     17.55     0.5     8.775     7.21     3.605     12.38     2.81     10     0.5     8.82     4.41     18.25     0.5     9.125     6.93     3.465     12.59     2.85     11     12     0.5     0.5     8.95     8.81     4.475     4.405     17.52     17.95     0.5     0.5     8.76     8.975     6.65     7.7     3.325     3.85     12.085     12.825     2.70     2.91     4.42     8.91     7.12     3.56     12.47     2.82     0.04     0.17     0.45     0.22     0.31     0.09 BMP-2+FS     13     0.5     6.93     3.465     25.06     0.5     12.53     10.56     5.28     17.81     5.14     14     0.5     8.8     4.4     25.98     0.5     12.99     13.94     6.97     19.96     4.54     15     0.5     7.69     3.845     26.1     0.5     13.05     12.63     6.315     19.365     5.04     16     0.5     7.53     3.765     23.4     0.5     11.7     14.18     7.09     18.79     4.99     3.87     12.57     12.83     6.41     19.98     4.93     0.39     0.62     1.66     0.83     0.92     0.27

表2.3 孔数 消化液体积    DNA/ml     总DNA  GAG/ml(培养基) 培养基体积   培养基总GAG  GAG/ml(消化液)     消化液总GAG     总GAG     GAG/ug DNA 对照     1     0.5     0.88     0.44     35.23     1     35.23     16.57     8.285     43.515     98.90     2     0.5     0.99     0.495     36.98     1     36.98     16.75     8.375     45.355     91.63     3     0.5     1.07     0.535     35.85     1     35.85     15.87     7.935     43.785     81.84     4     0.5     0.99     0.495     40.63     1     40.63     17.12     8.56     49.19     99.37     92.93     8.20 OP-1     13     0.5     1.31     0.655     66.24     1     66.24     36.85     19.425     85.665     130.79     14     0.5     1.19     0.595     66.48     1     66.48     39.35     19.675     86.155     144.80     15     0.5     1.15     0.575     64.75     1     64.75     38.56     19.28     84.03     146.14     16     0.6     1.29     0.645     54.1     1     54.1     28.35     14.175     68.275     105.85     131.89     18.70 OP-1+FS     17     0.5     1.07     0.535     66.93     1     66.93     36.09     18.04     84.97     158.82     18     0.5     1.06     0.53     61.74     1     61.74     34.56     17.28     79.02     149.09     19     0.5     1.05     0.525     61.61     1     61.61     33     16.5     78.11     148.78     20     0.5     1.14     0.57     63.36     1     63.36     31.24     15.62     78.98     138.56     148.31     8.27

表2.4