评估再生软骨的方法
阅读：314发布：2020-05-12
专利汇可以提供评估再生软骨的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且有关实施方式的评估再生软骨的方法，包含将含有 耳 廓软骨细胞的细胞群于培养基存在下进行放置，与之后自所述培养基中采取至少一部分的液体成分，及测定已采取的所述液体成分中所含的GFAP含量，以及根据所述GFAP含量来判断自所述细胞群获得或可得的再生软骨是否适合移植。，下面是评估再生软骨的方法专利的具体信息内容。
1.一种评估再生软骨的方法，包含: 将含有耳廓软骨细胞的细胞群于培养基存在下进行放置，与之后自所述培养基中采取至少一部分的液体成分，及测定采取的所述液体成分中所含的神经胶质微纤维酸性蛋白质含量，以及根据所述神经胶质微纤维酸性蛋白质含量来判断自所述细胞群获得或可得的再生软骨是否适合移植。
2.根据权利要求1所述的评估再生软骨的方法，其中所述判断是当所述神经胶质微纤维酸性蛋白质含量于每ImL所述液体成分为0.05ng以上时，判断为适合移植。
3.根据权利要求1所述的评估再生软骨的方法，其中所述判断是当所述神经胶质微纤维酸性蛋白质含量于每ImL所述液体成分为0.5ng以上时，判断为适合移植。
4.根据权利要求1所述的评估再生软骨的方法，其中所述判断是当所述神经胶质微纤维酸性蛋白质含量于每ImL所述液体成分为5ng以上时，判断为适合移植。
5.—种再生软骨的制造方法，包含: 将含有耳廓软骨细胞的细胞群于培养基存在下进行放置，与之后自所述培养基中采取至少一部分的液体成分，及测定采取的所述液体成分中所含的神经胶质微纤维酸性蛋白质含量，以及根据所述神经胶质微纤维酸性蛋白质含量来判断自所述细胞群可得的再生软骨是否适合移植，及 形成再生软骨。
6.根据权利要求5所述的再生软骨的制造方法，其中形成所述再生软骨是包含使用支架材料使软骨细胞进行立体培养。
7.—种再生软骨，其是如权利要求5或6所述的制造方法制造。
评估再生软骨的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及评估再生软骨的方法。
背景技术
[0002] 对于颅颜面的先天型态形成异常，或切除恶性肿瘤后的颅颜面缺损，至今是采用以自体组织移植的组织修复以及再建。然而，自体组织移植目前仍残存着可采组织面积的限制，以及对采取部位造成侵袭性等课题。其中软骨再生医疗，相对地在临床应用持续进步，目前，世界普及的方法是使用自体软骨细胞的移植术(ACI (autologous chondrocyteimplantation))。ACI原法是于1995年首先由瑞典的研究团队发表报告。ACI原法是对于因运动外伤等造成的关节软骨的局部缺损，将自体培养软骨细胞制成细胞悬浊液投予至缺损部，进而为防止外漏而披覆骨膜贴片(patch)的方法。
[0004] 有关评估经培养的软骨细胞特性，至今已利用例如基因表现以及表面标记(surface marker)。然而,现状是该等方法缺乏定量性,且最终必须牺牲一部分欲获得的细胞群。
[0005] 该等技术的相关技术是例如下术文献所记载的技术。
[0006] 布里特伯格M、林达尔A、尼尔森A、欧尔森C、伊萨克森O、彼得森L，1994，以自体软骨细胞移植进行膝盖的重度软骨缺损的治疗，新英格兰医学杂志)331(14):889-895(Brittberg M,Lindahl A,Nilsson A,Ohlsson C，Isaksson 0,Peterson L.1994.Treatment of deep cartilage defect in the knee with autologous chondrocytestransplantation.N Engl J Med331(14):889-895).[0007] 矢永H、矢永K、今井K、古贺M、副岛C、大森K，2006，用于颅颜或鼻腔的增殖与修复的经培养的自体人类耳廓软骨细胞与自体血清的临床应用，整形和改造外科117(6):2019-2030(Yanaga H, Yanaga K, Imai K, Koga M, Soejima C, Ohmori K.2006.Clinicalapplication of cultured autologous human auricular chondrocytes with autologousserum for craniofacial or nasal augmentation and repair.Plast ReconstrSurgl17(6):2019-2030).发明内容
[0008][发明欲解决的课题]
[0009] 本发明的目的是提供一种无需牺牲再生软骨或成为其材料的软骨细胞的一部分，且定量地评估再生软骨的方法。
[0010][解决课题的手段]
[0011] 根据本发明的一个实施方式，可提供一种评估再生软骨的方法，其是包含将含有耳廓软骨细胞的细胞群于培养基存在下进行放置，其后，自所述培养基中采取至少一部分的液体成分，及测定采取的所述液体成分中所含的GFAP含量，以及根据所述GFAP含量来判断自所述细胞群获得或可得的再生软骨是否适合移植。附图说明
[0012] 图1是表示各种细胞中GFAP基因的表现量图。
[0013] 图2是表示来源相异的人类耳廓软骨细胞中GFAP基因的表现量图。
[0014] 图3是表示使用经培养的人类耳廓软骨细胞，评估由人类耳廓软骨细胞所产生的GAG与GFAP的相关性的结果图。
[0015] 图4是表示使用经培养的人类耳廓软骨细胞，评估由人类耳廓软骨细胞所产生的C0L2与GFAP的相关性的结果图。
[0016] 图5是表示使用藉由培养人类耳廓软骨细胞可得的培养上清液，评估由人类耳廓软骨细胞所产生的GAG与GFAP的相关性的结果图。
[0017] 图6是表示使用藉由培养人类耳廓软骨细胞可得的培养上清液，评估由经培养的人类耳廓软骨细胞所产生的C0L2与GFAP的相关性的结果图。
[0019] 图8是移植以图1所示的经培养的软骨细胞#1后的再生组织的示意图。
[0020] 图9是移植以图7所示的经培养的软骨细胞#2后的再生组织的示意图。
[0021] 图10是移植以图7所示的经培养的软骨细胞#3后的再生组织的示意图。
[0022] 图11是移植以图7所示的经培养的纤维母细胞#1后的再生组织的示意图。
[0023] 图12是移植以图7所示的经培养的纤维母细胞#2后的再生组织的示意图。
[0024] 图13是移植以图7所示的经培养的纤维母细胞#3后的再生组织的示意图。
[0025] 图14表示与一实施方式有关的耳廓软骨再生制品的制造步骤的概略图。
具体实施方式
[0026] 1、概要
[0027] 以往再建软骨的再生医疗是采用注入软骨细胞的方法。
[0028] 然而，由于软骨细胞本身未具有充分的大小以及充分的强度，因此仅以注入软骨细胞，依然存在极高的无法充分达成组织再建目的的可能性。在如此的状况下，本发明团队开发了提供具有充分的大小或强度的如同“植入物”般的再生软骨的方法。于该开发中，首先，将软骨细胞移植入体内时，着眼于必须可保证一定的品质。该品质具体而言是指再生软骨具有软骨特性。此处“软骨特性”的用语是可与“做为软骨的特性”、“软骨的特性”、“作为软骨的性质”、“软骨的性质”等用语互换使用。“软骨特性”是指作为适合移植的软骨的特异的性质。具体而言是可安全地进行移植，且于移植后形成软骨，于体内具有可作为软骨生着的性质。试举一例，“软骨特性”是是指移植后于体内显示有旺盛的软骨再生的性质。另外，“软骨特性”是亦可被理解为移植妥当性。为使再生软骨具有软骨特性，无需掺混异物，例如掺混其他细胞，且无过度增殖的需要。
[0029] 软骨细胞是分泌可左右再生软骨的特性与功能的软骨基质的重要构成要素。例如软骨细胞过度增殖时，排除分化(dedifferentiation)后会减弱软骨特性,进而失去软骨特性。另外，于分离软骨细胞时混入纤维母细胞(fibroblast)，并使纤维母细胞于培养中过度增殖时，可能出现排挤作为目标的软骨细胞此一制造步骤上的风险。而移植藉由纤维母细胞排挤软骨细胞后的培养组织时，会造成纤维母细胞取代软骨细胞而被移植。该等移植组织无法作为软骨而生着。因此，于进行移植前预先判断所制造的再生软骨制品，不仅未含有与被排挤的软骨细胞相等量的其他细胞，且含有充分量的软骨细胞，以及于移植后可不会过度增殖地维持软骨特性是不可或缺的。
[0030] 本发明团队发现一种特异性的标记，可作为显示使用软骨细胞，特别是含耳廓软骨细胞的细胞群后可得或获得的再生软骨是否适合移植的指标。本发明是以该发现为基础。根据该标记，无需牺牲最终欲获得的目标物，且可定量地评估使用所述细胞群可得或获得的再生软骨的软骨特性。
[0031] 2、耳廓软骨细胞上特异性的标记
[0032] 上述软骨细胞，特别为耳廓软骨细胞上特异性的标记是神经胶质微纤维酸性蛋白质(Glial fibrillary acidic protein(GFAP))。
[0033] GFAP—般是具特异性地局部存在于神经系统，例如星状细胞(astrocyte)或许旺氏细胞(Schwann cell)的蛋白质。
[0034] 本发明团队发现GFAP在可利用于软骨再生医疗的细胞源的培养耳廓软骨细胞中具有特异性且大量表现，以及伴随继代培养(subculture)，GFAP基因的表现量及GFAP蛋白质量会缓慢地逐渐减少。
[0035] 藉由定量该GFAP蛋白质量，可检出纤维母细胞等其他细胞的混入，或伴随耳廓软骨细胞过度增殖的软骨特性减弱化等。藉此提供评估再生软骨制品的软骨特性的方法。
[0036] 根据本发明的其中一实施方式，可提供一种评估再生软骨的方法，其是包含将含有耳廓软骨细胞的细胞群于培养基存在下进行放置，其后，自所述培养基中分离至少一部分的液体成分，及测定分离的所述液体成分中所含的GFAP含量，以及根据所述GFAP含量来判断自所述细胞群可得的再生软骨是否适合移植。
[0037] 于该方法中，藉由测定液体成分例如培养上清液中所含的GFAP含量，可得知针对定量的软骨基质的堆积量信息。
[0039] 如后述所示之例，于作为本发明基础的研究中，发现培养上清液中的GFAP含量与GAG及C0L2的堆积量有关此一新颖的实际发现。根据该实际发现，藉由测定液体成分例如培养上清液中的GFAP含量，可评估软骨特性。
[0040] 例如，用于制造再生软骨的人类关节软骨细胞中，可举出作为表现量增强的标记的CD10、CD26、CD44、CD49c、CD81、CD166等，及作为表现量减少的标记的CD94a、CD106等。该等标记是细胞粘着分子，并用作细胞表面标记。细胞表面标记是可藉由流式细胞测量术(flow cytometry)分析,但经各别分析的相异的系统难以定量地比较。另外，由于细胞的粘着状态等可能因培养环境而不断变动，亦难以设定一定的标准。
[0041] 进而，除上述的细胞粘着分子之外，亦正确认丝胺酸蛋白酶抑制剂(Serpin)Al及丝胺酸蛋白酶抑制剂A3、纤维母细胞生长因子-18 (Fibroblast growthfactor-18 (FGF-18))或抑制黑色素瘤活性因子(MIA)等。尤以FGF-18是藉由使平面培养持续重叠，为增加基因表现量的因子，而具有作为表示软骨细胞的基质生产能力指标来使用的可能性。然而，使用该等因子为指标时，为可以基因层级进行评估，而残留定量性的课题。另外，该等因子均为分泌型蛋白质。预期自增殖中的培养软骨细胞所分泌的生理活性物质极为少量，虽然使用培养上清液为检体可测定其中所含的蛋白质量，但难以检出。基于该等理由而采用GFAP作为指标。
[0042] 与耳廓软骨细胞相比，关节软骨细胞的GFAP的表现量较少，因继代培养表现量的变化亦较小。因此，使用耳廓软骨细胞作为再生软骨的供给源。
[0043]自上述理由，使用耳廓软骨细胞作为再生软骨的供给源，可明确得知有利于使用GFAP作为再生软骨的软骨特性指标的一实施方式的评估方法。
[0044] 3、软骨细胞
[0045] 此处所使用的软骨细胞是耳廓软骨细胞。
[0047] 作为软骨细胞的供给源的哺乳动物，是依照作为移植由软骨细胞构成的再生软骨的对象的哺乳动物而选择。针对由软骨细胞构成的再生软骨的说明如后所述。
[0048] 以人类为移植对象时，可使用来自人类的耳廓软骨细胞“以下称作人类耳廓软骨细胞”，更佳是来自人类的自体耳廓软骨细胞。此处“自体耳廓软骨细胞”是指自欲移植由软骨细胞构成的再生软骨的对象的耳廓，于移植及制造再生软骨之前所采取的细胞。
[0049] 软骨细胞可依例如后述的方法分离。首先，以外科手术采取来自捐赠者哺乳动物的软骨片。其次，将采得的软骨片于无菌状态下进行细片化，可因应需要以期望的消化酵素，例如胶原蛋白酶及/或明胶酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及蛋白聚醣酶(aggrecanase)进行消化分解。藉此可获得含有至少一部分的含各自游离的各个软骨细胞的细胞群及/或藉由结合复数的软骨细胞所形成的微小组织片的细胞群。
[0050] 4、软骨细胞的培养
[0051] 接着，将含有耳廓软骨细胞的细胞群于培养基存在下进行放置。
[0052] 此时培养基可为使细胞产生细胞分裂者，亦可为不使细胞产生细胞分裂者。例如，培养基为含有细胞群生存必须成分的缓冲液。
[0053] “放置”是指将细胞维持于特定条件下。于该维持中，典型是发生细胞分裂。亦即，放置亦可为培养。另外于该维持中，亦可不发生细胞分裂。例如，可获得制造再生软骨必须的软骨活细胞数时，于该维持中，亦可不发生细胞分裂。于特定条件下的维持中发生细胞分裂时，亦即进行培养时，培养方法只要是可获得制造再生软骨必须的软骨活细胞数，可为相关业者现有的任一种方法。培养方法例如可为获得必须的活细胞数的继代培养。继代培养的一例是可藉由将分离的软骨细胞以平面培养进行培养3星期，进行继代I次，进而再培养3星期后使其增殖约1000倍。另外亦可进行更进一步的继代培养。并未特别限制培养型态，可因应目的适当选择。培养型态例如于培养瓶中的悬浮培养、于培养皿中的平面及/或悬浮培养(单层培养)、丸状方式培养(pellet culture)、以水性凝胶(hydrogel)等的三维立体培养等。
[0054] 使用的培养基是其本身周知的适于培养软骨细胞的培养基。培养基较佳是道尔贝高所改良的伊格尔培养基(Dulbecco，s modification of Eagle，s medium, DMEM)、最低必需培养基(Minimum Essential Medium, MEM)、DMEM/F12 以及含血清的 DMEM/F12。培养基的量相对于含软骨细胞的细胞群体积lmL，为20至20，OOOmL。
[0055] 放置于例如3 %〜7 %的CO2存在下，湿度80 %〜100 %，温度36 V〜38 °C下进行。放置时间例如于进行培养时，为培养所需时间。另外于放置期间，可搅拌培养基亦可不进行搅拌，但以进行搅拌为佳。
[0056] 上述放置后的含软骨细胞的细胞群，可为互相结合，至少形成部分的组织，或可为各自游离的软骨细胞。另外，含软骨细胞的细胞群，可为初代培养物及/或继代培养物。
[0057] 细胞群中所含软骨细胞的生存率，亦即细胞群中所含的软骨细胞中，软骨活细胞所占比例较佳是80%以上。软骨细胞生存率未达80%时，预计健全的软骨再生可能无法达成。生存率的测定方法为其本身周知的任何方法。生存率的测定方法例如使用自动细胞计数器(NucleoCounter)的PE测定法。
[0058] 含软骨细胞的细胞群例如为含有2亿4千万个以上的软骨活细胞。该等细胞群含有制造再生软骨所必须的软骨活细胞，可藉由使用其而制造再生软骨。
[0059] 5、GFAP 的测定
[0060] 接着，自上述培养基采取至少一部分液体成分。
[0061] 此处的液体成分是自培养基至少去除细胞后可得。培养基可为培养中的培养基，亦可于培养过程中，一时性地以具有其本身周知的生理组成的缓冲液取代培养基，进而亦可为以期望的时间进行培育后的该缓冲液。液体成分为例如培养上清液。
[0062]自培养基采取液体成分的方法，可使用自培养基以不含细胞群而可取得培养基的任一种方法。例如自培养基采取液体成分的方法，可使用离心分离法。
[0063]自培养基采取液体成分的时间点，可为选自分离含软骨细胞的细胞群之后、培养前、培养中、培养后、培养结束时、初代培养中、继代培养前、继代培养后、继代培养中、形成再生软骨前、形成再生软骨后、再生软骨移植前以及再生软骨移植后的至少一个时期。例如于分离含软骨细胞的细胞群后，立即使细胞群悬浊于缓冲液中，再采取所得悬浊液中的液体成分。于分离后立即采取液体成分供予测定GFAP量时，可分析遭分离的细胞群中软骨细胞的纯度。除了于分离后立即采取以外，亦可于例如培养中及/或再生软骨形成后、移植前采取液体成分，供予下述测定。于移植前采取液体成分提供测定时，可管理再生软骨的品质。
[0064] 其次，测定以经如下所述方法分离的液体成分中所含的GFAP量。测定GFAP量可使用其周知的任一种方法。测定GFAP量的方法例如酶联免疫吸附分析法(enzyme linkedimmunosorbent assay (ELISA))法、PR-PCR 法以及西方墨点法(western blotting)。
[0065] 其次，根据经如上所述方式测定的GFAP含量来判断自细胞群可得或获得的再生软骨是否适合移植。例如液体成分中所含的GFAP含量，每ImL液体成分为0.05ng以上时，判断自细胞群可得或获得的再生软骨适合移植。较佳是液体成分中所含的GFAP含量，每ImL液体成分为0.5ng以上时，判断自细胞群可得或获得的再生软骨适合移植。更佳是液体成分中所含的GFAP含量，每ImL液体成分为5ng以上时，判断自细胞群可得或获得的再生软骨适合移植。
[0066] 液体成分中所含的GFAP含量若每ImL液体成分为0.05ng以上时，显示自细胞群可得或获得的再生软骨于移植后可成为软骨而生着，更佳是表示其具有旺盛的软骨再生。反之，GFAP含量为每ImL液体成分未达0.05ng时，显示自细胞群获得的再生软骨于移植后无法成为软骨而生着，或极可能无法表现所期望的软骨再生。
[0067] 经判断为适于移植的细胞群，其后可使用于形成以下说明的再生软骨。反之，经判断为不适于移植的细胞群，则无法使用于形成再生软骨。
[0068] 另外针对再生软骨进行上述的评估时，判断再生软骨不适用于移植时，则不移植该再生软骨。
[0069] 6、再生软骨的形成
[0070] 再生软骨是使用含经于培养基存在下进行放置的软骨细胞的细胞群而形成。此处所使用的细胞群是根据如上所述的GFAP含量来判断自细胞群获得的再生软骨适合移植的细胞群。
[0071] 例如再生软骨可将含软骨细胞的细胞群，藉由立体培养而形成。立体培养是使用支架材料进行。具体而言，立体培养是藉由于支架材料之上或内部培养软骨细胞而进行。并未限制所使用支架材料的材料、性状、形状、构造、大小等，可因应目的适当地选择。支架材料的材料可为例如去端肽胶原蛋白(atelocollagen)、纤维蛋白(fibrin)、玻尿酸(hyaluronic acid)以及具生物分解性的聚合物多孔体。具生物分解性的聚合物多孔体是例如聚左旋乳酸(Poly L-1actic acid(PLLA))、聚轻基乙酸(Poly Glycolic Acid(PGA))及聚乳酸-轻基乙酸(Poly Lactic-co-Glycolic Acid(PLGA))。支架材料可使用任一种周知的方法形成。立体培养可进而使用凝胶化剂而进行。例如混合含有凝胶化剂与软骨细胞的细胞群后，再藉由使其与支架材料接触，进行安定的立体培养，可获得安定的再生软骨。凝胶化剂是例如去端肽胶原蛋白以及藻酸盐(Alginate)。立体培养可以于例如37°C、5%CO2培养器的条件下进行2小时。
[0072] 如上所述，可制造适于移植的再生软骨。
[0073] 经如上述方式制造的再生软骨具有相当程度的大小，可做为植入物(implant)而使用。再生软骨可为悬浊液型态或固体型态，但以固体型态为佳。
[0074] 制造的再生软骨可作为例如为填补或补强软骨缺损或软骨损伤部位的医疗用移植材料。特别是可使用于先天性型态形成异常，例如用于唇颚裂的鼻变形的医疗用移植材料。另外，该再生软骨亦可使用为美容整形用移植材料。
[0075] 软骨再生医疗主要包含(I)自患者采取软骨、(2)分离与培养软骨细胞、(3)回收培养的软骨细胞或形成再生软骨、(4)移植至患者等4个步骤。第2步骤的分离与培养软骨细胞是于细胞培养处理中心(Cell Processing Center)此一特殊的设施内进行,且为制造再生医疗制品的本质部份。因此，为要求最严密的品质管理的步骤。
[0076] 以往，由于混入软骨细胞以外的其他细胞，或软骨细胞过度增殖，无法保证再生软骨的品质，亦无法提供患者预定的医疗，或于移植后发生软骨形成能力下降等问题。有关其他细胞混入，由于尚未确立显示软骨细胞纯度的指标，因此尚无法判断。其他细胞会妨碍软骨细胞增殖及细胞团分化为软骨。另外，软骨细胞过度增殖是培养的细胞团进行显著的排除分化，其结果，发生减弱软骨特性。过度增殖是由于难以正确计测分离时的软骨细胞数而产生。亦即，将分离时的软骨细胞数预测为较实际为多，且藉由继代培养获得目标细胞数时，结果为发生软骨细胞过度增殖。[0077] 根据上述评估再生软骨的方法，由于可评估自培养软骨细胞获得或可得的再生软骨的软骨特性，可解决如上所述的已往发生的问题。具体而言，由于上述的评估方法可藉由测定GFAP含量，而获得显示细胞群中软骨细胞纯度的定量的指标，而可排除所含的与其他细胞排挤软骨细胞等量的细胞群。并且，由于使用含软骨细胞的细胞群制造的再生软骨，已经进行是否适合用于移植的判断，因此可避免移植后在体内软骨形成能力降低的状况。
[0078]另外，评估软骨特性不仅使用含软骨细胞的细胞群，亦使用自培养基分离且未含有软骨细胞的液体成分，例如上清液。因此，自不会耗损再生软骨制品贵重原料的细胞此一观点，非常有利于再生软骨的制造。
[0079] 进而，使用上述软骨特性评估方法所制造的再生软骨的品质有保证。因此该等再生软骨可安全的使用于医疗用以及美容用移植材料。
[0080][例][0081 ] 以下针对本发明的例进行说明。
[0082] <实施例1>
[0083] 例1、检讨用以判定再生软骨制品的构成细胞是耳廓软骨细胞的指标
[0084] 藉由下述方法，检索用于制造再生软骨制品的经培养后增殖1000倍的耳廓软骨细胞中大量表现的基因。
[0085] 针对耳廓软骨细胞、纤维母细胞、皮肤角质细胞、气管上皮细胞、关节软骨细胞、肋软骨细胞、星状细胞(星状胶细胞)，藉由单层培养法于约一周内进行一次继代培养，再进行长期连续继代培养。在第二次继代(PS)以及第8次继代(P8)的时间点，自各培养细胞萃取总核糖核酸(Total ribonucleic acid (Total RNA)),使用阿芙美特利克斯(Affymetrix)公司制的 GeneChip (登记商标)Human Genome U133plus Array,藉由微阵列法(microarray),各别检索细胞大量表现的基因。
[0086] 其结果，检测出纤维母细胞生长因子(FGF)-18、神经胶质微纤维酸性蛋白质(GFAP)等基因，但其中表现量特高的基因是GFAP基因。
[0087] 进而使用实时PT-PCR (Real Time PT-PCR)法测定GFAP基因的表现量。对各细胞进行3个检体测定，获得测定值的平均与标准差。
[0088] 各细胞获得结果示于图1。
[0089] 图1显示GFAP的表现量在耳廓软骨细胞、纤维母细胞、皮肤角质细胞、气管上皮细胞、关节软骨细胞、肋软骨细胞及星状细胞中，以耳廓软骨细胞有显著高的表现量。
[0090]自该结果可得知，藉由检测GFAP，暗示可消除培养中耳廓软骨细胞遭纤维母细胞排挤，而意外投入未预期的纤维母细胞此一风险。
[0091] 例2、检讨将GFAP基因作为产生软骨基质的指标的适用性
[0092] 将来源相异的6例耳廓软骨细胞，使用含5%血清、FGF-2以及胰岛素的DMEM/F12培养液，于约一周内进行一次继代培养，再以单层培养法进行至第8次继代(P8)为止的长期连续继代培养。在产生丰富的基质产生量的培养后倍增约100倍的耳廓软骨细胞(P2)，与I亿倍程度的细胞(P8)时间点，自培养细胞萃取Total RNA,以Real Time PT-PCR法测定GFAP基因的表现量。
[0093] 结果示于图2。自图2可知，全例均显示P2的表现量高，但无关相同培养条件下的培养，P2基因表现的基因复制数(copy number)为7.2 X IO3〜1.321 X 106，细胞间存在相当大的差异。
[0094] 因此，为抑制测定上的差异性，检讨于蛋白质层次的评估。
[0095] 例3、测定蛋白质层次的GFAP表现
[0096] 针对捐赠者相异的18例人类耳廓软骨细胞，使用含5%血清、FGF-2以及胰岛素的DMEM/F12培养液，于约一周内进行一次继代培养，再经长期培养进行至第3次继代。将培养的耳廓软骨细胞以胰蛋白酶处理后回收，以细胞浓度为IXlO7细胞/mL与1%去端肽胶原蛋白凝胶混合。将该与细胞混合的凝胶于每试管内分注20iU，再以含成骨蛋白(BMP-2 (Bone morphogenetic protein-2)、膜岛素(insulin)、甲状腺荷尔蒙(T3 (Triiodothryonine))的含BMP_2/insulin/T3的诱导产生软骨细胞基质培养基，进行高密度包埋培养。3周后，藉由比色法及ELISA法测定软骨细胞分泌的GAG量以及C0L2量。另外取出与经去端肽胶原蛋白包埋者相同的P3培养软骨细胞IX IO4细胞，以ELISA法测定该细胞溶解液中GFAP量。以捐赠者相异的18例耳廓软骨细胞进行相同试验，采用SSRI公司制的Excel统计计算培养细胞分泌的GAG量、C0L2量以及细胞中GFAP量的相关性。结果示于图3以及图4。
[0097] 自图3以及图4可得知细胞中GFAP量与GAG的相关系数为0.507，与C0L2的相关系数为0.590，显示二值间的相关性为中等程度相关。由此可知，藉由于蛋白质层次测定构成再生软骨的软骨细胞的GFAP，暗示可对软骨细胞进行功能性的评估。
[0098] 例4、检讨用以评估GFAP含量的检体
[0099] 将捐赠者相异的18例耳廓软骨细胞，培养至第3次继代(P3)，再将培养的耳廓软骨细胞藉由胰蛋白酶处理后回收，以细胞浓度为I X IO7细胞/mL与I %去端肽胶原蛋白凝胶混合。将该与细胞混合的凝胶于每试管内分注20iU，再以含BMP-2/insulin/T3的诱导产生软骨细胞基质培养基，进行高密度包埋培养。3周后，藉由比色法及ELISA法测定软骨细胞分泌的GAG量以及C0L2量。另外取出与经去端肽胶原蛋白包埋者相同的P3培养软骨细胞的培养上清液的一部分，藉由ELISA法测定该培养上清液中所含GFAP量。以捐赠者相异的18例耳廓软骨细胞进行相同试验，计算培养细胞分泌的GAG量、C0L2以及培养上清液中GFAP量的相关性。结果示于图5以及图6。
[0100] 自图5以及图6可知，培养上清液中GFAP量与GAG的相关系数为0.767，与C0L2的相关系数为0.735，显示二值间具有相当强烈的相关性。另外，培养上清液中GFAP含量愈高，显示愈具有旺盛的软骨再生。
[0101] 因此，采取一部分的培养上清液，以ELISA测定GFAP量，藉此显示可不损及细胞或组织，判定是否可出货。
[0102] 例5、决定用以评估软骨特性的GFAP蛋白质量的阀值
[0103] 分别使用3例的第2次继代(P2)的培养耳廓软骨细胞以及培养纤维母细胞，于软骨增殖培养基使用含5%血清、FGF-2以及胰岛素的DMEM/F12培养液进行一周培养。自该培养细胞取出ImL培养上清液，其后以胰蛋白酶处理后回收培养细胞。将该回收的细胞以浓度为I X IO8细胞/mL与I %去端肽胶原蛋白凝胶混合后，投入多孔体型支架材料，于37°C下培养2小时后使其凝胶化。并将其移植入裸鼠背部皮下。
[0104] 2个月后，取出移植物，切半后一半以甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色供于组织学评估。另一半则用于GAG量、第II型胶原蛋白量的蛋白质定量评估。以ELISA法测定取出的培养上清液中所含GFAP量。结果示于图7以及图8至图13。
[0105]自图7的培养上清液中GFAP量的结果以及图8至图13的组织学评估，耳廓软骨细胞的全例均于培养上清液中检测出GFAP，显示藉由移植至裸鼠可发现软骨形成。反之，纤维母细胞全例均未检测出GFAP，亦未发现软骨形成。
[0106] 另外，自图7至图13于移植后形成软骨且显示旺盛的软骨再生的培养人类耳廓软骨细胞中，显示培养上清液中GFAP至少存在0.05ng/mL以上。自该等结果，若培养上清液中含GFAP为0.05ng/mL以上，暗示含有可形成再生软骨的培养人类耳廓软骨细胞，可明确得知可将培养上清液中所含GFAP量的值使用为判定再生软骨品质的标准。
[0107]〈实施例2>
[0108] 根据下述顺序制造再生软骨。图14是概略显示该再生软骨的制造步骤的图。
[0109] 自患者采取耳廓软骨的一部分(约IcmX 5mmX 2mm)，再藉由胶原蛋白酶处理而分离软骨细胞。将经分离的软骨细胞以含5%自体血清、FGF-2以及胰岛素的DMEM/F12培养液培养约3〜6周。培养时回收使其增殖约1000倍细胞数的细胞。将该回收的培养软骨细胞投入PLLA制的支架材料，形成再生软骨(图14)。
[0110] 且于培养后39天(移植前3天)进行培养液检查，使用ELISA测定培养上清液中所含的GFAP蛋白质浓度。藉由于培养后39天(移植前3天)确认培养上清液中GFAP含量为0.05ng/mL以上，判断可安全进行移植，且移植后于体内形成软骨，能够以再生软骨形式生着。
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