CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒
阅读：4发布：2023-02-24
专利汇可以提供CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测 试剂 盒 ，该融合蛋白由CK-M蛋白和CK-B蛋白通过Loop连接形成，与天然CK-MB蛋白功能相同。其制备方法是将人源性CK-M和CK-B的编码基因序列用Loop的核苷酸 碱 基偶联在一起，克隆到表达载体得到表达质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，培养产物经过细菌 超 声波 破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Superdex G200分子筛层析柱，得到活性蛋白含量高达85％的高纯度蛋白。本发明采用稀土 荧光 微球作为标记载体制备了测CK-MB的试剂盒，具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。，下面是CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种CK-MB融合蛋白，其特征在于，由CK-M蛋白和CK-B蛋白通过Loop连接形成，所述Loop的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的CK-MB融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白的编码基因。
4.权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将人源性CK-M蛋白和CK-B蛋白的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamH I/Xho I中，得到表达质粒pET28a-CKMB；
将表达质粒pET28a-CKMB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；
培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Superdex G200分子筛层析柱，得到纯化的CK-MB蛋白。
5.以权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白作为抗原，制备的抗体。
6.一种用于检测CK-MB的试剂盒，包括CK-MB蛋白的阳性对照品，其特征在于，所述CK-MB蛋白为权利要求1或2所述的CK-MB融合蛋白。
7.一种用于检测CK-MB的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括含冻干的荧光微球复合体的枪头、免疫荧光试纸卡、含样品缓冲液的冻存管，和权利要求1或2所述CK-MB融合蛋白制备的阳性对照品；其中，
荧光微球复合体：将稀土荧光微球通过碳二亚胺和羟基硫代琥珀酰亚胺将羧基活化，然后以羧基化的稀土荧光微球作为标记载体，与CK-MB单抗中-NH2共价结合；
免疫荧光试纸卡包括CK-MB检测试纸，检测试纸由吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫依次搭接贴于PVC衬板上构成，硝酸纤维素膜上的检测线位置包被有抗CK-MB单抗，质控线位置包被有羊抗小鼠多抗；检测试纸固定在塑料底卡上并且表面用面卡压紧，面卡在对应检测试纸的样品垫和硝酸纤维素膜的部位分别预留加样孔和观察窗。
8.根据权利要求7所述的用于检测CK-MB的免疫荧光试剂盒，其特征在于，还包括干燥剂；全部试剂均封装在铝箔袋中，真空封口，4℃保存。
9.根据权利要求7所述的用于检测CK-MB的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述样品缓冲液为含有质量体积比0.25％酪蛋白和40mM EDTA的PB缓冲液。
10.根据权利要求7所述的用于检测CK-MB的免疫荧光试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品稀释液，所述阳性对照品稀释液为含有质量体积比6％BSA和浓度5mM葡萄糖的PB缓冲液。
CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基组成的二聚体。
[0003] CK-MB在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中CK-MB水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中测定CK-MB的活性比做心电图更为可靠。心肌梗塞时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3～4日内恢复正常。且CK-MB诊断的特异性最高。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。
[0005] 双抗夹心免疫化学发光法具有敏感度高、所需时间短等优点，但是不能检测正常人血中的CK-MB。
[0006] 放射性免疫法是通过将放射活性分子共价交联至CK-MB抗体免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来间接定量检测CK-MB的一种超微量分析方法。具有特异性好、灵敏度高(可达ng和pg级)、操作简便、样品制备简单、精确定量等优点，但是该方法中操作人员会接触到放射性物质，可能会损害操作人员的身体，而且检测完成后怎样处置放射性材料也是个严重的问题。
[0007] CK-MB的酶联免疫检测方法是双抗夹心ELISA方法，将一对CK-MB单抗分别进行酶标板固化和酶标记，抗原抗体反应后，通过酶与底物的呈色反应，即可显示特定抗原是否存在，并可根据呈色之深浅进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、样品能量大、不但能进行定性检测也能定量检测，但是耗时较长。
[0008] 侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线在2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素膜的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、荧光微球等。
[0009] CK-MB的胶体金免疫层析法通过静电吸附将CK-MB抗体标记到胶体金颗粒表面，通过观察胶体金颗粒在检测线上的聚集显色判断检测结果。具有快速、简便、直观等优点，但同时存在着依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量、标记通过静电吸附，标记产物不稳定等缺点。
[0010] CK-MB的免疫荧光层析技术是将CK-MB抗体共价结合于荧光微球表面的活性基团(-COOH、-NH2)上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断检测结果，延续了胶体金免疫层析方法的优势，同时具有高敏感度、完全定量、标记物稳定的优点。在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。
[0011] 在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
[0012] 时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子Stokes位移大，避免了激发光和发射光的重叠而影响结果，而且镧系稀土离子荧光寿命长，，可以通过延长检测时间来消除检测物质本底荧光的干扰，提高了灵敏度，另外稀土元素的荧光强度高，同样能够提高检测的灵敏度。常用的稀土荧光微球为铕(EU)荧光微球。
[0013] 目前对于CK-MB的多种检测方法中，需用到大量高质量的标准品，由于人CK-MB天然来源有限，所以通过基因工程的方法来制备高质量重组CK-MB标准品(或免疫原)是CK-MB的主要来源。
[0014] 现有技术中对重组CK-MB的制备是通过克隆CK-M、CK-B基因，将二者的扩增产物分别连接至载体pEASY-Blunt构建转化质粒，再转化感受态Trans-TOP-1，用氨苄西林筛选平板筛选阳性菌落，回收CK-M、CK-B片段后转至质粒pGEX-4T-1，鉴定正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB转化感受态E.coliBL21(DE3)，以含Amp的LB培养基筛选培养，IPTG诱导表达。纯化采用GST亲和层析。这种方法操作过程较为繁琐，而且更重要的一点是所获得的重组蛋白多以包涵体形式存在，活性较差，实际应用中存在困难。
发明内容
[0015] 本发明的目的在于提供一种与天然CK-MB具有相同功能的融合蛋白，以弥补CK-MB天然来源有限的问题。
[0016] 本发明的另一个目的是针对现有基因工程方法制备CK-MB重组蛋白包涵体多、活性差的问题，提供一种能够获得高活性CK-MB重组蛋白的方法。
[0017] 本发明的再一目的是提供上述CK-MB融合蛋白在作为阳性对照品制备检测CK-MB的试剂盒中的应用。
[0018] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0019] 本发明提供的一种CK-MB融合蛋白，由CK-M蛋白和CK-B蛋白通过Loop连接形成，所述Loop的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0020] Loop连接CK-M蛋白和CK-B蛋白，形成二聚体蛋白产物，保持两个蛋白各自的空间结构，活性极高，与天然CK-MB功能相同。
[0021] 优选地，上述CK-MB融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022] 本发明还保护上述CK-MB融合蛋白的编码基因。
[0023] 本发明提供的一种上述CK-MB融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
[0024] 将人源性CK-M蛋白和CK-B蛋白的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamH I/Xho I中，得到表达质粒pET28a-CKMB；
[0025] 将表达质粒pET28a-CKMB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；
[0027] 镍柱也称为镍离子亲和层析柱，是以琼脂糖凝胶微球为基础，在其表面共价交联带有多个游离羧基的配体有机小分子化合物，由于多个羧基与Ni2+发生螯合，螯合后的Ni2+能与目标蛋白中His上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。优选使用美国GE公司HisTrap HPNi FFNTA型号的5mL规格的镍离子亲和层析柱。
[0028] 强阴离子交换柱Q柱，优选使用美国GE公司HiTrap Q型号的5mL规格的预装柱。
[0029] Superdex G200凝胶过滤层析柱是美国GE公司Superdex 75/300GL型号的预装柱。
[0030] 本发明还提供上述CK-MB融合蛋白作为抗原，制备的抗体。
[0033] 免疫荧光试纸卡包括CK-MB检测试纸，检测试纸由吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫依次搭接贴于PVC衬板上构成，硝酸纤维素膜上的检测线位置包被有抗CK-MB单抗，质控线位置包被有羊抗小鼠多抗；检测试纸固定在塑料底卡上并且表面用面卡压紧，面卡在对应检测试纸的样品垫和硝酸纤维素膜的部位分别预留加样孔和观察窗。
[0034] 检测原理：将稀释好的样品与荧光检测抗体(荧光微球复合体，标记有小鼠源的CK-MB单抗)混合后，加入到试纸卡一端的加样口，通过毛细作用向前移动，反应一段时间后，利用荧光扫描仪，扫描试纸卡的观察框，捕捉质控线和检测线被激发的荧光强度，如果样品中含有相应的CK-MB抗原，包被在检测线上的抗体(抗CK-MB单抗)和荧光标记物与样品中的抗原结合，形成免疫复合物，检测线和质控线均会产生荧光；如果待检样品中没有相应抗原，荧光标记物将不会与包被在检测线上的抗原或抗体结合，荧光标记物不会富集，则检测线上不会产生荧光，而质控线会出现荧光。
[0036] 优选地，上述用于检测CK-MB的免疫荧光试剂盒，所述样品缓冲液为含有质量体积比0.25％酪蛋白和40mM EDTA的PB缓冲液。
[0037] 优选地，上述用于检测CK-MB的免疫荧光试剂盒，还包括阳性对照品稀释液，所述阳性对照品稀释液为含有质量体积比6％BSA和浓度5mM葡萄糖的PB缓冲液。
[0038] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0039] 本发明将CK-M和CK-B蛋白进行融合表达，得到的CK-MB融合蛋白，与天然CK-MB功能相同，并且具有高活性。
[0040] 本发明提供的CK-MB融合蛋白的制备方法，能够得到CK-MB活性蛋白含量高达85％的高纯度蛋白，包涵体极少，无需进行后续处理，工艺流程简单成本降低。
[0041] 以本发明的CK-MB融合蛋白为基础，稀释后得到含有不同浓度CK-MB活性蛋白的标准品溶液，经ELISA法检测，误差小于5％。
[0042] 本发明提供的检测试剂盒，通过采用稀土(镧系元素)荧光微球作为标记载体，标记载体稳定，标记通过共价键将微球和抗体连接，标记产物稳定；可避免样品本身的荧光影响，检测快速简便、敏感性高，可实现全定量检测；以本发明的CK-MB融合蛋白作为阳性对照，组装检测CK-MB免疫荧光定量检测试剂盒，使试剂盒具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。附图说明
[0044] 图2是实施例3中试纸条结构组成图。
[0045] 图3是实施例4中CK-MB融合蛋白在不同浓度下在荧光试纸卡上的层析曲线。
[0046] 图4是实施例4中CK-MB融合蛋白的标准曲线。
[0047] 图5是实施例5中FN荧光层析和ELISA方法检测血液样本的准确度的相关性结果。
具体实施方式
[0048] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0049] 以下实施例中，如无特殊说明，所用生物材料及试剂均为市售商品，未详细提及的实验步骤均为常规技术手段。为表述清晰，以下实施例中，Loop均记载为“连接Loop”。
[0050] 实施例1：CK-MB融合蛋白的克隆、表达与纯化
[0051] ①按氨基酸序列N端到C端的方向，合成“CKM-连接Loop-CKB”全基因序列，。其中CK-M、连接Loop和CK-B的基因序列和蛋白序列如下：
[0052] CK-M氨基酸序列：SEQ ID NO.3；
[0053] CK-M编码基因序列：SEQ ID NO.4；
[0054] Loop氨基酸序列：SEQ ID NO.1；
[0055] Loop编码基因序列：SEQ ID NO.5；
[0056] CK-B氨基酸序列：SEQ ID NO.6；
[0057] CK-B编码基因序列：SEQ ID NO.7。
[0058] ②将“CKM-连接Loop-CKB”基因序列克隆到pET28a质粒表达载体的BamH I和Xhol I的多克隆插入位点。
[0059] ③将克隆得到的表达质粒pET28a-CKMB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布平板，并过夜培养。
[0060] ④第二天早上挑取单菌落接种到LB培养基中于37℃培养至菌液光吸收值(OD)达到1.0，加入1μg/mL的IPTG诱导表达。37℃培养4小时后离心收集细菌。
[0061] ⑤在细菌中加入100mL的100mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，搅拌振荡使细菌沉淀重悬，用超声波破壁后，16,000rpm转速下离心取上清。
[0062] ⑥将上清依次通过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Superdex G200分子筛层析柱。得到纯化的CK-MB蛋白。纯化结果如图1所示。
[0063] 实施例2：CK-MB融合蛋白的ELISA法定量检测
[0064] ①利用热电公司生产的BCA蛋白含量测定试剂盒测定纯化到的CK-MB融合蛋白的总蛋白含量，对三批纯化蛋白进行检测，并做误差分析。结果如表一所示。
[0065] ②利用CloneTech公司生产的CK-MB的ELISA试剂盒检测CK-MB融合蛋白的活性蛋白含量。对以上三批纯化蛋白进行检测，并做误差分析。结果如表一所示。
[0066] 表一、利用BCA法测定总蛋白含量和利用ELISA法测定CK-MB融合蛋
[0067] 白含量
[0068]
[0069] 实施例3：免疫层析试剂盒的制备
[0070] (1)荧光微球标记抗体：
[0071] ①取0.5mL稀土荧光微球，离心取沉淀，加入pH6.0的MES缓冲液洗涤两次。
[0072] ②活化：在洗涤后的微球中分别加入114μL的50mM的碳二亚胺(EDAC)和114μL的50mM的羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温震荡1h。
[0073] ③离心微球，用PB缓冲液洗涤两次。
[0074] ④加入适当量的小鼠源的CK-MB单克隆抗体，室温震荡2h。
[0075] ⑤离心微球，加入50mM的羟胺缓冲液淬灭反应，室温震荡5min；然后离心微球，加入50mM的羟胺缓冲液彻底淬灭反应，室温震荡30min
[0076] ⑥离心微球，加入封闭液(0.5％酪蛋白，10mM PB)，室温震荡2h。
[0077] ⑦加入400μL储存液(0.5％BSA，0.5％Tween-20，0.02％叠氮化钠，10mMPB)保存于4℃。
[0078] (2)枪头的制备：
[0080] (3)包被膜的制备：
[0081] ①包被
[0083] 调整划线的位置，是T线距NC膜下缘(样品垫端)7mm，C线距NC膜下缘(吸水垫端)11mm，T线和C线间距为4mm。
[0084] 检测线(T线)：用0.01M的PBS(pH7.4，包含3％甲醇)将抗CK-MB抗体稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
[0085] 质控线(C线)：用0.01M的PBS(pH7.4，包含3％甲醇)将羊抗小鼠多克隆抗体稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
[0086] ②干燥
[0087] 放入37℃烘箱，干燥30～40min。
[0088] (4)样品垫的制备：
[0089] 将玻璃纤维膜裁剪至31mm×100mm，用枪头将1.91mL封闭液(0.01M PB缓冲液，包含3％BSA)均匀涂布于玻璃纤维膜表面，置37℃烘箱过夜干燥。
[0090] (5)检测试纸的组装与剪切
[0091] 在已粘贴硝酸纤维素膜(包被有抗CK-MB单抗检测区和羊抗小鼠质控区)的PVC底板(宽77mm)的两端分别粘贴吸水垫和已处理好的样品垫，吸水垫在较窄一端，宽度为25mm，与包被膜交联2mm；样品垫在较宽一端，宽度为31mm，与包被膜交联2mm。
[0092] 组装完成，切条机切成5mm宽度，即为免疫荧光试纸。具体组装方式如图2所示。
[0093] (6)试纸卡的制备
[0094] 把一条免疫荧光试纸固定在塑料底卡上，试纸表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条的样品垫和NC膜的部位分别预留加样孔和观察窗。即为免疫荧光试纸卡。
[0095] (7)试剂盒的制备
[0096] 将免疫荧光试纸卡、含冻干荧光微球抗体复合物的枪头、含样品缓冲液的冻存管、两包1g干燥剂共同放入铝箔袋，真空封口后4℃保存，即制备完成检测CK-MB的免疫荧光试剂盒。
[0097] 实施例4：检测CK-MB标准品
[0098] 连续稀释CK-MB标准品(本发明的CK-MB融合蛋白)，用稀释液(6％BSA，5mM葡萄糖，PB)将标准品进行10倍稀释，制成100000ng/L、75000ng/L、50000ng/L、25000ng/L、10000ng/L、7500ng/L、5000ng/L、2500ng/L、1000ng/L、100ng/L、10ng/L的样品。用含冻干荧光微球复合物的移液器取75μL样品溶液，加入到300μL的样品缓冲液(0.25％酪蛋白，40mM EDTA，PB)中，混匀后取75μL点加到试纸卡的加样孔中。室温静置20min，将试纸卡放到荧光扫描仪中读数。用检测线荧光值除以质控线荧光值为测量值。每个样品浓度进行测量三次，取平均值后，以测量值对样品浓度作图。检测线和质控线的峰形图如图3所示，峰形非常灵敏。标准品的线性结果如图4所示，线性也非常好。
[0099] 实施例5：临床血样中CK-MB的检测
[0100] 采集医院CK-MB的阳性和阴性样本，用本试剂盒(标记为FN荧光层析，方法同上)和EISA两种方法进行检测，分别计算检出率。结果如表二所示，本免疫荧光定量检测试剂盒的检出率明显高于ELISA的方法。
[0101] 表二、临床血样中CK-MB的检测
[0102] 阴性 阳性 阴性符合率 阳性符合率
ELISA 169 426 95.6％ 97.3％
FN荧光层析 169 426 97.2％ 98.6％
ELISA 169 426 95.6％ 97.3％
FN荧光层析 169 426 97.2％ 98.6％
[0103] 同时对血样进行准确度相关性的实验，以免疫荧光定量检测试剂盒的检测结果对ELISA的检测结果进行作图，如图5所示，点的分布主要分布在45度角直线附近，拟合得到相关曲线，得到两种方法的相关系数为0.9912，可见两种方法的检测结果非常一致。
[0104] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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