数十年来，表达载体被用作表达编码宿主细胞内感兴趣多肽或蛋白质的 基因或cDNA的媒介。一直以来，人们将重组DNA瞬时或稳定转染到宿主 细胞内，以此方式用强的病毒或细胞启动子和增强子来高水平表达感兴趣的 基因。在这一方面，人巨细胞病毒的即刻早期(immediate early，IE)区特别适 用，已经知道，例如从EP0323997B1可知，由该区可产生含有基因元件的表 达载体。
直至今天，使用小鼠巨细胞病毒(mCMV)的基因调控序列的情况还是不 多，虽然mCMV产生的调控序列已被鉴定为极其有效，甚至比人对应物具有 更强的作用(Kim等人，2002)。
美国专利US 4,963,481(de Villiers)公开了一些表达载体，其DNA在 mCMV IE基因区产生的DNA片段(包括自病毒性基因组分离出来的约2270 个碱基对(bp)限制性内切核酸酶PstI片段)转录控制下编码异源蛋白质。此片 段的1387bp截短型作为表达异源蛋白质的启动子能明显提高DNA片段的效 率。
美国专利US 4,968,615(Kozinowski)描述了一些重组DNA分子，它们含 有小鼠巨细胞病毒(MCMV)的转录增强子，可用来增强真核细胞结构基因的 转录。据de Villiers(US 4,963,481)鉴定，mCMV增强子位于2.27kb PstI片段 内。
Manning和Mocarski(1988)分析了mCMV IE2区对小鼠巨细胞病毒复制 的重要功能。为此，构建了一个重组病毒，它带有受mCMV IE增强子/启动 子转录控制的lacZ报导基因，因而破坏IE2基因。事实上，观察不到任何IE2 基因表达，病毒正常地复制。作者由此得出这样的结论：IE2基因不存在于诸 如mCMV和hCMV等巨细胞病毒中，而且不是病毒复制的必要条件。Manning 和Mocarski没有公开或提示到IE2增强子/启动子区的任何特定用途。
最近一些文章表明，小鼠与人CMV IE区之间还有不同之处。小鼠基因 座以与第一IE基因相反的方向表达第二主要mRNA。该第二即刻早期基因被 称为IE2，它的启动子序列称为IE2启动子(Messerle等人，1991)。
迄今为止，还未曾有人在载体中使用mCMV的IE2区表达异源蛋白质。

本发明基于这样的发现：含有带mCMV IE2启动子区的DNA元件的载 体能有效地驱动转染宿主细胞内感兴趣基因的表达。
本发明还基于mCMV IE2区内一个新增强子的鉴定，该增强子在此处被 称为mCMV IE2增强子。这个增强子满足通常关于增强子定义的标准，即独 立于(1)位置，(2)方向增加表达，以及(3)增加由异源启动子驱动的表达。
所以，本发明第一方面涉及一种表达载体，它含有mCMV-IE2基因启动 子或其功能性表达启动片段，和/或mCMV-IE2基因增强子或其功能性表达增 强片段，其中该表达载体不含有任何全mCMV基因。
本发明第二方面涉及一种含有本发明载体的宿主细胞。
本发明第三方面涉及一种生产感兴趣多肽的方法，该方法包括用本发明 载体转染宿主细胞的步骤。
本发明第四方面涉及一种生产感兴趣多肽的方法，该方法包括培养本发 明宿主细胞的步骤。
本发明第五方面涉及本发明载体在表达一或多个感兴趣基因或cDNA中 的用途。
本发明第六方面涉及本发明载体在选择表达高含量感兴趣基因的克隆中 的用途。
本发明第七方面涉及本发明载体在DNA疗法中的用途。
附图说明
图1所示为用在表达构建体中自mCMV IE区产生的双向DNA元件序列。 图中分别示出IE2和IE1启动子的+1位点和TATA盒。框内为两种基因的核 心启动子。HpaI和XhoI限制位点以粗体表示。给出的-682位置以IE1的+1 为基准。
图2所示为报导基因构建体A至G。萤光素酶报导基因以粗线表示，启 动子以空心箭头表示。
A：阴性无启动子对照(pGL3基本型)。
B：SV40启动子/增强子驱动的萤光素酶报导基因载体(pGL3对照)。
C：萤光素酶表达，IE1启动子驱动(pmCMV萤光素酶，IE1驱动)。
D：萤光素酶表达，IE2启动子驱动(prevmCMV萤光素酶，IE2驱动)。
E：萤光素酶表达，IE2启动子驱动，IE1启动子缺失(prevmCMV萤光素 酶(ΔXhoI)，IE2驱动，IE1缺失)。
F：萤光素酶表达，IE1启动子驱动，IE2启动子缺失(pBS.MCMV3萤光 素酶，IE1驱动(1.4kb)，IE2缺失)。
G：萤光素酶表达，IE1启动子短型驱动(p-680萤光素酶，IE1驱动(短型， 0.68kb))。
图3所示为一个类似图2中构建体C(构建体C-2)的双向构建体，具有与IE2 启动子连接的IL-18BP编码序列(粗线)。所以，此构建体内mCMV IE1启动子 驱动萤光素酶表达，同时mCMV IE2启动子驱动IL-18BP表达。三角形：内含 子。闭合椭圆形：polyA。
图4所示为图2中不同报导基因构建体A至G的萤光素酶报导基因表达。用 构建体A至G瞬时转染，或者模拟转染无血清培养基(SFM)中生长的CHO-S细 胞。萤光素酶活性以RLU＝相对光亮度单位表示。
图5所示为在转染CHO-S细胞稳定池中测到的萤光素酶表达，以RLU表 示。所述细胞与图2所示的构建体D、C、F和E转染后在SFM中培养。选择21 天后评价萤光素酶表达。
图6所示为细胞用900、500、300和100ng图3所示的双向构建体C-2转染 后测到的萤光素酶表达，以RLU表示。
图7所示为根据图6的瞬时转染实验(构建体C-2)得到的细胞培养上清液中 IL-18BP的数量(ng/l)。
图8所示为根据图6和图7的实验测到的IL-18BP与萤光素酶之数量比。
图9所示为48个克隆表达的萤光素酶数量(以RLU计，左边y轴)和IL-18BP 数量(单位为ng/ml，右边y轴)，所述克隆是用双向构建体C-2(如图3所示)转染 后8天被挑选出来。萤光素酶的检测极限约500RLU，IL-18BP的检测极限为2.5 ng/ml。X轴上每一个增量表示一个克隆。
图10(a)所示为报导基因构建体H至N。萤光素酶报导基因(Luc)以粗线表 示，IE1和IE2启动子以空心箭头表示。增强子以灰色椭圆形表示：浅灰色表 示已知的IE1增强子，深灰色表示新的IE2增强子。
H：带IE2启动子的双向构建体驱动的萤光素酶表达；
I：IE2启动子驱动的萤光素酶表达，IE1启动子缺失；
J、K、L、M、N：含有截短mCMV启动子的构建体，图中的位置对应于 mCMV启动子的碱基对数目，以IE2的+1位为基准点。
J：相距-1076
K：相距-783
L：相距-587
M：相距-387
N：相距-189。
图10(b)所示为在无血清培养基中生长的CHO-S细胞瞬时转染后，图10(a) 所示报导基因构建体H至N的萤光素酶表达(以RLU计)。
图11(a)所示为结合了新IE2增强子(灰色椭圆形)与SV40启动子的另外一 些报导基因构建体O至Y。灰色椭圆形代表-587至-189的IE2增强子，一半灰 色椭圆形代表-387至-189的IE2增强子。IE2增强子上方的箭头表示增强子序 列方向。萤光素酶报导基因以粗线表示，SV40启动子以空心箭头表示。黑色 椭圆形：polyA。
O：克隆在SV40启动子5’的长IE2增强子序列(-587/-189)；
P：克隆在SV40启动子5’的短IE2增强子序列(-387/-189)；
Q：以相反方向克隆在SV40启动子5’的长IE2增强子序列(-587/-189)；
R：以相反方向克隆在SV40启动子5’的短IE2增强子序列(-387/-189)；
S：克隆在萤光素酶报导基因3’的长IE2增强子序列(-587/-189)；
T：克隆在萤光素酶报导基因3’的短IE2增强子序列(-387/-189)；
U：以相反方向克隆在萤光素酶报导基因3’的长IE2增强子序列 (-587/-189)；
V：以相反方向克隆在萤光素酶报导基因3’的短IE2增强子序列 (-387/-189)；
W：对照，在萤光素酶编码序列3’中的SV40启动子和SV40增强子；
X：对照，不存在任何增强子情况下SV40启动子驱动的萤光素酶表达；
Y：阴性对照，完全无启动子。
图11(b)所示为图11(a)中报导基因构建体O至Y驱动的萤光素酶表达。用构 建体O至Y瞬时转染无血清培养基(SFM)中生长的CHO-S细胞。萤光素酶活性 与对照X(数值1)，即不存在任何增强子情况下SV40启动子驱动的表达相比倍 数增加。空心条：长IE2增强子(-587至-189)，带阴影线条：短IE2增强子(-387 至-189)。X轴是对数刻度。
图12所示为比较新IE2增强子与已知hCMV增强子的实验。用对照构建体 A(pGL3基本型，见图2，无启动子)、对照构建体B(pGL3对照，见图2，在萤 光素酶编码区3’具有以SV40增强子序列所示的SV40启动子)、对照构建体X (SV-Luc+，见图11a，无增强子的SV40启动子)，以及构建体O和Q(见图11a) 或构建体O-2和Q-2转染细胞，其中IE2增强子序列(长型，-587至-189)被已知 的hCMV增强子序列(SEQ ID NO：2)置换。测定萤光素酶，单位为RLU(X轴)。 带阴影线条：带有已知的hCMV增强子。灰色条：带有新的IE2增强子。
图13所示为用来同时表达IL-18BP和萤光素酶的双向载体。IE1和IE2以空 心箭头表示。三角形表示hCMV IE区的内含子A，灰色椭圆形表示聚腺苷酸化 信号。闭合方形表示信号肽。
构建体#26：IE1启动子表达的萤光素酶和IE2启动子表达的IL-18BP。两 个启动子之间的序列与图10.a所示的构建体H相同。
构建体#140：IE2启动子表达的萤光素酶和IE1启动子表达的IL-18BP。IE2 增强子(-587至-189)位于两个启动子之间。
图14所示为用图13的构建体#26或#140瞬时转染无血清培养基中生长的 CHO细胞后，表达的萤光素酶(RLU，左边Y轴)和IL-18BP(ng/ml，右边Y轴) 的数量。条形：萤光素酶表达，闭合菱形：IL-18BP表达。
图15所示为用图13的构建体#26或#140转染的稳定池中萤光素酶(RLU， 左边Y轴)和IL-18BP(ng/ml，右边Y轴)的表达。表达是在转染后7星期测定的。 细胞保持在嘌呤毒素选择中(+嘌呤毒素)，或者保持在无嘌呤毒素选择3星期(- 嘌呤毒素)。条形：萤光素酶表达，闭合菱形：IL-18BP表达。
图16所示为图15的实验中萤光素酶表达与时间之关系。X轴代表时间，以 周计。图15所示的数据对应于图16中3星期的数据。闭合菱形：#26+嘌呤毒素， 小方形：#140+嘌呤毒素，闭合三角形：#26-嘌呤毒素，大方形：#140-嘌呤 毒素。
图17所示为图16的实验中IL-18BP表达与时间之关系。图例与图16相同。
图18所示为对各个原克隆的萤光素酶表达(方形，以RLU计，左边Y轴)和 IL-18BP表达(菱形，ng/ml，右边Y轴)所作的分析。X轴上每个增量代表各个 原克隆。用构建体#26稳定转染CHO细胞构建原克隆，并保持在嘌呤毒素选择 条件下。
图19与图18相同，但用构建体#140转染细胞构建原克隆。
图20所示为在96孔板中分析用构建体#26或者#140转染的原克隆的萤 光素酶表达，倒转ChemiDoc观看。

本发明意外地发现，小鼠巨细胞病毒(mCMV)的即刻早期2(IE2)基因启动 子有效地提高非mCMV IE2蛋白质本身的感兴趣多肽，即异源多肽或蛋白质 的表达。这一表达载体不一定是小鼠巨细胞病毒本身，或者含有任何全mCMV 病毒性基因，但它应是重组蛋白质表达的载体。
所以，本发明涉及一种含有mCMV-IE2基因启动子或其功能性表达启动 片段的表达载体，其中该表达载体不含有任何全mCMV基因。
此外，在mCMV-IE2区鉴定到一个新增强子，它在此处被称为mCMV IE2 增强子，或者IE2增强子。这种增强子增加基因表达，与它相对于基因的位 置或方向无关，并且增加异源启动子驱动的表达，因此满足关于增强子的一 般标准。
所以，本发明也涉及一种含有mCMV-IE2基因增强子或其功能性表达增 强片段的表达载体，其中该表达载体不含有任何全mCMV基因。
本领域技术人员应当理解，本发明的载体可仅含有mCMV IE2启动子， 或者还含有任何适当的已知增强子。本领域技术人员也应当理解，本发明的 载体可仅含有mCMV IE2增强子，或者还含有任何适当的已知启动子。另外， 本发明的载体可含有mCMV IE2启动子与mCMV IE2增强子的组合。
mCMV IE2基因本身已为人所知，例如Messerle等人(1991)对它作了描 述。
本文所用的术语“启动子”指的是其功能是控制一或多个DNA序列转 录，并且结构特征为存在一个DNA依赖性RNA聚合酶结合位点以及存在相 互作用以调节启动子功能的其它DNA序列的DNA区。启动子的功能性表达 启动片段是一个短的或截短型启动子序列，但保留了启动子活性。启动子活 性可用本领域任何公知的试验测定，例如通过使用萤光素酶为报导基因 (Wood，1991；Seliger和McElroy，1960；de Wet等人(1985)，或购自Promega) 的报导基因试验来测定。
本发明的IE2启动子例如可以含有从位置+1到TATA盒的序列，如图1 所示。IE2启动子也可以含有从图1所示序列核苷酸1至39(框)的序列，此处 称之“核心启动子”。本领域技术人员应当理解，mCMV IE2启动子序列可以 比核心启动子长或短，只要它能驱动与它操作性相连的DNA序列转录。例如， IE2启动子也可以含有核心启动子上游100-200个碱基对。这一启动子区也叫 “近端启动子”。本领域技术人员还应当理解，术语“启动子”和“增强子” (见下文)的定义不是完全一致，因此，启动子可以包含增强子区，或者增强子 区可以包含启动子区，视乎命名和上下文说明。
术语“载体”指的是用来将外源DNA转移到宿主细胞内复制和/或通过 宿主细胞适当表达外源DNA的任何外源DNA或RNA运载体。
术语“操作性相连的”指的是把启动子与结构基因或cDNA或待转录的 任何其它DNA序列在适当读框内功能性融合，以在启动子控制下表达基因、 cDNA或其它DNA。此处所用的术语“操作性相连的”不仅仅限于DNA序 列的直接融合。
术语“全mCMV基因”指的是具有自身(内源性，病毒)5’和3’调节元件 的小鼠巨细胞病毒的病毒性基因。
术语“增强子区”指的是其功能是增加一或多个基因转录的DNA区。 更具体地说，此处用的术语“增强子”是一个与它相对于需要表达的基因的 位置和方向无关，能提高、增强、增进或改善该基因表达，并且可以提高、 增强、增进或改善一个以上启动子表达的DNA调节元件。较佳地，增强子同 时增加一个以上启动子驱动的表达。增强子的功能性表达增强片段是一个短 的或截短型增强子序列，但保留了增强子活性。
本发明的载体最好含有一个包括mCMV IE2上游区核苷酸-387至-189 的片段，核苷酸编号以IE2基因的+1为基准。此片段具有增强子功能，此处 也称作IE2增强子短型。
在另一优选实施例中，载体含有一个包括mCMV IE2上游区核苷酸-587 至-189的片段，核苷酸编号以IE2基因的+1为基准。此片段具有增强子功能， 此处也称作IE2增强子长型。
本发明的载体也可含有另一个mCMV IE增强子，或其功能性表达增强 片段，此处将该增强子称为“CMV IE1增强子”。
这样一个mCMV IE1增强子已为本领域所知，例如美国专利US 4,968,615 对它作了描述。它可以例如横跨图1所示序列的位置-587到-147，或者位置 -682到-147，编号以IE2基因的+1位为基准。本发明可用的mCMV IE1增 强子还可包含横跨碱基对-1330到-488的序列，以图1中的IE2基因的+1位 为基准。增强子区可以包含全部或部分启动子。
利用mCMV增强子和IE2启动子，可以进一步增加感兴趣多肽的表达。
本发明的载体还包含一个不同于mCMV-IE2启动子的启动子，或其功能 性表达启动片段。
在一优选实施例中，本发明的载体含有第一和第二病毒性、细胞性或人 工启动子，或其功能性表达启动片段。
根据本发明，由于有了第二启动子，所以mCMV IE2启动子能有效地表 达感兴趣多肽。所以，在一优选实施例中，载体含有mCMV IE2启动子与第 二启动子或其功能性表达启动片段的组合。其它适当启动子的例子包括 hCMV启动子、金属硫蛋白启动子(MT)、SV40启动子或人工启动子。较佳地， 第二启动子是mCMV IE2启动子的另一个拷贝。此类其它启动子可以促进组 成型或调节型表达。调节型表达可以是诱导型或阻抑型表达，或者二者都有。
这样的第二启动子最好是mCMV-IE1基因启动子，或其功能性表达启动 片段。特别优选的情况是，第一启动子是mCMV-IE2启动子，或其功能性表 达启动片段，第二启动子是mCMV-IE1启动子，或其功能性表达启动片段。
mCMV-IE1启动子是已知的，例如可从WO 87/03905获知。它可包含核 心启动子，该核心启动子含有图1所示序列的最后47bp(框)，或上游序列附 加100至200bp(即近端启动子)，或者它可包含整个基因间区，延至位置-1330 (以IE2基因的+1位为基准，见图1)。
在一优选实施例中，载体含有SEQ ID NO：1所示的DNA序列，包括IE1 和IE2启动子以及IE1增强子和新IE2增强子，或其任何功能性表达启动片 段。
在一高度优选实施例中，本发明载体的启动子或其功能性表达启动片段 与编码至少一个多肽的DNA序列操作性相连。在本发明另一优选实施例中， 本发明的增强子与编码至少一个多肽的DNA序列同时存在于表达载体上。
DNA序列最好编码感兴趣蛋白质。
另一较佳情况是，DNA序列编码标记蛋白质，或者是可扩增基因。
又一较佳情况是，DNA序列编码报导基因蛋白质。
如果本发明的载体含有一个以上启动子，感兴趣蛋白质、标记蛋白质、 报导基因、可扩增基因等的任意组合或次组合都可用同一个质粒表达。
根据本发明，感兴趣多肽可以是不同于IE2多肽的任何多肽，也可以是 诸如肽激素、细胞因子或生长因子等胞外蛋白质，或者诸如生长因子受体或 激素受体等跨膜蛋白质，或者诸如激酶、磷酸酶或DNA结合蛋白等胞内蛋白 质，取决于感兴趣多肽或它在其中表达的宿主细胞的预定用途。
适合本发明使用的标记蛋白质例如是阴性或阳性选择标记物或可扩增基 因。这样的例子包括选自以下组的蛋白质：腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷 酸转移酶(neo)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷 激酶(tk)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、多重耐药基因(MDR)、鸟氨酸 脱羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性(CAD)、或嘌呤霉素-乙酰转移 酶(PAC)。其它例子包括利用特定代谢途径来选择的基因，例如半乳糖激酶 (Schumperli等人，1982)、叶酸受体(Zhu等人，2001)、或还原性叶酸载体(Assaraf 等人，1992)。
在另一优选实施例中，感兴趣多肽是报导基因。
此处使用的术语“报导基因”或“报导基因蛋白质”指的是编码基因产 物的基因，可用简单低廉的方法或试剂鉴定，并且可与本发明的启动子区， 或其活性片段操作性相连。用报导基因来确定筛选试验的转录活性(例如见 Goeddel(ed.)，Methods Enzymol.，Vol.185，San Diego.Academic Press，Inc. (1990))，例如，以萤光素酶为报导基因(Wood，1991；Seliger和McElroy，1960； de Wet等人(1985)，或购自Promega)。
这样的例子选自：萤光素酶、绿色萤光蛋白、碱性磷酸盐、O-半乳糖苷 酶、或辣根过氧化物酶或与其它蛋白质的分子内组合，譬如绿色萤光蛋白(GFP) 或增强型GFP(EGFP)与嘌呤霉素-乙酰转移酶基因(Abbate等人，2001)，或其 组合。
本发明的实验数据表明，用存在于同一个质粒上的IE2和IE1启动子可 以有效地同时表达感兴趣多肽。所以，在一优选实施例中，mCMV IE2启动 子和mCMV-IE1启动子，或其功能性表达启动片段，分别与一多肽操作性相 连。
如果一个双向结构内含有两个启动子，可以获得高水平表达。所以，使 mCMV-IE2启动子或其功能性表达启动片段，和一个启动子特别是mCMV-IE1 启动子或其功能性表达启动片段双向设置。
此处使用的术语“双向设置”指的是两个启动子以相反方向驱动转录。 质粒DNA的这种设置也称载体的“双向结构”。
mCMV-IE1或mCMV-IE2基因启动子，或其功能性表达启动片段，或者 可与mCMV-IE2启动子联用或可与IE2增强子联用的的任何其它启动子，还 可以包括一个翻译起始信号。
在一优选实施例中，mCMV-IE2基因启动子或其功能性表达启动片段， 或者mCMV IE2增强子与调节或影响转录的其它元件相连。这些元件可影响 RNA的加工、稳定性或翻译效率。适当元件的例子选自以下组：5’UTR、内 含子、3’UTR(例如见Mazumder等人，2003)、mRNA 3’端加工序列(例如聚 腺苷酸化位点)、以及用于多顺反子性表达的IRES序列(例如见Mountford和 Smith，1995)。
优选使用表达多顺反子性mRNA的IRES元件，其中编码序列被IRES 隔开。它的优点在于用同一个mRNA因此可用同一个启动子表达多个感兴趣 多肽。
在又一优选实施例中，mCMV-IE2基因启动子单独，或与mCMV IE1基 因启动子，或与任何其它天然或人工启动子，或与IE2增强子的组合，可与 其它表达启动序列相连，如绝缘体、边界元件、LCR(例如见Blackwood和 Kadonga(1998)所述)或者基质/骨架附着区(例如见Li等人，1999所述)。
本领域技术人员可以理解，本发明的载体还可含有其它增强子，例如公 知的SV40增强子或hCMV增强子。
根据本发明，与第一启动子，优选与mCMV IE2启动子，操作性相连的 多肽和与第二启动子，优选与mCMV IE1启动子，操作性相连的多肽可以相 同。在这种情况下，同一基因的两个拷贝存在于同一个载体上，但受两个不 同启动子控制。因此，获得的表达率可以比由编码感兴趣多肽的基因的单个 拷贝获得的表达率高。
在一替换实施例中，与第一启动子，优选与mCMV IE2启动子，操作性 相连的多肽和与第二启动子，优选与mCMV IE1启动子，操作性相连的多肽 可以不同。因此，本发明提供一种有效载体，它能够共表达两个不同多肽， 例如选择标记蛋白和感兴趣蛋白质，共表达同一蛋白质中两个或多个亚基或 者同一蛋白质中不同结构域，只要它适合在同一个宿主细胞内独立地各自表 达它们。
本领域技术人员应当理解到，本发明多个表达载体可被共转染到同一个 细胞内，用来表达多个蛋白质和/或相当复杂的多聚蛋白质的亚基。
较佳地，与第一启动子，例如mCMV IE2启动子，操作性相连的多肽是 二聚或多聚蛋白质的第一亚基；与第二启动子，优选与mCMV IE1启动子， 操作性相连的多肽是二聚或多聚蛋白质的第二亚基。本发明优选的是共表达 二聚蛋白质的两个亚基。特别优选的是共表达同一蛋白质的两个亚基，这是 因为由两个启动子共表达可以产生差不多数量的亚基，或者可以获得预定比 值的两个多肽，取决于所用启动子的强度。然后，可以把亚基装配在同一个 细胞内，形成一个成熟蛋白质。
适合用本发明载体表达的二聚蛋白质的优选例子是肽激素的α-链和β- 链，例如人FSH、人LH、人TSH和人CG。可将两个亚基其中之一与本发 明的启动子，优选与mCMV IE2启动子相连。本领域技术人员应当理解到， 本发明同样可使用来自其它物种的激素，例如马、猪、牛激素，取决于重组 多肽的预定用途。
在本发明另一个实施例中，第一亚基是免疫球蛋白重链，第二亚基是免 疫球蛋白轻链，反之亦然。适当免疫球蛋白的优选例子是IgG。这样的免疫 球蛋白可以是例如治疗用的人源化或人抗体。人源化抗体的高度优选例子是 商标名为Raptiva的人源化抗-CD11抗体。
许多感兴趣的多肽可以用本发明的载体表达。在优选实施例中，多肽选 自以下物质组成的组：绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素-绒毛膜 促性腺激素、促甲状腺激素、人生长激素、干扰素(如干扰素β-1a、干扰素 β-1b)、干扰素受体(如干扰素γ受体)、TNF受体p55和p65、白介素(如白介 素-2、白介素-11)、白介素结合蛋白(如白介素-18结合蛋白)、抗-CD11a抗体， 及其突变蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。
优选的其它感兴趣多肽包括例如促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、 粒-巨噬细胞集落刺激因子、垂体肽激素、绝经期促性腺激素、胰岛素样生长 因子(如生长调节素-C)、角化细胞生长因子、神经胶质细胞系产生的神经营养 因子、血栓调节蛋白、碱性纤维母细胞生长因子、胰岛素、因子VIII、生长 激素、骨形态形成蛋白-2、血小板产生的生长因子、水蛭素、epoietin，重组 LFA-3/IgG1融合蛋白、葡萄糖苷脂酶，及其突变蛋白、片段、可溶性形式、 功能性衍生物、融合蛋白。
本发明第二方面涉及用至少一种上述载体转染的宿主细胞。本领域技术 人员应当理解，这种宿主细胞同样可用本发明的两或多个载体共转染。
很多宿主细胞都适用于本发明，例如由各种各样真核生物细胞获得的原 代或已建立细胞系，包括植物和动物细胞、哺乳动物或人细胞。例如，适当 的宿主细胞包括CHO细胞、COS细胞、CV1细胞、鼠L细胞、HT1080细胞、 BHK-21细胞、HEK293细胞、NIH-3T3细胞、LM细胞、Y1细胞、NS0和 SP2/0鼠杂交瘤细胞等、Namalwa细胞、RPMI-8226细胞、Vero细胞、WI-38 细胞、MRC-5细胞或其它永生和/或转化细胞。
宿主细胞优选是CHO细胞，更好是CHO-S细胞，例如见Shotwell等人 所述(1982，J Biol.Chem.257：2974-2980)。Puck(J.Exp.Med.108，945，1958) 首先从雌性中国仓鼠卵巢活组织切片培养出CHO细胞。由这些原始细胞，制 备了大量具有不同特性的亚细胞系。这些CHO细胞系之一是CHO-K1，它需 要有脯氨酸，是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的二倍体。由此细胞系产生的另 一细胞系是DHFR缺陷CHO细胞系(CHO DUK B11)(PNAS 77，1980， 4216-4220)，其特点为缺少DHFR功能，结果有一个DHFR基因产生突变， 伴随另一个基因丧失。
所有这些细胞系都可以用半稳定方式(例如若载体是附加型)或稳定方式 (例如整合到基因组中)用本发明载体瞬时转染，。最好采用稳定转染，这样可 以构建连续地表达感兴趣多肽的克隆。
本发明的IE2启动子或者IE2增强子，可在一种称作“内源基因激活” 的技术框架下作为调节元件。本发明的载体可包含导入基因座的基因组，该 基因组可以被同源重组激活，由此将调控序列(IE启动子和/或增强子)与需要 诱导或增强其表达的感兴趣基因操作性相连起来。这种技术的描述见例如 WO 91/09955。
本发明第三方面涉及一种生产感兴趣多肽的方法，该方法包括用本发明 载体转染宿主细胞的步骤。
取决于感兴趣多肽的性质，利用本发明的方法，可以从细胞培养上清液 中收获分泌性蛋白质或多肽，或者通过已知方法从细胞分离出细胞膜蛋白质 或胞内蛋白质。根据本发明方法产生的多肽有广泛用途，最好把它用作治疗 蛋白质，供人或动物用。
视乎预定用途，利用本发明的方法得到的产物可以是带有整合多肽的细 胞。这样一种细胞可以例如用在细胞治疗法中。
本发明第四方面涉及一种生产感兴趣多肽的方法，该方法包括培养本发 明宿主细胞的步骤。
在一优选实施例中，该方法还包括从宿主细胞或细胞培养上清液分离感 兴趣多肽的步骤。此步骤特别适宜而且易于应用在从细胞培养上清液可简单 地分离出来的分泌性蛋白质中。不过，此步骤同样可用在从细胞膜或胞内区 室分离多肽的情形，所述细胞膜或胞内区室自宿主细胞分离出来。
该方法可应用在瞬时、稳定、附加型或病毒表达系统中。如以下实施例 所示，本发明的载体如果用在稳定表达系统中，所希望的蛋白质表达特别强。
本发明第五方面涉及本发明载体在表达感兴趣基因中的用途。感兴趣基 因例如可以是编码上述感兴趣多肽中任何一种的基因。本发明的载体也可用 来表达标记基因、报导基因、可扩增基因等等。
较佳地，用本发明的载体同时表达两个或多个感兴趣基因或cDNA。它 也可用来同时表达一个感兴趣基因和一个标记基因或报导基因或可扩增基因 等等。
本发明意外地发现，本发明载体，特别是含有IE2启动子、IE2增强子和 IE1启动子的载体，能够鉴定高度表达报导基因和感兴趣基因的克隆。所以， 本发明第六方面涉及本发明载体在选择表达高含量感兴趣基因中的用途。
本发明第七方面涉及本发明载体在制备用于质粒或DNA疗法或者基因 疗法的药物中的用途。
本发明第八方面涉及本发明的宿主细胞在制备用于细胞疗法的药物中的 用途。如果细胞治疗的对象是人，宿主细胞适宜是人细胞或细胞系，更好是 取自接受治疗的病人的细胞或细胞系。
已经对本发明作完整叙述，本领域技术人员懂得，在不偏离本发明的精 神和范围下，无需进行过多实验就可在等效参数、浓度和条件的较宽范围内 进行本发明。
虽然本发明结合具体实施例作了描述，但应明白可作进一步的改进。本 申请旨在覆盖任何变化、应用和适应性变化，它们一般来说遵循本发明原则， 是本发明所属领域已知的或可从常规实践中得出的，以及如所附权利要求范 围所述适合上述基本特征的未在本发明中公开的内容。本发明的原理和不脱 离本文公开的内容都可如本发明权利要求所述的基本特征应用本领域已知的 或习惯的方法实施。
本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或 外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均整体纳入本文参考 文献中，包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文 引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。
参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承 认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中公开得到、启发 或者暗示。
上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用 本领域的一般技术常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实 验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作 出改变和/或调整。所以，根据本文所述和指引，意味着这样一些改变和/或调 整在本发明所公开的实施例相等的范围内。需要知道的是，本文的用语或术 语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根 据本文所述和提供的指引，并结合本领域普通技术人员所知道的常识作出解 释。
实施例
实施例1：评价瞬时转染中的表达载体
材料和方法：
材料
细胞：CHO-S，来自Gibco/Invitrogen(Cat no 11619)。
按照制造商的方案，用Nucleobond PC 500试剂盒(Macherey-Nagel Cat. No 740574)在过夜生长标准培养基中分离出如图2和图3所示的质粒DNA。
转染：
转染试剂：Lipofectamine(Invitrogen，Cat No 18324-012)
格式：24孔板
细胞：转染前24小时使处于指数生长期的CHO-S细胞传代。为了避免 低细胞密度的稳定期，将细胞稀释至0.75×106细胞/ml。要转染的细胞总量 为1.5×105，重悬于24孔板中，每孔有100μl无血清培养基SFM II(Invitrogen， Cat No 12052-114)。
转染混合物如下：
A)Lipofectamine：2μl
SFM II培养基：48μl
总体积：50μl
B)DNA：1μg(50ng表达载体+950ng运载质粒，pBluescript II KS(+)， Stratagene，cat.212205-01)
SFM II培养基：配至50μl
将溶液A和B混合，室温培养30分钟。
在含有1.5×105细胞的100μl SFM II培养基中加入此混合物。把细胞放 回培养器中，在37℃、5％CO2条件下培育3小时。然后，加入400μl SFM II 培养基，稀释转染试剂Lipofectamine。分析样品之前再将细胞培育多48小时。 所有转染都重复三次。
萤光素酶测定：
采用Promega的Bright-Glo萤光素酶测定系统(Cat No E2610)，按照制 造商指示进行萤光素酶测定。
简言之，均匀混合(pipetting up and down)多次，均化细胞悬液，取一等分 试样50μl，放在白色的96孔板(Nunc，Cat no 236108)中。然后，加入50μl 重组Bright-Glo试剂，室温培育5分钟。在5秒钟捕获时间内用Centro LB 960 光度计(Berthold Technologies)测定发光量。
结果
图2所示为用在CHO-S细胞瞬时表达系统中的表达载体构建体。此系列 实验以萤光素酶为报导基因，评价基因表达。完全无启动子(构建体A)和有 SV40启动子/增强子(构建体B)的载体在CHO-S细胞内活性较低，用作对照。
使用载体A至G的瞬时转染实验结果见图4。构建体C和F的萤光素酶 表达由IE1启动子驱动。两种构建体都获得萤光素酶表达。此外，构建体C 的IE2启动子与IE1启动子为双向设置。与单独使用IE1启动子的构建体F 相比，此双向设置降低了构建体C中IE1启动子驱动的表达效率。IE1启动 子的0.68kb短型(构建体G)比长型(构建体F)效率低。
无论同一构建体内是否存在第二启动子，IE2启动子都能有效地驱动萤 光素酶表达(构建体D和E)，因此可用作表达载体的启动子元件，以表达感 兴趣多肽。
与IE1启动子相反，如果单独使用IE2启动子(构建体E)，其效率比在双 向结构(构建体D)中使用时低。所以，它特别适用于双向表达载体。 实施例2：评价稳定转染中的表达载体
材料和方法：
方法：
细胞：CHO-S，来自Gibco/Invitrogen(Cat no 11619)。
按照制造商提供的方案，用Nucleobond PC 500试剂盒(Macherey-Nagel Cat.No 740574)在过夜生长标准培养基中分离出质粒DNA(图2)。
转染：
转染试剂：Lipofectamine(Invitrogen，Cat No 18324-012)
稳定转染采用T75烧瓶。转染前24小时使处于指数生长期的CHO-S细 胞传代。为了避免低细胞密度的稳定期，将细胞稀释至0.75×106细胞/ml。 要转染的细胞总量为5×106，重悬于T75烧瓶的7ml无血清培养基SFM II (Invitrogen，Cat No 12052-114)。
转染混合物如下：
A)Lipofectamine：52.1μl
SFM II培养基：517.9μl
总体积：570μl.
B)DNA：10μg线性质粒DNA，(9μg萤光素酶表达载体+1μg选择质粒： SV40启动子驱动嘌呤霉素耐药基因。所有质粒都用PvuI线性化)。
SFM II培养基：配至570μl。
将溶液A和B混合，室温培养30分钟。加入含有5×106细胞的7ml SFM II培养基。把细胞放回培养器中，在37℃、5％CO2条件下培育3小时。然 后，使培养基以800g离心3分钟，细胞沉淀物重悬于5ml EX-CELL 325(JRH， Cat no 14335-1000M)，补充1X HT和4.5mM L-谷氨酰胺(100X HT， Invitrogen，Cat.no 11067-030，L-谷氨酰胺200mM，Sigma，G-7513)。直接 在T75烧瓶中加入5ml EX-CELL 325，重悬粘着细胞，并加入到悬液中。10 ml EX-CELL 325培养基中共有5×106个细胞。
选择步骤：
转染后48小时进行选择，交换培养基，并用含10μg/ml嘌呤霉素的 EX-CELL 325(Sigma，P-8833)稀释至1×106细胞/ml。每两天计算细胞数， 离心，以1×106活细胞/ml的密度重悬于新鲜的选择性培养中。在这些时间 点检查细胞存活率。经过21至35天后，完成选择，细胞存活率超过80％。
萤光素酶测定：
培养基取样前2小时，计算细胞数，并将培养基稀释至0.2×106活细胞 /ml。
采用Promega的Bright-Glo萤光素酶测定系统(Cat No E2610)，按照制 造商指示进行萤光素酶测定。
简言之，均匀混合(pipetting up and down)多次，均化细胞悬液，取一等分 试样50μl，放在白色的96孔板(Nunc，Cat no 236108)中。直接加入50μl重 组Bright-Glo试剂，室温培育5分钟。在5秒钟捕获时间内用Centro LB 960 光度计(Berthold Technologies)测定发光量。
以测试样品中活细胞数目，即一般情况为1×104细胞，标准化萤光素酶 活性。
结果
在稳定表达系统中测试构建体C、D、E和F(见图2)。实验结果见图5。 仅含有IE2启动子的构建体E在此系统中的萤光素酶表达最强。如果双向结 构中同时存在IE1启动子(构建体D)，IE2启动子获得的萤光素酶表达比仅用 IE1启动子(构建体F)或者与IE2启动子组成双向结构(构建体C)驱动的表达都 高。
实施例3：用双向表达载体共表达两个感兴趣多肽
材料和方法：
参照实施例1和2的方法进行转染。简言之，在24孔板中用900、500、300 和100ng载体DNA(构建体C-2，见图3)瞬时转染CHO-S细胞(悬液，Gibco SFMII) (每种条件重复三次)。转染后两天，对细胞提取物进行萤光素酶分析，以RLU (相对光亮度单位)计，重复三次试验。先取出这些孔中的上清液，再溶解细胞， 汇合，用ELISA试验分析IL-18BP(见下文)。
IL-18BP的ELISA试验
采用结合了生物素并用蛋白质G-纯化的单克隆抗-rh-IL-18BP抗体在标准 ELISA试验测定上清液中的重组人IL-18BP(rhIL-18BP)的数量。以 Extravidine-HRP(Sigma)为检测试剂。
图9所示为用双向mCMV启动子构建体(见图3)稳定转染后90天由48个克 隆表达的IL-18BP数量(ng/ml)和萤光素酶数量(RLU)。萤光素酶的检测极限约 500RLU，IL-18BP的检测极限为2.5ng/ml。
结果
此系列实验分析了图3所示构建体C-2的两个基因共表达。IE1启动子表达 标记基因(萤光素酶)，IE2启动子表达感兴趣基因即IL-18BP基因。IL-18BP是 一种分泌性蛋白质。两个启动子为双向设置，即两个启动子以相反方向同时 驱动表达。
本研究结果见图6至图9。图6所示为在瞬时表达系统中测到的萤光素酶表 达水平，以RLU计。在该同一个瞬时表达系统中，通过ELISA试验测定细胞 培养上清液中的IL-18BP。图7所示为分泌性IL-18BP的结果(ng/ml)。图8所示 为每个瞬时表达实验中IL-18BP与萤光素酶之比。
如图6至图8所示，使用不同数量的质粒DNA来转染。所有不同数量的 DNA都能够表达萤光素酶和IL-18BP。令人惊奇的是，转染DNA数量最低(100 ng载体DNA)，获得的结果反而最好，IL-18BP和萤光素酶都是这样的结果。
此外，稳定系数(图8)表明，两个启动子表达能力的关系保持不变。
结论是，这些数据表明，用两个启动子单元可同时表达两种基因，而两 个表达单元在双向启动子结构中完全正常运作。
接着，稳定地转染构建体C-2，分析48个不同克隆的萤光素酶和IL-18BP 表达。
按照实施例2的方案进行稳定转染，不同之处在于转染后采用的培养基 是ProCho5(Cambrex，cat.12766Q)。
要克隆单个细胞，用Multidrop分配器(ThermoLabsystems，cat.5840150) 将稳定池(stable pools)排列在384孔板(Nunc，cat.164688)中，密度为0.5细胞 /孔(70μl/孔)。8天后，随机选取192个克隆分析萤光素酶表达。从中选定萤 光素酶表达最高的48个克隆，再分析萤光素酶(测定光亮度)和IL-18BP表达 (ELISA试验，见上文)。
图9给出此实验的结果。全部48个克隆都表达萤光素酶和IL-18BP，但 表达的数量不同。
实施例4：最小增强子序列定义
材料和方法
质粒DNA
利用PCR(聚合酶链式反应)技术及与mCMV启动子匹配的特定引物(表1) 构建了一组含短型mCMV启动子的载体。
PCR条件如下：
混合物：
10ng DNA质粒(prevmCMV-萤光素酶(ΔXhoI)，图2所示的构建体E)
50pmol有义和反义引物(见下表1，全部为常见反义引物)
dNTP(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)各200μM
1X Dynazyme缓冲液，含有1.5mM MgCl2
4单位Dynazyme II DNA聚合物酶(Finnzymes，cat.F-501S)
循环参数：
95℃，5分钟
循环2次：
95℃，30秒
52℃，30秒
72℃，1分30秒
循环2次：
95℃，30秒
54℃，30秒
72℃，1分30秒
循环10次：
95℃，30秒
58℃，30秒
72℃，1分30秒
循环15次：
95℃，30秒
60℃，30秒
72℃，1分30秒
每次PCR反应取5μl，装入1％琼脂糖凝胶。剪下正确长度的条带，用 Qiagen Minilute凝胶提取试剂盒(cat.28606)纯化，然后克隆。
表1
  位置   引物   -1076   CCGCTCGAGACCTTATGTACGTGCCA   -783   CCGCTCGAGCTCCAATGGAACTTTCCTG   -587   CCGCTCGAGACTTTCCTGTTGATTCACC   -387   CCGCTCGAGCAAAACCCAGTGGAAAGTC   -189   CCGCTCGAGATGCCATATGAGTGTATTAG   E1-IE2as   CGGAATTCGATATCCGCGGCTCTC
以IE2的+1位为基准，对应于mCMV启动子所含碱基对数目的位置为： -1076，-783，-587，-387和-189。
克隆任一启动子片段所用的策略相同，用全长mCMV启动子 (prevmCMV-萤光素酶(ΔXhoI)，即图2所示的构建体E)进行PCR。再用XhoI/ EcoRI消化这些片段，在特定引物序列末端加入两个限制位点。接着，通过 XhoI/EcoRI消化除去构建体E的启动子序列，在该同一基因座插入短型。
进行瞬时Lipofectamine转染后再测定萤光素酶，以此评价构建体。采用 的其它材料和方法见实施例1。此实施例用的SFM培养基为ProCho5，Cambrex， B-12766Q。
结果
为了确定用IE2启动子获得高表达水平所需的最小序列，构建了载体H至 N(图10.a)，它们含有驱动萤光素酶基因的mCMV IE2启动子。
在采用CHO-S细胞的瞬时表达系统中使用了七种表达载体构建体H至N。 实验结果见图10.b。此系统中，构建体L是保留了强的萤光素酶表达的最短构 建体。构建体M获得的萤光素酶表达水平约为构建体H至L所能获得的30％。 构建体N获得的萤光素酶表达非常低，但仍然有意义，这表示含有TATA盒和 起始密码子的生产性转录起始位点具有如预想一样的基础启动子活性。
结论是，这些实验确定了mCMV IE2上游区一个新增强子，此处称作 mCMV IE2增强子。在上述实验中，IE2增强子增加了留在构建体N内的最小 IE2启动子驱动的转录。高水平表达报导基因所需的最小序列在-587至-189bp 片段内(构建体L)，含有-387至-189bp片段的构建体仍然具有提高萤光素酶表 达的能力(构建体M)。
实施例5：新IE2增强子激活SV40最小启动子
为了评估新IE2增强子确实满足增强子活性所要求的全部标准，即独立 于(1)位置，(2)方向增加表达，以及(3)启动子性质，进行了另外一些实验。为 此，构建了构建体O至V，以评估该新IE2增强子是否能够提高异源启动子 SV40启动子的表达，而与相对于SV40启动子的方向、距离和位置(5’或3’) 无关。以构建体W、X和Y为对照，W含有SV40增强子，X不带有任何增 强子但含有SV40启动子，Y既没有增强子也没有启动子。
构建载体
用pGL3-对照(Promega，E 1741)构建了一种仅有SV40启动子的载体， 称作pSV-Luc(图11.a所示的构建体X)，也构建了如下载体：含有驱动萤光 素酶基因的SV40启动子以及在基因3’处有SV40增强子(构建体W)、无启动 子和增强子的pGL3-基本型(Promega，E1751)(构建体Y)。
简言之，用NotI/XbaI切割pGL3-对照，分离得到一个含SV40启动子， 后面为萤光素酶基因的片段。类似地，用NotI/XbaI切割pGL3-基本型，分 离得到含有poly A区但没有3’增强子的载体骨架。将两个片段合并，得到 pSV-Luc(构建体X)。
以两个方向克隆IE2增强子序列(-587至-189)，加工此载体的SV40启动 子5’区，得到p5’enh-SV-Luc(构建体O)和p5’反向enh-SV.Luc(构建体Q)。 另外，也可以两个方向将IE2增强子序列(-587至-189)克隆到萤光素酶基因3’ 区。得到的载体称作p3’enh-SV-Luc+(构建体S)和p3’反向enh-SV.Luc(构建 体U)。
对IE2增强子短型(即具有-387至-189而非-587至-189片段)，进行同样 程序，得到构建体P、R、T和V，见图11.a。
构建体O、P：接受载体为pSV-Luc+(图11.a所示的构建体X)，以 NheI/SmaI消化打开。先用NdeI消化，再以克列诺聚合物平端反应，纯化和 NheI消化，分离出全长增强子。该策略同样用于短型增强子构建体的构建。
构建体Q、R：接受载体为pSV-Luc+(图11.a所示的构建体X)，以 XhoI/SmaI消化打开。先用NdeI消化，再以克列诺聚合物平端反应，纯化和 XhoI消化，分离出全长增强子。该策略同样用于短型增强子构建体的构建。
构建体S、T、U和V：接受载体为pSV-Luc+(图11.a所示的构建体X)， 以BamHI消化再用克列诺聚合物平端反应打开。先用NdeI/NheI消化，再以 克列诺聚合物平端反应，分离出全长增强子。克隆获得了双向结构，通过限 制酶切分析加以鉴定。保留两个方向作分析。该策略同样用于短型增强子构 建体的构建。
构建体pGL3-基本型(构建体Y)，用作无表达对照。pGL3-对照(构建体 W)用作SV40启动子/增强子载体。pSV-Luc是仅有SV40启动子的对照(构建 体X)。
按照上述实施例的方法，进行转染和萤光素酶测定。
结果
图11.a所示的构建体O至Y获得的实验结果见图11.b。以无增强子的 SV40启动子构建体作为提高增强子活性的基线，把测得的构建体X活性定 为1。具有长或短IE2增强子的全部构建体都能表达报导基因。长型总能导致 SV40启动子高水平表达报导基因，该水平比SV40启动子和SV40增强子的 组合(构建体O)所获得的表达水平高。所以，本实验清楚地明确了-587至-189 序列和-387至-189序列为真正(bona fide)增强子，以不依赖于位置和方向的 方式激活异源启动子。
实施例6：IE2增强子长型(-587至-189)与hCMV增强子之比较
按照实施例1所述的实验结果，进行Lipofectamine转染，再测定萤光素 酶。
结果
在此实验中，构建体O和Q的SV40启动子5’在两个方向上都有新IE2 增强子长型，用它们来与已知的强增强子hCMV(人巨细胞病毒)增强子作比 较。为此，在构建体O内用hCMV增强子序列(SEQ ID NO：2)置换mCMV IE2 序列，得到构建体O-2。对构建体Q作同样处理，得到构建体Q-2。
用来克隆的hCMV增强子序列如下，它的侧边为MluI位点(MluI＝acgcgt)：
aCGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTC
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGAC
CGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAA
TAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAG
TACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGC
CCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCT
ACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTG
GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTT
TGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCACGCG
TGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCG
CCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCcacgcgt
SV-Luc+用MluI消化，小牛肠碱性磷酸酶处理，防止自我连接(self ligation)。在MluI位点内克隆hCMV启动子序列。保留两个方向的克隆以便 与等效IE2构建体进行比较。
萤光表酶表达结果见图12。新IE2增强子(长型)获得的萤光表酶表达水 平至少是典型hCMV增强子所获得的萤光表酶表达水平的2倍。
实施例7：双向构建体内IE2增强子的性能
设计了另外两个构建体，即图13所示的构建体#26和#140，测试双向结 构内的新增强子。
#26：此载体基于mCMV-Luc+(构建体C，图3)。它用SacII/EcoRI消化。 IL-18BP盒来自phCMV-IL18BP2。用SacII/EcoRI切割此载体，分离得到一个 片段，该片段含有内含子A，内含子A后是IL-18BP开放阅读框和SV40polyA 区。
#140：此载体基于图10.a所示的构建体L。它用XhoI/NheI消化，打开 IE2增强子的载体5’。由IE1启动子表达IL18BP的载体称作pBS.I IL18BP(IE1).I，用作插入供体。用XhoI/SpeI消化此载体，分离得到一个片段， 该片段含有XhoI的IE1启动子(见图1)，IE1启动子后是内含子 A-IL18BP-SV40polyA盒。得到的构建体缺失-589至原始mCMV启动子序列 的XhoI之间的序列。
如实施例2所述的方法，进行稳定转染和萤光素酶测定，如实施例3所 述的方法，进行IL18BP ELISA试验。
不过，构建体#140与构建体#26并非完全映像相同，原因在于IE1和IE2 启动子为相反方向。因此，构建体#26内由IE1启动子驱动萤光素酶表达，而 构建体#140内由IE2启动子驱动萤光素酶表达；构建体#26内由IE2启动子 驱动IL18BP表达，构建体#140内由IE1启动子驱动IL18BP表达。
以下给出两个构建体获得的结果，因为它们对于新IE2增强子在同时影 响双向表达载体(构建体#140)内两个不同启动子有重要意义。
图14为用构建体#26和#140稳定转染的稳定池所获得的萤光素酶与 IL-18BP表达结果。用构建体#140获得的标记基因(萤光素酶)和感兴趣基因 (IL-18BP)表达水平较高。
为了评价萤光素酶与IL-18BP表达的稳定性，将稳定池保持在选择条件 下，即用嘌呤霉素处理，或者保持在无选择压力下(无嘌呤霉素)3星期。结果 见图15至图17。报导基因萤光素酶和IL-18BP的表达水平随时间变化不大， 见图16和17。
已经证实，在选择压力存在或不存在下构建体#26和#140随时间变化表 现相似的表达水平。所以，具有新IE2增强子的构建体适合稳定和同时表达 两种基因。
基于上述稳定池获得的结果，稀释两个池至0.5细胞/孔，获得克隆。
在嘌呤霉素选择条件下培养克隆，评价克隆表达水平。然后，在嘌呤霉 素存在和不存在下，使分离的克隆分裂，以便最终监测它们的稳定性。图18 和19所示的结果是在嘌呤霉素存在和不存在条件下克隆分裂之前获得的。除 去嘌呤霉素后2个星期获得的结果表明，两个构建体无明显差异，这提示了 克隆具有稳定性。此研究时间持续多10-12星期。
采用高通量方式评价两种基因的表达，即在96孔板内进行评价：
第1天：细胞稀释一半，100μl ProCho5培养基(无血清)+100μl含5％ 胎牛血清(FBS)的新鲜ProCho5。当终浓度含有2.5％FBS时，细胞能够粘着。 采用1/20稀释因数，维持板每周在ProCho5培养基传代。
第2天：弃掉培养基，再用200μl1x PBS(Invitrogen，10010-015)洗一次， 加入75μl含5％FBS的新鲜ProCho5，培育24小时表达脉冲。
第3天：回收50μl上清液，加入200μl ELISA缓冲液(1x PBS，0.1％w/v BSA，0.2％v/v Tween 20)。取100μl用ELISA试验分析IL-18BP。
孔板上的孔用200μl 1x PBS洗涤(弃掉)，加入100μl Glo溶胞缓冲液 (Promega，E266a)。孔在室温培养30分钟，确保细胞溶解。取30μl溶解细 胞转移到白色的96孔板，加入30μl重组Bright-Glo试剂，测定萤光素酶活 性。在5秒钟捕获时间内用Centro LB 960光度计(Berthold Technologies)测定 发光量。
对用构建体#26稳定转染获得的克隆进行分析，结果见图18，对用构建 体#140稳定转染获得的克隆进行分析，结果见图19。
图18和图19所示的克隆以它们的萤光素酶数值从高至低顺序排列。 IL18BP表达水平以OD值表示。因为ELISA试验以高通量方式进行，所以无 法对IL-18BP水平作真正定量分析。然而，本研究包括了2500ng/ml和250 ng/ml对照以及空白试验，监测板到板之变化。
图20所示为以倒转ChemiDoc看到的孔板上萤光素酶表达。观看时采用 CCD照相机(Biorad)，捕获化学发光信号(见图20)。使用的软件为Quantity One 4.2.3，可以对照片进行处理，例如将信号倒转。
根据图18至20所示结果，明显可见，用构建体#140获得大量不表达克 隆。不过，令人惊奇的是，少数阳性克隆非常强地表达两种基因。
所以，要鉴定高水平表达两种感兴趣基因的少数克隆，在克隆初期阶段 可用构建体#140筛选极高水平表达子，无需测试和追踪大量克隆。
参考文献：
1.Abbate et al.，Biotechniques 2001Aug；31(2)：336-40
2.Assaraf et al.，J Biol Chem 1992Mar 25；267(9)：5776-84
3.Blackwood EM，Kadonaga JT.Science 1998Jul 3；281(5373)：61-3
4.De Wet et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA 82，7870
5.Dorsch-Haesler，K.et al.(1985).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8325-8329
6.Goeddel Methods Enzymol.，Vol.185，San Diego
7.Li Q，Harju S，Peterson KR.Trends Genet 1999Oct；15(10)：403-8
8.Manning WC and Mocarski，ES，Virology 167，477-484(1988).
9.Mazumder B，Seshadri V，Fox PL.Trends Biochem Sci 2003Feb；28(2)：91-8
10.Messerle，M.et al.(1991).J.Virol.65：1638-1643
11.Kim，S-Y.et al.(2002).J.Biotech.93：183-187.
12.Mountford PS，Smith AG.Trends Genet 1995 May；11(5)：179-84.
13.Sandford and Burns，Virology 222，310-317(1996)
14.Schumperli et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 1982 Jan；79(2)：257-61
15.Seliger and McElroy(1960)Arch.Biochem.Biophys.88，136
16.Shotwell et al.，1982，J.B.C.257(6)，2974-80
17.Wood et al.，(1991)Biochme.Biophys.Res.Comm.124，592.
18.US patent 4’963’481.
19.US patent 4,968,615
20.Zhu et al.，J Cell Biochem 2001Mar 26；81(2)：205-19