一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法
专利汇可以提供一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种线粒体脱氢酶法检测重组人 肝细胞 生长素 生物 活性的方法，采所用的技术方案是以线粒体脱氢酶活性方法检测rhHSS产品的生物学活性，提供了一种简便易行、特异敏感的rhHSS活性检测方法。，下面是一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法专利的具体信息内容。
1.一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法，其特征在于步骤为：a：复苏冻存HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b：培养增殖后HTC细胞，以培养液调整细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品：(1)HTC细胞对照组(C组)：每孔加无血清的培养液；(2)阴性对照组(P组)：加无血清的培养液，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组：以培养液配置系列浓度；置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加MTT培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；对数据及统计学处理：所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当n＝8，t＞2.2时有活性。
2.如权利要求1所述的一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法，其特征在于步骤为：a：复苏冻存HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b：培养增殖后HTC细胞，以含小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度，铺96孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品：(4)HTC细胞对照组(C组)：每孔加无血清的DMEM-F12培养基；(5)阴性对照组(P组)：加无血清的DMEM-F12培养基，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(6)rhHSS组：以DMEM-F12培养基配置系列浓度；每组8孔，置CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次；加MTT，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；数据及统计学处理：所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1ml]。
3.如权利要求2所述的一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法，其特征在于步骤为：复苏冻存HTC细胞株，接种于10ml培养瓶培养增殖，培养增殖后HTC细胞，以含10％小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度为1.0×105个细胞/ml，铺96孔板，每孔100μl。置37℃，5％CO2培养箱培养24h，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品：(1)HTC细胞对照组(C组)：每孔加100μl无血清的DMEM-F12培养基；(2)阴性对照组(P组)：加无血清的DMEM-F12培养基，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组：以DMEM-F12培养基配置，终浓度为2.5，10，30μg/ml；每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次；加0.15mg/ml MTT 0.1ml，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜0.1ml/孔，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；数据及统计学处理：所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1ml]。
4.如权利要求1所述的一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法，其特征在于所述的有机溶剂可以为异丙醇或二甲基亚砜中任意一种。
一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法
技术领域
促进肝细胞再生是防治肝损伤的关键，而肝细胞的再生受多种细胞因子的调控，其中肝细胞生长素(hepatocyte stimulatory substance，HSS)是促进肝细胞增殖、修复肝损伤的一个重要因子。HSS的研究成为近十年肝病防治领域研究的一个热点，已有多家单位研制出了重组人肝细胞生长素(recombinant human hepatocyte stimulatorysubstance，rhHSS)，rhHSS有希望开发成治疗肝病的新生物制品药物。
与化学药物不同，蛋白质类药物的药性体现于细胞因子的生物活性，具有生物活性的细胞因子才会有药性，同时生物活性的大小也影响药性的大小，所以细胞因子类药物的活性检测是药物质量控制的重要环节，目前已报道的rhHSS活性检测方法主要包括：(1)体内检测方法：制作小鼠CCL4肝损伤模型。分组给药后观察动物病死率及肝脏病理改变，需耗时二周时间；(2)体外细胞同位素检测方法：制备原代培养的肝细胞或传代HTC(hepatocyte cancer)肝癌细胞，分组加药培养后，加入H3-胸腺嘧啶(H3-TdR)进行液闪计数。上述方法主要存在以下不足：(1)体内检测方法操作复杂、结果变异大、耗时长，不宜作为药品活性检测的常规方法；(2)体外细胞同位素检测方法存在放射线污染、变异大等不足，操作也较复杂。
本发明的目的采所用的技术方案是利用rhHSS对HTC肝癌细胞线粒体脱氢酶活性有促进作用，利用测定HTC肝癌细胞线粒体脱氢酶活性从而测定rhHSS产品的生物活性的方案。即以线粒体脱氢酶活性方法来检测rhHSS产品的生物学活性。
本发明技术方案的步骤为：a：复苏冻存的HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b：以培养液调整培养增殖后HTC细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品：(1)HTC细胞对照组(C组)：每孔加培养液；(2)阴性对照组(P组)：加培养液及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组：以培养液配置不同浓度rhHSS；置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethylthiazal-2yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；数据及统计学处理：所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当样本数n＝8时，t＞2.2有活性。
本发明技术方案进一步可以为：a：复苏冻存HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖。b：培养增殖后HTC细胞，以含小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度，铺96孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品：(1)HTC细胞对照组(C组)：每孔加无血清的DMEM-F12培养基；(2)阴性对照组(P组)：加无血清的DMEM-F12培养基，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组：以DMEM-F12培养基配置，终浓度为2.5，10，30μg/ml。
每组8孔，置CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次。加MTT，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值。检测波长570nm，参考波长630nm。
数据及统计学处理：所有数据以x±s表示，以t检验比较差别的显著性。当n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1ml]。
本发明的检测方法操作简单，无放射性污染，省时，变异小，重复性好，不需特殊仪器设备，克服了现存方法的不足之处。
每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次。加0.15mg/ml MTT 0.1ml/孔，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜0.1ml/孔，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值。检测波长570nm，参考波长630nm。
实验结果数据及统计学处理：所有数据以x±s表示，以t检验比较差别的显著性。表 rhHSS促进HTC肝癌细胞线粒体脱氢酶活性(x±s，n＝8)浓度(μg/ml) A值Control 0.355±0.007rhHSS 30 0.402±0.004**10 0.393±0.010**2.5 0.359±0.009与对照组比较，**P＜0.01n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1ml]＝100×100/(10×0.1)＝10000(单位)
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