表没食子儿茶素没食子酸酯四聚体以及含有它们的血管内皮功能改善剂
阅读：1022发布：2020-06-13
专利汇可以提供表没食子儿茶素没食子酸酯四聚体以及含有它们的血管内皮功能改善剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供能持续摄取、具有通过增强来自血管内皮细胞的NO的作用等来改善血管内皮功能的作用的化合物。具体而言，提供式(I)(式中，R1、R2、R3和R4分别为H或 没食子酸 酯基)表示的化合物或其盐、以及含有该化合物的血管内皮功能改善剂、饮食品或医药组合物。，下面是表没食子儿茶素没食子酸酯四聚体以及含有它们的血管内皮功能改善剂专利的具体信息内容。
表没食子儿茶素没食子酸酯四聚体以及含有它们的血管内
皮功能改善剂
技术领域
[0001] 本发明涉及新型表没食子儿茶素没食子酸酯四聚体化合物、该化合物的制造方法、以及含有该化合物的饮食品和医药组合物、特别是具有血管内皮功能改善作用的饮食品和医药组合物。
背景技术
[0002] 代谢综合征是一种因生活习惯或遗传因素引起内脏脂肪蓄积量增加，结果诱发胰岛素抵抗，出现脂质代谢异常、高血压、耐糖量异常等症状，容易引起血管病变的病态。这种病态最终会引起心肌梗塞、脑梗塞等动脉硬化症，最严重时还会导致死亡。
[0004] NO是在血管内皮细胞内在内皮型NO合成酶(以下简称为eNOS)的作用下由L-精氨酸和氧分子生成的。来自血管内皮的血管舒张因子NO的作用主要在于对增殖性病变、炎症性病变、血小板凝集、氧化应激的抑制作用，在动脉硬化、高脂血症等各种危险因子的存在下，可见NO的产生下降或作用不足(非专利文献2)。特别是在伴随着代谢综合征出现的胰岛素抵抗状态下，已知eNOS的辅酶四氢生物蝶呤(以下简称为BH4)的产生酶即GTP环化水解酶I(以下简称为GTP-CH1)活性下降(非专利文献1)。NO的产生下降、产生不足的机制很复杂，但已知L-精氨酸的代谢产物不对称性二甲基精氨酸(以下简称为ADMA)会抑制eNOS活性。另外，在eNOS活性下降的状态下，氧分子会优先被NADPH氧化酶代谢，产生活性氧，导致血管内皮功能进一步下降(非专利文献3)。另一方 面，血管内皮细胞通过产生ADMA分解酶即二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(以下简称为DDAH2)，能保持良好的血管内皮功能。此外，使存在于血管内皮细胞中的NADPH氧化酶的活性下降，也能保持良好的血管内皮功能。
[0005] 作为具有血管内皮功能改善效果的食品材料，已知有绿茶中含有的(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(以下也称为“EGCG”)(非专利文献4)。另外，摄入红茶能改善人上臂的血流依赖性血管舒张反应(非专利文献5)，在使用了红茶提取物的体外研究中发现eNOS的活化得到促进(非专利文献6)，但它们的活性成分尚不明确。此外，至今还没有与乌龙茶及其成分相关的研究。
[0006] 作为在乌龙茶固有的发酵过程中产生的EGCG聚合物，已单离并鉴定出二聚体(乌龙双黄烷A和乌龙双黄烷B)(非专利文献7)和三聚体(专利文献1)，据报道这些化合物具有非常强的胰脂肪酶抑制活性(非专利文献8、专利文献1)。
[0007] 专利文献1 国际公开第2005/116005号
[0008] 非专利文献1 Folia Pharmacol.Jpn.Vol.125：p285-290，2005
[0009] 非专利文献2 Journal of clinical Investigation，vol.95，p1747-1755，1995 [0010] 非专利文献3 Endocrinology，vol.148，p3773-3780，2007
[0011] 非专利文献4 Journal of Biological Chemistry，vol.279，p6190-6195，2004 [0012] 非专利文献5 Circulation.Vol.104，p151-156，2001
[0013] 非专利文献6 Journal of Biological Chemistry，vol.279，p46637-46643，2004 [0014] 非专利文献7：Chem.Pharm.Bull.37(12)，3255-3263，1989
[0015] 非专利文献8：J.Agric.Food Chem.53，4593-4598(2005)
发明内容
[0016] 在非专利文献4中记载了EGCG的血管内皮功能改善效果，但在使用了培养细胞的研究中，为了提高eNOS活性，必须至少为30～50μM这样的较高浓度。在非专利文献5中公开了红茶的血管内皮功能改善效果，据记载，让人每天摄入900ml的红茶，摄取4周，与对照组相比，上臂的血流依赖性血管舒张反应得到改善。
[0017] 如上所述，EGCG具有血管内皮功能改善效果，但其效果并不充分，为了 通过摄取含有EGCG的红茶来得到其效果，则必须摄入较多的红茶等。另外，EGCG是苦味和涩味的原因，因此在持续摄取中存在香味问题，此外红茶的大量摄取会导致咖啡因等的大量摄取，因此认为并不适合以维持血管内皮功能为目的的持续摄取。
[0018] 本发明的目的在于提供能持续摄取、具有通过增强来自血管内皮细胞的NO的作用等来改善血管内皮功能的作用的化合物、以及含有该化合物的饮食品。
[0019] 为了解决上述问题，本发明者对由EGCG等具有色满环的化合物衍生的化合物进行了研究，结果发现具有4个色满环的新型化合物具有比EGCG更好的血管内皮功能改善作用，从而完成了本发明。
[0020] 即，本发明涉及：
[0021] 1.式(I)表示的化合物或其盐；
[0022]
[0023] (式中，R1、R2、R3和R4分别为H或式(A)表示的基团。)
[0024]
[0025] 2.根据上述1所述的化合物或其盐，其如式(II)所示；
[0026]
[0027] (式中，R1、R2、R3和R4同上)
[0028] 3.根据上述1所述的化合物或其盐，其如式(III)所示；
[0029]
[0030] (式中，R1、R2、R3和R4同上)
[0031] 4.根据上述1～3中任一项所述的化合物或其盐，其中，R1、R2、R3和R4均为式(A)表示的基团；
[0032]
[0033] 5.血管内皮功能改善剂，其含有上述1～4中任一项所述的化合物或其盐； [0034] 6.饮食品，其掺有上述1～4中任一项所述的化合物或其盐；
[0035] 7.医药组合物，其含有上述1～4中任一项所述的化合物或其盐；
[0036] 8.上述1～4中任一项所述的化合物的制造方法，其包含在酸的存在下使表没食子儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素与甲醛反应的工序。
[0037] 通过在饮食品中掺入本发明的四聚体，能提供以改善血管内皮功能、增进 健康为目的的饮料或营养补充剂。另外，这些化合物即使在饮食品中掺和时也不会有损香味，因此嗜好性高，安全性也很好，因而能进行以维持血管内皮功能为目的的持续性摄取。 附图说明
[0038] 图1所示为化合物1的1HNMR谱。
[0039] 图2所示为化合物1的13CNMR谱。
[0040] 图3所示为化合物2的1HNMR谱。
[0041] 图4所示为化合物2的13CNMR谱。
[0042] 图5是表示eNOS的表达结果的图。
[0043] 图6是表示GTP-CH1的表达结果的图。
[0044] 图7是表示DDAH2的表达结果的图。
[0045] 图8是表示NADPH氧化酶的Nox4亚单位基因表达的结果的图。
[0046] 图9是表示eNOS的表达结果的图。
[0047] 图10是表示GTP-CH1的表达结果的图。
[0048] 图11是表示DDAH2的表达结果的图。
[0049] 图12是表示NADPH氧化酶的Nox4亚单位基因表达的结果的图。
具体实施方式
[0050] 本发明涉及4个色满环通过亚甲基连接而成的式(I)表示的新型EGCG四聚体化合物、式(I)的化合物的制造方法以及含有式(I)的化合物的血管内皮功能改善剂、饮食品和医药组合物。以下，对本发明进行说明。
[0051]
[0052] 本发明的式(I)表示的EGCG四聚体化合物可以如下来制造。
[0053] R1、R2、R3和R4均为式(A)表示的基团(没食子酸酯基)的式(I)的化合物可以用如下方法来制造：在溶剂中，在酸的存在下，使(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯与甲醛反应。
[0056] 关于甲醛，例如可以使用相对于1mol的EGCG为1～100mol的甲醛。
[0058] R1、R2、R3和R4均为H(氢原子)的式(I)的化合物可以用如下方法来制造：用(-)-表没食子儿茶素代替(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，使其与上述同样地和甲醛反应。
[0059] 需要说明的是，当在与甲醛的反应中使用(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯或(-)-表没食子儿茶素时，在得到的式(I)的化合物中，各色满环的2位的取代基与3位的取代基的相对空间位置为顺式(cis)。
[0060] 利用(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯或(-)-表没食子儿茶素与甲醛的反应得到的四聚体的产物，通常为含有亚甲基的色满环连接方式不同的式(II)、式(III)以及式(IV)这三种化合物中的至少两种化合物的四聚体化合物的混合物。采用公知的精制方法例如利用HP-20(三菱化学株式会社制)等苯乙烯类吸附树脂或Shephadex LH-20之类的葡聚糖类树脂的开管柱色谱法以及高效液相色谱法(HPLC)等，可以从上述混合物中单离出式(II)、式(III)以及式(IV)的各化合物。
[0061]
[0062] R1、R2、R3和R4中的1至4个为H的式(I)的化合物还可以用如下方法来制造：通过水解将没食子酸酯基从R1、R2、R3和R4均为没食子酸酯基的式(I)的化合物中除去。该水解可以使用氢氧化钠、氢氧化钾等碱性化合物的水溶液来进行，或使用具有单宁酶活性的酶等水解酶来进行。
[0063] 在上述水解中，通常，从R1、R2、R3和R4均为没食子酸酯基的式(I)的化合物中除去1个、2个、3个或4个没食子酸酯基而形成多种化合物的混合物。此时，采用公知的精制方法例如利用HP-20(三菱化学株式会社制、日本)等苯乙烯类吸附树脂或Shephadex LH-20之类的葡聚糖类树脂的开管柱色谱法以及高效液相色谱法(HPLC)等，可以从上述混合物中单离出各化合物。
[0064] 本发明还涉及式(I)的化合物的盐。
[0065] 作为这样的盐，只要是能由式(I)的化合物形成的盐即可，没有特殊限制，优选医药上能允许的盐。
[0066] 作为这样的盐，例如可以列举式(I)的化合物的锂盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐等与元素周期表的第1族或第2族的金属元素形成的金属盐。这样的金属盐例如可以在式(I)的化合物的羟基(酚性羟基、R1、R2、R3和R4中的任一个为H或均为H时的羟基)上形成。
[0067] 例如，在非质子性溶剂中，使式(I)的化合物与金属钠或氢化钠反应， 将羟基(-OH)转换成钠氧基(-ONa)，即可制造式(I)的化合物的钠盐。通过调节金属钠或氢化钠的用量，能将式(I)的化合物中含有的羟基全部转换成钠氧基，也可以只将羟基的一部分转换成钠氧基。
[0068] 本发明的式(I)的化合物是新型化合物，本发明者用制造的式(II)和式(III)的化合物作为标准品进行了研究，结果得知如后述实施例所述在乌龙茶中也存在式(II)和式(III)的化合物。因此，式(II)和式(III)的化合物以茶(Camellia sinensis)的叶子为原料。
[0069] 通过从茶类、优选乌龙茶、红茶等发酵茶或焙茶中提取、精制，也能进行单离。 [0070] 例如，利用吸附柱色谱法或高效液相色谱法(HPLC)等，可以从上述茶类单离出式(II)和式(III)的化合物。
[0071] <血管内皮功能改善剂、饮食品和医药组合物>
[0072] 本发明的化合物具有血管内皮功能的改善作用。
[0073] 即，本发明的化合物可以通过增强eNOS基因的表达，增强GTP-CH1基因的表达，增强DDAH2基因的表达，和/或减少NADPH氧化酶基因的表达，来发挥血管内皮功能的改善作用。关于eNOS基因、GTP-CH1基因、DDAH2基因以及NADPH氧化酶基因的表达的评价，可以采用文献公知的方法或下述实施例中记载的方法来进行。
[0074] 如上所述，本发明的化合物显示血管内皮功能的改善作用，因而能作为血管内皮功能改善剂使用。另外，由于本发明的化合物显示血管内皮功能的改善作用，因此通过将本发明的化合物掺入饮食品，或制成医药组合物的形态，从而制成适合人等哺乳动物摄取的形态，使用该饮食品或医药品对哺乳动物具有血管内皮功能的改善作用。
[0075] 因此，本发明还涉及掺有本发明的化合物或其盐的饮食品、以及含有本发明的化合物或其盐的医药组合物。
[0076] 本发明的化合物可以掺入各种饮食品中。对能掺和本发明的化合物的饮食品没有特殊限制，可以掺入已有的各种饮食品中。作为饮食品，例如可以列举清凉饮料、茶饮料、液体强壮剂、健康饮料、营养补充饮料、运动饮料以及碳 酸饮料(包含这些饮料的浓缩原液和调制用粉末)等饮料；以及口香糖、糖果、果冻、压片糖、健康食品、营养补充食品以及营养补充剂等食品。关于这些饮食品中的本发明化合物的比例，例如可以按0.01～10000ppm(μg/ml)的比例掺和。优选可以按0.06～2000ppm的比例掺和，更优选可以按
0.1～1000ppm的比例掺和。
0.1～1000ppm的比例掺和。
[0077] 将本发明的化合物作为药品使用时，以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体制剂和注射剂等形态提供。本发明的化合物或其盐可以直接、或用水等稀释后口服给药。或者，将其与公知的医药用载体一起制成制剂。例如，将本发明的化合物或其盐制成糖浆剂等口服液体制剂，或加工成浸膏、粉末等，与药学上允许的载体掺和，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等口服固体制剂来给药。作为药学上能允许的载体，采用作为制剂材料常用的各种有机或无机载体物质，作为固体制剂中的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂；液体制剂中的溶剂、赋形剂、悬浮剂、粘合剂等掺和。根据需要，还可以使用防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂等制剂添加物。
[0078] 关于有效剂量，可以根据患者的年龄和体重、疾病的种类和严重程度以及给药途径来适当决定。
[0079] 实施例
[0080] 用实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
[0081] [实施例1]式(II)和式(III)的化合物的合成和单离
[0082] 1.合成和利用开管柱的分离
[0083] 将6g(13mmol)的(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)(TeavigoTM，罗氏公司制、瑞士)溶于HCl的乙醇溶液120mL(0.02当量，HCl为2.4mmol)中，加入甲醛的乙醇溶液180mL(4质量％，甲醛为240mmol)，然后在室温下搅拌4小时。反应结束后，用纯水稀释至10倍，加载于吸附树脂CHP-20P柱(600mL，37-75μm，三菱化学株式会社、日本)。用1200mL的水洗涤后，用900mL的25V/V％乙腈水溶液、1200mL的30％V/V％乙腈水溶液依次洗脱，将25V/V％乙腈水溶液的洗脱组分分成各300mL的3个馏分(fr.1至fr.3)，将
30％V/V％乙腈水溶液的洗脱组分分成各300mL的4个馏分(fr.4至fr.7)。
30％V/V％乙腈水溶液的洗脱组分分成各300mL的4个馏分(fr.4至fr.7)。
[0084] 2.分取HPLC条件
[0085] 将通过CHP-20P柱精制得到的分离物进一步用反相的分取HPLC进行精制。 [0086] <条件>
[0087] 柱：Develosil ODS-HG-5(5cmφ×50cm，野村化学株式会社、日本)
[0088] 流动相A：0.05V/V％TFA/H2O(TFA：三氟乙酸)
[0089] 流动相B：90V/V％CH3CN、0.05V/V％TFA/H2O
[0090] 流速：32mL/分钟
[0091] 梯度程序：A/B＝80/20(30分钟)、A/B＝80/20→60/40(100分钟)、A/B＝60/40(30分钟)
[0092] 检测器：紫外可见光吸收检测器SPD-6AV(株式会社岛津制作所、日本)
[0093] 检测波长：A280nm
[0094] 样品：将通过CHP-20P柱精制得到的fr.2到fr.7分别溶于20V/V％乙腈水溶液中，分数次将总量加载于色谱柱。
[0095] <分离>
[0096] 在上述分析条件下，收集相当于保留时间为109分钟(化合物1)、113分钟(化合物2)、以及保留时间为85分钟(化合物3)、保留时间为106分钟(化合物4)、保留时间为104分钟(化合物5)以及保留时间为135分钟(化合物6)的各峰。
[0097] 3.化合物的结构解析
[0098] 对通过分取HPLC单离得到的化合物进行MS和NMR测定。
[0099] 采用Q-TOF Premier(Micromass公司制、英国)，在负离子、V模式下测定化合物-3～6的MS，结果分别得到m/z 927.160、927.163、1397.248、927.161的[M-H] 的离子峰。另外，化合物3的NMR谱数据与文献(Chem.Pharm.Bull.37(12)，3255-3563(1989))中记载的乌龙双黄烷-A的NMR谱数据一致。化合物4的NMR谱数据与文献(Chem.Pharm.Bull.37(12)，3255-3563(1989))中记载的乌龙双黄烷-B的NMR谱数据一致。此外，化合物
5的NMR谱与国际公开第2005/116005号的图4和图5中记载的NMR谱一致。化合物6的NMR 谱与国际公开第2005/116005号的图2和图3中记载的NMR谱一致。由这些结果可证实：化合物3是乌龙双黄烷-A，化合物4是乌龙双黄烷-B，化合物5是下述式(V)的化合物(式中，R表示没食子酸酯基)，化合物6是乌龙双黄烷-C。
5的NMR谱与国际公开第2005/116005号的图4和图5中记载的NMR谱一致。化合物6的NMR 谱与国际公开第2005/116005号的图2和图3中记载的NMR谱一致。由这些结果可证实：化合物3是乌龙双黄烷-A，化合物4是乌龙双黄烷-B，化合物5是下述式(V)的化合物(式中，R表示没食子酸酯基)，化合物6是乌龙双黄烷-C。
[0100]
[0101] 通过以下的MS、NMR对化合物1和化合物2进行结构解析。
[0102] MS采用在Q-TOF Premier(Micromass公司制，英国)的离子源安装了Z喷雾离子源得到的ESI，在负离子、V模式下测定。锥孔电压为45V，毛细管电压为3KV，脱溶剂温度为-180℃，用lock-spray进行质量校正，参比样品采用亮氨酸脑啡肽(m/z 554.2615[M-H])。 [0103] 其 结 果 为，化 合 物 1产 生m/z 1867.3112[M-H]- 的 分 子 离 子 和2 价
2-
的 933.1517[M-2H] ， 分 子 式 为 C91H72O44(err.：-11.0ppm)， 化 合 物 2 产- 2-
生m/z1867.3100[M-H] 的 分 子 离 子 和 2 价 的 933.1151[M-2H] ，分 子 式 为C91H72O44(err.：-11.7ppm)，推定任一化合物均为由4个EGCG分子通过3个亚甲基交联得到的化合物。
2-
的 933.1517[M-2H] ， 分 子 式 为 C91H72O44(err.：-11.0ppm)， 化 合 物 2 产- 2-
生m/z1867.3100[M-H] 的 分 子 离 子 和 2 价 的 933.1151[M-2H] ，分 子 式 为C91H72O44(err.：-11.7ppm)，推定任一化合物均为由4个EGCG分子通过3个亚甲基交联得到的化合物。
[0104] 在以下条件下进行NMR测定。将化合物1和化合物2溶于DMSO-d6((CD3) 2SO)，1 13 1 13
以 H和 C的残留峰δ2.50、δ39.43为内标进行NMR测定。测定项目为 HNMR、CNMR、
1 13 1 13
H{ C}-HSQC、H{ C}-HMBC、TOCSY以及DQF-COSY， 用DMX-750spectrometer(布鲁克拜厄斯宾公司，德国)测定。NMR的结果表明：化合物1为按EGCG8:8EGCG6:8EGCG6:8EGCG结合而成的化合物(式(II))，化合物2为按EGCG8:6EGCG8:8EGCG6:8EGCG结合而成的化合物
1 13 1
(式(III))。化合物1的 HNMR和 CNMR谱分别如图1和图2所示，化合物2的 HNMR和
13
CNMR谱分别如图3和图4所示。
以 H和 C的残留峰δ2.50、δ39.43为内标进行NMR测定。测定项目为 HNMR、CNMR、
1 13 1 13
H{ C}-HSQC、H{ C}-HMBC、TOCSY以及DQF-COSY， 用DMX-750spectrometer(布鲁克拜厄斯宾公司，德国)测定。NMR的结果表明：化合物1为按EGCG8:8EGCG6:8EGCG6:8EGCG结合而成的化合物(式(II))，化合物2为按EGCG8:6EGCG8:8EGCG6:8EGCG结合而成的化合物
1 13 1
(式(III))。化合物1的 HNMR和 CNMR谱分别如图1和图2所示，化合物2的 HNMR和
13
CNMR谱分别如图3和图4所示。
[0105] 化合物1：
[0106] 1HNMR(DMSO-d6 中 ) 有 δ10.34，9.37，9.17，9.09，9.01，8.88，8.75，8.71，8.68，8.08，8.04，7.62，6.81，6.77，6.72，6.55，6.49，6.39，6.04，5.86，5.55，5.47，5.34，5.23，
4.96，4.79，4.64，4.04，4.02，3.92，3.90，3.85，3.83，3.73，3.71，3.64，3.62，3.54，3.52，
3.07，3.05，2.96，2.93，2.74，2.72，2.70的信号。
4.96，4.79，4.64，4.04，4.02，3.92，3.90，3.85，3.83，3.73，3.71，3.64，3.62，3.54，3.52，
3.07，3.05，2.96，2.93，2.74，2.72，2.70的信号。
[0107] 13CNMR 有 δ165.29，165.13，165.02，165.01，154.45，154.44，154.25，152.33，152.20，151.97，151.66，151.62，150.82，150.66，150.52，149.66，145.63，145.56，145.54，
145.50，145.50，145.27，145.23，145.18，138.46，138.38，132.77，132.26，132.12，128.50，
127.61，119.20，119.17，118.96，118.90，108.73，108.55，107.05，106.19，105.19，105.05，
104.31，103.77，99.01，98.52，77.44，76.65，76.51，76.10，67.53，67.50，66.95，66.63，
25.94，25.63，25.49，25.30，17.14，16.74，15.81的信号。
145.50，145.50，145.27，145.23，145.18，138.46，138.38，132.77，132.26，132.12，128.50，
127.61，119.20，119.17，118.96，118.90，108.73，108.55，107.05，106.19，105.19，105.05，
104.31，103.77，99.01，98.52，77.44，76.65，76.51，76.10，67.53，67.50，66.95，66.63，
25.94，25.63，25.49，25.30，17.14，16.74，15.81的信号。
[0108] 化合物2：
[0109] 1HNMR(DMSO-d6) 有 δ9.91，9.25，9.16，8.09，7.22，6.81，6.76，6.74，6.52，5.94，5.50，5.38，4.77，4.52，3.95，3.95，3.80，3.54，2.80，2.74，2.73，2.67的信号。 [0110] 13CNMR 有 δ165.08，165.01，154.06，152.83，152.35，151.45，150.78，150.26，
145.52，145.52，145.24，145.18，138.49，138.44，132.21，132.10，128.42，127.63，119.05，
118.95，108.58，108.46，108.46，106.95，105.74，104.92，104.06，98.32，97.81，76.59，
75.94，66.69，66.35，26.33，25.26，16.72，15.99的信号。
145.52，145.52，145.24，145.18，138.49，138.44，132.21，132.10，128.42，127.63，119.05，
118.95，108.58，108.46，108.46，106.95，105.74，104.92，104.06，98.32，97.81，76.59，
75.94，66.69，66.35，26.33，25.26，16.72，15.99的信号。
[0111] 通过上述合成、精制得到的各化合物的收量为化合物3(乌龙双黄烷-A、984mg)、化合物4(乌龙双黄烷-B、374mg)、化合物5(468mg)、化合物6 (乌龙双黄烷-C、33mg)、化合物1(15mg)、化合物2(44mg)。
[0112] [实施例2]采用培养的血管内皮细胞的血管内皮功能改善效果研究
[0113] (1)式(II)、式(III)的血管内皮功能改善效果
[0114] 研究实施例1中合成和精制得到的式(II)、式(III)的化合物对血管内皮功能相关基因的表达的影响。作为比较对象，采用血管内皮功能改善作用已知的EGCG单体(和光纯药工业株式会社制、日本)和茶黄素、茶黄素-3-O-没食子酸酯、茶黄素-3’-O-没食子酸酯以及茶黄素-3，3’-O-二没食子酸酯(长良科学株式会社制、日本)。
[0115] 将这些化合物溶于灭菌后的二甲亚砜(DMSO，Nacalai Tesque株式会社、日本)中，制备浓度为10mM的溶液。
[0116] 用HuMedia-EG2培养基(仓敷纺织株式会社、日本)将这些溶液稀释1000倍，制备最终浓度为10μM的溶液(DMSO的最终浓度为0.1V/V％)。将这些样品溶液以3mL/孔添加到6-孔板中培养的人脐带血管内皮细胞(仓敷纺织株式会社、日本)中，在37℃、5％CO2的条件下培养8小时。
[0117] 用ISOGEN(日本基因株式会社、日本)回收细胞，从细胞提取RNA。然后，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)精制RNA。以精制的总RNA 200ng为模板，用High-Capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems株式会社、日本)合成cDNA，进行定量PCR。采用以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因作为内标的比较Ct法进行解析，以无处理细胞为对照，算出被测样品的基因表达变化率(相对于对照的倍数)。
[0118] EGCG、式(II)(OHBF-Tet1)、式(III)(OHBF-Tet2)、茶黄素(THF)、茶黄素-3-O-没食子酸酯(THF3G)、茶黄素-3’-O-没食子酸酯(THF3’G)以及茶黄素-3，3’-O-二没食子酸酯(THFDiG)的各基因表达变化率如图5～8所示。
[0119] 式(II)和式(III)的化合物使eNOS基因的表达增强3倍左右(图5)、使GTP-CH1基因的表达增强7倍左右(图6)、使DDAH2基因的表达增强3倍左右(图7)。另外，在式(II)和式(III)的化合物的存在下，在血管内皮细胞中产生活性氧、使血管内皮功能下降的NADPH氧化酶的Nox4亚单位基因 的表达急剧下降(图8)。
[0120] 另一方面，EGCG单体和茶黄素类在这次讨论的浓度下几乎没有使任何基因表达发生改变，表明本发明的EGCG四聚体与EGCG单体和茶黄素类相比在低浓度下也有效。 [0121] (2)各种EGCG聚合体的血管内皮功能改善效果
[0122] 研究EGCG二聚体和三聚体对血管内皮功能相关基因的表达的影响。评价中采用的EGCG聚合体中，Theasinensin(TSN)-A采用根据论文(Hashimoto，F.Nonaka，G.Nishioka，I.Chem.Pharm.Bull.36(5)，1676-1684(1988)合成的物质，乌龙双黄烷-A、乌龙双黄烷-B、乌龙双黄烷-C以及化合物5采用实施例1中合成和精制的物质，用与上述(1)相同的方法进行评价。
[0123] 乌龙双黄烷-A(OHBF-A)、乌龙双黄烷-B(OHBF-B)、乌龙双黄烷-C(OHBF-C)、化合物5(OHBFTri-1)、Theasinensin-A(TSN-A)的各种基因表达变化率如图9～12所示。 [0124] 如图9～12所示，作为EGCG二聚体的乌龙双黄烷-A、乌龙双黄烷-B、乌龙双黄烷-C、Theasinensin A以及作为EGCG三聚体的化合物5在与上述1中探讨的式(II)和式(III)的化合物相同的浓度下没有使任何基因的表达发生改变。
[0125] 以上结果表明，本发明的EGCG四聚体的血管内皮功能改善效果在EGCG聚合体中为本发明的化合物的特征作用。
[0126] [实施例3]LC-MS/MS的测定条件和黑乌龙茶的测定
[0127] LC-MS/MS的测定采用4000 Q TRAP(Applied公司制)，使用Turbo IonSpray，在负离子模式下，在以下的条件下测定。
[0128] 碰撞能量：46eV(nega.)、离子喷雾电压：4500V、温度：450℃
[0129] MRM(multiple reaction monitoring；多反应监控)中的测定通道为EGCG四聚体化合物；933.16/168.90(nega.2价)，在下述测定条件下进行。标准物质采用式(III)的化合物。
[0130] 柱：Develosil C30-UG-3(野村化学，3mmφ×150mm)
[0131] 流速：0.3mL/分钟
[0132] 柱温：40℃
[0133] 流动相A：0.1V/V％ HCOOH/H2O
[0134] 流动相B：0.1V/V％ HCOOH/CH3CN
[0135] 梯度程序：A/B＝91/9(0分钟)→A/B＝40/60(17分钟)→A/B＝15/85(17.1分钟)→A/B＝15/85(17.1～19分钟)
[0136] 采用上述条件来进行黑乌龙茶的测定。
[0137] 用CHP-20P柱(三菱化学株式会社、日本)将黑乌龙茶的调和液(杀菌前的溶液)逐步分离，进行各馏分的定量。将各馏分检测到的浓度相加，作为调和液中的浓度。关于调和液中的浓度，将作为EGCG的四聚体检测到的4种成分加在一起，换算成式(III)的化合物，结果为55ng/mL。
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