一种耐盐且具有产电特性的菌株及其在微生物燃料电池中的应用
阅读：0发布：2020-11-07
专利汇可以提供一种耐盐且具有产电特性的菌株及其在微生物燃料电池中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种耐盐且具有产电特性的菌株，名称为E-1，分类名称为：海藻希瓦氏菌Shewanella algae，保藏编号为：CGMCC No.17857，保藏日期：2019年5月27日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本菌株是一株耐盐的产电微生物。这是该种内微生物具有产电特性的首次报道，成果丰富了耐盐产电微生物的多样性，为微生物 燃料 电池 在 海 水 资源化处理方面的应用提供新的实验材料。，下面是一种耐盐且具有产电特性的菌株及其在微生物燃料电池中的应用专利的具体信息内容。
1.一种耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：名称为E-1，分类名称为：海藻希瓦氏菌Shewanella algae，保藏编号为：CGMCC No.17857，保藏日期：2019年
5月27日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：
所述菌株的16S rDNA基因具有如序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，序列长度为1450bp，在Genbank上的登录号为MK787267.1。
3.根据权利要求1所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：
所述菌株筛选自南海的海水；通过对南海的海水经过简单的沉淀处理后进行富集、分离、纯化和筛选得到。
4.根据权利要求1所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：
所述菌株为兼性厌氧菌、短杆状、长2.5um、宽0.5um、革兰氏阴性；适宜生长的pH范围为5～
10、温度范围25～40℃，能够在NaCl质量浓度为0～7％的范围内生长。
5.根据权利要求1所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：
所述菌株在盐胁迫下具有生长性能；所述菌株具有产电性能。
6.根据权利要求1所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：
所述菌株在含盐的条件下具有产电性能。
7.根据权利要求1至6任一项所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，其特征在于：所述菌株能够利用乳酸、乙酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸、尿苷，不能利用L-阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、甘油。
8.如权利要求1至6任一项所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株在微生物燃料电池进行产电方面中的应用。
9.如权利要求1至6任一项所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株在制作微生物燃料电池方面中的应用。
10.根据权利要求9所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株在在制作微生物燃料电池方面中的应用，其特征在于：应用方法的步骤为：
⑴菌种活化：从LB斜面培养基上挑取一环Shewanella algae菌株接种到50mL的LB液体培养基中，30-37℃、160-200r/min下振荡培养20-48h，取菌液6000×g离心10min后，收集菌体并用质量浓度为0.9％的生理盐水洗涤3次；
⑵接种液制备：将菌体重悬于含有不同NaCl浓度的阳极液中，以0.8-2.0g/L葡萄糖作为底物，使其初始OD600为0.8-1.5，然后接种到MFCs的反应器中；
⑶产电性能检测：反应器分别和外电阻以及数据采集装置连接好，在37±1℃恒温条件下运行，运行过程中定期更换接种液；待出现连续两个稳定电压时即认为启动成功；当监测的输出电压低于50mV时，开始更换阳极液，至获得稳定可重复的输出电压。
一种耐盐且具有产电特性的菌株及其在微生物燃料电池中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells，MFCs)是利用微生物的催化作用氧化有机物(包括废水中的污染物)直接将化学能转化成电能的新型装置。由于具有废水处理和产生电能的双重作用，它在清洁能源生产、废水资源化处理、生物传感器开发及环境生物修复等领域表现出巨大的应用前景。
[0003] 产电微生物是微生物燃料电池系统的核心组成，其电化学活性由于菌种产生电子和传递电子的机制不同而表现出明显的差异。目前大部分产电微生物的来源为污水处理厂的活性污泥、沉积物、土壤和生物垃圾等。已发现的产电微生物主要集中在变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。变形菌门主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、地杆菌属(Geobacter)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、红育菌属(Rhodoferax)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、气单胞菌属(Aeromonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、弧形杆菌属(Arcobacter)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等，厚壁菌门主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)等。尽管，近年来研究者开始从近海的淤泥样品和海域的潮间带表面沉积物中分离和筛选来源于海洋的产电微生物，但这些菌株在盐条件下的产电特性缺乏进一步的分析。
[0004] 海藻希瓦氏菌最早于1985年由Yuichi Kotati等人从红藻表面分离出来，当时被命名为OK-1。1990年，Simidu分析了OK-1的G+C含量和16S rRNA碱基序列特点后发现OK-1与希瓦氏菌属有较近的亲缘关系，但因OK-1与腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)的碱基序列间仍存在显著差异，所以将OK-1定义为一种新的希瓦氏菌，即海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)。目前，海藻希瓦氏菌大多应用在发酵生产河豚毒素以及抑制对金属材料的腐蚀性能方面。该种内微生物的耐盐性能、产电特性及其在微生物燃料电池方面的应用在国内外尚未发现相关报道。
发明内容
[0006] 本发明目的在于克服现有技术中目前耐盐产电微生物报道较少的不足之处，提供一种耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株及其在微生物燃料电池中的应用，该菌株是一株耐盐的产电微生物。这是该种内微生物具有产电特性的首次报道，成果丰富了耐盐产电微生物的多样性，为微生物燃料电池在海水资源化处理方面的应用提供新的实验材料。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，名称为E-1，分类名称为：海藻希瓦氏菌Shewanella algae，保藏编号为：CGMCC No.17857，保藏日期：2019年5月27日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0009] 而且，所述菌株的16S rDNA基因具有如序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，序列长度为1450bp，在Genbank上的登录号为MK787267.1。
[0010] 而且，所述菌株筛选自南海的海水；通过对南海的海水经过简单的沉淀处理后进行富集、分离、纯化和筛选得到。
[0012] 而且，所述菌株在盐胁迫下具有生长性能；所述菌株具有产电性能。
[0013] 而且，所述菌株在含盐的条件下具有产电性能。
[0015] 如上所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株在微生物燃料电池进行产电方面中的应用。
[0016] 如上所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株在制作微生物燃料电池方面中的应用。
[0017] 而且，应用方法的步骤为：
[0018] ⑴菌种活化：从LB斜面培养基上挑取一环Shewanella algae菌株接种到50mL的LB液体培养基中，30-37℃、160-200r/min下振荡培养20-48h，取菌液6000×g离心10min后，收集菌体并用质量浓度为0.9％的生理盐水洗涤3次；
[0020] ⑶产电性能检测：反应器分别和外电阻以及数据采集装置连接好，在37±1℃恒温条件下运行，运行过程中定期更换接种液；待出现连续两个稳定电压时即认为启动成功；当监测的输出电压低于50mV时，开始更换阳极液，至获得稳定可重复的输出电压。
[0021] 本发明取得的优点和积极效果为：
[0022] 1、本发明菌株适宜生长的温度范围为25～40℃，pH范围为5～10，同时可在NaCl浓度0～7％范围内生长，表现出良好的耐盐能力。将其接种于不添加NaCl和添加NaCl的微生物燃料电池中均能产生电能，说明它是一株耐盐的产电微生物。这是该种内微生物具有产电特性的首次报道，成果丰富了耐盐产电微生物的多样性，为微生物燃料电池在海水资源化处理方面的应用提供新的实验材料。
[0023] 2、本发明来自海洋的耐盐产电菌，该菌株分别接种到不添加NaCl及添加6.6％NaCl的微生物燃料电池中均能表现出产电能力，功率密度分别达到51.69mW·m-2和-226.56mW·m 。其适宜生长的温度范围为25～40℃，pH范围为5～10，表现出多样的底物利用能力，这是首次对S.algae种内微生物产电性能及其在微生物燃料电池中应用的报道，为微生物燃料电池在海水资源化处理方面的应用提供新的实验材料。
附图说明
附图说明
[0024] 图1为本发明菌株Shewanella algae E-1在无外源添加盐压力的条件下运行MFCs产生的电压变化曲线(a)、极化曲线和功率密度曲线(b)；
[0025] 图2为本发明菌株Shewanella algae E-1在不同盐浓度下的生长曲线；
[0026] 图3为本发明菌株Shewanella algae E-1在外源添加盐压力6.6％的条件下运行MFCs产生的电压变化曲线(a)、极化曲线和功率密度曲线(b)；
[0027] 图4为本发明菌株Shewanella algae E-1的菌落形态图(a,b)；革兰氏染色结果(c)；菌体扫描电镜图(d)；
[0028] 图5为本发明菌株Shewanella algae E-1与GenBank中收录的相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对所构建的系统发育树。
具体实施方式
[0029] 下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0030] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0031] 一种耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株，名称为E-1，分类名称为：海藻希瓦氏菌Shewanella algae，保藏编号为：CGMCC No.17857，保藏日期：2019年5月27日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0032] 较优地，所述菌株的16S rDNA基因具有如序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，序列长度为1450bp，在Genbank上的登录号为MK787267.1。
[0033] 较优地，所述菌株筛选自南海的海水；通过对南海的海水经过简单的沉淀处理后进行富集、分离、纯化和筛选得到。
[0034] 较优地，所述菌株为兼性厌氧菌、短杆状、长2.5um、宽0.5um、革兰氏阴性；适宜生长的pH范围为5～10、温度范围25～40℃，能够在NaCl质量浓度为0～7％的范围内生长。该菌株可以作为微生物燃料电池的阳极催化剂，进行催化底物产电，从而实现了本发明的目的。
[0035] 较优地，所述菌株在盐胁迫下具有良好的生长性能；所述菌株具有良好的产电性能。
[0036] 较优地，所述菌株在含盐的条件下具有良好的产电性能。
[0037] 较优地，所述菌株能够利用乳酸、乙酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸、尿苷，不能利用L-阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、甘油。
[0038] 如上所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株可以应用在微生物燃料电池进行产电方面中。
[0039] 如上所述的耐盐且具有产电特性的Shewanella algae菌株可以应用在制作微生物燃料电池方面中。
[0040] 较优地，应用方法的步骤为：
[0041] ⑴菌种活化：从LB斜面培养基上挑取一环Shewanella algae菌株接种到装有50mL的LB液体培养基中，30-37℃、160-200r/min下振荡培养20-48h，取菌液6000×g离心10min后，收集菌体并用质量浓度为0.9％的生理盐水洗涤3次；
[0042] ⑵接种液制备：将菌体重悬于含有不同NaCl浓度的阳极液中，以0.8-2.0g/L葡萄糖作为底物，使其初始OD600为0.8-1.5，然后接种到MFCs的反应器中；
[0043] ⑶产电性能检测：反应器分别和外电阻以及数据采集装置连接好，在37±1℃恒温条件下运行，运行过程中定期更换接种液；待出现连续两个稳定电压时即认为启动成功；当监测的输出电压低于50mV时，开始更换阳极液，至获得稳定可重复的输出电压。
[0044] 所述海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)E-1通过16SrDNA序列比对分析，与已知菌株Shewanella algae Hiro-1具有100％的同源性。该菌株16S rRNA的Genbank登录号为MK787267.1。
[0045] 海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)E-1是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的细菌。到目前为止，未有能产电的海藻希瓦氏菌的报道。所述海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)E-1能在0～7％NaCl浓度下产电。
[0046] 更具体地，所述海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)E-1在制备微生物燃料电池中的应用，具体包括如下步骤：
[0047] 1)菌种活化：从LB斜面培养基上挑取一环菌体接种到装有50mL的LB液体培养基的250mL三角瓶中，30-37℃、160-200r/min下振荡培养20-48h，取菌液6000×g离心10min后收集菌体并用0.9％的生理盐水洗涤3次。
[0048] 接种液制备：将菌体重悬于含有不同NaCl浓度的阳极液中(以0.8-2.0g/L葡萄糖作为底物)，使其初始OD600为0.8-1.5，然后接种到MFCs的反应器中。
[0049] 产电性能检测：反应器分别和外电阻以及数据采集装置连接好，在(37±1)℃恒温条件下运行，运行过程中定期更换接种液。待出现连续两个稳定电压时即认为启动成功。当监测的输出电压低于50mV时，开始更换阳极液。当获得稳定可重复的输出电压后测定功率密度和计算系统内阻等。
[0050] 具体地，本发明相关的步骤如下：
[0051] 一、MFCs阳极生物膜上微生物的分离纯化
[0052] 取自南海的海水经过简单的沉淀处理后接种于MFCs的阳极室，分别在阳极液含有质量浓度0％和6.6％NaCl的两种条件下连续运行。反应器主体为一个长为2.0cm，横断面直径为3.0cm的有机玻璃柱体，有效容积为14mL，阴阳极的有效面积均为7cm2。阳极和阴极分别置于MFCs主体的两测，并用橡胶圈密封固定。阳极一端用有机玻璃盖盖住，阴极一端的盖子是开口的，且阴极碳布载铂，阴极和阳极都与钛丝连接将电子导出或导入，最后整个装置用螺丝和丝杠拧紧固定。系统于37℃下分别连续运行125h和60h后，负载电阻两端的电压逐渐稳定，阳极上形成肉眼可见的厚的生物膜。将该生物膜上的全部菌体用接种针刮取，并悬浮于质量浓度0.9％的生理盐水中制备成均匀的菌悬液，将其进行梯度稀释后涂布于分离的LB固体培养基上，37℃恒温条件下培养2d，根据菌落形态、颜色、大小、表面和边缘特征，挑取特征差异明显的菌落，分别接种于LB液体培养基中再次富集培养，如此反复传代5～6次，得到纯培养的菌株，并对其进行编号和命名。
[0053] 二、MFCs阳极生物膜上纯种微生物的产电性能分析
[0054] 以步骤一中分离和筛选得到的各个分离株为对象，将其分别接种到LB液体培养基中，37℃，200r/min下振荡培养24h，取菌液6000×g离心10min后收集菌体并用质量浓度0.9％的生理盐水洗涤3次。
[0055] 将不同分离株的相同质量的菌体分别重悬于阳极液中(以1g/L葡萄糖作为底物)，得到接种液(接种了对应分离株菌体的阳极液)，使其初始OD600为1.0，然后接种到MFCs反应器中。反应器分别和外电阻(无特殊说明时外电阻均固定在1000Ω)和数据采集装置连接好，在(37±1)℃恒温条件下运行，运行过程中定期更换接种液。待出现连续两个稳定电压时即认为启动成功。启动成功后进入正式运行期，当监测的输出电压低于50mV时，只需要更换阳极液。当输出电压再次达到最高并获得稳定可重复的输出电压后进行电化学参数的测定，之后停止MFCs运行。整个过程中利用PISO-813型数据采集系统对电压进行实时的在线数据监测和记录，分析数据时取30min内的平均值，采样精度为0.001V。根据各个分离株的电压曲线，最终筛选到一株产电性能较好的分离株E-1。
[0056] 三、菌株E-1在无外源添加盐压力下的产电性能
[0057] 由图1可知，在无外源添加盐压力的条件下，分离株E-1接种到MFCs后运行415h后达到稳定，稳定电压约为554mV，功率密度在电流密度为192.14mA/m2时最大，达到51.69mW·m-2。
[0058] 四、菌株E-1在盐压力下的生长性能
[0059] 将分离株E-1过夜培养后的菌液分别转接到含有质量浓度0％、2％、4％、6.6％NaCl的50mL的LB液体培养基中，并将其初始OD值调为一致。37℃，200r/min振荡培养，不同时间取样测定OD600并绘制生长曲线。
[0060] 由图2可知，在NaCl浓度为0％的条件下，菌株的延滞期为0～2.5h，对数期为2.5～16h，培养21h后OD600值达到最大，为1.66。随着NaCl浓度的增加，菌株的延滞期明显延长，达到稳定后的OD600值随之下降。当NaCl浓度为6.6％时，菌株的延滞期为0～6h，对数期为6～
23h，培养25h后OD600值达到最大，为1.53。因此，上述数据表明，菌株E-1对盐具有较强的耐受性，在盐压力下生长状态良好。
23h，培养25h后OD600值达到最大，为1.53。因此，上述数据表明，菌株E-1对盐具有较强的耐受性，在盐压力下生长状态良好。
[0061] 五、菌株E-1在盐压力下的产电性能
[0062] 由图3可知，将分离株E-1接种到外源添加盐质量浓度6.6％的MFCs运行98h后达到稳定，稳定电压约为384mV，其功率密度在电流密度79.54mA/m2时最大，达到26.56mW·m-2。与无压力条件相比，NaCl添加后的系统达到稳定的时间缩短了76.4％。说明该菌株是一株耐盐的产电微生物，在海水资源化处理方面表现出巨大的应用潜力。
[0063] 六、菌株E-1的生物学鉴定
[0064] 1.菌株的形态特征
[0065] (1)菌落形态特征：菌株E-1在LB固体培养基上，37℃恒温培养24-48h后，菌落呈圆形，为浅棕黄色，边缘整齐，表面透明光滑，呈油脂状，直径2mm，分泌某种褐色物质使培养基呈现浅棕黄色(见图4(a，b))
[0066] (2)菌体形态特征：革兰氏染色的结果表明菌株E-1为革兰氏阴性菌。利用扫描电子显微镜观察菌株，菌体呈短杆状，长度约2.5μm，宽度约0.5μm(见图4(c，d))。
[0067] 2.Biolog分析
[0068] 按照革兰氏阴性菌Biolog鉴定参数选择合适的培养条件。参考文献进行Biolog分析。具体方法为：将单菌落接种到BUA+B培养平板上，37℃培养24h，用无菌牙签挑取少量新鲜菌落制成菌悬液，和标准菌悬液进行对照，误差范围小于±2，用八道移液枪进行Biolog GN II板接种，每孔接种菌悬液150μL，加盖30℃培养24h，打开微孔板盖放入结果自动读数仪，显色结果与Biolog数据库进行比对分析。Biolog鉴定结果有三个重要的参数需要考虑：可能性Probability(PROB)，相似性Similarity(SIM)和位距Distance(DIST)。当DIST<5.0，SIM>0.75为良好的匹配；SIM值越接近于1，检定结果的可靠性越高。
[0069] 由表1知，分离株E-1的SIM值＝0.94>0.75；DIS值＝0.89<5.0；PROB为100％。系统得到的三个重要参数比较理想，与数据库匹配良好，SIM值越接近1.00，说明鉴定结果的可靠性更高。在物种栏显示出一个最佳匹配名称：Shewanella algae。菌种鉴定出阳性反应33种，阴性反应50种，边界反应12种。阳性反应表示目标菌株与数据库的匹配程度>80％，阴性反应表示样品菌与数据库匹配程度<20％，边界反应多于15个为鉴定结果不好，实验中为12。各种数据指标都表明，鉴定结果准确，和数据库有很好的匹配，初步鉴定菌株E-1为海藻希瓦氏菌。
[0070] 表1 Biolog微生物鉴定系统鉴定结果
[0071]
[0072] 3.菌株的16S rDNA测序分析
[0073] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株E-1的基因组DNA作为模版，细菌16Sr DNA的通用引物(27F，1492R)作为引物，扩增菌株E-1的16S rDNA片段。该菌株的16S rDNA基因的序列长度为1450bp，将获得的16S rDNA基因序列输入GenBank，通过Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析。利用MEGA7.0软件，采用基于Kimura 2-parameter模型的邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发育树，进化树分枝稳定性用Bootstrap分析，重复1000次。结果发现，该菌株的16S rDNA基因序列与希瓦氏菌属(Shewanella)的菌株Shewanella algae Hiro-1具有较高的相似性，同源性达到100％。由图5可知，分离株E-1与Shewanella algae Hiro-1处在系统发育树的同一分支，亲缘关系最为接近。
[0074] 经过菌株的形态观察、biolog分以及16S rDNA序列比对，菌株E-1鉴定为Shewanella algae。
[0075] 七、菌株E-1的碳源利用情况和生长条件特性
[0076] 根据代谢微平板对照相应碳源，将菌株E-1分别涂布到含有不同碳源的基本无机盐固体培养基上，通过观察菌株是否生长分析其对碳源的利用程度。由表2可知，菌株能够利用乳酸、乙酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸、尿苷等碳源，但不能利用L-阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖和甘油等碳源(表3)。此外，该菌株在不同温度和pH条件下的生长情况表明，适宜生长的温度范围为25～40℃，pH范围为5～10。
[0077] 表2菌株E-1能够利用的碳源
[0078]
[0079]
[0080] 表3菌株E-1不能利用的碳源
[0081]
[0082]
[0083] 所述菌株的16S rDNA基因具有如序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，序列长度为1450bp，在Genbank上的登录号为MK787267.1。
[0084] SEQ ID No.1：
[0085] CGCTTGCGCAGCTACACATGCAGTCGAGCGGTAACATTTCAAAAGCTTGCTTTTGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAATTTGCCCATTTGTGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTGATGGATAAGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTAGGTGAGGTAAAGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAgGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGKTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGGTGTAAGTTAATACCTTACATCTGTGACGtTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACCGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGTCTTGAACACTGGGCTCTCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAAcCCTTACCTACTCTTGACATCCASAGAACTTKSCtAGAGATGSATYGGTGCCTTCGGGAACTSTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTACTTGCCAGCGGGTAATGcCCGGGAACTTTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAGCCGGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTACCACGGTTGGTCTGCAT。
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