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一种耦合 发酵制备海藻糖的方法

阅读：668发布：2024-02-11

专利汇可以提供一种耦合发酵制备海藻糖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法。本发明通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC以及麦芽糖转运蛋白基因EIICB后，构建获得重组工程菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM12345)，通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。，下面是一种耦合发酵制备海藻糖的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种耦合发酵制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43-F/P43-PhoD-R、PhoD-P43-F/PhoD-TreS-R进行PCR扩增，分别制得P43基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS-PhoD-F/TreS-R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS片段；通过重叠PCR连接P43基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P43-PhoD-treS基因片段；
所述引物对的核苷酸序列分别如下：
P43-F：CGCGGATCCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为BamHI酶切位点
P43-PhoD-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；
PhoD-P43-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG；
PhoD-TreS-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；
TreS-PhoD-F：GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC；
TreS-R：GACGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAAACATGCCCGCTGCTGT；
下划线为Aat II酶切位点；
(2)将步骤(1)制得的P43-PhoD-treS基因片段插入载体pHT01，制得pHT01-P43-PhoD-treS重组载体；
(3)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因EIICB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、-ΔSkfA、-ΔLytC、-ΔSdpC、-ΔEIICB，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB分别转化B.subtilis WB800n感受态细胞，制得重组菌LM12345；
(4)将步骤(2)制得的pHT01-P43-PhoD-treS重组载体转化步骤(3)制得的重组菌LM12345的感受态细胞，制得自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS；
(5)将步骤(4)制得的自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS经种子培养、扩大培养后，按3～5％的体积百分比接种至发酵培养基中，在温度35～38℃，转速350～500rpm，发酵培养56～72h，发酵5～8h后，开始流加混合糖液，发酵结束，经纯化，制得含有海藻糖的发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，P43基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；PhoD基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；长度为2067bp的treS片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将P43-PhoD-treS基因片段插入载体pHT01的步骤如下：
将P43-PhoD-treS基因片段与pZERO-Blunt平末端载体连接，然后用限制性内切酶BamHI/AatII对pZERO-P43-PhoD-treS和载体pHT01进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接，制得pHT01-P43-PhoD-treS重组载体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，敲除载体为载体pMAD。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，连接到敲除载体为将基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB与敲除载体pMAD分别用限制性内切酶BamHI/EcoRI酶切后，酶切产物经T4连接酶连接，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转化为在电压2000V的条件下转化5ms，然后涂布于含40μg/mL X-gal和30μg/mL红霉素抗性的LB平板，35～38℃过夜培养，筛选蓝色转化子，液体LB培养基中35～38℃过夜培养，按体积百分比5％接种量转接至含浓度30μg/mL的红霉素抗性LB培养基中，28～32℃孵育2h，升温至40～43℃继续孵育5.5-2 -5
～6.5h，稀释至10 ～10 ，涂布含有浓度40μg/mL X-gal和浓度30μg/mL红霉素抗性的LB平板，40～43℃过夜培养，挑取阳性单菌落于28～32℃在无抗性LB培养基中孵育5.5～6.5h，升温至40～43℃继续孵育2.5～3.5h，稀释至10-2～10-5，涂布含有40μg/mL X-gal的LB平板，40～43℃过夜培养，挑取白斑的单菌落，验证后，即得。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，转化为在电压2000V的条件下转化5ms，然后在复苏培养基培养2.5～3.5h，然后涂布于浓度30μg/mL的氯霉素抗性LB平板，挑单菌落，验证后，即得；
进一步优选的，所述复苏培养基组份如下：
蛋白胨：1g/L；酵母浸粉：0.5g/L；氯化钠：1g/L；山梨醇：9.1g/L；甘露醇：7g/L,水定容至1000mL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，种子培养条件为：35～38℃、
180～220r/min恒温摇床培养10～14h；种子培养基为在LB液体培养基的基础上添加氯霉素至浓度为30μg/mL。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，扩大培养条件为：35～38℃、
180～220r/min扩大培养8～10h，接种量为扩大培养基体积的1～2％；扩大培养基为在LB液体培养基的基础上添加氯霉素至浓度为30μg/mL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，混合糖液组份为：麦芽糖
280～320g/L，葡萄糖5～8g/L；进一步优选的，所述流加混合糖液的流速为0.5mL/min。

说明书全文

一种耦合发酵制备海藻糖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

[0002] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)是原核生物研究领域中的重要模式菌，人们对其遗传背景和生理特征的了解仅次于大肠杆菌(Escherichia coli)。枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。该宿主的优点是：公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码子偏爱性；生长快，易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作简单的特点，且适合工程菌株改造等显著优势。

[0003] 基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前体蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白的折叠，在对蛋白分泌过程中起着重要作用。信号肽是一类具有15～60个氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆至信号肽的C端，从而在宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点的结合，进而跨膜转运至胞外。因此。研究不同种类的信号肽对于实现外源蛋白基因的高效表达和分泌机制等均有重要意义。

[0004] 发酵工程中，目前用于生产海藻糖合酶的菌种多是在细胞内表达，而且表达量低，转化麦芽糖时，只能在发酵结束后，将菌体破碎得到粗酶液，再与麦芽糖混合转化，这种生产方式生产过程复杂，消耗时间长，生产成本高，不利于大规模生产制备海藻糖。而耦合发酵技术可以将发酵过程与转化过程结合起来，同时进行，极大地简化生产过程，降低生产成本，为工业化生产制备海藻糖具有重要意义。

[0005] 中国专利文献CN103215300A(申请号201310174692.7)公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并将此酶用于生产海藻糖的方法。具体是将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造。虽然该技术中的海藻糖合酶可以分泌到胞外，但仍然无法实现耦合发酵生产海藻糖。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种耦合发酵制备海藻糖的方法。

[0007] 本发明通过启动子及信号肽密码子的筛选及优化、无痕敲除技术的应用，构建了高效分泌表达海藻糖合酶的工程菌，并通过对发酵技术的创新及优化实现了耦合发酵制备海藻糖的方法。

[0008] 本发明技术方案如下：

[0009] 一种耦合发酵制备海藻糖的方法，包括如下步骤：

[0010] (1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43-F/P43-PhoD-R、PhoD-P43-F/PhoD-TreS-R进行PCR扩增，分别制得P43基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS-PhoD-F/TreS-R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS基因片段；通过重叠PCR连接P43基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P43-PhoD-treS基因片段；

[0011] 所述引物对的核苷酸序列分别如下：

[0012] P43-F：CGCGGATCCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为BamHI酶切位点

[0013] P43-PhoD-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；

[0014] PhoD-P43-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG；

[0015] PhoD-TreS-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；

[0016] TreS-PhoD-F：GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC；

[0017] TreS-R：GACGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAAACATGCCCGCTGCTGT；

[0018] 下划线为Aat II酶切位点；

[0019] (2)将步骤(1)制得的P43-PhoD-treS基因片段插入载体pHT01，制得pHT01-P43-PhoD-treS重组载体；

[0020] (3)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因EIICB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB分别转化B.subtilis WB800n感受态细胞，制得重组菌LM12345；

[0021] (4)将步骤(2)制得的pHT01-P43-PhoD-treS重组载体转化步骤(3)制得的重组菌LM12345的感受态细胞，制得自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS；

[0022] (5)将步骤(4)制得的自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS经种子培养、扩大培养后，按3～5％的体积百分比接种至发酵培养基中，在温度35～38℃，转速350～500rpm，发酵培养56～72h，发酵5～8h后，开始流加混合糖液，发酵结束，经纯化，制得含有海藻糖的发酵液。

[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，P43基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；PhoD基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；长度为2067bp的treS基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0024] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，将P43-PhoD-treS基因片段插入载体pHT01的步骤如下：

[0025] 将P43-PhoD-treS基因片段与pZERO-Blunt平末端载体连接，然后用限制性内切酶BamHI/AatII对pZERO-P43-PhoD-treS和载体pHT01进行双酶切，将酶切产物用T4连接酶连接，制得pHT01-P43-PhoD-treS重组载体。

[0026] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，敲除载体为载体pMAD；进一步优选的，所述的连接为将基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB与敲除载体pMAD分别用限制性内切酶BamHI/EcoRI酶切后，酶切产物经T4连接酶连接，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB。

[0027] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，转化为在电压2000V的条件下转化5ms，然后涂布于含40μg/mL X-gal和30μg/mL红霉素抗性的LB平板，35～38℃过夜培养，筛选蓝色转化子，液体LB培养基中35～38℃过夜培养，按体积百分比5％接种量转接至含浓度30μg/mL的红霉素抗性LB培养基中，28～32℃孵育2h，升温至40～43℃继续孵育5.5～6.5h，稀释至10-2～10-5，涂布含有浓度40μg/mL X-gal和浓度30μg/mL红霉素抗性的LB平板，40～43℃过夜培养，挑取阳性单菌落于28～32℃在无抗性LB培养基中孵育5.5～6.5h，升温至40～43℃-2 -5
继续孵育2.5～3.5h，稀释至10 ～10 ，涂布含有40μg/mL X-gal的LB平板，40～43℃过夜培养，挑取白斑的单菌落，验证后，即得；

[0028] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，转化为在电压2000V的条件下转化5ms，然后在复苏培养基培养2.5～3.5h，然后涂布于浓度30μg/mL的氯霉素抗性LB平板，挑单菌落，验证后，即得；

[0029] 进一步优选的，所述复苏培养基组份如下：

[0030] 蛋白胨：1g/L；酵母浸粉：0.5g/L；氯化钠：1g/L；山梨醇：9.1g/L；甘露醇：7g/L,水定容至1000mL。

[0031] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，种子培养条件为：35～38℃、180～220r/min恒温摇床培养10～14h；种子培养基为在LB液体培养基的基础上添加氯霉素至浓度为30μg/mL。

[0032] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，扩大培养条件为：35～38℃、180～220r/min扩大培养8～10h，接种量为扩大培养基体积的1～2％；扩大培养基为在LB液体培养基的基础上添加氯霉素至浓度为30μg/mL。

[0033] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，混合糖液组份为：麦芽糖280～320g/L，葡萄糖5～8g/L；进一步优选的，所述流加混合糖液的流速为0.5mL/min。

[0034] 有益效果

[0035] 本发明首次通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC以及麦芽糖转运蛋白基因EIICB后，构建获得重组工程菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM12345)，通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。附图说明

[0036] 图1是pHT01-P43-PhoD-treS重组载体的构建结构示意图；

[0037] 图2是实施例6中自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS的海藻糖转化曲线图；

[0038] 图3是对比例1中重组菌pHT01-PsrfA-PhoD-treS(LM12345)的海藻糖转化曲线图；

[0039] 具体实施方法

[0040] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

[0041] 培养基

[0042] LB固体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉2g/L；

[0043] LB液体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，pH 7.0；

[0044] TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，甘油4ml/L，KH2PO4 2.4g/L，K2HPO416.5g/L；

[0045] 种子培养基：30μg/mL的氯霉素，蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，pH 7.0；

[0046] 扩大培养基：30μg/mL的氯霉素，蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，pH 7.0；

[0047] 发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO4 0.6g/L，K2HPO44g/L；

[0048] 实施例中涉及的菌株和质粒均为普通市售产品。

[0049] 实施例1多种启动子高效表达海藻糖合酶

[0050] 1、启动子的优化

[0051] 根据NCBI报导的启动子PsrfA(SEQ ID NO.9)、启动子Pcry3A(SEQ ID NO.11)和启动子P43(SEQ ID NO.13)的序列，进行密码子优化，将PsrfA启动子的-35区(GTGATA)和-10区(TAAACT)分别改为-35区(TTGACT)和-10区(TATAAT)，得到优化后的启动子PsrfA核苷酸序列SEQ ID NO.10；将Pcry3A启动子的-35区(TTGCAA)和-10区(TAAGCT)分别改为-35区(TTGACA)和-10区(TATAAT)，得到优化后的启动子Pcry3A核苷酸序列SEQ ID NO.12；将P43启动子序列缩短，比原序列减少了13bp，得到优化后的启动子P43核苷酸序列SEQ ID NO.1，根据优化后的序列进行人工合成。分别以合成的启动子序列和枯草芽孢杆菌基因组为模板，用相应的引物扩增相应的启动子，启动子包括PsrfA、Pcry3A、P43、PabrB(SEQ ID NO.14)、PspoVG(SEQ ID NO.15)、PlytR(SEQ ID NO.16)、PmmgA(SEQ ID NO.17)，通过重叠PCR技术，将自诱导启动子启动子PsrfA和Pcry3A，时期特异性启动子PabrB、PspoVG、PlytR、PmmgA串联得到双启动子PsrfA-cry3A和多启动子PabrB-spoVG-lytR-mmgA。

[0052] 2、重组质粒的构建

[0053] 分别将扩增的启动子PsrfA、Pcry3A、P43、PsrfA-cry3A和PabrB-spoVG-lytR-mmgA与海藻糖合酶基因串联得到PsrfA-treS、Pcry3A-treS、P43-treS、PsrfA-cry3A-treS、PabrB-spoVG-lytR-mmgA-treS，通过酶切位点BamHI和AatII分别将这五个基因片段连接到穿梭表达载体pHT01质粒，得到重组质粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-Pcry3A-treS、pHT01-P43-treS、pHT01-PsrfA-cry3A-treS和pHT01-PabrB-spoVG-lytR-mmgA-treS。

[0054] 3、重组菌的构建

[0055] 将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis WB800n，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。

[0056] 4、摇瓶发酵酶活检测

[0057] 将构建的重组菌pHT01-PsrfA-treS、pHT01-Pcry3A-treS、pHT01-P43-treS、pHT01-PsrfA-cry3A-treS和pHT01-PabrB-spoVG-lytR-mmgA-treS接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。

[0058] 将培养好的种子液以1％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心去上清，收集菌体，用10mL，20mM的pH8.0的PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。

[0059] 海藻糖合酶酶活力分析

[0060] (1)酶活力单位定义

[0061] 在酶的最佳酶反应条件下(25℃，pH 8.0)，将300g/L麦芽糖转化为海藻糖，每小时产生1μmol海藻糖所需的酶量定义一为个酶活单位(U)。

[0062] (2)酶活力测定步骤

[0063] 将收集的粗酶液与质量百分比浓度为60％的麦芽糖溶液按体积比1:1混合均匀，置于25℃水浴锅中转化4h，沸水浴煮沸10min，冷却。取1mL转化液离心取上清，通过HPLC高效液相色谱分析仪测定其转化的海藻糖的含量并计算出每克干菌体的酶活。各种启动子表达的海藻糖合酶的酶活如表1所示。结果显示启动子P43表达效果最好，双启动子和多启动子表达效果相近，但低于P43启动子，PsrfA和Pcry3A启动子虽然都进行了密码子优化，但表达效果依然不强，所以筛选得到表达效果最强的启动子P43，结果如表1所示。

[0064] 表1

[0065]启动子酶活(U/g)
PsrfA 9734
Pcry3A 12347
P43 26880
PsrfA-cry3A 19236
PabrB-spoVG-lytR-mmgA 19035

[0066] 实施例2 24种信号肽分泌表达海藻糖合酶

[0067] 1、重组质粒的构建

[0068] 以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用相应引物扩增得到24个信号肽序列，通过重叠PCR分别将启动子P43、信号肽和海藻糖合酶基因的前315bp treS-1扩增得到P43-PhoD-treS-1、P43-YwbN-treS-1、P43-WprA-treS-1、P43-YkuE-treS-1、P43-YmaC-treS-1、P43-AlbB-treS-1、P43-AmyX-treS-1、P43-AppB-treS-1、P43-LipA-treS-1、P43-PbpX-treS-1、P43-OppB-treS-1、P43-YvhJ-treS-1、P43-YuiC-treS-1、P43-YmzC-treS-1、P43-QcrA-treS-1、P43-TipA-treS-1、P43-WapA-treS-1、P43-YesW-treS-1、P43-YdeJ-treS-1、P43-YesM-treS-1、P43-YfkN-treS-1、P43-YkpC-treS-1、P43-YubF-treS-1、P43-SpoIIIJ-treS-1，将24个基因片段与经BamHI和Not I酶切纯化的载体pHT01-P43-treS，用T4DNA ligase 4℃连接16h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-PhoD-treS、pHT01-P43-YwbN-treS、pHT01-P43-WprA-treS、pHT01-P43-YkuE-treS、pHT01-P43-YmaC-treS、pHT01-P43-AlbB-treS、pHT01-P43-AmyX-treS、pHT01-P43-AppB-treS、pHT01-P43-LipA-treS、pHT01-P43-PbpX-treS、pHT01-P43-OppB-treS、pHT01-P43-YvhJ-treS、pHT01-P43-YuiC-treS、pHT01-P43-YmzC-treS、pHT01-P43-QcrA-treS、pHT01-P43-TipA-treS、pHT01-P43-WapA-treS、pHT01-P43-YesW-treS、pHT01-P43-YdeJ-tre1、pHT01-P43-YesM-treS、pHT01-P43-YfkN-treS、pHT01-P43-YkpC-treS、pHT01-P43-YubF-treS、pHT01-P43-SpoIIIJ-treS。

[0069] 2、重组菌的构建

[0070] 将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis WB800n，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。

[0071] 3、摇瓶发酵酶活检测

[0072] 将构建的重组菌pHT01-P43-PhoD-treS、pHT01-P43-YwbN-treS、pHT01-P43-WprA-treS、pHT01-P43-YkuE-treS、pHT01-P43-YmaC-treS、pHT01-P43-AlbB-treS、pHT01-P43-AmyX-treS、pHT01-P43-AppB-treS、pHT01-P43-LipA-treS、pHT01-P43-PbpX-treS、pHT01-P43-OppB-treS、pHT01-P43-YvhJ-treS、pHT01-P43-YuiC-treS、pHT01-P43-YmzC-treS、pHT01-P43-QcrA-treS、pHT01-P43-TipA-treS、pHT01-P43-WapA-treS、pHT01-P43-YesW-treS、pHT01-P43-YdeJ-treS、pHT01-P43-YesM-treS、pHT01-P43-YfkN-treS、pHT01-P43-YkpC-treS、pHT01-P43-YubF-treS、pHT01-P43-SpoIIIJ-treS，分别接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。

[0073] 将培养好的种子液以1％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心，收集上清液和菌体，菌体用10mL 20mM pH8.0PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。

[0074] 酶活力测定步骤

[0075] 将收集的粗酶液和发酵上清液分别与质量百分比浓度60％麦芽糖按体积比1:1混合均匀，置于25℃水浴锅中转化4h，沸水浴煮沸10min，冷却。取1mL转化液离心取上清，通过HPLC高效液相色谱分析仪测定其转化的海藻糖的含量并计算出每克干菌体和每升发酵液的酶活。信号肽分泌表达的酶活如表2所示：

[0076] 表2

[0077]信号肽胞内酶活(U/g) 上清酶活(U/L)
PhoD 26880 41346
YwbN 27456 35927
WprA 28466 27425
YkuE 28654 28554
YmaC 27538 23665
AlbB 28657 17535
AmyX 27124 19645
AppB 28435 27524
LipA 27975 25846
PbpX 28435 19425
OppB 29464 21875
YvhJ 28636 22864
YuiC 29724 18456
YmzC 27745 26346
QcrA 28419 19545
TipA 27358 27745
WapA 28643 26457
YesW 28442 21645
YdeJ 27955 20543
YesM 29526 27566
YfkN 28242 28537
YkpC 29369 25235
YubF 28353 17463
SpoIIIJ 27253 26456

[0078] 4、信号肽密码子优化

[0079] 将24个信号肽中分泌表达量最高的信号肽PhoD进行密码子优化，然后人工合成优化后序列，将此序列替换原PhoD基因序列(SEQ ID NO.18)，连接到质粒pHT01-P43-PhoD(2)-treS，通过电转的方法转入B.subtilis WB800n得到密码子优化后的分泌表达重组菌。

[0080] 5、将构建的重组菌pHT01-P43-PhoD-treS和密码子优化后的重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(密码子优化)，分别接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。

[0081] 将培养好的种子液以1％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心，收集上清液和菌体，菌体用10mL 20mM pH8.0PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。

[0082] 酶活力测定步骤

[0083] 将收集的粗酶液和发酵上清液分别与质量百分比浓度60％麦芽糖按体积比1:1混合均匀，置于25℃水浴锅中转化4h，沸水浴煮沸10min，冷却。取1mL转化液离心取上清，通过HPLC高效液相色谱分析仪测定其转化的海藻糖的含量并计算出每克干菌体和每升发酵液的酶活。信号肽密码子优化后的酶活与未优化的酶活对比如表3所示：

[0084] 表3

[0085]工程菌胞内酶活(U/g) 上清酶活(U/L)
pHT01-P43-PhoD-treS 27293 40753
pHT01-P43-PhoD-treS密码子优化 26485 53917

[0086] 上述信号肽氨基酸序列如下：

[0087] AlbB:MSPAQRRILLYILSFIFVIGAVVYFVKSDYLFTLIFIAIAILF

[0088] AmyX:MVSIRRSFEAYVDDMNIITVLIPAEQKEIM

[0089] AppB:MAAYIIRRTLMSIPILLGITILSFVIMKAAPG

[0090] LipA:MAKKDEHLRKPEWLKIKLNTNENYTGLKKLMREN

[0091] OppB:MLKYIGRRLVYMIITLFVIVTVTFFLMQAAPG

[0092] PbpX:MTSPTRRRTAKRRRRKLNKRGKLLFGLLAVMVCITIWNAL

[0093] QcrA:MSPFPLRLCFSKIQEAVFYFLLIMIKRRKRRRARDIG

[0094] SpoIIIJ:MLLKRRIGLLLSMVGVFMLLAGCS

[0095] TipA:MKKTLTTIRRSSIARRLIISFLLILIVPITALSVSAYQS

[0096] WapA:MKKRKRRNFKRFIAAFLVLALMISLVPADVLAKST

[0097] WprA:MKRRKFSSVVAAVLIFALIFSLFSPGTKAAAAGAID

[0098] YdeJ:MKKRRKICYCNTALLLMILLAGCT

[0099] YesM:MKKRVAGWYRRMKIKDKLFVFLSLIMAVSFLFVYSGVQYAFHV

[0100] YesW:MRRSCLMIRRRKRMFTAVTLLVLLVMGTSVCPVKAEGA

[0101] YfkN:VRIQKRRTHVENILRILLPPIMILSLILPTPPIHAEES

[0102] YkpC:MLRDLGRRVAIAAILSGIILGGMSISLANMP

[0103] YkuE:MKKMSRRQFLKGMFGALAAGALTAGGGYGYARYL

[0104] YmaC:MRRFLLNVILVLAIVLFLRYVHYSLEPE

[0105] YmzC:MFESEAELRRIRIALVWIAVFLLFGACG

[0106] YubF:VQKYRRRNTVAFTVLAYFTFFAGVFLFSIGLYNADNL

[0107] YuiC:MMLNMIRRLLMTCLFLLAFGTTFLSVSGIEAKDL

[0108] YvhJ:MAERVRVRVRKKKKSKRRKILKRIMLLFALALLVVVGLGGYKLY

[0109] YwbN:MSDEQKKPEQIHRRDILKWGAMAGAAVAIGASGLGGLAPLVQTAAKP

[0110] PhoD:MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQSVGAFEV

[0111] 实施例3敲除裂解基因重组菌的构建

[0112] 1、重组质粒的构建

[0113] 以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用相应引物PCR扩增得到裂解基因Xpf、SkfA、LytC和Sdpc，通过酶切位点BamHI和EcoRI连接到敲除载体pMAD，得到四个敲除质粒pMAD-Xpf、pMAD-SkfA、pMAD-LytC和pMAD-Sdpc。

[0114] 2、重组菌的构建

[0115] 依次将敲除质粒pMAD-Xpf、pMAD-SkfA、pMAD-LytC和pMAD-Sdpc通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis WB800n，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含
30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌B.subtilis WB800n(ΔXpf、ΔSkfA、ΔLytC和ΔSdpc)，将此重组菌命名为LM1234。

[0116] 3、工程菌的构建

[0117] 将启动子和信号肽优化后的质粒pHT01-P43-PhoD-treS通过电转的方法转入重组菌LM1234，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h，得到重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM1234)。

[0118] 4、摇瓶发酵酶活检测

[0119] 将构建的重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM1234)，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。

[0120] 将培养好的种子液以体积百分比1％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心，收集上清液和菌体，菌体用10mL 20mM pH8.0PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。

[0121] 酶活力测定步骤

[0122] 将收集的粗酶液和发酵上清液分别与60％麦芽糖1:1混合均匀，置于25℃水浴锅中转化4h，沸水浴煮沸10min，冷却。取1mL转化液离心取上清，通过HPLC高效液相色谱分析仪测定其转化的海藻糖的含量并计算出每克干菌体和每升发酵液的酶活。敲除裂解基因与未敲除酶活对比如表4所示：

[0123] 表4

[0124]工程菌胞内酶活(U/g) 上清酶活(U/L)
pHT01-P43-PhoD-treS(WB800n) 26284 41743
pHT01-P43-PhoD-treS(LM1234) 31184 58285

[0125] 实施例4敲除麦芽糖转运蛋白基因重组菌的构建

[0126] 1、重组质粒的构建

[0127] 以枯草芽孢杆菌基因组为模板，用引物PCR扩增得到麦芽糖转运蛋白基因EIICB，通过酶切位点BamHI和EcoRI连接到敲除载体pMAD，得到敲除质粒pMAD-EIICB。

[0128] 2、重组菌的构建

[0129] 将敲除质粒pMAD-EIICB通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis LM1234，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌B.subtilis LM1234(ΔEIICB)，将此重组菌命名为LM12345。

[0130] 3、工程菌的构建

[0131] 将启动子和信号肽优化后的质粒pHT01-P43-PhoD-treS通过电转的方法转入重组菌LM12345，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM12345)。

[0132] 实施例5发酵条件的优化

[0133] A不同磷酸盐浓度对产酶的影响

[0134] 1、种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液；

[0135] 2、发酵产酶：使用TB培养基作为原始培养基，将培养基中磷酸盐浓度分别改变为原始培养基的3/4、1/2、1/4和0，发酵培养基的pH都维持在8.0左右，将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，测定重组菌的菌体和发酵上清液中的酶活。当磷酸盐浓度为原始TB培养基的1/4时酶活最高；

[0136] B不同碳源对产酶的影响

[0137] 1、种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液；

[0138] 2、发酵产酶：使用TB培养基作为原始培养基，将培养基中甘油分别改变为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉，发酵培养基的pH都维持在8.0左右，将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，测定重组菌的菌体和发酵上清液中的酶活；

[0139] C不同pH对产酶的影响

[0140] 1、种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液；

[0141] 2、发酵产酶：使用TB培养基作为原始培养基，将培养基中甘油改变为蔗糖，使用磷酸盐缓冲液将发酵培养基的pH分别调节到6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，测定重组菌的菌体和发酵上清液中的酶活；

[0142] D 发酵罐分批补料发酵产酶

[0143] 1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液；

[0144] 2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液；

[0145] 3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵24h，分别在4h、8h、12h、16h在发酵罐中补加100mL蔗糖溶液(12g/L)，每隔2-3h取样测菌体和发酵上清液中的酶活；

[0146] E 5L发酵罐流加补料发酵产酶

[0147] 分泌型重组菌在5L发酵罐中培养，流加不同浓度的蔗糖，检测酶活的变化；

[0148] 1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液；

[0149] 2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液；

[0150] 3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵24h，从发酵4h开始，在发酵罐中流加500mL不同浓度蔗糖溶液(浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L)，流速为1mL/min，每隔2-3h取样测菌体和发酵上清液中的酶活；

[0151] 实施例6耦合发酵生产海藻糖

[0152] 目前酶法生产海藻糖都是在发酵结束后破碎菌体得到粗酶液，再将粗酶液与麦芽糖混合转化生产海藻糖，这样耗时时间长，增加生产成本。本发明通过筛选优化启动子和信号肽，敲除裂解基因与麦芽糖转运蛋白基因，得到高效分泌表达海藻糖合酶的重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM12345)，通过优化发酵条件，极大提高了海藻糖合酶的分泌量，通过检测分泌到胞外的酶活能够占到总酶活的70％，从而实现了耦合发酵，实现在发酵罐中的边发酵边转化，将以往的转化过程并入发酵过程，加入的糖液既可以为细菌生长产酶提供能量，又能被海藻糖合酶转化生产海藻糖，极大简化生产过程，缩短生产时间，降低生产成本；具体步骤如下：

[0153] A发酵罐中一次补料耦合发酵

[0154] 自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS在5L发酵罐中培养，在6h取的样品已经可以在发酵液中检测到酶活，说明在6h之前已经开始分泌，尝试在发酵罐发酵过程中加入麦芽糖实现边发酵边转化，在8h时加入100mL麦芽糖与葡萄糖的混合溶液(麦芽糖30g/L，葡萄糖10g/L)：

[0155] 1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM12345)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液；

[0156] 2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液；

[0157] 3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵60h，8h时加入100mL麦芽糖与葡萄糖的混合溶液(麦芽糖30g/L，葡萄糖10g/L)，每隔2-3h取样测菌体和发酵上清液中的酶活；

[0158] B发酵罐中流加麦芽糖耦合发酵

[0159] 尝试罐内发酵边转化时加入麦芽糖与葡萄糖的混合溶液(麦芽糖30g/L，葡萄糖10g/L)，在发酵液中检测到海藻糖，说明罐内发酵边转化的方法可行，但是，由于糖浓度过低，在几个小时之后，葡萄糖被消耗完，麦芽糖与海藻糖开始被消耗，而且葡萄糖浓度不能过高，过高会抑制枯草芽孢杆菌的分泌，所以采取流加麦芽糖与葡萄糖的方式实现边发酵边转化，配制900mL麦芽糖与葡萄糖的混合糖液(麦芽糖300g/L，葡萄糖6g/L)，由于初始发酵培养基中的蔗糖大约在6h时会消耗完，所以6h开始流加混合糖液；

[0160] 1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS(LM12345)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液。

[0161] 2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液。

[0162] 3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵60h，6h时开始流加混合糖液，流速0.5mL/min，每隔2-3h取样测发酵上清液中的糖浓度，计算转化率。

[0163] 结果如图2所示，自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS发酵罐中海藻糖浓度在55h达到最高，此时转化率达到70.07％

[0164] 对比例

[0165] 采用上述制备的自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS的方法，不同之处在于，启动子采用PsrfA，制得pHT01-PsrfA-PhoD-treS(LM12345)。

[0166] 采用实施例6的方法进行发酵生产海藻糖。

[0167] 采取流加麦芽糖与葡萄糖的方式实现边发酵边转化，配制900mL麦芽糖与葡萄糖的混合糖液(麦芽糖300g/L，葡萄糖6g/L)，由于初始发酵培养基中的蔗糖大约在6h时会消耗完，所以6h开始流加混合糖液；

[0168] 1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-PsrfA-PhoD-treS(LM12345)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液；

[0169] 2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液；

[0170] 3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵60h，6h时开始流加混合糖液，流速0.5mL/min，每隔2-3h取样测发酵上清液中的糖浓度，计算转化率。

[0171] 结果如图3所示，重组菌pHT01-PsrfA-PhoD-treS(LM12345)发酵罐中海藻糖浓度在55h趋于稳定，转化率最高达到28.8％。

[0172] 对比例中重组菌pHT01-PsrfA-PhoD-treS(LM12345)PsrfA启动子由于转录强度低，导致胞内表达生成的海藻糖合酶较自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS少，这显著影响了分泌到发酵液中的海藻糖合酶的量，因而相对于自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-treS转化生成的海藻糖浓度显著降低，没有工业应用价值，无法实现耦合生产海藻糖的目的。

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