一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
阅读：2发布：2024-02-21
专利汇可以提供一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种同时生产 乙醇 酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明公开的同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌，通过对受体菌进行如下改造得到：敲除受体菌的xylB基因、glcD基因、aceB基因、glcB基因、gcl基因、aceEF基因；增加受体菌中dte基因、fucK基因、fucA基因、aldA基因、ackA基因、pta基因编码 蛋白质 的含量。本发明获得的工程菌株，有利于简化PLGA的合成步骤，同时生产乙醇酸和乳酸两种 单体 ，并且重组菌在摇瓶培养中的乙醇酸和乳酸的产量能达到理想 水 平，具有较好的应用前景。，下面是一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用专利的具体信息内容。
1.重组菌的构建方法，包括对受体菌进行下述A1-A12的改造，得到所述重组菌；
A1、敲除所述受体菌的xylB基因或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；
A2、敲除所述受体菌的glcD基因或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；
A3、敲除所述受体菌的aceB基因或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；
A4、敲除所述受体菌的glcB基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；
A5、敲除所述受体菌的gcl基因或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；
A6、敲除所述受体菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；
A7、增加所述受体菌中dte基因编码蛋白质的含量或增强所述dte基因编码蛋白质的活性；
A8、增加所述受体菌中fucK基因编码蛋白质的含量或增强所述fucK基因编码蛋白质的活性；
A9、增加所述受体菌中fucA基因编码蛋白质的含量或增强所述fucA基因编码蛋白质的活性；
A10、增加所述受体菌中aldA基因编码蛋白质的含量或增强所述aldA基因编码蛋白质的活性；
A11、增加所述受体菌中ackA基因编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；
A12、增加所述受体菌中pta基因编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；
所述受体菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌为1)或2)：
1)大肠杆菌；
2)大肠杆菌MG1655。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述dte基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：
a1)序列表中序列12所示的蛋白质；
a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述fucK基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：
b1)序列表中序列13所示的蛋白质；
b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述fucA基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：
c1)序列表中序列14所示的蛋白质；
c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述aldA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：
d1)序列表中序列15所示的蛋白质；
d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述ackA基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质：
e1)序列表中序列16所示的蛋白质；
e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述pta基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质：
f1)序列表中序列17所示的蛋白质；
f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
A1通过向所述受体菌中导入含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述dte基因的dte基因表达盒实现；
和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述fucK基因的fucK基因表达盒实现；
和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述fucA基因的fucA基因表达盒实现；
和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aldA基因的aldA基因表达盒实现；
和/或，A11通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现；
和/或，A12通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列6所示的DNA分子；
所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；
所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子；
所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子；
所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子；
所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子；
和/或，所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒中启动子为下述j1)或j2)：
j1)序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子；
j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
和/或，所述dte基因表达盒中所述dte基因为下述k1)或k2)：
k1)序列表中序列1的第70-942位所示的DNA分子；
k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述fucK基因表达盒中所述fucK基因为下述l1)或l2)：
l1)序列表中序列2的第70-1518位所示的DNA分子；
l2)与l1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述fucA基因表达盒中所述fucA基因为下述m1)或m2)：
m1)序列表中序列3的第70-717位所示的DNA分子；
m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述aldA基因表达盒中所述aldA基因为下述n1)或n2)：
n1)序列表中序列4的第70-1509位所示的DNA分子；
n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为下述o1)或o2)：
o1)序列表中序列5的第70-1272位所示的DNA分子；
o2)与o1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述pta基因表达盒中所述pta基因为下述p1)或p2)：
p1)序列表中序列5的第1347-3491位所示的DNA分子；
p2)与p1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述dte基因表达盒为序列表中序列1的第9-942位所示的DNA分子；
所述fucK基因表达盒为序列中序列2的第9-1518位所示的DNA分子；
所述fucA基因表达盒为序列表中序列3的第9-717位所示的DNA分子；
所述aldA基因表达盒为序列表中序列4的第9-1509位所示的DNA分子；
所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒为序列表中序列5的第9-3491位所示的DNA分子。
7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备的重组菌。
8.成套试剂，由权利要求4-6中任一所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段、所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒组成。
9.权利要求8所述成套试剂或利用权利要求1-6中任一所述方法制备的重组菌的下述任一应用：
X1、生产乙醇酸和乳酸；
X2、制备生产乙醇酸和乳酸产品；
X3、降解木糖和/或葡萄糖；
X4、制备降解木糖和/或葡萄糖产品。
10.生产乙醇酸和乳酸的方法，包括：以乙酸、木糖和葡萄糖为碳源，利用权利要求1-6中任一所述的方法制备的重组菌进行生物转化，制备乙醇酸和乳酸。
一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和
应用
技术领域
背景技术
[0002] 乙醇酸又称羟基乙酸，是最简单的α-羟基羧酸。作为重要的化工产品和有机合成中间体，乙醇酸在化工、医药、纺织和冶金等多个领域有广泛应用。例如，2％乙醇酸和1％甲酸的混合酸是一种高效低成本的清洗剂，可用于锅炉、管道、冷凝器和热交换器等的清洗；乙醇酸分子小，能有效渗透毛孔，解决皮肤老化、皱纹和暗疮等问题，常用作化妆品添加剂；
纺织行业中常用乙醇酸作为染整羊毛纤维及纤维素织品的交联耦合剂；另外，乙醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接剂以及化学助剂等。2011年，乙醇酸市场利润为9330万美元，预计2018年可能超过2亿美元。
纺织行业中常用乙醇酸作为染整羊毛纤维及纤维素织品的交联耦合剂；另外，乙醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接剂以及化学助剂等。2011年，乙醇酸市场利润为9330万美元，预计2018年可能超过2亿美元。
[0003] 在自然界中，乙醇酸存在于甘蔗、甜菜以及未成熟的葡萄汁中，含量低且与多种物质共存，分离纯化较为困难。工业上普遍采用化学合成的方法获得乙醇酸，例如氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等。化学法生产乙醇酸虽然工艺较为成熟，但是普遍存在原料毒性大(甲醛、一氧化碳和氰化物等)、生产条件苛刻(强酸或强碱、高温高压等)、反应设备要求高、分离纯化复杂和环境污染等问题，不符合当前低碳环保的可持续发展理念，迫切需要开发新的绿色合成工艺。通过微生物发酵的方法利用可再生生物质资源来获得乙醇酸，能够避免化学法合成的弊端，符合绿色化工发展的要求。
[0004] 乳酸又名2-羟基丙酸，是比乙醇酸多一个碳原子的羟基羧酸。乳酸在自然界中普遍存在，根据其旋光性不同，有D-乳酸、L-乳酸和D,L-乳酸三种形式，其中L-乳酸对人体无毒害作用，广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域。此外，乳酸能够通过化学法聚合为聚乳酸，可作为生物可降解材料使用。2015年，全球乳酸产量约为50万吨，用于食品和饮料领域的占比接近50％，用于聚乳酸领域的占比超过30％。
[0005] 乳酸的制备方法有化学法、酶法和微生物发酵法。微生物发酵法具有生产成本低、原料来源广、产物光学纯度高等优点，是目前工业上生产乳酸的主要方法。发酵使用的菌种有乳杆菌Lactobacillus、芽孢杆菌Bacillus、米根霉Rhizopus、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和大肠杆菌Escherichia coli等，主要生产企业有荷兰Corbion-Purac、美国Cargill与Archer Daniels Midland、比利时Galactic和日本武藏野等。利用非粮廉价原料例如纤维素、木薯、糖蜜和菊芋等发酵生产乳酸已有若干研究，但是玉米淀粉仍是目前大规模使用的原料，由此导致乳酸价格偏高，限制了其广泛应用。
[0006] 乳酸和乙醇酸可以通过化学法共聚合成聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。PLGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为生物医用材料使用。与聚乳酸(polylactic acid，PLA)或者聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)相比，PLGA共聚物具有更加多样的材料学性能。PLGA是少数几种美国食品药品管理局(FDA)批准的生物可降解医用材料之一，常用作手术缝合线、药物缓释载体、骨科固定及组织修复材料等。在药物缓释领域，PLGA是近年来文献报导最多的微球包覆材料之一，涉及的药物包括紫杉醇、阿霉素等小分子，重组生长激素、胰岛素等多肽和蛋白质大分子，以及多种疫苗等。PLGA的合成需要分别制备乳酸和乙醇酸单体，再进行化学法聚合。乳酸主要通过发酵法生产，乙醇酸主要通过氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等化学法生产。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是如何利用木糖、葡萄糖和乙酸同时生产出乙醇酸和乳酸。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1-A12的改造，得到所述重组菌；
[0009] A1、敲除所述受体菌的木酮糖激酶基因(xylB基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：948133)或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；
[0010] A2、敲除所述受体菌的乙醇酸氧化酶基因(glcD基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：947353)或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；
[0011] A3、敲除所述受体菌的苹果酸合酶A基因(aceB基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：948512)或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；
[0012] A4、敲除所述受体菌的苹果酸合酶G基因(glcB，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：948857)基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；
[0013] A5、敲除所述受体菌的羟丙二酸半醛合酶基因(gcl基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：945394)或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；
[0014] A6、敲除所述受体菌的丙酮酸脱氢酶基因(aceE基因和aceF基因，记为aceEF基因；aceE基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：944834；aceF基因，GeneBank号：NC_
000913.3，Gene ID：944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；
000913.3，Gene ID：944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；
[0015] A7、增加所述受体菌中磷酸戊糖异构酶基因(dte基因)编码蛋白质的含量或增强所述dte基因编码蛋白质的活性；
[0016] A8、增加所述受体菌中墨角藻糖激酶基因(fucK基因)编码蛋白质的含量或增强所述fucK基因编码蛋白质的活性；
[0017] A9、增加所述受体菌中墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因(fucA基因)编码蛋白质的含量或增强所述fucA基因编码蛋白质的活性；
[0018] A10、增加所述受体菌中醛脱氢酶基因(aldA基因)编码蛋白质的含量或增强所述aldA基因编码蛋白质的活性；
[0019] A11、增加所述受体菌中乙酸激酶基因(ackA基因)编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；
[0020] A12、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶基因(pta基因)编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；
[0021] 所述受体菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。
[0022] 上述方法中，所述受体菌为1)或2)：
[0023] 1)大肠杆菌；
[0024] 2)大肠杆菌MG1655。
[0025] 上述方法中，所述dte基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：
[0027] a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0028] 和/或，所述fucK基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：
[0029] b1)序列表中序列13所示的蛋白质；
[0030] b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0031] 和/或，所述fucA基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：
[0032] c1)序列表中序列14所示的蛋白质；
[0033] c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0034] 和/或，所述aldA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：
[0035] d1)序列表中序列15所示的蛋白质；
[0036] d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0037] 和/或，所述ackA基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质：
[0038] e1)序列表中序列16所示的蛋白质；
[0039] e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0040] 和/或，所述pta基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质：
[0041] f1)序列表中序列17所示的蛋白质；
[0042] f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
[0043] 上述方法中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0044] 上述方法中，A1通过向所述受体菌中导入含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
[0045] 和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段实现；
[0046] 和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
[0047] 和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
[0048] 和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段实现；
[0049] 和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；
[0050] 和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述dte基因的dte基因表达盒实现；
[0051] 和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述fucK基因的fucK基因表达盒实现；
[0052] 和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述fucA基因的fucA基因表达盒实现；
[0053] 和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aldA基因的aldA基因表达盒实现；
[0054] 和/或，A11通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现；
[0055] 和/或，A12通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现。
[0056] 向所述受体菌中导入各表达盒均可通过将含有相应表达盒的表达载体导入所述受体菌中实现。
[0057] 所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为质粒pBBR1MCS-2。
[0058] 上述方法中，各基因的敲除均可通过λ-red同源重组方式实现。
[0059] 上述方法中，所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列6所示的DNA分子；
[0060] 所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；
[0061] 所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子；
[0062] 所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子；
[0063] 所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子；
[0064] 所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子；
[0065] 和/或，所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒中启动子为下述j1)或j2)：
[0066] j1)序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子；
[0067] j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
[0068] 和/或，所述dte基因表达盒中所述dte基因为下述k1)或k2)：
[0069] k1)序列表中序列1的第70-942位所示的DNA分子；
[0070] k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
[0071] 和/或，所述fucK基因表达盒中所述fucK基因为下述l1)或l2)：
[0072] l1)序列表中序列2的第70-1518位所示的DNA分子；
[0073] l2)与l1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
[0074] 和/或，所述fucA基因表达盒中所述fucA基因为下述m1)或m2)：
[0075] m1)序列表中序列3的第70-717位所示的DNA分子；
[0076] m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
[0077] 和/或，所述aldA基因表达盒中所述aldA基因为下述n1)或n2)：
[0078] n1)序列表中序列4的第70-1509位所示的DNA分子；
[0079] n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
[0080] 和/或，所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为下述o1)或o2)：
[0081] o1)序列表中序列5的第70-1272位所示的DNA分子；
[0082] o2)与o1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
[0083] 和/或，所述pta基因表达盒中所述pta基因为下述p1)或p2)：
[0084] p1)序列表中序列5的第1347-3491位所示的DNA分子；
[0085] p2)与p1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
[0086] 上述方法中，所述75％或75％以上同一性均可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0087] 上述方法中，所述dte基因表达盒为序列表中序列1的第9-942位所示的DNA分子；
[0088] 所述fucK基因表达盒为序列表中序列2的第9-1518位所示的DNA分子；
[0089] 所述fucA基因表达盒为序列表中序列3的第9-717位所示的DNA分子；
[0090] 所述aldA基因表达盒为序列表中序列4的第9-1509位所示的DNA分子；
[0091] 所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒为序列表中序列5的第9-3491位所示的DNA分子。
[0092] 本发明还提供了利用所述方法制备的重组菌。
[0093] 本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂由所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段、所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒组成。
[0094] 所述成套试剂可用于生产乙醇酸和乳酸，也可用于降解木糖和/或葡萄糖。
[0095] 本发明还提供了所述成套试剂或所述重组菌的下述任一应用：
[0096] X1、生产乙醇酸和乳酸；
[0097] X2、制备生产乙醇酸和乳酸产品；
[0098] X3、降解木糖和/或葡萄糖；
[0099] X4、制备降解木糖和/或葡萄糖产品。
[0100] 本发明还提供了生产乙醇酸和乳酸的方法，所述方法包括：以乙酸、木糖和葡萄糖为碳源，利用所述重组菌进行生物转化，制备得到乙醇酸和乳酸。
[0101] 其中，进行所述生物转化可利用MM液体培养基进行。
[0102] 所述MM液体培养基的组成如下：每升培养基含5g木糖、5g葡萄糖、5g乙酸、2g NH4Cl、5g(NH4)2SO4、6g KH2PO4、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.05g卡那霉素、2g酵母粉，余量为水。
[0103] 所述微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.03g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
[0104] 所述生物转化的条件可为：30-37℃(如37℃)摇瓶振荡培养24-72h(如48h)。摇瓶的转速具体可调整。
[0105] 本发明的有益效果：本发明通过在大肠杆菌中表达6个代谢途径相关的基因和敲除7个内源基因，获得了能够以木糖、葡萄糖和乙酸为碳源，同时获得乙醇酸和乳酸的工程菌株，有利于简化PLGA的合成步骤，并且重组菌在摇瓶培养中的乙醇酸和乳酸的产量和得率能达到较高的水平，具有较好的应用前景。附图说明
[0106] 图1为pMCS-GALA1载体图谱。
[0107] 图2为pMCS-GALA2载体图谱。
[0108] 图3为pMCS-GALA3载体图谱。
[0109] 图4为pMCS-GALA4载体图谱。
[0110] 图5为pMCS-GALA5载体图谱。
具体实施方式
[0111] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
[0112] 下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均为NEB(New England Biolabs，http://www.neb-china.com/)公司产品；质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒，均为北京博迈德基因技术有限公司(http://www.biomed168.com/)产品；实施例中涉及的DNA合成和测序工作，由北京博迈德基因技术有限公司完成。
[0113] E.coli MG1655：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center(http://cgsc2.biology.yale.edu/)，编号CGSC#6300。
[0114] E.coli NEB 5-alpha：来源于NEB(New England Biolabs)，货号C2987I。
[0115] 质粒pKD13：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center，编号CGSC#7633。
[0116] 质粒pKD46：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center，编号CGSC#7739。
[0117] 质粒pCP20：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center，编号CGSC#7637。
[0118] 质粒pBBR1MCS-2：公众可根据NCBI accession number U23751.1的序列自行提交基因合成公司获得，该质粒记载在如下文献中：Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes,1995,Gene,166:175-176。
[0119] MM液体培养基的组成如下：每升培养基含5g木糖、5g葡萄糖、5g乙酸、2g NH4Cl、5g(NH4)2SO4、6g KH2PO4、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.05g卡那霉素、2g酵母粉，余量为水。
[0120] 微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.03g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
[0121] 实施例1、构建重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)和E.coli GALA6(pMCS-GALA4)[0122] 一、重组表达载体pMCS-GALA5的构建
[0123] 1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有dte表达盒，上游为SacI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-942位核苷酸为dte基因序列。
[0124] 2、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有fucK表达盒，上游为XbaI位点，下游为HindIII位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1518位核苷酸为fucK基因序列。
[0125] 3、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有fucA表达盒，上游为HindIII位点，下游为XhoI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-717位核苷酸为fucA基因序列。
[0126] 4、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有aldA表达盒，上游为XhoI位点，下游为ApaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1509位核苷酸为aldA基因序列。
[0127] 5、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有ackA和pta表达盒，上游为ApaI位点，下游为KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1272位核苷酸为ackA基因序列，第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。
[0128] 6、用SacI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为936bp的DNA片段；用SacI和XbaI双酶切质粒pBBR1MCS-2，回收大小约为5124bp的DNA片段；将上述约936bp和
5124bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和XbaI进行酶切验证，得到的酶切产物大小约为936bp和5124bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA1。将得到的重组质粒pMCS-GALA1进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA1为将质粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第9-942位所示的dte表达盒得到的重组质粒。
5124bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和XbaI进行酶切验证，得到的酶切产物大小约为936bp和5124bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA1。将得到的重组质粒pMCS-GALA1进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA1为将质粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第9-942位所示的dte表达盒得到的重组质粒。
[0129] 7、用XbaI和HindIII双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小约为1516bp的DNA片段；用XbaI和HindIII双酶切步骤6中得到的质粒pMCS-GALA1，回收大小约为6018bp的DNA片段；将上述约1516bp和6018bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和HindIII进行酶切验证，酶切产物大小约为1516bp和6018bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA2。将得到的重组质粒pMCS-GALA2进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA2为将质粒pMCS-GALA1的XbaI和HindIII的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第9-1518位所示的fucK表达盒得到的重组质粒。
[0130] 8、用HindIII和XhoI双酶切步骤3中合成的DNA序列，回收大小约为715bp的DNA片段；用HindIII和XhoI双酶切步骤7中得到的质粒pMCS-GALA2，回收大小约为7513bp的DNA片段；将上述约715bp和7513bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用HindIII和XhoI进行酶切验证，酶切产物大小约为715bp和7513bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA3。将得到的重组质粒pMCS-GALA3进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA3为将质粒pMCS-GALA2的HindIII和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3的第9-717位所示的fucA表达盒得到的重组质粒。
[0131] 9、用XhoI和ApaI双酶切步骤4中合成的DNA序列，回收大小约为1511bp的DNA片段；用XhoI和ApaI双酶切步骤8中得到的质粒pMCS-GALA3，回收大小约为8215bp的DNA片段；将上述约1511bp和8215bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XhoI和ApaI进行酶切验证，酶切产物大小约为1511bp和8215bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA4。将得到的重组质粒pMCS-GALA4进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA4为将质粒pMCS-GALA3的XhoI和ApaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4的第9-1509位所示的aldA表达盒得到的重组质粒。
[0132] 10、用ApaI和KpnI双酶切步骤5中合成的DNA序列，回收大小约为3489bp的DNA片段；用ApaI和KpnI双酶切步骤9中得到的质粒pMCS-GALA4，回收大小约为9720bp的DNA片段；将上述约3489bp和9720bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用ApaI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小约为3489bp和9720bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA5。将得到的重组质粒pMCS-GALA5进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA5为将质粒pMCS-GALA4的ApaI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列5的第9-3491位所示的ackA和pta表达盒得到的重组质粒。
[0133] 二、大肠杆菌E.coli GALA6的构建
[0134] 1、敲除xylB基因
[0135] 1)合成xylB基因敲除所用的引物xylBF和xylBR，序列如下：
[0136] xylBF：5’-ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
[0137] xylBR：5’-TTACGCCATTAATGGCAGAAGTTGCTGATAGAGGCGACGGAACGTTTCTCGTCGTGGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
[0138] 2)以质粒pKD13为模板，采用引物xylBF和xylBR进行PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段，命名为xylB同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序，xylB同源重组片段的核苷酸序列为序列6，其中，第1-60位为xylB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为xylB基因下游同源臂。
[0139] 3)利用电转化的方法将质粒pKD46转化至受体菌株E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得含有pKD46的重组菌，记为E.coli MG1655(pKD46)。
[0140] 4)将E.coli MG1655(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养1h，加入阿拉伯糖至终浓度5g/L，继续培养1.5h，接下来制备E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。
[0141] 5)利用菌落PCR的方法，以xylBF和xylBR为引物进行PCR，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的xylB基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，记为E.coli MG1655xylB-K(pKD46)。
[0142] 6)将E.coli MG1655xylB-K(pKD46)接种于LB液体培养基中，42℃培养传代三次，除去pKD46质粒，得到E.coli MG1655xylB-K；E.coli MG1655xylB-K是xylB基因被Kan基因替换了的E.coli MG1655。
[0143] 7)将E.coli MG1655xylB-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h，制备E.coli MG1655xylB-K感受态细胞。
[0144] 8)利用电转化的方法将质粒pCP20转化到E.coli MG1655xylB-K感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。利用菌落PCR的方法验证转化子，以xylBF和xylBR为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli MG1655基因组上的xylB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA1。
[0145] 2、敲除glcD基因
[0146] 与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
[0147] glcD基因敲除所用引物如下：
[0148] glcDF：
[0149] 5’-ATGAGCATCTTGTACGAAGAGCGTCTTGATGGCGCTTTACCCGATGTCGACCGCACATCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
[0150] glcDR：
[0151] 5’-TCAGAAACGCTCCAGTTCAGGGAAAGGTAAATGACCGTGATGCACATGCATGGCACCAAAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
[0152] 利用glcD基因敲除引物得到的glcD同源重组片段的核苷酸序列为序列7，其中，第1-60位为glcD基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为glcD基因下游同源臂。所用转化受体菌株为上述步骤1得到的突变体E.coli GALA1。利用菌落PCR的方法验证转化子，以glcDF和glcDR为引物，得到202bp的片段的菌为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA1基因组上的glcD基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA2。
[0153] 3、敲除aceB基因
[0154] 与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
[0155] aceB基因敲除引物序列如下：
[0156] aceBF：
[0157] 5’-ATGACTGAACAGGCAACAACAACCGATGAACTGGCTTTCACAAGGCCGTATGGCGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
[0158] aceBR：
[0159] 5’-TTACGCTAACAGGCGGTAGCCTGGCAGGGTCAGGAAATCAATTAACTCATCGGAAGTGGTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
[0160] 利用aceB基因敲除引物得到的aceB同源重组片段的核苷酸序列为序列8，其中，第1-60位为aceB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为aceB基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤2得到的突变体E.coli GALA2。利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceBF和aceBR为引物，得到202bp的片段的菌为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA2基因组上的aceB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA3。
[0161] 4、敲除glcB基因
[0162] 与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
[0163] glcB基因敲除引物序列如下：
[0164] glcBF：
[0165] 5’-ATGAGTCAAACCATAACCCAGAGCCGTTTACGCATTGACGCCAATTTTAAACGTTTTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
[0166] glcBR：
[0167] 5’-TTAATGACTTTCTTTTTCGCGTAAACGCCAGGCGTGTAATAACGGTTCGGTATAGCCGTTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
[0168] 利用glcB基因敲除引物得到的glcB同源重组片段的核苷酸序列为序列9，其中，第1-60位为glcB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为glcB基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤3得到的突变体E.coli GALA3。利用菌落PCR的方法验证转化子，以glcBF和glcBR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA3基因组上的glcB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA4。
[0169] 5、敲除gcl基因
[0170] 与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
[0171] gcl基因敲除引物序列如下：
[0172] gclF：
[0173] 5’-ATGGCAAAAATGAGAGCCGTTGACGCGGCAATGTATGTGCTGGAGAAAGAAGGTATCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
[0174] gclR：
[0175] 5’-TTATTCATAGTGCATGAAGCAGGTTTCAGTCGGTGCGTCCGCTGCGTTATCGGCGATATCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
[0176] 利用gcl基因敲除引物得到的gcl同源重组片段的核苷酸序列为序列10，其中，第1-60位为gcl基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为gcl基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤4得到的突变体E.coli GALA4。利用菌落PCR的方法验证转化子，以gclF和gclR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA4基因组上的gcl基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA5。
[0177] 6、敲除aceEF基因
[0178] 与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
[0179] aceEF基因敲除引物序列如下：
[0180] aceEFF：
[0181] 5’-ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGACGTGGATCCGATCGAAACTCGCGACTGGCTCCAGGCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
[0182] aceEFR：
[0183] 5’-TTACATCACCAGACGGCGAATGTCAGACAGCGTGTTGTTAATGATGGTAATGAAACGGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
[0184] 利用aceEF基因敲除引物得到的aceEF同源重组片段的核苷酸序列为序列11，其中，第1-60位为aceEF基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为aceEF基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤5得到的突变体E.coli GALA5。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceEFF和aceEFR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA5基因组上的aceEF基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA6。
利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceEFF和aceEFR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA5基因组上的aceEF基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA6。
[0185] 三、重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)的构建
[0186] 1、将上述步骤一得到的重组质粒pMCS-GALA5通过电转化的方法转化到上述步骤二得到的大肠杆菌E.coli GALA6，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
[0187] 2、挑取单克隆于含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
[0188] 3、提取转化子的质粒，验证菌株，将含有pMCS-GALA5的重组菌记为E.coli GALA6(pMCS-GALA5)。
[0189] E.coli GALA6(pMCS-GALA5)为敲除E.coli MG1655染色体基因xylB、glcD、aceB、glcB、gcl、aceEF，并且含有基因dte、fucK、fucA、aldA、ackA、pta的外源表达盒的重组菌。
[0190] 四、对照重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA4)的构建
[0191] 1、将上述步骤一得到的重组质粒pMCS-GALA4通过电转化的方法转化到上述步骤二得到的大肠杆菌E.coli GALA6，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
[0192] 2、挑取单克隆于含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
[0193] 3、提取转化子的质粒，验证菌株，得到含有pMCS-GALA4的重组菌记为E.coli GALA6(pMCS-GALA4)。
[0194] E.coli GALA6(pMCS-GALA4)为敲除E.coli MG1655染色体基因xylB、glcD、aceB、glcB、gcl、aceEF，并且含有基因dte、fucK、fucA、aldA的外源表达盒的重组菌。
[0195] 实施例2、重组菌在生产乳酸和乙醇酸中的应用
[0196] 一、重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)和E.coli GALA6(pMCS-GALA4)的摇瓶培养条件
[0197] 1、将实施例1中制备的E.coli GALA6(pMCS-GALA5)和E.coli GALA6(pMCS-GALA4)分别在含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
[0198] 2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MM液体培养基中进行发酵，选用250ml摇瓶，装液量为50ml，转速为75rpm或150rpm，37℃培养48h，分别在培养24h和48h收集发酵液。
[0199] 3、通过高效液相色谱对重组菌的乙醇酸和乳酸生产以及木糖、葡萄糖和乙酸消耗进行定量检测。具体条件如下：
[0201] 色谱条件：Bio-Rad HPX-87H(7.8×300mm)；流速0.60mL/min；柱温55℃；流动相为5mM硫酸水溶液。
[0202] 检测方法：取乙醇酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的乙醇酸标准品水溶液(乙醇酸，Sigma-Aldrich，产品编号420581)，取乳酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的乳酸的标准品水溶液(乳酸，Sigma-Aldrich，产品编号69785)，取葡萄糖浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的葡萄糖标准品水溶液(葡萄糖，Sigma-Aldrich，产品编号G8270)，取木糖浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的木糖标准品水溶液(木糖，Sigma-Aldrich，产品编号X1500)，取乙酸浓度分别为0、1、
2、3、4、5g/L的乙酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号A6283)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的乙醇酸、乳酸、葡萄糖、木糖、乙酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同物质的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、3、4、5g/L的乙酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号A6283)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的乙醇酸、乳酸、葡萄糖、木糖、乙酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同物质的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0203] 取2mL的发酵液，先用紫外分光光度计测定菌液在600nm的OD值，再于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新的离心管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。将待测样品发酵上清液的乙醇酸、乳酸的色谱峰面积代入相应标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的乙醇酸、乳酸含量。将待测样品发酵上清液的葡萄糖、木糖、乙酸色谱峰面积代入相应标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液残留的葡萄糖、木糖、乙酸含量，将接种后初始的葡萄糖、木糖、乙酸含量分别减去发酵上清液残留的葡萄糖、木糖、乙酸含量，得到重组菌的葡萄糖、木糖、乙酸消耗量。
[0204] 二、重组菌在不同条件下生产乙醇酸和乳酸
[0205] 1、将重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)按照上述一中的条件进行摇瓶发酵，所用250ml摇瓶装液量为50ml,分别在发酵24h、48h收集发酵液检测产物生产和底物消耗情况，如表1所示。
[0206] 表1 E.coli GALA6(pMCS-GALA5)的产物生产和底物消耗情况
[0207]
[0208] 由结果可以看出，本发明构建的重组菌株E.coli GALA6(pMCS-GALA5)能够在添加木糖、葡萄糖和乙酸为碳源的培养基中，发酵获得乙醇酸和乳酸，75rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为0.98g/L和2.74g/L，150rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为1.96g/L和3.21g/L。
[0209] 2、将重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA4)按照上述步骤一中的条件进行摇瓶发酵，所用250ml摇瓶装液量为50ml,分别在发酵24h、48h收集发酵液检测产物生产和底物消耗情况，如表2所示。
[0210] 表2 E.coli GALA6(pMCS-GALA4)的产物生产和底物消耗情况
[0211]
[0212] 由结果可以看出，本发明构建的重组菌株E.coli GALA6(pMCS-GALA4)能够在添加木糖、葡萄糖和乙酸为碳源的培养基中，发酵获得乙醇酸和乳酸，75rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为0.88g/L和1.11g/L，150rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为1.22g/L和1.34g/L。
[0213] 综合表1和表2的结果，重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)与重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA4)相比，细菌的OD值、乙醇酸和乳酸的产量、以及乙酸的利用量均显著增加。
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