一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9及其应用
阅读：546发布：2024-02-25
专利汇可以提供一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 “一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9及其应用”，属于 微 生物 技术领域。所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9的保藏号为CGMCC No.14783。基于该菌株，本发明还提供包含该菌株的降解木质素/ 纤维 素的菌剂、 生物降解 剂、用于堆肥的制品、添加剂，以及使用该菌株的木质素/ 纤维素 生物降解方法、堆肥的制备方法、生产锰过 氧 化物酶的方法。本发明的YZC9菌株的锰过氧化物酶(MnP)活性可高达116U/ml；同时该密孔菌株YZC9还可获得良好的堆肥效果，具备工业化生产锰过氧化物酶(MnP)以及园林堆肥的良好应用前景。，下面是一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9及其应用专利的具体信息内容。
1.一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCC No.14783。
2.用于降解木质素和/或纤维素的菌剂，其包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
3.根据权利要求2所述的菌剂，还包括制备菌剂常用的辅料；
优选地，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
4.一种木质素和/或纤维素的生物降解剂，其包括权利要求1所述的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，和/或，权利要求2或3所述的菌剂。
5.一种木质素和/或纤维素的生物降解方法，包括将保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9与木质素和/或纤维素接触。
6.根据权利要求5所述的生物降解方法，其特征在于，将所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9用于堆肥、将所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9用于堆肥、或用于与秸秆类农业废弃物、果园废弃物、园林绿化废弃物、动物粪便接触；
具体地，所述秸秆类农业废弃物包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆；所述动物粪便包括牛马羊粪便。
7.一种生产锰过氧化物酶的方法，包括：培养保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，从该菌株培养物中提取锰过氧化物酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述培养指将所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9置于产酶培养基中发酵培养；
优选地，所述产酶培养基包含如下物质：葡萄糖10g/L，酒石酸铵2mmol/L，吐温
800.05g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，VB1 1mg/L；含有如下成分的微量元素混合液：氨基乙酸0.5g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl 1.0g/L，CoSO4 0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，ZnSO4·7H2O0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，AlK(SO4)2·12H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，Na2MoSO4·2H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L；
pH4.5的醋酸缓冲溶液10mmol/L；
优选地，所述培养条件为35℃，150r/min摇床中培养72h后再培养48h；
优选地，所述提取锰过氧化物酶指，将培养后的培养基用纱布过滤，将滤液于4℃，
10000r/min离心机离心15min，取上清液即得包含了所述锰过氧化物酶的粗制酶液。
9.用于园林废弃物堆肥的制品，其特征在于，所述制品包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9；
优选地，所述的制品，其特征在于，还包括用于园林废弃物堆肥的常规成分。
10.用于园林废弃物堆肥的添加剂，其特征在于，所述添加剂包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 密孔菌属(Pycnoporus sp.)是多孔菌目多孔菌科的一种真菌，担子果1～多年生，非平伏，担子果无柄，菌盖木栓质；菌肉橙～红色，遇10％KOH变黑；菌丝系统为三系菌丝，有索状联合；子实层体管状、有时有囊状体，无刚毛。子实体单生，群生或叠生。
[0003] 密孔菌属的新菌株的发现目前报道的较少，具有功能的密孔菌菌株更是罕见。现有技术中已报道过一种可生产漆酶的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)菌株mk528，其保藏号为CGMCC NO.1124。血红密孔菌，属多孔菌科一种，是木栖腐生的中小型菇类，该菇类生长于低中海拔林区，生长期间约是在春夏两季之间。上述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)菌株mk528产生的漆酶酶活可达63U/ml。
发明内容
[0005] 针对本领域的上述空白和需求，本发明开发得到一株可同时降解木质素和纤维素，且同时具备木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性，以及滤纸酶、外切β-葡聚糖酶和内切β-葡聚糖酶活性的新密孔菌菌株YZC9，该菌株的锰过氧化物酶(MnP)活性尤其高，可达到116U/ml。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCC No.14783。
[0008] 用于降解木质素和/或纤维素的菌剂，其包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0009] 所述菌剂，还包括制备菌剂常用的辅料；
[0010] 优选地，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
[0012] 一种木质素和/或纤维素的生物降解方法，包括将保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9与木质素和/或纤维素接触。
[0014] 一种生产锰过氧化物酶的方法，包括：培养保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，从该菌株培养物中提取锰过氧化物酶。
[0016] 优选地，所述产酶培养基包含如下物质：葡萄糖10g/L，酒石酸铵2mmol/L，吐温800.05g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，VB1 1mg/L；含有如下成分的微量元素混合液：氨基乙酸0.5g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl 1.0g/L，CoSO4 0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，ZnSO4·7H2O0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，AlK(SO4)2·12H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，Na2MoSO4·2H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L；
pH4.5的醋酸缓冲溶液10mmol/L
pH4.5的醋酸缓冲溶液10mmol/L
[0017] 优选地，所述培养条件为35℃，150r/min摇床中培养72h后再培养48h；
[0018] 优选地，所述提取锰过氧化物酶指，将培养后的培养基用纱布过滤，将滤液于4℃，10000r/min离心机离心15min，取上清液即得包含了所述锰过氧化物酶的粗制酶液。
[0019] 用于园林废弃物堆肥的制品，其特征在于，所述制品包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9；
[0020] 优选地，所述的制品，其特征在于，还包括用于园林废弃物堆肥的常规成分。
[0021] 用于园林废弃物堆肥的添加剂，其特征在于，所述添加剂包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0022] 一种堆肥，其由堆肥物料中接种保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9发酵而得。
[0023] 所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；
[0024] 所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣按体积比8∶2混合的混合物；
[0025] 优选地，在堆肥物料中按体积比0.5％的接种密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0026] 一种堆肥的制备方法，包括：在堆肥过程中向堆肥物料接种保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0027] 所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；
[0028] 所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣按体积比8∶2混合的混合物；
[0029] 优选地，按体积比0.5％接种量在堆肥物料中接种密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0030] 本发明的有益效果在于：本发明从野外环境的腐殖土中分离得到一株菌株，通过ITS分子鉴定及其功能测定，包括降解木质素、降解纤维素、堆肥腐熟等试验，发现其是一株属于密孔菌Pycnoporus sp.的新菌株，并将其命名为YZC9，同时发现该YZC9菌株同时具备木质素/纤维素降解能力，并测定出其同时发挥具备木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性，以及滤纸酶、外切β-葡聚糖酶和内切β-葡聚糖酶活性，其中以锰过氧化物酶(MnP)活性最高，在未经诱导以及未经工业扩大培养的前提下，仅在实验室发酵的粗制酶液中，该YZC9菌株的锰过氧化物酶(MnP)活性可高达116U/ml；同时该密孔菌株YZC9还可获得良好的堆肥效果，具备工业化生产锰过氧化物酶(MnP)以及园林堆肥的良好应用前景。
[0032] 菌种保藏名称：YZC9
[0033] 保藏号：CGMCC No.14783
[0034] 分类命名：密孔菌
[0035] 拉丁名：Pycnoporus sp.
[0036] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0037] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0038] 保藏日期：2017年9月27日
[0040] 图1为葡萄糖标准曲线。
[0041] 图2为YZC9愈创木酚显色反应。
[0042] 图3为YZC9苯胺蓝脱色反应。
[0043] 图4为YZC9产LiP、MnP酶实验。
[0044] 图5为YZC9产Lac酶实验。
[0045] 图6为YZC9木质素分解酶活力。
[0046] 图7为YZC9刚果红透明圈实验结果。
[0047] 图8为YZC9滤纸降解实验结果。
[0048] 图9为YZC9纤维素分解酶活力。
[0049] 图10为YZC9堆肥温度的变化。
[0050] 图11为YZC9菌落形态。
[0051] 图12为YZC9的系统发育树。
具体实施方式
[0052] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053] 生物材料的来源
[0055] 培养基
[0056] 分离培养基：PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)、高氏1号培养基(放线菌)[0057] 木质素降解菌筛选培养基：PDA-愈创木酚显色培养基、PDA-苯胺蓝脱色培养基[0058] 纤维素降解菌筛选培养基：CMC-Na培养基、滤纸培养基
[0059] 上述培养基均具备本领域常规理解的含义，可从本领域的工具书中查询获知相应的培养基配方。
[0060] 第1组实施例、本发明的密孔菌株YZC9
[0061] 本组实施例提供一株密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCC No.14783。
[0062] 在一些具体的实施例中，所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9还具有如下特征：菌落直径50～55mm，白色，局部表面橙色，稀疏絮状；背面浅褐色，无水溶性色素。营养菌丝初期无色，壁光滑，后期深褐色，壁明显粗糙，具分隔，分枝多，宽1.5～4.0μm；无锁状联合现象。第2组实施例、本发明的菌剂
[0063] 本组实施例提供一种用于降解木质素和/或纤维素的菌剂。本组所有的实施例都具备如下特征：所述菌剂包括保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0064] 在进一步的实施例中，所述菌剂还包括制备菌剂常用的辅料；
[0065] 在优选的实施例中，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
[0066] 第3组实施例、本发明的生物降解剂
[0067] 本组实施例提供一种木质素和/或纤维素的生物降解剂。在本组所有的实施例中，都具备如下共同特征：所述生物降解剂包括第1组实施例任一所述的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，和/或，第2组实施例任一所述的菌剂。
[0068] 第4组实施例、本发明的生物降解方法
[0069] 本组实施例提供一种木质素和/或纤维素的生物降解方法。本组实施例具备如下共同特征：所述生物降解方法包括将保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9与木质素和/或纤维素接触。
[0070] 在一些具体的实施例中，所述生物降解方法的特征是，将所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9用于堆肥、或用于与秸秆类农业废弃物、果园废弃物、园林绿化废弃物、动物粪便接触；
[0071] 具体地，所述秸秆类农业废弃物包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆；所述动物粪便包括牛马羊粪便。
[0072] 第5组实施例、本发明生产锰过氧化物酶的方法
[0073] 本组实施例提供一种生产锰过氧化物酶的方法。本组所有的实施例具备如下共同特征：所述方法包括：培养保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9，从该菌株培养物中提取锰过氧化物酶。
[0074] 一些实施例中，所述培养指将所述密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9置于产酶培养基中发酵培养。
[0075] 在进一步的实施例中，所述产酶培养基包含如下物质：蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl5g/L、CMC-Na 5g/L。
[0076] 在具体的实施例中，所述培养条件为35℃，150r/min摇床中培养72h后再培养48h；
[0077] 在优选的实施例中，所述提取锰过氧化物酶指，将培养后的培养基于4℃，10000r/min离心机离心15min，取上清液即得包含了所述锰过氧化物酶的粗制酶液。
[0078] 第6组实施例、本发明的堆肥
[0079] 本组实施例提供一种堆肥。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述堆肥由堆肥物料中接种保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9发酵而得。
[0080] 在一些实施例中，所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；
[0081] 在优选的实施例中，所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣体积比8∶2的混合物；
[0082] 在具体的实施例中，在堆肥物料中按体积比0.5％接种密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。第7组实施例、本发明堆肥的制备方法
[0083] 本组实施例提供一种堆肥的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述制备方法包括：在堆肥过程中向堆肥物料接种保藏号为CGMCC No.14783的密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0084] 在一些实施例中，所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；
[0085] 在进一步的实施例中，所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣体积比8∶2的混合物；
[0086] 在具体的实施例中，按体积比0.5％接种量在堆肥物料中接种密孔菌Pycnoporus sp.菌株YZC9。
[0087] 实验例、本发明的实验操作过程
[0088] 3实验方法
[0089] 3.1土壤菌种分离
[0090] 配制无菌水，将土样按10-3到10-7的浓度梯度溶解到无菌水中，充分溶解。然后吸取混合液接种在PDA培养基上，置于28℃下培养5～7d。
[0091] 3.2菌种形态鉴定与纯化
[0092] 根据形态初步判定真菌、细菌和放线菌，并接到各自专用培养基上，反复接种纯化直至获得纯菌株，备用。
[0093] 3.3木质素降解菌的筛选方法
[0094] 3.3.1PDA-愈创木酚平板显色反应
[0095] 将纯化后的菌种接于PDA-愈创木酚培养基平板上后,置28℃下培养5d,每天记录有无红棕色变色圈的产生及变色圈直径的大小,有红棕色圈者记为+,反之记为-。根据变色圈所产生的时间及变色圈的直径大小,检测出产Lac较高的菌株。
[0096] 3.3.2PDA-苯胺蓝平板脱色反应
[0097] 将纯化后的菌种接于PDA-苯胺蓝培养基平板上,并将平板置28℃下避光培养10d,记录蓝色培养基中有无退色圈的产生及退色圈直径的大小,有退色圈者记为+,反之记为-。根据退色圈产生的时间及退色圈的直径大小,检测出产MnP和LiP较高的菌株
[0098] 3.3.3产酶试验
[0100] 3.3.4酶活试验
[0101] 液体培养基于35℃，150r/min摇床中培养72h，取0.2ml接种于100ml产酶培养基[0102] 产酶培养基：葡萄糖10g/L，酒石酸铵2mmol/L，吐温80 0.05g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，VB1 1mg/L；微量元素混合液70ml：氨基乙酸0.5g/L，MgSO4·7H2O3g/L，NaCl 1.0g/L，CoSO4 0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，ZnSO4·7H2O0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，AlK(SO4)2·12H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，Na2MoSO4·2H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.1g/L；醋酸缓冲溶液10mmol/L(pH4.5)定容到1L；
[0103] 中，相同条件下培养48h。每隔24h取样测定酶活，将培养好的液体发酵产酶培养基置于4℃，10000r/min离心机离心15min，取上清液，即粗制酶液，待用。
[0104] 木质素过氧化物酶活性的测定——藜芦醇法
[0105] 锰过氧化物霉活性的测定——Mn2+法
[0106] 漆酶活性的测定——ABTS法
[0107] 3.4纤维素降解菌的筛选方法
[0109] a.将所有的菌种接种在CMC-Na培养基中，两个重复，根据不同类型的菌种，调整不同的培养温度，培养不同的时间后，待菌种长的完整.
[0111] c.取10ml 1mol/L的氯化钠溶液至每个平板上，静置脱色1小时后，倒掉多余的液体。
[0112] d.观察并测量透明圈与菌种直径，并拍照。
[0113] e.计算DP值(透明全大小D与菌种大小d的比值的平方)
[0114] 3.4.2滤纸降解实验法
[0115] 将菌种接种在滤纸培养基中，做两个重复，并有一组无菌水的对照。按照培养条件，培养一段时间后，每两天一观测滤纸的降解程度，并拍照记录。
[0116] 3.4.3纤维素降解菌酶活的测定方法
[0117] 3.4.3.1材料
[0118] DNS试剂、产酶培养基(蛋白胨10g/L酵母膏10g/L NaCl 5g/L CMC-Na 5g/L)、0.05mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L柠檬酸钠溶液、0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、1％CMC溶液
[0119] 3.4.3.2葡萄糖标准曲线的绘制
[0120] 用分析天平称取0.108g葡萄糖试剂于100ml烧杯中，随后加入蒸馏水定容至100ml，使其充分溶解后，按下列表格(表1)，利用移液枪移取不同量的葡萄糖、蒸馏水以及DNS试剂于十只洗干净的试管中，充分摇匀后，放入吸光光度计进行吸光值的测定。利用excel录入数据，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到标准曲线方程(如图1)。
[0121] 表1 葡萄糖标准曲线参考表
[0122]
[0123] 3.4.3.3酶活测定方法
[0124] 3.4.3.3.1制备粗酶液
[0125] a.选出刚果红和滤纸实验效果好的菌种，分别接在200ml的真菌、细菌、放线菌的液体培养基中，培养1-2天后，用移液枪取2ml的液体培养基中的菌液，接种在100ml的产酶培养基中，一个菌种做21个重复。根据真菌、细菌、放线菌不同的培养时间、培养温度于150r/min的摇床中进行培养，以备之后七天的酶活测定实验。
[0126] b.每天一种菌种取三瓶作为三个重复，分别倒入15ml离心管中进行离心，离心转数为1400r/min,时间为15min,离心后取5ml于小锥形瓶中，加入45ml蒸馏水稀释10倍。
[0127] 3.4.3.3.2滤纸酶活力的测定
[0128] 每种菌种在测量时，取4只20ml的试管，加入50mg的去淀粉滤纸，随后加入1.5ml 0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取稀释后的粗酶液0.5ml于三个试管中为三个重复,另外一个试管中加入0.5ml蒸馏水作为测吸光值时的调零溶液，50度水浴加热1h后，加入
1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。
1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。
[0129] 3.4.3.3.3外切β-葡聚糖酶酶活力的测定
[0130] 取4只20ml的试管，加入50mg的脱脂棉，随后加入1.5ml 0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取稀释后的粗酶液0.5ml于三个试管中为三个重复,另外一个试管中加入0.5ml蒸馏水作为测吸光值时的调零溶液，50度水浴加热1h后，加入1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。
[0131] 3.4.3.3.4内切β-葡聚糖酶酶活力的测定
[0132] 取4只20ml的试管，加入含有1％CMC的1.5ml 0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取稀释后的粗酶液0.5ml于三个试管中为三个重复,另外一个试管中加入0.5ml蒸馏水作为测吸光值时的调零溶液，50度水浴加热30min后，加入1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。
[0133] 3.4.3.3.5酶活力计算
[0134] 通过所得到的吸光值，带入到葡萄糖标准曲线中，计算出葡萄糖的含量，随后利用下面的公式进行计算，得到酶活力。
[0135] 酶活力(U/ml)＝(葡萄糖含量(mg)×酶液定容总体积(ml)×1000)/(反应液中酶液加入量(ml)×反应时间(min))
[0136] 3.5堆肥实验
[0137] 将牛粪和菇渣按体积比8∶2进行混合，同时加入菌并搅拌均匀，堆在1m3的发酵池中，接种量为体积比0.5％，之后进行堆肥发酵，堆肥期间每天进行温度测定。堆完肥后，将最后取的样进行自然晾干，晾干后用粉碎机粉碎以备测各种指标时使用。测定各项指标测定包括堆肥温度、pH值、C/N、种子发芽率、电导率、全氮、全磷、全钾、全碳、有机质、有机碳、腐殖酸。
[0138] 表2 堆肥材料理化性质表
[0139]
[0140]
[0141] 3.6菌株的鉴定
[0142] 参照《真菌鉴定手册》对筛选所得的木质素降解菌YZC9进行形态特征观察和初步鉴定。
[0143] 分子生物学鉴定采用ITS rDNA测序分析。PCR扩增和序列测定：提取菌株总DNA为模板，PCR扩增其ITS序列。
[0144] 设计引物序列
[0145] FR1：AIC CAT TCAATC GGT AIT，
[0146] NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC。
[0147] PCR扩增体系:DNA(70ng/μL)模板2μL；dNTP Mixture(2.5mmol/L)2.5μL；FR1(20μmol/L)1.5μL；NS1(20μmol/L)1.5μL；10×ExTaq Buffer(Mg2+pluse)5μL；ExTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL；补足ddH2O到50μL。PCR条件：94℃预变性3min；然后94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸2min,共30个循环；最后72℃延伸5min。由上海美吉生物医药科技有限公司对纯化后的PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST，然后用MEGA7.0软件进行系统发育树的构建。
[0148] 4结果与分析
[0149] 对土壤菌种初步的分离与纯化，从中分离纯化50种，从50种菌种种筛选出1种既能降解木质素又能降解纤维素的真菌YZC9。
[0150] 4.1 YZC9降解木质素能力分析
[0151] 将纯化后的YZC9菌种接于PDA-愈创木酚培养基上培养和PDA-苯胺蓝培养基上，发现其既能显色也能脱色(分别如图2和图3所示)。说明YZC9具有降解木质素的能力。
[0152] 分泌胞外酶系统来降解木质素是微生物降解木质素的主要途径。其中涉及到的木质素降解没主要包括木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。这些酶一般合称为木质素降解酶。对筛选出YZC9菌，进行下一步产酶试验。LiP、MnP产酶实验结果如下图4所示，向平板内打孔处滴加现配的等量4％与1％焦酚混合液，YZC3出现黄褐色显色圈，证明该菌能产生LiP、MnP酶。Lac产酶实验为向平板内打孔处滴加0.1mol/L用96％乙醇配制的α-萘酚溶液，YZC3出现紫色显色圈(如图5)，证明此真菌能产生Lac。
[0153] 对YZC9木质素分解酶活力进行测试，如图6所示，发现YZC9具有较强的产LiP能力，并YZC9在第8天出现峰值，其活力为11.469U/ml。YZC9产MnP能力略强，在10-12d出现酶活力高峰，峰值为116U/ml。YZC9产Lac是在第7d出现活力峰值，峰值为8.889U/ml。
[0154] 4.2 YZC9降解纤维素能力分析
[0155] YZC9通过CMC-Na水解圈测定法进行纤维素降解能力的测定，如图7所示，实验结果显示YZC9分解纤维素能力较强，DP值达到10。进一步对YZC9进行滤纸的降解实验，如图8所示，根据滤纸的破碎程度判断其分解纤维素的能力，滤纸分解的越彻底则其分解纤维素的能力越强，反之则越弱。结果显示培养第十天，滤纸片被分解碎化，培养基近似糊状。说明YZC9具有很强的纤维素分解能力。
[0156] 对YZC9纤维素分解酶活力进行测试，结果如图9所示，发现对于滤纸酶来说，YZC9在生长到第2d时达到峰值，峰值达到6.02U/ml，随后呈下降的趋势。对于外切β-葡聚糖酶来说，YZC9在第3d酶活上升后，开始下降，并从第5d开始酶活又升高，在第7d达到峰值，达到6.6U/ml。对于内切β-葡聚糖酶来说，呈先上升后下降的趋势，在第5d达到峰值，为12.86U/ml。
[0157] 4.3 YZC9对枯枝落叶堆肥的影响
[0158] 4.3.1 YZC9对堆肥腐熟的影响
[0159] 腐熟度是堆肥中的有机物经过矿化、腐殖化后达到稳定化的程度，是衡量堆肥产品质量好坏的一个综合指标，可以根据堆肥的温度、C/N、电导率、pH值和GI来判断。
[0160] 温度是判断堆肥腐熟程度的重要指标之一，堆肥过程会历经升温期，高温期，降温期和后熟期4个时期，当温度重新回到环境温度即可视为堆肥初步成熟。中国粪便无害化卫生标准(GB7959-87)规定，堆肥温度在50℃以上并持续5-7d，便符合粪便无害化卫生标准。如图10所示，YZC9堆肥初期温度快速升至最高，持续10d后下降至50℃以下，经过较长的后熟期后，温度回归到环境温度。如表1所示，YZC9处理的高温天数比CK多5d，说明YZC9有利于堆肥发酵及高温时间的延长。
[0161] C/N是判断堆肥腐熟程度的另一重要指标，C/N越低表明腐熟程度越高，当C/N达到20-30，则认为堆肥基本腐熟。如表1所示，各处理之间差异性显著，说明YZC有助于堆肥的腐熟，降低碳氮比。
[0162] 电导率和pH也是判断堆肥腐熟程度的指标。电导率是以数字表示的溶液传导电流的能力，离子浓度越高，导电能力越强；离子浓度高则表明堆肥材料分解的多，堆肥腐熟程度越高。如表1所示，YZC9处理的电导率显著高于空白处理，说明YZC9有利于堆肥材料分解和堆肥腐熟。按照国家标准，固体有机废物堆肥处理后pH应在5.5-8.5，由表1可知，各处理的pH均在堆肥标准范围内。
[0163] 种子发芽指数(Germination Index,GI)不仅可以体现堆肥的植物毒性，还能够判断堆肥的腐熟程度，通常认为，当GI达到80％-85％，堆肥已无植物毒性或者说堆肥已腐熟。由表1可知，YZC9的发芽指数均大于80％已腐熟，显著高于对照的发芽指数，而对照显然在堆肥31天后，还未成熟。
[0164] 表3 菌剂堆肥腐熟程度指标
[0165]
[0166] 4.3.2 YZC9对堆肥品质的影响
[0167] 堆肥中TN、TP、TK以及腐殖质的含量是评价肥料的重要指标，全效养分含量越高，堆肥品质越好。如表4所示，加入YZC9的堆肥中TN、TP含量均显著高于空白对照，说明该菌有助于减少堆肥过程中氮素的损失，和加速磷元素的矿化过程。
[0168] 在堆肥过程中，原料中的有机质在降解的同时还进行着腐殖化过程。腐殖质含有大量的官能团(如羧基、酚羟基等)，能够吸附和固定重金属离子，因此，腐殖质的生成对于堆肥品质有重要影响。作为腐殖质的主要组成部分，腐殖酸的形成与木质素的降解密切相关。通过测定腐殖酸的含量，可以判断堆肥的腐殖化程度以及堆肥品质。如表4所示，YZC9处理的堆肥中腐殖酸含量显著高于空白对照(CK)，说明YZC9能够加速木质素降解，形成腐殖酸，有助于堆肥的腐殖化。
[0169] 表4 堆肥养分指标
[0170]
[0171] 4.4菌种鉴定结果
[0172] CYZ9在PDA培养基上生长迅速，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径50～55mm，白色，局部表面橙色，稀疏絮状；背面浅褐色，无水溶性色素。营养菌丝初期无色，壁光滑，后期深褐色，壁明显粗糙，具分隔，分枝多，宽1.5～4.0μm；无锁状联合现象(图11)。
[0173] 将PCR扩增获得的ITS序列在NCBI上进行BLAST，然后使用软件MEGA7.0将YZC9与同源性较高的10株菌进行系统发育树的构建，如图12所示。经分子生物学鉴定，确定YZC9为密孔菌Pycnoporus sp.将该菌株送保藏，其保藏号为CGMCC No.14783。
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