米斛的人工育种方法
阅读：690发布：2024-02-15
专利汇可以提供米斛的人工育种方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种米斛的人工育种方法，包括以下步骤：S1 播种 ；S2 种子 萌发生成 幼苗 ；S3外植体诱导生成原球茎；S4继代培养；S5原球茎增殖。本发明所述米斛的人工育种方法，采用组织培养的方式，生长周期短，繁殖系数高，满足米斛需求量大的现状。而且，得到的米斛营养价值丰富，具有清咽润喉、清音明目、解暑益气、养胃清热的功效。，下面是米斛的人工育种方法专利的具体信息内容。
1.一种米斛的人工育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1播种；
S2种子萌发生成幼苗；
S3外植体诱导生成原球茎；
S4继代培养；
S5原球茎增殖。
2.根据权利要求1所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1播种：将米斛果实用质量分数为1-2％的次氯酸钠水溶液消毒50-60分钟，用无菌蒸馏水冲洗3-5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为5-
10粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7-8g/L琼脂、1650mg/LNH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度23-25℃、空气湿度70-80％、光照强度
1400-1800lx、光照时间12-16小时/天的条件下培养6-7个月，种子萌发生成幼苗；
S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1-1.5cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为4-6个茎段/mL培养基，于温度23-25℃、空气湿度70-
80％、光照强度1400-1800lx、光照时间12-16小时/天的条件下培养30-60天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7-8g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.1-0.3mg/L生长调节剂，余量为水；
S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养30-40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2-3个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6-7g/L琼脂、1900mg/L KNO3、
1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
S5增殖培养：将原球茎以30-100g/L的接种量转入增殖培养基中，于温度23-25℃、空气湿度70-80％、光照强度1400-1800lx、光照时间12-16小时/天的条件下培养30-40天。
3.根据权利要求2所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，步骤S5中增殖培养阶段的培养方式为固体静置培养，所述增殖培养基为固体增殖培养基，其中所述固体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、7-8g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·
7H2O、4400mg/LCaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
4.根据权利要求2所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，步骤S5中增殖培养阶段的培养方式为液体静置培养液体或振荡培养，所述增殖培养基为液体增殖培养基。
5.根据权利要求4所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，所述液体增殖培养基的组成为：液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/LCaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
6.根据权利要求4所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，所述液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、15-25mL/L真菌匀浆液，余量为水。
7.根据权利要求6所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，所述真菌匀浆液的制备过程为：将天麻蜜环菌活化后，以30-40g/L的接种量转接到液体麦麸培养基中，其中液体麦麸培养基的组成为：30g/L麦麸、20g/L葡萄糖、3g/L KH2PO4、1.5g/L MgSO4、余量为水；随后以
120-180转/分钟的转速于暗室中摇床培养2-3周后，收获菌丝和发酵液；将发酵液和真菌分离，将真菌和发酵液以50-60g/L的比例混匀，用匀浆机匀浆，得到真菌匀浆液。
8.根据权利要求2～3中任一项所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，在步骤S5增殖培养阶段，在第18-20天时，向培养基中添加30-40g/L蔗糖，随后继续振荡培养。
9.根据权利要求2所述的米斛的人工育种方法，其特征在于，所述生长调节剂为萘乙酸、苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基氨基嘌呤中的一种或几种的混合物。
米斛的人工育种方法
技术领域
[0001] 本发明涉及育种技术领域，特别是涉及一种米斛的人工育种方法。
背景技术
[0002] 霍山石斛俗称米斛，最早见载于清代赵学敏《本草钢目拾遗》，距今有200年以上历史。该书记载称：“霍石斛出江淮霍山，形似钗斛细小，色黄而形曲不直，有成球者，彼土人以代茶茗，霍石斛嚼之微有浆、黏齿、味甘、微咸，形缩为真”。该书引用年希尧集经验方曰：“长生丹用甜石斛，即霍山石斛也。”道家经典《道藏》曾把霍山石斛、天山雪莲、三两人参、百二十年首乌、花甲茯苁、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草等列为中华“九大仙草”，且霍山石斛名列之首。
[0003] 米斛作为珍稀名贵的中药材早已驰名国内外，目前市场需求量巨大。但是米斛对生长条件要求极为苛刻，种子繁殖能力极低，生长周期长。而且由于过度采挖，米斛自然资源早已枯竭。这给米斛的开发利用和可持续发展带来不利影响，因而对保证米斛原料来源、实行规模化培养的需求越来越迫切。当前米斛组织培养研究多以种子离体萌发，诱导茎尖、茎段分生组织直接成苗为主。但是试管苗生根缓慢，移栽困难，且移栽后的成活率比较低，[0004] 米斛的原球茎实质上是分化的体细胞胚胎，其与米斛的植株主要药用有效成分相当，具有同样的生理代谢潜能，可以来替代原药材。而且，原球茎比试管苗繁殖快，生长周期短，因而探讨本发明对米斛原球茎增殖的适宜培养方式进行探讨。
发明内容
[0005] 本发明客服了现有技术中米斛资源短缺、生长周期长的问题，采用米斛原球茎作为米斛植株的替代品，使米斛的生产更利于产业化和商业化。
[0006] 本发明提供一种米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0007] S1播种；
[0008] S2种子萌发生成幼苗；
[0009] S3外植体诱导生成原球茎；
[0010] S4继代培养；
[0011] S5原球茎增殖。
[0012] 具体地，本发明所述米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0013] S1播种：将米斛果实用质量分数为1-2％的次氯酸钠水溶液消毒50-60分钟，用无菌蒸馏水冲洗3-5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为5-10粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7-8g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0014] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度23-25℃、空气湿度70-80％、光照强度1400-1800lx、光照时间12-16小时/天的条件下培养6-7个月，种子萌发生成幼苗；
[0015] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1-1.5cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为4-6个茎段/mL培养基，于温度23-25℃、空气湿度70-80％、光照强度1400-1800lx、光照时间12-16小时/天的条件下培养30-60天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7-8g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.1-0.3mg/L生长调节剂，余量为水；
[0016] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养30-40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2-3个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6-7g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0017] S5增殖培养：将原球茎以30-100g/L的接种量转入增殖培养基中，于温度23-25℃、空气湿度70-80％、光照强度1400-1800lx、光照时间12-16小时/天的条件下培养30-40天。
[0018] 在本发明的一些技术方案中，步骤S5中增殖培养阶段的培养方式为固体静置培养，所述增殖培养基为固体增殖培养基，其中所述固体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、7-8g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·
2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
[0019] 在本发明的一些技术方案中，步骤S5中增殖培养阶段的培养方式为液体静置培养液体或振荡培养，所述增殖培养基为液体增殖培养基。其中振荡培养的转速优选为110-170转/分钟。
[0020] 在一些实施例中，所述液体增殖培养基的组成为：液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
[0021] 在一些实施例中，所述液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、15-25mL/L真菌匀浆液，余量为水。
[0022] 所述真菌匀浆液的制备过程为：将天麻蜜环菌活化后，以30-40g/L的接种量转接到液体麦麸培养基中，其中液体麦麸培养基的组成为：30g/L麦麸、20g/L葡萄糖、3g/L KH2PO4、1.5g/L MgSO4、余量为水；随后以120-180转/分钟的转速于暗室中摇床培养2-3周后，收获菌丝和发酵液；将发酵液和真菌分离，将真菌和发酵液以50-60g/L的比例混匀，用匀浆机匀浆，得到真菌匀浆液。
[0023] 作为本发明的一个改进的技术方案，在步骤S5增殖培养阶段，在第18-20天时，向培养基中添加30-40g/L蔗糖，随后继续振荡培养。
[0024] 所述生长调节剂为萘乙酸、苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基氨基嘌呤中的一种或几种的混合物。优选地，所述生长素为萘乙酸和吲哚丁酸的混合物，其中，萘乙酸和吲哚丁酸的质量比为1：2。
[0025] 本发明所述米斛的人工育种方法，采用组织培养的方式，生长周期短，繁殖系数高，满足米斛需求量大的现状。而且，得到的米斛营养价值丰富，具有清咽润喉、清音明目、解暑益气、养胃清热的功效。
具体实施方式
[0027] 下述实施例中，
[0028] 该实验在安徽省霍山县石斛生产基地进行。
[0029] 米斛果实，购自安徽霍山佬霍山石斛有限公司。
[0030] 次氯酸钠，CAS号：7681-52-9，购自阿法埃莎(中国)化学有限公司。
[0031] 萘乙酸，CAS号：86-87-3，购自武汉长成化成科技发展有限公司
[0032] 天麻蜜环菌，购自湖北宜昌农鑫天麻生物科技有限公司。
[0033] 吲哚丁酸，CAS号：133-32-4，购自泰安市嘉叶生物科技有限公司。
[0034] 水解乳蛋白，CAS号：68458-87-7，购自上海研域商贸有限公司。
[0035] 实施例1
[0036] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0037] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0038] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0039] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.3mg/L萘乙酸，余量为水；
[0040] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0041] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入固体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下静置培养40天，其中固体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
[0042] 实施例1原球茎增殖培养采用固体培养基，只有部分原球茎与培养基相接触，生长相对于缓慢，而且固体培养的原球茎分化成苗的较多，这与试验设想的原球茎大量增殖的情况不符。这大概是由于米斛原球茎是正在生长分化的体细胞胚胎，在固体培养基中培养的过程中，原球茎容易受到诱导，分化成苗。
[0043] 实施例2
[0044] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0045] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0046] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0047] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.3mg/L萘乙酸，余量为水；
[0048] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0049] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入液体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下静置培养40天，其中液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
[0050] 结果发现，经液体静置培养的原球茎生长紧密，相对于固体静置培养，分化成苗较少。
[0051] 实施例3
[0052] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0053] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0054] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0055] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.3mg/L萘乙酸，余量为水；
[0056] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0057] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入液体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下，以110转/分钟的转速振荡培养40天，其中液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水。
[0058] 结果发现，液体振荡培养的原球茎呈颗粒状，均匀和分散性均比较好，而且原球茎生长比较紧密。
[0059] 综合实施例1-3，得出以下结论：液体振荡培养可以有效调节原球茎的生长状态，更适于米斛原球茎的分散，有利于原球茎的快速增殖，且能适量控制原球茎分化成苗。
[0060] 实施例4
[0061] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0062] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0063] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0064] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.3mg/L萘乙酸，余量为水；
[0065] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0066] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入液体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下，以110转/分钟的转速振荡培养40天，其中液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、20mL/L真菌匀浆液，余量为水。
[0067] 所述真菌匀浆液的制备过程为：将天麻蜜环菌活化后，以30g/L的接种量转接到液体麦麸培养基中，其中液体麦麸培养基的组成为：30g/L麦麸、20g/L葡萄糖、3g/L KH2PO4、1.5g/L MgSO4、余量为水；随后以160转/分钟的转速于暗室中摇床培养3周后，收获菌丝和发酵液；将发酵液和真菌分离，将真菌和发酵液以60g/L的比例混匀，用匀浆机匀浆，得到真菌匀浆液。
[0068] 天麻蜜环菌可以与米斛共生培养，有利于增加米斛的生长量，这可能是由于蜜环菌为米斛生长提供了充足的营养，能够促进其旺盛生长，从而可提高米斛的产量和品质。
[0069] 实施例5
[0070] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0071] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0072] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0073] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.3mg/L萘乙酸，余量为水；
[0074] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0075] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入液体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下，以110转/分钟的转速振荡培养18天，其中液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、20mL/L真菌匀浆液，余量为水；在第18天时，向培养基中添加30g/L蔗糖，继续以110转/分钟的转速振荡培养22天。
[0076] 所述真菌匀浆液的制备过程为：将天麻蜜环菌活化后，以30g/L的接种量转接到液体麦麸培养基中，其中液体麦麸培养基的组成为：30g/L麦麸、20g/L葡萄糖、3g/L KH2PO4、1.5g/L MgSO4、余量为水；随后以160转/分钟的转速于暗室中摇床培养3周后，收获菌丝和发酵液；将发酵液和真菌分离，将真菌和发酵液以60g/L的比例混匀，用匀浆机匀浆，得到真菌匀浆液。
[0077] 多糖是米斛中的主要营养物质，为了获得高含量多糖的米斛原球茎，在确定细胞生长特性和多糖合成特性后，得到本发明所述的技术方案，即在增值培养的第18天向培养基中加入30g/L蔗糖。因为原球茎对蔗糖的利用途径是蔗糖进入细胞后，在活性酶的作用下降解成葡萄糖和果糖供给细胞生长，有利于体细胞的生长发育。所以，采用实施例4所述的培养方式，不仅有利于多糖的积累，而且还可以促进原球茎的生成。
[0078] 实施例6
[0079] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0080] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0081] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0082] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.3mg/L吲哚丁酸，余量为水；
[0083] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0084] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入液体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下，以110转/分钟的转速振荡培养18天，其中液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、20mL/L真菌匀浆液，余量为水；在第18天时，向培养基中添加30g/L蔗糖，继续以110转/分钟的转速振荡培养22天。
[0085] 所述真菌匀浆液的制备过程为：将天麻蜜环菌活化后，以30g/L的接种量转接到液体麦麸培养基中，其中液体麦麸培养基的组成为：30g/L麦麸、20g/L葡萄糖、3g/L KH2PO4、1.5g/L MgSO4、余量为水；随后以160转/分钟的转速于暗室中摇床培养3周后，收获菌丝和发酵液；将发酵液和真菌分离，将真菌和发酵液以60g/L的比例混匀，用匀浆机匀浆，得到真菌匀浆液。
[0086] 实施例7
[0087] 米斛的人工育种方法，包括以下步骤：
[0088] S1播种：将米斛果实用质量分数为1％的次氯酸钠水溶液消毒60分钟，用无菌蒸馏水冲洗5分钟，切开果实，将种子均匀散布在固体播种培养基表面，种子的播种量为7粒/mL培养基，其中所述固体播种培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0089] S2种子萌发生成幼苗：将播种后的培养基于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养6个月，种子萌发生成幼苗；
[0090] S3外植体诱导生成原球茎：选择长度为1.2cm的幼苗茎段作为外植体，将茎段接种于固体诱导培养基中，茎段的接种量为6个茎段/mL培养基，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下培养40天，有原球茎生成，其中固体诱导培养基的组成为：30g/L蔗糖、7g/L琼脂、303mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、661mg/L CaCl2·2H2O、340mg/L KH2PO4、0.1mg/L萘乙酸、0.2mg/L吲哚丁酸，余量为水；
[0091] S4继代培养：将诱导产生的原球茎继续培养40天后，从茎段上分离，在继代培养基上培养2个月，从继代培养物中挑选长势均一、生长良好的、无分化、色泽鲜绿的原球茎，其中所述继代培养基的组成为：30g/L蔗糖、1g/L水解乳蛋白、6.5g/L琼脂、1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、70mg/L MgSO4·7H2O、440mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4，余量为水；
[0092] S5增殖培养：将原球茎以40g/L的接种量转入液体增殖培养基中，于温度25℃、空气湿度80％、光照强度1600lx、光照时间12小时/天的条件下，以110转/分钟的转速振荡培养18天，其中液体增殖培养基的组成为：30g/L蔗糖、1650mg/L NH4NO3、1900mg/L KNO3、370mg/L MgSO4·7H2O、4400mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、20mL/L真菌匀浆液，余量为水；在第18天时，向培养基中添加30g/L蔗糖，继续以110转/分钟的转速振荡培养22天。
[0093] 所述真菌匀浆液的制备过程为：将天麻蜜环菌活化后，以30g/L的接种量转接到液体麦麸培养基中，其中液体麦麸培养基的组成为：30g/L麦麸、20g/L葡萄糖、3g/L KH2PO4、1.5g/L MgSO4、余量为水；随后以160转/分钟的转速于暗室中摇床培养3周后，收获菌丝和发酵液；将发酵液和真菌分离，将真菌和发酵液以60g/L的比例混匀，用匀浆机匀浆，得到真菌匀浆液。
[0094] 测试例1
[0095] 对实施例2-7的米斛的生长性能进行测定：将原球茎置于105℃烘箱中烘30分钟，然后置于60℃烘箱中烘至恒重后称取干重。原球茎生长的生物量以每单位体积增殖培养基的原球茎干重量表示(g/L)。
[0096] 具体测试结果见表1。
[0097] 表1：生长性能测试结果表
[0098] 生长量(g/L)
实施例2 13.7
实施例3 16.1
实施例4 19.9
实施例5 21.2
实施例6 20.4
实施例7 23.5
实施例2 13.7
实施例3 16.1
实施例4 19.9
实施例5 21.2
实施例6 20.4
实施例7 23.5
[0099] 从表1可以看出，实施例3采用液体振荡培养，其生长性能优于实施例2，这大概是由于振荡培养时，原球茎能充分与培养液接触，可以很好地吸收营养成分，生长相对比较快，而且多糖含量较高，形态上原球茎分化较少。
[0100] 测试例2
[0101] 对实施例2-7的米斛的多糖含量进行测试，采用苯酚-浓硫酸法测定：将原球茎于105℃烘箱中烘20分钟，然后60℃烘箱中烘14小时，将其取出并研磨过40目筛，得到粉末；称取粉末100mg用滤纸和棉花包好成滤纸包后，置于索氏提取器中，依次用石油醚、体积分数为80％的乙醇水溶液在水浴中回流提取去除干扰杂质成分，而后取出样品滤纸包置于105℃烘箱中干燥30分钟，最后用细口瓶将滤纸包里面的原球茎样品冲洗至150mL的圆底烧瓶中(约40mL蒸馏水)，于沸水浴中提取3小时，趁热过滤，并洗涤烧瓶，收集滤液，转入到100mL的容量瓶中并定容，摇匀；精密吸取该液1mL于容量瓶中，定容、摇匀，取1mL，加蒸馏水补足至2mL，加苯酚试剂(10g蒸馏苯酚溶于150mL蒸馏水)1.0mL混匀，浓硫酸0.5mL，迅速混匀，放置5分钟，置沸水浴中加热15分钟后，取出，流水冷却至室温于490nm处测定吸光度，3次重复，以2mL蒸馏水同样操作，作空白对照；将无水葡萄糖置于75℃左右烘箱中干燥30分钟，然
2
后将该葡萄糖制作标准曲线，其线形回归方程为y＝0.0168x+0.0035，r＝0.9989；多糖含量可以通过标准方程计算得到。
2
后将该葡萄糖制作标准曲线，其线形回归方程为y＝0.0168x+0.0035，r＝0.9989；多糖含量可以通过标准方程计算得到。
[0102] 具体测试结果见表2。
[0103] 表2：多糖含量测试结果表
[0104]
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