技术领域
[0001] 本
发明属于作物遗传育种技术领域，具体提供了一种用于小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的跨内含子分子标记及其应用。
背景技术
[0002] 小麦(Triticum aestivum L.)白粉病是由布氏白粉菌引起的一种小麦重要病害。根据基因对基因学说：针对寄主
植物的每一个抗性基因，病原菌迟早会出现一个与之相对应的毒性基因。培育抗病品种是
预防小麦白粉病最经济有效的方式。
[0003] 随着分子标记的快速发展，已有分子标记种类繁多，不同标记各有其优缺点，但总体而言，功能性、多态性及通用性是衡量标记优劣的标准。在育种工作中，分子标记能够用于基因
定位、累加和转移，显著提高育种的效率，快速实现育种目标。内含子是真核
生物基因组中重要的组成元件，且广泛分布于真核生物基因组中，虽然部分内含子可能影响基因的表达，但其功能较小，因此内含子变异程度要高于编码序列。由于内含子是基因内的非编码序列，所承受的选择压低于外显子区域，其变异程度高于编码区域。Feltus等比较了8个
水稻品种，发现在每1000个
碱基中，内含子上SNP个数是外显子上的3倍，因此内含子标记在多态性上会具有明显优势。同时，内含子位于基因内部，利用其开发的标记具有功能性，可用于分子辅助育种。
[0004] 地方品种(Triticum.aestivum)由于适应性限制以及自身一些
缺陷，没有大面积推广，但携带有许多优良的抗性基因。盛宝钦等(1992)对来自我国3441个小麦地方品种进行白粉病抗性鉴定，筛选出77个抗病品种，其中6个免疫至高抗的品种，71个中抗品种。因此，鉴定地方品种白粉病抗病基因，开发紧密连
锁的分子标记，转移或累积白粉病抗病基因。
[0005] 目前，利用标记辅助育种，已选育了一批新的抗病品系和种质，如曾祥艳等(2005)通过复合杂交、回交，将抗白粉病基因聚合体Pm4+Pm13+PmV、抗条锈病基因YrX(源自YW243)、抗黄矮病基因Bdv2向优异农艺亲本转育。利用抗病性鉴定和分子标记辅助选择，选育出聚合了3～5个抗病基因的兼抗白粉、条锈和黄矮病的冬性小麦新种质和春性小麦新种质；任明见等(2009)利用分子标记辅助选择技术与常规杂交育种方法，培育出一个6VS/6AL簇毛麦-普通小麦易位系，含抗白粉病基因Pm21的小麦品种贵农19号；Jia等(2013)利用分子标记辅助选择选育出了抗条锈病和白粉病的新品系0-123-1-1；降好宇等(2019)利用褐飞虱抗性基因连锁标记，辅助选择广谱抗稻瘟病种质75-1-127。
[0006] 挖掘并转移抗白粉病基因，借助抗病基因连锁分子标记，将不同抗谱的基因累加，可能产生超亲抗性，拓宽抗谱，防控病害的流行与蔓延。mlxbd连锁标记可用于小麦标记辅助选择(MAS)育种，为更好地利用白粉病抗性资源和进一步研究Pm5位点提供了理论依据。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种重复性好，分辨
力高的用于小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的跨内含子分子标记；另一个目的在于提供一种简便实用、准确性高的标记辅助选择抗白粉病基因mlxbd的方法，在小麦分子辅助育种中可高效、准确检测mlxbd，提高育种效率。
[0008] 本发明所采取的技术方案是：
[0009] 一种用于小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的跨内含子分子标记，其特征在于所述的跨内含子分子标记，命名为7BLCOS-9和7BLCOS-8，在小麦基因组7BL
染色体位于mlxbd的一侧，与之紧密连锁，分子标记7BLCOS-9与mlxbd基因的遗传距离为1.3cM，分子标记7BLCOS-8与mlxbd基因的遗传距离为1.7cM；
[0010] 其中扩增分子标记7BLCOS-9的引物对序列为：
[0011] 标记7BLCOS-9F的核苷酸序列如
序列表中SEQ ID NO：1所示；
[0012] 标记7BLCOS-9R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
[0013] 其中扩增分子标记7BLCOS-8的引物对序列为：
[0014] 标记7BLCOS-8F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；
[0015] 标记7BLCOS-8R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
[0016] 一种用于小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的分子标记的应用，其特征在于将待检测的植株DNA为反应模板，对所述的用于小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的分子标记引物对7BLCOS-9或7BLCOS-8进行PCR扩增，根据扩增得到的分子标记的
片段大小判断植株中是否含有白粉病抗性基因mlxbd。
[0017] 利用分子标记7BLCOS-9或7BLCOS-8的引物对扩增得到的片段，以小白冬麦、Chancellor(CC)及其F2群体为对象，利用所述的SSR标记7BLCOS-9或7BLCOS-8的上游及下游引物，PCR扩增小麦植株基因组DNA，当出现7BLCOS-9标记的250bp的带型时，则表示该植株中小麦白粉病的抗性基因mlxbd存在，能够辅助选择含抗白粉病基因mlxbd的单株，用于小白冬麦抗白粉病基因mlxbd转移与累加。或者当出现7BLCOS-8标记的723bp的带型时，则表示该植株中小麦白粉病的抗性基因mlxbd存在，能够辅助选择含抗白粉病基因mlxbd的单株，用于小白冬麦抗白粉病基因mlxbd转移与累加。
[0018] 作为优选，所述分子标记的应用方法包括如下具体步骤：
[0019] (1)提取植株DNA：为检测目的基因位点与所获得标记位点的遗传连锁性，将F2后代190个单株分别提取基因组DNA，采用常规CTAB法(Saghaimaroof等.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81：8014-8018)；
[0020] (2)PCR反应体系为：总体积20μL，含10×Tag Buffer(Mg2+)2.0μL、2.5mM dNTP1.6μL、10μm/μL上游引物和下游引物各1.0μL、1U Taq DNA聚合酶0.2μL、100-300ng/μL基因组DNA 2.0μL，去离子水12.2μL；
[0021] (3)扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，标记7BLCOS-9在55℃或7BLCOS-8在58℃复性30s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
[0022] (4)
电泳为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将3μL PCR产物和2μL上样缓冲液混合点样，35.2W恒定功率电泳2h，其中
电压为160V，
电流为220mA，
硝酸银染色拍照；
[0023] 作为优选，所述的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，由丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺(Acr:Bis)＝37.5:1、过
硫酸铵、TEMED组成；
[0024] 所述的上样缓冲液含100mM EDTA，10mM Tris-HCL，5％聚
蔗糖400，0.25％溴酚兰，0.25％二
甲苯青。
[0025] 本发明所述的跨内含子分子标记为7BLCOS-9和7BLCOS-8，在小麦基因组7BL染色体位于mlxbd的一侧，与之紧密连锁，分子标记7BLCOS-9与mlxbd基因的遗传距离为1.3cM，分子标记7BLCOS-8与mlxbd基因的遗传距离为1.7cM。本发明还提供了一种利用所述分子标记检测小麦白粉病抗性基因mlxbd的辅助选择育种中的应用。利用本发明的分子标记辅助选择mlxbd，节约成本，显著提高了选择效率，
加速了抗白粉病育种
进程。
[0026] 本发明具备的有益效果：
[0027] (1)本发明的跨内含子分子标记具有特异性强、
稳定性高、重复性好等优点；
[0028] (2)标记的开发方法操作简便快捷，对检测设备和引物模板
质量要求不高，实验
试剂用量少，速度快，成本低，适合高通量、自动化的优点；
[0029] (3)如本发明的小麦白粉病抗性基因mlxbd分子标记和引物对应用于小麦育种工作中，将极大降低小麦白粉病流行对生产造成的经济损失，同时显著地减少
农药使用量，有益于降低生产成本，具有很大的应用潜力和极高的经济价值；
[0030] (4)本发明筛选出与基因mlxbd紧密连锁的分子标记，可以有效地用于基因mlxbd的标记辅助选择，并为小麦白粉病抗性基因mlxbd的克隆提供了重要的信息。
[0031] 本发明提供的用于小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的跨内含子分子标记重复性好、灵敏度高、准确率高，可显著提高抗病育种效率、加速育种进程。
附图说明
[0032] 图1是小白冬麦共显性跨内含子分子标记7BLCOS-9和7BLCOS-8与小白冬麦抗白粉病基因mlxbd遗传连锁图；其中左侧为分子标记与小白冬麦抗白粉病基因mlxbd间的遗传距离，单位为：cM；右侧为分子标记名称。
[0033] 图2是小白冬麦/CC的F2群体中通过跨内含子分子标记7BLCOS-9检测多态性DNA片段。泳道M：DS2000；泳道1：小白冬麦；泳道2：CC；泳道3-8：纯合抗病植株；泳道9-14：杂合感病植株；泳道15-20：纯合感病植株。白色箭头表示多态性DNA片段。
[0034] 图3是小白冬麦/CC的F2群体中通过跨内含子分子标记7BLCOS-8检测多态性DNA片段。泳道M：DS2000；泳道1：小白冬麦；泳道2：CC；泳道3-8：纯合抗病植株；泳道9-14：杂合感病植株；泳道15-20：纯合感病植株。白色箭头表示多态性DNA片段。
具体实施方式
[0035] 下面结合实例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制。本发明
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品
说明书进行。
[0036] 下述所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过商业途径购买获得的常规产品。
[0037] 实施例1：
[0038] 一、分离群体的获得及鉴定
[0039] 以抗病品种小白冬麦，感病品种CC，经杂交获得F2群体。
[0040] 将小麦白粉病菌E09接种到CC，16-20℃培养，获得足够菌株。采用弹拂法接种BgtE09，对小白冬麦和CC组合的F2分离群体进行苗期(1到2叶期)抗病性鉴定，待对照组CC充分发病时对F2分离群体进行鉴定，按照0～4级分级标准调查小麦白粉病反应型(盛宝钦，1988，用反应型记载小麦苗期白粉病，
植物保护，1，49)，其中0型为免疫，0；型为近免疫，1级为高抗，2级为中抗，3级为中感，4级为高感。F2鉴定结果显示：在鉴定的190株F2分离群体中，
136株表现为感病；54株表现为抗病。经卡方检验感病与抗病植株符合3:1的遗传分离比(χ2＝1.19<χ2 0.05＝3.84，P＝0.28>0.05，df＝1)。
[0041] 二、与小白冬麦抗白粉病基因mlxbd连锁的分子标记的获得
[0042] 1、小麦基因组DNA提取
[0043] 选取经鉴定的F2抗病(等级为0；和0)和感病(等级为4)极端个体，以及抗病亲本小白冬麦与感病亲本CC，分别取植株的第一片或第二片叶，经液氮冷冻
研磨，采用优化的CTAB法(Saghaimaroof等.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81：8014-8018)提取小麦基因组DNA，用1％的琼脂糖凝胶检测DNA的质量，经紫外分光光度计测定浓度后，加入ddH2O稀释至100-200ng/μL备用。
[0044] 2、分子标记的开发
[0045] 本发明所述的小麦白粉病抗性基因mlxbd辅助选择的分子标记的开发方法，具体过程如下：
[0046] 本发明所使用的SSR分子标记通过小麦中国春染色体7BL的基因组序列(http：//wheat-urgi.versailles.inra.fr/http//www.wheatgenome.org/Projects/IWGSC-Bread-Wheat-Projects/Sequencing/Whole-Chromosome-Reference-Sequencing-Projects/7B-Reference-Sequencing)用于开发标记。然后，通过使用Batchprimer 3(https：//probes.pw.usda.gov/batchprimer3)
软件设计跨内含子标记。
[0047] 引物序列如下：
[0048] 标记7BLCOS-9序列为：
[0049] 7BLCOS-9F：5'-AAGCTCCTCATCCACGACTAC-3'，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
[0050] 7BLCOS-9R：5'-TCTTGTCGTGGATGAATGCC-3'，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
[0051] 标记7BLCOS-8序列为：
[0052] 7BLCOS-8F：5'-GAGATCCTGTCGAACAAGCAG-3'，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；
[0053] 7BLCOS-8R：5'-TGCCTTCATCCTTCTACTGAGC-3'，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
[0054] 所述的跨内含子分子标记用于筛选时的反应程序为：PCR扩增反应在S1000型热循环仪(Bio-Rad，California，USA)上进行，体系为20μL，含10×Tag Buffer(Mg2+)2.0μL、2.5mM dNTP 1.6μL、10μm/μL上游引物和下游引物各1.0μL、1U Taq DNA聚合酶0.2μL、100-
300ng/μL基因组DNA 2.0μL、去离子水12.2μL；扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，
7BLCOS-9在55℃或7BLCOS-8在58℃复性30s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。电泳为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，正负极的电泳缓冲液都为1×TBE，上样量5μL(3μL PCR产物和2μL上样缓冲液)，35.2W恒定功率电泳2h，其中电压为160V，电流为220mA。
经硝酸银染色后进行带型统计。其中所述的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺(Acr:Bis)＝37.5:1、过硫酸铵、TEMED组成。所述的上样缓冲液含100mM EDTA，10mM Tris-HCL，5％聚蔗糖400，0.25％溴酚兰，0.25％二甲苯青。
[0055] 3、多态性跨内含子标记筛选与遗传图谱构建：
[0056] 以亲本小白冬麦和CC为材料，对新开发的约22对跨内含子引物进行筛选，获得2对在两亲本间有差异呈共显性的清晰、稳定、可靠的多态性跨内含子引物用于190个F2单株进行基因型分析。
[0057] 利用作图软件 v4.0和MapDraw V2.1软件对有多态性的小麦跨内含子引物在190个F2作图单株中所获得的基因型数据进行连锁分析并构建小白冬麦抗白粉病基因遗传连锁图谱。目的基因mlxbd紧密连锁的跨内含子标记为7BLCOS-9和7BLCOS-8，其遗传距离分别为1.3cM和1.7cM(图1)。
[0058] 实施例2：
[0059] 为了验证分子标记7BLCOS-9和7BLCOS-8在实际育种中的选择效果，我们根据抗白粉病鉴定结果，从小白冬麦×CC的F2代群体中分别随机选择纯合抗病植株，纯合感病植株和杂合感病植株，采用跨内含子引物7BLCOS-9和7BLCOS-8进行PCR扩增验证，分别以小白冬麦(含抗白粉病基因mlxbd)和CC(无抗白粉病基因)作为对照。
[0060] 本发明所述分子标记在检测小麦白粉病抗性基因mlxbd中的应用，包括如下具体步骤：
[0061] (1)CTAB法提取植株DNA：采用常规CTAB法(Saghaimaroof等.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81：8014-8018)；
[0062] (2)PCR反应体系为：总体积20μL，含10×Tag Buffer(Mg2+)2.0μL、2.5mM dNTP1.6μL、10μm/μL上游引物和下游引物各1.0μL、1U Taq DNA聚合酶0.2μL、100-300ng/μL基因组DNA 2.0μL、去离子水12.2μL；
[0063] (3)扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，标记7BLCOS-9在55℃或7BLCOS-8在58℃复性30s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
[0064] (4)电泳为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将3μL PCR产物和2μL上样缓冲液混合点样，35.2W恒定功率电泳2h，其中电压为160V，电流为220mA，硝酸银染色拍照。
[0065] 所述的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，由丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺(Acr:Bis)＝37.5:1、过硫酸铵、TEMED组成；所述的上样缓冲液含100mM EDTA，10mM Tris-HCL，5％聚蔗糖400，
0.25％溴酚兰，0.25％二甲苯青。
[0066] 所述的亲本小白冬麦和CC以及F2群体基因分型：如果在小白冬麦和F2抗病个体基因组DNA的PCR扩增产物中含有如7BLCOS-9引物扩增的250bp特异带型时即为含有小麦白粉病的纯合抗病基因rr或如果在小白冬麦和F2抗病个体基因组DNA的PCR扩增产物中含有如7BLCOS-8引物扩增的723bp特异带型时即为含有小麦白粉病的纯合抗病基因rr；如果F2感病个体基因组DNA在引物7BLCOS-9含有与CC相同的PCR扩增带型时即为含有小麦白粉病的纯合感病基因RR或如如果F2感病个体基因组DNA在引物7BLCOS-8含有与CC相同的PCR扩增带型时即为含有小麦白粉病的纯合感病基因RR；如果F2个体基因组DNA的PCR扩增产物中同时含有与小白冬麦(引物7BLCOS-9扩增出250bp条带或引物7BLCOS-8扩增出723bp条带)和CC相同的扩增带型时即为含有小麦白粉病的杂合感病基因Rr。
[0067] 引物7BLCOS-9的扩增结果表明纯合感白粉病后代全部扩增出与CC相同的扩增带型，抗白粉病后代植株的扩增产物中均有250bp的条带，表现为与小白冬麦相同的扩增带型(图2)；引物7BLCOS-8的扩增结果表明纯合感白粉病后代全部扩增出与CC相同的扩增带型，抗白粉病后代植株的扩增产物中均有723bp的条带，表现为与小白冬麦相同的扩增带型(图3)。因此，说明引物7BLCOS-9和7BLCOS-8能够作为筛选小白冬麦抗白粉病基因mlxbd的分子标记，用于抗白粉病品种小白冬麦的分子标记辅助育种。
[0068] 本发明所述的分子标记在小麦分子辅助育种中的应用，利用所述的分子标记7BLCOS-9和7BLCOS-8对待检测样品的全基因组DNA进行PCR扩增，依据扩增出的特异片段是否可用于含白粉病抗性基因mlxbd的品种的辅助选择育种。
[0069] 本发明公开了一种辅助筛选小麦抗白粉病基因mlxbd的专用引物，即两个辅助筛选抗白粉病小麦的跨内含子标记7BLCOS-9和7BLCOS-8，这两个标记能准确鉴定抗白粉病基因mlxbd，将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
[0070] 上述实施例是提供给熟悉本领域内的人员来实现或使用本发明的，熟悉本领域的人员可在不脱离本发明的发明思想的情况下，对上述实施例做出种种
修改或变化，因而本发明的保护范围并不被上述实施例所限，而应该是符合
权利要求书提到的创新性特征的最大范围。
